segunda parte sobre o tratamento com o sulfato de bleomicina e a associação com a EDET. Com relação à primeira parte, serão abordados parâmetros de avaliação especificamente no tecido muscular, seja ele representado pelos músculos respiratórios, em alguns momentos, ou especificamente pelo músculo diafragma, que é o principal alvo do recurso terapêutico EDET, além da abordagem de parâmetros sistêmicos relacionados a órgãos, como coração, pâncreas e estômago, os quais poderiam estar sendo estimulados pela corrente elétrica, uma vez que essa é aplicada na caixa torácica. No final dessa primeira parte, será abordada a análise do perfil bioquímico durante uma sessão de EDET, uma vez que esta promove contrações musculares.
O início da segunda parte dos resultados está relacionado à certificação do efeito do quimioterápico bleomicina no tecido pulmonar e, posteriormente, as análises estão direcionadas ao tecido muscular, especificamente aos músculos respiratórios, e ao perfil bioquímico e hematológico, uma vez que são importantes para a homeostasia sistêmica. Após foi realizada uma análise do tecido pancreático, devido à ação da bleomicina, uma vez que a insulina é essencial para ativar vias citosólicas responsáveis pela homeostasia do tecido muscular, incluindo os músculos respiratórios, os quais são os tecidos-alvo de ação do fisioterapeuta. Esta análise insulínica se perdura no decorrer da apresentação dos resultados, incluindo também o grupo tratado com bleomicina e EDET, sendo finalizada com duas análises, sendo uma no músculo diafragma e outra sistêmica.
5.1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea
O foco inicial do trabalho esteve direcionado na avaliação do conteúdo de glicogênio dos músculos respiratórios dos grupos controle (C) e submetidos a 7 sessões subsequentes de estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET). Nesta fase do estudo, foi observado que o recurso fisioterapêutico promoveu uma expressiva elevação (p<0,05) na concentração muscular de glicogênio atingindo 90,5% no diafragma (D), 50% no intercostal (I), 113,3% no peitoral (P) e 136,4% no abdominal (A) quando comparado ao grupo controle, conforme mostra a tabela 1.
Tabela 1. Concentração do glicogênio (mg/100mg) dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e abdominal dos grupos controle e tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET).
Controle EDET
Diafragma 0,21±0,01 0,40±0,03*
Intercostal 0,32±0,08 0,48±0,03*
Peitoral 0,30±0,05 0,64±0,04*
Abdominal 0,22±0,01 0,52±0,04*
Valor da média±epm, n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
As 7 sessões diárias de EDET não foram suficientes para alterar o conteúdo de proteínas totais em nenhum dos músculos analisados, conforme observado na tabela 2. A quantidade de DNA (mg/100mg) nos músculos respiratórios também não foi alterada (p>0,05) pela EDET (D: 0,06±0; I: 0,03±0; A: 0,03±0; P: 0,03±0) em relação ao controle (D: 0,08±005; I: 0,05±0,01; A: 0,03±0,05; P: 0,03±0,005).
Tabela 2. Concentração de proteínas totais (mg/100mg) dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e abdominal dos grupos controle e tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET).
Controle EDET Diafragma 4,53±0,25 4,65±0,30 Intercostal 5,31±0,72 4,56±0,25 Peitoral 4,45±0,58 3,66±0,24 Abdominal 4,26±0,09 4,79±0,47 Valor da média±epm, n=6.
Com relação à tipagem de fibra muscular do diafragma, o grupo controle apresentou 47,2% de fibras tipo I, 26% tipo IIA, 12,7% tipo IIB e 14,1% tipo IID. Já o grupo que recebeu 7 sessões de EDET apresentou 39,2% tipo I, 29% tipo IIA, 10% tipo IIB e 21,8% tipo IID, ressaltando a diminuição das fibras tipo I (16,9%; p<0,05) e aumento das fibras do tipo IID (54,6%; p<0,05).
Foi avaliada também a população de receptores de insulina do músculo diafragma, além da concentração de insulina plasmática e foi observado que houve aumento
VO2 (C: 2,78±0,88; EDET: 4,04±1,37; mLO2/h.g) e VCO2 (C: 2,12±0,70; EDET: 3,13±0,97;
mLCO2/h.g). Com relação ao grupo Pós-EDET e Sham também não houve diferença
significativa (p>0,05) (VO2 (Pós-EDET: 3,59±1,8; Sham: 2,65±0,7; mLO2/h.g); VCO2 (Pós-
EDET: 2,95±1,41; Sham: 2,20±0,1; mLCO2/h.g).
A partir da constatação de alterações metabólicas musculares, insulinêmicas e da tipagem de fibra muscular diafragmática, condições relevantes da terapêutica, e pautados no fato da terapia basear-se na aplicação de corrente elétrica na região torácica, o trabalho foi redirecionado para a análise do padrão eletrocardiográfico, tentando dirimir a dúvida se o tratamento estaria interferindo na atividade elétrica cardíaca.
Os resultados mostraram que não houve alteração significativa na freqüência cardíaca média in vivo dos animais submetidos à EDET, em relação ao grupo controle (p>0,05, Tabela 3). A aplicação de EDET também não alterou as outras variáveis, como a amplitude (mm) dos intervalos registrados no ECG (QR, QT e QTc), o intervalo PR e o eixo elétrico quando comparado ao grupo controle, conforme mostra a tabela 3.
Tabela 3. Frequência cardíaca (FC, batimentos/minuto), dos intervalos QR, QT, QTc, PR (mm) e do eixo elétrico cardíaco (graus) obtidos na avaliação eletrocardiográfica dos grupos controle e tratado com a estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET).
Grupos FC (bat/min) QR (mm) QT (mm) QTc (mm) PR (mm) Eixo (graus) Controle 381 ±11 99,2±19,2 199,2±8,03 353,4±9,7 105,3±7,4 49,9±9,3 EDET 370 ± 18 72±21,9 198±15,4 345±18,6 114±8,1 64,5±2,9 Valor da média±epm, n=6.
Dentro da análise da dinâmica cardíaca foi realizada a avaliação da sensibilidade atrial às catecolaminas, onde não foi observada diferença significativa na frequência de batimentos do átrio direito isolado (in vitro) entre os grupos controle e EDET (p>0,05; Tabela 4). Também não houve alteração na resposta máxima (p>0,05; Tabela 4) ou
na sensibilidade (p>0,05; Tabela 5, Figura 4) à noradrenalina em átrios direitos isolados de ratos submetidos à estimulação diafragmática elétrica transcutânea, quando comparado a animais do grupo controle. O mesmo foi observado quando a curva concentração-efeito à noradrenalina foi obtida em presença de inibidores dos sistemas de metabolização das catecolaminas (p>0,05; Tabela 4 e 5, Figura 4).
Tabela 4. Valores de freqüência inicial (FI, batimentos/minuto) e resposta máxima (RM, batimentos/minuto) à noradrenalina de átrios direitos isolados de ratos dos grupos controle e tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET).
Grupos Na FIb-curva1c RMb-curva1c FIb-curva2d RMb-curva2d Controle 6 287±09 120±10 262±03 145±09
EDET 6 270±05 167±16 267±07 160±15
a Nº de experimentos. b Média ± erro–padrão. c Curva realizada na ausência de inibidores dos processos de
recaptação neuronal e captação extraneuronal das catecolaminas. d Curva realizada na presença de inibidores
dos processos de metabolização das catecolaminas.
Tabela 5. Valores pD2 da noradrenalina de átrios direitos isolados dos grupos controle e tratado com
estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET).
Grupos Na pD2b-curva1c pD2b-curva2d
Controle 6 7,50±0,12 7,85±0,52 EDET 6 7,59±0,13 7,78±0,08
a Nº de experimentos. b Média ± erro–padrão. c Curva realizada na ausência de inibidores dos processos de
recaptação neuronal e captação extraneuronal das catecolaminas. d Curva realizada na presença de inibidores
Figura 4. Curvas concentração-efeito à noradrenalina, antes (A) e após (B) a inibição dos sistemas de metabolização das catecolaminas, obtidas em átrios direitos isolados de ratos controle ou submetidos à estimulação diafragmática elétrica transcutânea. n=6.
Além da análise cardíaca, houve também a hipótese de que a EDET poderia estar estimulando o nervo vago, uma vez que ele se localiza nessa região. Assim, dois órgãos, inervados por ele, foram alvos de avaliação, incluindo o pâncreas e o estômago. Com relação ao pâncreas foram realizadas duas avaliações, o efluxo de 86Rb+ e a secreção estática de insulina das ilhotas pancreáticas, e com relação ao estômago, a presença ou não de úlcera devido à secreção de ácido clorídrico pela estimulação vagal.
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 50 A log [NA] M % R es po sta M -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 50 100 controle B eletroestimulação log [NA] M % R es po sta M áx im a
É importante ressaltar que nesse ínterim, para a certificação da localização do nervo vago na região, também foi realizada a análise imunohistoquímica. Neste sentido, a figura 5 mostra a presença/localização da inervação vagal, ressaltando que este ponto anatômico encontra-se na zona de fixação e emissão de corrente pelos eletrodos.
Figura 5. Corte transversal do esôfago de rato controle correspondente à região subdiafragmática. Observa-se a presença de imunoreatividade positiva para neurofilamentos nos troncos vagais anterior (va), posterior (vp) e os demais ramos. ABC peroxidase; contra coloração com hematoxilina de Meyer (aumento 40x).
A resposta à concentração estimulatória de glicose (16,7mM) foi avaliada em ilhotas isoladas de ratos controle (aproximadamente 150 ilhotas/câmara, figura 6). Após 20 minutos iniciais de perfusão com solução de Krebs-Ringer (5,6mM) para adaptação das ilhotas ao sistema, estas foram perfundidas com glicose a 5.6mM durante mais 60 minutos (6A) sendo determinada a razão de efluxo cuja dinâmica mostra a constante média de 2,34±0,02% min-1; 2,08±0,006% min-1 e 1,83±0,01% min-1 respectivamente nas 3 fases da
perfusão (22-40o min, 42-60o min e 62-80o min). Em B, está representado o efluxo do 86Rb+, inicialmente na concentração de 5,6mM seguido da mudança para a solução perfusora contendo 16,7 mM de glicose. A razão do efluxo de 86Rb+ foi reduzida significativamente, sendo o efluxo médio na primeira fase do período 2,30±0,01% min-1 (22-40o min)seguido de
média da razão do efluxo foi 2,34±0,02% min-1, 2,08±0,006% min-1 e 1,83±0,01% min-1
respectivamentenas 3 fases da perfusão (22-40o min, 42-60o min e 62-80o min). Em B, pode-se verificar que o efluxo na primeira fase da perfusão foi de 2,30±0,01%min-1 e quando a
carbamilcolina (100µM) foi adicionada ao meio perfusor (40-60o min) provocou uma elevação de
27% no efluxo fracional até a acrofase do platô em 2,90±0,03% min-1 permanecendo até o final
do período. Após o retorno à condição inicial, a razão de efluxo declinou a valores próximos da condição inicial (média de 2,21±0,06% min-1).
Na fase experimental seguinte, foi avaliado o efluxo do 86Rb realizado em ilhotas de Langerhans isoladas de ratos submetidos a 7 sessões de estimulação diafragmática elétrica transcutânea. A figura 8A mostra a dinâmica de efluxo na presença Krebs-Ringer contendo glicose 5,6mM (A) sendo determinada a constância da razão de efluxo média de 2,29·0,01% min-1; 2,17±0,01% min-1 e 2,02±0,0% min-1 respectivamentenas 3 fases da perfusão
(22-40o min, 42-60o min e 62-80o min). A figura 8B representa o efluxo do 86Rb+ inicialmente na concentração de 5,6mM seguido da mudança para 16,7 mM de glicose e nota-se que a razão do efluxo de 86Rb+ foi reduzida em 16% sendo o efluxo médio na primeira fase do período 2,33±0,03% min-1 (22-40o min)seguido de uma redução em relação ao período anterior
quando o efluxo atingiu na acrofase do plâto 1,95±0,07% min-1 (42-60o min). O retorno à
solução perfusora com 5,6mM de glicose provocou o retorno da razão do efluxo até 2,17±0,07% min-1 (62-80o min).
A figura 9 se refere ao efluxo de ilhotas de Langerhans isoladas de ratos submetidos a 7 sessões de estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET) e mostra em A o efluxo fracional do radioisótopo em ilhotas perfundidas durante 80 minutos com glicose 5,6mM na solução de Krebs-Ringer, sendo que neste a média da razão do efluxo foi 2,29±0,01% min-1; 2,17±0,01% min-1 e 2,02±0,02% min-1 respectivamentenas 3 fases da perfusão (22-40o
min, 42-60o min e 62-80o min). Em B, pode-se observar a mudança na condição experimental onde o efluxo dos 22-40o minuto manteve a média de 2,34±0,01% min-1, no entanto, quando a
carbamilcolina (100µM) foi adicionada ao meio de perfusão (40-60o min) provocou uma elevação
período. Após o retorno à condição inicial a razão de efluxo declinou de forma lenta e constante a valores similares à condição inicial (média de 2,30±0,1% min-1).
Após a verificação das alterações na sensibilidade das células β pancreáticas foi avaliada a concentração plasmática de glicose dos animais, sendo que os valores observados no grupo submetido à EDET não diferenciou do controle (Controle: 91,28±5,9mg/dL x EDET: 83,43±2,7mg/dL). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78 Tempo (min) 86 R b ( % /m in ) 16,7mM
Figura 6. Efeito da glicose sobre a dinâmica do efluxo de 86Rb+ em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos do grupo
controle. Na linha A pode-se verificar a dinâmica do efluxo do 86Rb de ilhotas perfundidas com solução de Krebs -
bicarbonato (5,6mM) durante 80 minutos. Em B, as linhas verticais interrompidas (42-60o min) indicam o momento
de introdução e retirada da glicose 16,7mM. Cada ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas.
A B
0 0,5 1 1,5 2 2,5 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78 Tempo (min) 86 Rb (% /m
Figura 7. Efeito da carbamilcolina (100µM) sobre a razão do efluxo de 86Rb+ em ilhotas pancreáticas isoladas de
ratos do grupo controle. A linha A mostra o efluxo de ilhotas perfundidas por solução de Krebs - bicarbonato contendo 5,6mM de glicose, durante todo o período. Na figura B, as linhas interrompidas (42-60o min) indicam o
momento de introdução e de retirada da carbamilcolina. Cada ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78 Tempo (min) 86 R b (% /m in ) 16,7mM EDET
Figura 8. Efeito da glicose sobre a dinâmica do efluxo de 86Rb+ em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos submetidos
à estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET). Na linha A de efluxo pode-se verificar a dinâmica do efluxo do 86Rb de ilhotas perfundidas com solução de Krebs - bicarbonato (5,6mM) durante 80 minutos. Em B (42-
60o min), as linhas verticais interrompidas indicam o momento de introdução e retirada da glicose 16,7mM. Cada ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas.
A B A B
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78 Tempo (min) 86 R b ( % /min ) Cch EDET
Figura 9. Efeito da carbamilcolina (100µM) sobre a razão do efluxo de 86Rb+ em ilhotas pancreáticas isoladas de
ratos submetidos à estimulação diafragmática elétrica transcutânea. A linha A mostra o efluxo de ilhotas perfundidas por solução de Krebs - bicarbonato contendo 5,6mM de glicose, durante todo o período de perfusão. Na figura B, as linhas interrompidas (42-60o min) indicam o momento de introdução e de retirada da carbamilcolina. Cada ponto
representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas.
Outra análise direcionada à função pancreática foi a secreção estática de insulina, onde foram avaliados os grupos controle, tratado com EDET e também um grupo que foi avaliado após 7 dias da última sessão de EDET, para observar se o comprometimento na secreção era persistido mesmo após a retirada da correntes em sessões diárias. Os resultados mostraram que o grupo tratado com EDET 7 dias apresentou um aumento de 323% na secreção de insulina quando suas ilhotas foram submetidas à baixa concentração de glicose (2,8mM) com relação ao controle, além de diminuição de 63,2% na maior concentração (16,7mM) (figura 10). Com relação ao grupo tratado associado com o período de recuperação, o aumento na secreção hormonal foi observado nas concentrações 5,6mM (162,5%) e 8,3mM (575%), e a diminuição persistiu na concentração de 16,7mM (72,6%), conforme mostra a figura 11.
A B
0 2 4 6 8 10 12 * 16,7mM 8,3mM 5,6mM 2,8 mM *
Figura 10. Média±epm da concentração de insulina (ng/ilhota/hora) nas concentrações 2,8; 5,6; 8,3 e 16,7mM de glicose dos grupos controle (branco) e tratado com EDET durante 7 dias (preto). n=6, p<0,05, * comparado ao controle. 0 1 2 3 4 5 16,7mM 8,3mM 5,6mM 2,8mM * * *
Figura 11. Média±epm da concentração de insulina (ng/ilhota/hora) nas concentrações 2,8; 5,6; 8,3 e 16,7mM de glicose dos grupos controle (branco) e tratado com EDET durante 7 dias seguido de 7 dias sem tratamento (preto). n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
Mesmo havendo alteração na função pancreática devido à presença da corrente elétrica no tórax e uma possível ativação vagal, não foi observada presença de úlcera nos estômagos dos animais que receberam as sessões de EDET.
Uma vez que a estimulação elétrica promove contração muscular, é sugestivo o fato de a terapia estar alterando o perfil bioquímico durante a aplicação do estímulo. Frente ao exposto, foi avaliada a concentração plasmática de glicose, lactato e insulina durante a sessão da estimulação diafragmática elétrica transcutânea, além de avaliar o comportamento da concentração de ácido ascórbico e colesterol da glândula supra-renal e o conteúdo de glicogênio dos músculos respiratórios de ratos, em um período logo após a sessão.
Durante a sessão de EDET foi observada uma redução inicial na concentração de insulina plasmática e uma elevação no tempo 20o, sendo que os valores (média±dpm, ng/mL) foram, respectivamente, nos tempos 0, 5, 10, 15 e 20: 1,72±0,23; 1,18±0,37; 0,86±0,18; 0,92±0,56 e 1,54±0,42. Após a finalização da sessão, a insulina continuou a se elevar, atingindo o pico no tempo 35o, sendo os valores (média±dpm, ng/mL): 2,54±0,32; 2,71±1,02; 3,12±0,17; 2,68±1,57, respectivamente, nos tempos 25, 30, 35, 40 (figura 12).
Com relação à glicemia (mmol/L) houve um aumento progressivo durante a EDET perdurando no período pós-sessão, porém esse aumento se manteve em concentrações de normalidade, não promovendo hiperglicemia. A lactacidemia (mmol/L) também apresentou aumento progressivo durante a estimulação elétrica, porém, no tempo 25o atingiu o pico (8,27±0,47) e retornou aos níveis de normalidade no tempo 40o (figura 13).
No grupo controle, o qual não recebeu a estimulação elétrica, não houve alteração nas concentrações plasmáticas de glicose (5,22±1,17mmol/L) lactacidemia (4,52±0,31mmol/L) e insulinemia (4,52±0,31ng/mL) durante esse mesmo período, mantendo concentrações normais, e assim, não estão representadas nas figuras.
Findada a análise durante o período de estimulação elétrica nesse grupo que recebeu uma sessão, foram coletadas as glândulas adrenais para analisar a concentração de ácido ascórbico (µg/mg), a qual não se alterou em relação ao grupo controle (Controle: 6,35±0,27; EDET: 7,00±0,58), por outro lado, a concentração de colesterol (mg/dL) foi menor (42,57% , p<0,05) na presença do recurso (Controle: 108,45±14,95 x EDET: 62,28±14,96).
A concentração de glicogênio (mg/100mg) dos músculos respiratórios após a sessão, foi maior em 66,67% (p<0,05) no diafragma (média±epm, Controle: 0,21±0,01 x EDET: 0,35±0,04) e em 136,36% no abdominal (Controle: 0,22±0,01 x EDET: 0,52±0,07) e
0 10 20 30 40 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Insul ina plasm á tic a (ng/m L ) Tempo (minuto)
Figura 12. Comportamento da concentração de insulina plasmática (ng/mL; média) durante a sessão de estimulação elétrica (20 minutos, tempos 0 a 20) nos tempos (minutos) 25, 30, 35 e 40 (após a sessão).
0 10 20 30 40 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 mm ol /L Tempo (minutos) Glicemia Lactacidemia
Figura 13. Comportamento da concentração de glicemia e lactacidemia (mmol/L; média) durante a sessão de estimulação elétrica (20 minutos, tempos 0 a 20) nos tempos (minutos) 25, 30, 35 e 40 (após a sessão).
5.2. Tratamento com bleomicina e a associação com a EDET
Conforme exposto anteriormente, a sequência dos resultados está direcionada ao efeito do tratamento com bleomicina, não somente no tecido-alvo da indução da fibrose pulmonar, mas também em tecidos musculares, especificamente, nos músculos respiratórios, além de outros sistemas que poderiam estar sendo influenciados pelo tratamento quimioterapêutico, destacando a avaliação de enzimas plasmáticas, perfil hematológico e funcionalidade pancreática.
Com relação à análise morfométrica do tecido pulmonar, o tratamento com bleomicina promoveu alteração significativa (p<0,05) caracterizada pela redução de 43,2% na densidade da área alveolar quando comparado ao grupo controle (figura 14).
Figura 14. Alvéolos e sacos alveolares dos pulmões dos grupos controle (A) e tratado com bleomicina (B). Em B, no tecido intersticial, entre duas camadas de células epiteliais alveolares, o septo alveolar é maior e a área alveolar é menor (100x, HE).
Após a verificação da alteração no tecido pulmonar pelo tratamento com o quimioterápico, foi avaliado o conteúdo de TBARS nos músculos respiratórios, sendo que houve aumento significativo (p>0,05) em dois músculos do grupo tratado com bleomicina, representado por 73% no peitoral e por 88% no abdominal. Foi avaliado também o conteúdo de TBARS plasmático, havendo aumento de 56,7%, conforme pode ser observado na tabela 6.
Intercostal 43,95±3,62 40,52±2,82
Peitoral 23,44±2,54 40,55±2,56*
Abdominal 19,57±1,65 36,78±2,25*
Plasma 46,52±3,29 72,90±3,46* Valor da média±epm, n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
Com relação à concentração plasmática de glicose, uréia, creatinina e fosfatase alcalina não houve diferença significativa quando o grupo tratado com bleomicina foi comparado ao controle. Porém, houve aumento de 391,4% tanto na lactacidemia quanto nas enzimas aspartato aminotransferase (45,3%) e alanina aminotransferase (37,3%), conforme mostra a tabela 7. Com relação aos ácidos graxos livres (AGL), houve também alteração no grupo tratado com bleomicina, representado por aumento de 180,4% (tabela 7).
Tabela 7. Concentração plasmática de glicose (mg/dL), lactato (mmol/L), uréia (mg/dL), creatinina (mg/dL), fosfatase alcalina (U/L), aspartato aminotransferase (AST, U/mL), alanina aminotransferase (ALT, U/mL), ácidos graxos livre (AGL, mmol/L) dos grupos controle e tratado com bleomicina.
Controle Bleomicina
Glicose (mg/dL) 93,7±2,12 87,57±7,51
Lactato (mmol/L) 1,97±0,08 9,68±2,35*
Uréia (mg/dL) 26,3±1,42 29,1±2,19
Creatinina (mg/dL) 0,61±0,04 0,71±0,04
Fosfatase Alcalina (U/L) 91,6±8,12 86,6±10,25
AST (U/mL) 63,5±5,24 92,3±1,83 *
ALT (U/mL) 24,1±1,83 33,1±1,19 *
AGL (mmol/L) 0,46 ± 0,02 1,29±0,28*
Outra avaliação realizada foi a do perfil hematológico, sendo que houve utilização de parâmetros considerados normais para ratos, conforme está presente na literatura científica. Sendo assim Baker, Russell e Steven (1979), consideram os seguintes valores normais: Eritrometria: 6 a 9,7 x106; Hemoglobina: 11,4 a 19,2 g/dL; Hematócrito: 40,5 a 53,9%. Já no Canadian Council on Animal Care, os valores considerados são: Eritrometria: 6 a 10 x106; Hemoglobina: 11 a 17 g/dL; Hematócrito: 40 a 50%.
Sendo assim, conforme mostra a tabela 8, o grupo bleomicina apresentou valores normais na eritrometria, porém reduzidos nos valores de hematócrito e na concentração de hemoglobina quando comparado aos valores considerados normais, além da comparação com o grupo controle.
Tabela 8. Perfil hematológico do grupo controle e tratado com bleomicina, constando-se de eritrometria (células/mm3), hematócrito (%), hemoglobina (g/dL).
Eritrometria Hematócrito Hemoglobina
Controle 6,7±0,5 x106 47,7±1,9 14,8±0,42
Bleomicina 6,06±0,19 x106 36±1* 10,33±0,58*
Valor da média±epm, n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
Com relação à série branca das células sanguíneas, foram avaliados alguns parâmetros, incluindo a leucometria, os linfócitos do timo, os linfócitos dos linfonodos mesentéricos e os macrófagos torácicos, sendo observado redução significativa (p<0,05) nos linfonodos mesentéricos e aumento (p<0,05) nos macrófagos torácicos no grupo tratado com bleomicina quando comparado ao controle (tabela 9).
Tabela 9. Leucometria, linfócitos do timo, linfócitos dos linfonodos mesentéricos e macrófagos torácicos (células/mm3 , x106) dos grupos controle e bleomicina.
Controle Bleomicina
Leucometria 6,34±0,36 7,01±0,38
Linfócitos do timo 459,5±42,5 412,5±34,8
Linfócitos dos linfonodos mesentéricos 158,62±4,02 107,75±10,1*
Macrófagos torácicos 5,31±0,72 9,00±0,60*
3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 0 20 40 60 80 100 Hem ó lise (%) Concentração NaCl (g/L) CONTROLE BLEOMICINA
Figura 15. Teste de fragilidade osmótica dos grupos controle e tratado com bleomicina (n=6).
Direcionando à avaliação ao pâncreas, foi realizado o teste de tolerância à glicose (GTT), sendo que a variável analisada foi a área sob a curva, a qual foi formada pela variação na concentração glicêmica (mg/dL), nos tempos, em minutos, 0 (momento da aplicação da glicose), 5, 10, 15, 20, 30 e 60 (após a aplicação da glicose). O grupo tratado com bleomicina mostrou uma área estatisticamente maior (17.306±539, p<0,05) do que o grupo controle (9.151±517), conforme mostra a figura 16.
0 10 20 30 40 50 60 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 G licem ia (m g/ dL) - G T T Tempo (minutos) CONTROLE BLEOMICINA
Figura 16. Teste de tolerância à glicose (GTT) aplicado nos grupos controle e tratado com bleomicina, analisando a glicemia (mg/dL) nos tempos (em minutos) 0, 5, 10, 15, 20, 30 e 60, após a sobrecarga da glicose. n=6, p<0,05, sendo que o grupo tratado se apresentou diferente estatisticamente do controle.
Uma vez que a resposta da célula β à sobrecarga de glicose mostrou-se alterada, optou-se por realizar um teste de tolerância à insulina (ITT) para avaliar a sensibilidade tecidual.
O ITT está representado pela porcentagem de decaimento da glicemia (Kitt) na presença da insulina, sendo analisados os tempos, em minutos, 0 (seguido da aplicação da insulina); 2,5; 5; 10 e 20 (após a aplicação da insulina). A figura 17 mostra que o grupo tratado teve um maior valor (média±epm, 8,08±0,56%, p<0,05) na porcentagem de decaimento da glicemia, quando comparado ao controle (3,87±1,14%). Isso mostra que a bleomicina alterou a sensibilidade à insulina, pois a velocidade de redução da glicemia se apresentou maior.
0 5 10 15 20 10 20 30 40 50 60 G licem ia (m g/dL) - IT Tempo (minutos)
Figura 17. Teste de tolerância à insulina (ITT) aplicado nos grupos controle e tratado com bleomicina, analisando a glicemia (mg/dL) nos tempos (em minutos) 0; 2,5; 5; 10 e 20, após a aplicação da insulina. n=6, p<0,05, sendo que o grupo tratado se apresentou diferente estatisticamente do controle.
Uma vez que houve alteração na funcionalidade pancreática, observada no GTT, o estudo foi direcionado a uma avaliação especificamente das ilhotas pancreáticas, realizando assim, o teste de secreção estática de insulina e pôde-se observar que houve redução significativa (p<0,05) na secreção de insulina nas três concentrações de glicose