EFEITO DA SINVASTATINA EM ARCABOUÇO DE PLGA PARA REGENERAÇÃO ÓSSEA: ESTUDO IN VITRO E IN VIVO
Dario M. Júnior², Juliana A. Domingues³, Moema A. Hausen4, Águedo Aragones¹, Silvia M. M. Cattani², Maria L. P. Barbo², Eliana A. R. Duek²*
1 – Departamento de Engenharia Mecânica – UFSC, Florianópolis/SC
2 – Departamento de Ciências Fisiológicas – PUC-SP, Sorocaba/SP, * Rua Joubert Wey, 290, Boa Vista – CEP: 18030-070 Sorocaba/SP – horário de funcionamento:
9:00h às 17:00h. E-mail: eliduek@pucsp.br
3 – Instituto de Biologia – Unicamp, Campinas/SP
4 – Laboratório de Biologia Estrutural – UFSCar, Sorocaba/SP
Resumo: Atualmente, o uso de poli(L-ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA), como substituto ao enxerto ósseo, está aumentando. Ele pode ser utilizado como carreador de fármacos osteoindutores, como a sinvastatina (SIN), e de células-tronco mesenquimais (CTMs), que podem se diferenciar em outras células, como os osteoblastos. Esse estudo procurou avaliar o efeito do arcabouço de PLGA com SIN no comportamento das CTMs in vitro e na regeneração de defeito ósseo confeccionado na calvária de ratos. Para isso, foram utilizados 14 animais que foram divididos em 3 grupos: controle (defeito vazio), PLGA e PLGA/SIN. Os animais foram sacrificados após 8 semanas. A análise da citocompatibilidade das CTMs nos arcabouços foi realizada pela Microscopia Confocal a Laser. Essa análise demonstrou que o PLGA/SIN foi tóxico para as CTMs, enquanto que o PLGA promoveu o crescimento das CTMs. Porém, na análise in vivo, o PLGA/SIN estimulou o crescimento ósseo, o que não foi observado no PLGA.
Palavras-chave: Células-tronco mesenquimais, Regeneração óssea, PLGA, Sinvastatina.
EFFECT OF SIMVASTATIN ON SCAFFOLD OF PLGA FOR REGENERATION BONE : STUDY IN VITRO AND IN VIVO
Abstract: The use of poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), as a substitute for bone graft is recently increasing. It can be used as a carrier for osteoinductive drugs, such as simvastatin (SIM), and mesenchymal stem cells (MSCs), which can differentiate into other cells, such as osteoblasts. This study evaluated the effect of PLGA scaffold with SIM in the behavior of MSCs in vitro and in vivo at critical defects in rat calvaria. Thus, 14 animals were used which were divided into 3 groups: control (empty defect), PLGA and PLGA/SIM, and sacrificed in 8 weeks after implants . Analysis of the cytocompatibility of MSCs in the scaffolds was conducted by Confocal Laser Microscopy. This analysis demonstrated that the PLGA/SIM was toxic to the MSCs, while PLGA promoted the growth of MSCs. However, in vivo analysis, the PLGA/SIM stimulated bone growth, which was not observed in the same range when pure PLGA was implanted.
Keywords: Mesenchymal stem-cell, Regeneration bone, PLGA, Simvastatin. INTRODUÇÃO
Os defeitos ósseos causados, principalmente, por doenças congênitas, cânceres e traumas estão cada vez mais comuns na prática médica. Consequentemente, o número de procedimentos cirúrgicos para correção desses defeitos tem aumentado (1). Assim, o desenvolvimento de técnicas que facilitem a regeneração óssea está se tornando foco de pesquisas recentes. Dentre as principais técnicas, o enxerto autógeno, o enxerto alógeno e o implante de biomateriais são as mais importantes, sendo que esta última parece ser mais promissora que as demais, devido à boa aceitação do material pelo receptor (1).
Os biomateriais mais usados nesses procedimentos cirúrgicos são os arcabouços poliméricos que conseguem mimetizar a bioengenharia dos tecidos vivos, além de promoverem a reconstituição deles (2,3).
Uma classe de polímeros biodegradáveis e bioreabsorvíveis é a dos poliésteres alifáticos, representados pelos poli(a-hidróxi ácido). Um dos principais poli(a-hidróxi ácido) é o poli(L-ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA). Ele é amorfo e,
facilmente, degradado por fluidos aquosos corporais, originando produtos na forma de monômeros solúveis e atóxicos (4).
A aplicação de fármacos com propriedades osteogênicas melhora o sucesso do implante de biomateriais, pois a degradação do arcabouço polimérico permite que o fármaco seja liberado na circulação periférica do implante de forma lenta e gradual, diminuindo a chance de toxicidade farmacológica ao paciente (5,6).
O grupo das drogas estatinas é corriqueiramente associado à interferência no metabolismo do colesterol. Tais drogas inibem a enzima 3-hidróxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA), havendo quebra de outras cadeias metabólicas mevalonato-dependentes, e, por sua vez, redução da síntese de colesterol. Entretanto, estudos recentes evidenciam a característica pleiotrópica da sinvastatina (SIN): a osteogênese. Além da capacidade de estimular a diferenciação de osteoblastos e de inibir a diferenciação de osteoclastos, a SIN pode aumentar a expressão da proteína morfogenética óssea-2 (BMP-2) (6).
O uso de células-tronco mesenquimais (CTMs) associadas a polímeros biodegradáveis e biorreabsorvíveis, como o PLGA, é um recurso promissor para a engenharia de tecidos. Estudos demonstram que CTMs provenientes da medula óssea, são capazes de se diferenciarem em osteoblastos e promover a formação de tecido ósseo (7,8,9). Além disso, fatores biomoleculares adicionais são também secretados e regulados por parte das CTMs, que garantem uma ação anti-inflamatória e imunomoduladora(10).
MATERIAIS E MÉTODOS
Soluções de PLGA 80/20 foram preparadas, via polimerização em massa, através da adição, em uma ampola de vidro, do diéster cíclico do L-ácido lático (Sigma-Aldrich) e do diéster cíclico do ácido glicólico (Sigma-Aldrich), na relação 80/20, respectivamente, juntamente com o catalisador Sn(Oct)2 (Sigma). A solução foi congelada em N2 líquido, a seguir, foi feito vácuo na ampola, a qual foi selada e imersa em banho de óleo a 110°C por uma semana. Depois dessa etapa, o copolímero foi dissolvido em clorofórmio (CHCl3) (Merck), precipitado em metanol (CH3OH) (Merck) e seco em uma estufa a vácuo a 60°C por 8h (11).
Para obtenção dos arcabouços, o PLGA foi dissolvido em clorofórmio (10% m/v), contendo sacarose (Synth) (75% m/v) com granulometria entre 200 a 500 µm. Para os materiais contendo SIN (Merck), essa foi adicionada a solução numa concentração final de 2 % (W/W). A solução foi vertida em placa de Petri para evaporação do solvente. Antes do uso, os arcabouços foram lavados em solução de PVA 1% (Poli Álcool Vinílico) e secos a temperatura ambiente.
CULTIVO DE CÉLULAS MESENQUIMAIS-ESTUDO in vitro
As CTMs foram obtidas da medula óssea dos fêmures e tíbias de ratos Wistar de 2 meses de idade. As células mononucleares foram suspensas em Tampão Fosfato-Salino (PBS) e centrifugadas a 2.000 rpm durante 10 minutos. Para separação por gradiente de densidade, o halo foi ressuspendido em soro fisiológico e transferido para outro tubo contendo Ficoll-Paque (densidade 1.077 g/mL) na diluição Ficoll:Células de 1:1, o qual foi centrifugado a 2.000 rpm durante 20 minutos à temperatura ambiente. O anel de células na interface Ficoll-células foi coletado e ressuspendido em PBS respeitando a diluição Células:PBS de 1:2. O procedimento foi centrifugado novamente por 3 vezes a 2.000 rpm durante 10 minutos. O pellet foi ressuspendido em 1 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 0,2M de L-glutamina, suplementado com 20% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab®), 50 µg/mL de gentamicina e 2,5 µg/mL de anfotericina-B. As células foram cultivadas em frascos de poliestireno T-25 cm3 (Corning®), mantidas em estufa a 37o C, 5% de CO2 e umidade de 95%.
A caracterização das CTMs foi realizada através de ensaios para a diferenciação celular osteogênica e adipogênica com o uso de meios indutores. A
diferenciação das CTMs em osteoblastos foi detectada pela observação de depósitos de cálcio nas culturas, através da coloração com Alizarin Red S (Sigma®), enquanto que a diferenciação das CTMs em adipócitos jovens foi detectada pela observação de gotículas de gordura nas culturas com o corante Oil Red O.
Para realização do cultivo celular, os arcabouços cilíndricos foram cortados em pequenos discos com cerca de 8mm de diâmetro e 1 mm de altura. Estes discos foram imersos em solução de etanol 70 % por 1 h e lavados em PBS. Em seguida, as células osteoblásticas primárias foram desprendidas dos frascos de cultivo-T25 usando solução tripsina/ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e, então, semeadas em uma concentração celular de 5x104 cél/mL, sendo mantidas em DMEM com 10 % SFB. As células foram cultivadas sobre os arcabouços durante o período de 14 dias.
O ensaio de viabilidade celular foi realizada por contagem de núcleos de células após 1, 7 e 14 dias de cultivo. Para isso, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e os núcleos corados com DAPI. As imagens foram analisadas por microscopia confocal de varredura a laser (LSCM - Leica TCS SP8, Alemanha). Para contar todas as células presentes nos arcabouços, foi realizada a reconstrução da imagem em 3D. A profundidade máxima em que as células estavam presentes foi de 400 µm.
Procedimento Cirúrgico
Foram utilizados 21 ratos Wistar, somente do sexo masculino, com idade aproximada de 2 meses e pesando entre 250 e 300 g. Os animais foram obtidos após aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde da Pontifícia Universidade Católica de São Paulo (CEUA/FCMS PUC-SP) no protocolo 2014/37.
Os ratos foram divididos quanto ao tipo de implante:
• Controle : Defeito no tamanho crítico de 8mm ausente de material.
• Defeito com PLGA: Defeito no tamanho crítico de 8 mm preenchido com o implante de PLGA.
• Defeito com PLGA/SIN: Defeito no tamanho crítico de 8 mm preenchido com o implante de PLGA/SIN.
Para cada tratamento, foi realizado um defeito no tamanho crítico de 8 mm de diâmetro na porção central da calota craniana. Os ratos foram submetidos à anestesia geral administrada via intramuscular com uma solução de cloridrato de cetamina 10 % (40 mg/kg) mais cloridrato de xilazina 2 % (5 mg/kg). Após a anestesia geral, foi realizada a tricotomia da parte dorsal do crânio do rato seguida de antissepsia com solução de iodo-polvedine na região do ferimento. Uma incisão de aproximadamente 30 mm foi feita no escalpe do animal, seguindo o trajeto da sutura coronal. A musculatura e o periósteo foram descolados e rebatidos. Um defeito ósseo no tamanho crítico central (12) foi realizado com o auxílio de uma broca trefina com 8 mm de diâmetro, montada em motor odontológico de baixa rotação elétrico (Beltec®), em irrigação constante com solução fisiológica estéril, a fim de evitar superaquecimento das bordas do defeito.
Após o período de implantação de 8 semanas, os ratos foram sacrificados por overdose de halotano. As calotas cranianas contendo a região do implante foram retiradas e, imediatamente, colocadas em solução fixadora de Formol 10% por um período de 24 horas. Em seguida, as amostras foram descalcificadas em EDTA. As amostras foram processadas para histologia convencional e coradas com H&E. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ensaio de diferenciação celular
O ensaio de diferenciação celular apresentou, como resultados, a diferenciação das CTMs em adipócitos (Fig. 1B) e em osteoblasto (Fig. 1D) após 14 dias de cultivo na presença de meio indutor específico. Esta é uma maneira de caracterizar as CTMs , pois se sabe que elas são capazes de se diferenciar em adipócitos e osteócitos quando sujeitas a fatores de diferenciação específicos (14).
Fig. 1 - Caracterização das CTMs isoladas da medula óssea de ratos Wistar. (A e C) experimento controle, as células cresceram em DMEM com 10 % de SFB. (B) capacidade das CTMs para se diferenciarem em adipócitos, após o crescimento em meio indutor. (A e B) coloração com Oil Red. (D) capacidade das CTMs para se diferenciarem em osteoblastos, após o crescimento em meio indutor osteogênico. ( C e D ) coloração com Alizarin Red.
Avaliação da citocompatibilidade das CTMs nos arcabouços
A avaliação da citocompatibilidade das CTMs nos arcabouços, mostrou que, nas mesmas condições ambientais, no primeiro dia, tanto os arcabouços de PLGA puro, quanto os arcabouços de PLGA/SIN permitiram a adesão das CTMs (Fig. 2 A e B). Após 14 dias, nas mesmas condições ambientais, nos arcabouços de PLGA/SIN, houve morte de todas as células (Fig. 2D), enquanto nos arcabouços de PLGA puro, houve um aumento na população celular (Fig. 2C).
A B
Fig. 2 – Imagens de microscopia Confocal dos núcleos das CTMs marcados em azul com DAPI. (A) arcabouço de PLGA puro e, (B) no arcabouço de PLGA/SIN, após 1 dia de cultivo. (C) arcabouço de PLGA puro e, (D) no arcabouço de PLGA/SIN, após 14 dias de cultivo. A marcação azul em (D) evidencia o contorno do arcabouço que apresenta autofluorescência devido à incorporação da sinvastatina, o qual neste grupo em 14 dias não apresentou células identificáveis pelo DAPI.
Acredita-se que a morte celular evidenciada no arcabouço PLGA/SIN, seja devido ao aumento na concentração de SIN que, por não ter onde espalhar-se no sistema in vitro, concentrou-se no arcabouço de PLGA, tornando-se tóxica para as CTMs. Foi demonstrado que a SIN reduz a viabilidade das CTMs através da exaustão de mevalonato e fator nuclear kappa B (NF-kB), fatores cruciais para o crescimento e diferenciação celular (15).
Cirurgias
Estudos indicam que a utilização de polímeros absorvíveis é de extrema vantagem em relação a procedimentos cirúrgicos tradicionais. Não só estes materiais evitam uma segunda intervenção para retirada do mesmo, como também se diminuem os riscos de corrosão e atrito com o osso (16). Seguindo esta linha de pesquisa, os implantes com o polímero biorreabsorvível PLGA ocorreram da maneira prevista no projeto, demonstrando aplicação viável e eficaz. Realizou-se uma incisão seguida de um defeito ósseo de tamanho crítico de 8 mm na calota craniana e implantou-se o material de mesmo tamanho. Após o implante, a pele do rato foi unida e suturada com a técnica de ponto em U.
O acompanhamento pós-operatório dos ratos indicou, no geral, boa recuperação no período que procede a cirurgia. Os animais apresentaram cicatrização adequada, tornando-se indistinguíveis com relação àqueles que não
foram submetidos ao implante. O retorno do movimento e agilidade dos animais ocorreu no período de no máximo 72 horas.
Avaliação histológica
Na análise histológica, realizada após 8 semanas de implante, foi observado formação de osso novo em todos os grupos. Foram realizados cortes longitudinais do centro do defeito, sendo corados com H&E (Fig. 3). A análise histológica dos cortes mostraram que, tanto no grupo controle, quanto, no grupo PLGA puro, houve pouca formação de osso novo localizado na borda da lesão e com a presença de poucas células osteoprogenitoras, enquanto que, no grupo PLGA/SIN, houve maior formação de osso novo, tanto nas bordas da lesão, quanto em outras regiões da calota, além de apresentar muitas células osteoprogenitoras locais, sendo indicativo de osteoindução.
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Fig. 3 – Imagens dos cortes histológicos obtidos de cada grupo. (A) Imagem da borda do defeito do grupo controle. (B) Imagem panorâmica do defeito do grupo PLGA puro. (C) Imagem panorâmica do defeito do grupo PLGA/SIN.
Conclusão
Após a análise dos resultados, conclui-se que os arcabouços de PLGA/SIN tornam-se tóxico para as células-tronco em ambientes estáticos in vitro, pois SIN, não tendo como se espalhar, concentra-se no local e promove morte celular. No entanto, o estudo in vivo mostrou que o grupo de PLGA/SIN formou mais osso novo do que os grupos controle e PLGA puro, evidenciando que a SIN tem propriedades osteoindutoras.
A B
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