Efeito de diferentes glicosaminoglicanos no tempo de trombose arterial e re-endotelização da artéria carótida de camundongos após lesão induzida por cloreto férrico

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

ANDRESSA RAYSA DA COSTA E SILVA

EFEITO DE DIFERENTES GLICOSAMINOGLICANOS NO TEMPO DE TROMBOSE ARTERIAL E RE-ENDOTELIZAÇÃO DA ARTÉRIA CARÓTIDA

DE CAMUNDONGOS APÓS LESÃO INDUZIDA POR CLORETO FERRICO

CAMPINAS

ANDRESSA RAYSA DA COSTA E SILVA

EFEITO DE DIFERENTES GLICOSAMINOGLICANOS NO TEMPO DE TROMBOSE ARTERIAL E RE-ENDOTELIZAÇÃO DA ARTÉRIA CARÓTIDA

DE CAMUNDONGOS APÓS LESÃO INDUZIDA POR CLORETO FERRICO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural, na Área de BIOLOGIA CELULAR

Orientadora: Profa_{. Dr}a_{. CRISTINA PONTES VICENTE}

Este arquivo digital corresponde à versão final da Dissertação defendida pela candidata Andressa Raysa da Costa e Silva e orientada pela profa_{. Dr}a_{. Cristina Pontes}

BANCA EXAMINADORA

Dra. Cristina Pontes Vicente (Orientadora)

Dra. Joyce Maria Annichino Bizzacchi

Dra. Nicola Amanda Conran Zorzetto

Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no

processo de vida acadêmica do aluno.

Agradecimentos

Agradeço primeiramente ao meu Deus todo poderoso, que sempre está comigo e me dá forças quando tudo parece contrário e me encoraja a seguir em frente.

Agradeço indiscutivelmente à minha orientadora Cris, por ter me dado uma oportunidade tão incrível na minha vida, por ter confiado em mim desde a primeira vez que entrei em sua sala para uma entrevista. Obrigada pelos seus ensinamentos, sua paciência, seus conselhos e seu cuidado, jamais esquecerei o que você representa para mim, todo meu crescimento pessoal e profissional durante esses dois anos eu devo muito a você.

Agradeço à minha mãe, pai e irmã por sempre torcerem por mim mesmo de longe com o coração apertado, por sempre me amar e nunca me deixar desistir, eu amo vocês! A minha vozinha, que sempre quando me vê se emociona de saudade e sempre me diz palavras de encorajamento por quê sabe o quão difícil é...., às minhas tias e primas, cada uma com sua personalidade fazem dessa família “muito unida e muito ouriçada!”, eu amo vocês! Agradeço ao meu amado Almir Neto por acreditar em mim e me encorajar, mesmo quando eu dizia que não era capaz, obrigada por me ensinar a ser persistente, hoje eu vejo que posso chegar onde eu quero com muita luta e garra! Admiro sua confiança, sua garra e sua paciência e me espelho muito em você, te amo!

Obrigada aos amigos de laboratório Maiara, Carol, Micheli, Luiz, Michel, vou sentir falta das nossas inúmeras reuniões e das nossas gargalhadas, cada um tem um cantinho guardado aqui no meu coração! Júlia, por algum motivo bom você entrou na minha vida e vai ficar para sempre! Agradeço à Deus por essa amizade que me fez tão feliz, amo você! Toni, obrigada pela excelente pessoa e profissional que és, vou sentir falta das conversas, das belíssimas fotos e dos conselhos!

Ao professor Claudio, pela ajuda e suporte quando necessário, a Camila, pela pronta ajuda, conselhos, pelos brigadeiros e bolos que me fizeram extremamente feliz, pelo seu carinho! Ao neto, pela alegria cotidiana contagiante, pelo suporte durante a realização do trabalho.

À Giane, professor Edson, Juliano e Júlio meu sincero obrigada pelos conselhos, avaliações e observações.

À professora Joyce, Nicola e Fernanda Bassora por terem aceito simpaticamente o convite de participação na banca de defesa.

Aos meus amigos de Manaus, Camila, Duda, Amanda e Fabrício, pelo apoio incondicional e pela amizade! À Dona Solange pelo suporte, amor, conselhos e alegria. À professora Ana Frazão, um anjo que a graduação me presenteou, tinha paixão pelo que fazia, jamais esquecerei seus ensinamentos!

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES/Proex pelo suporte financeiro,

Meu muito obrigada a todos que fizeram parte dessa caminhada árdua, meu coração se enche de alegria pelas conquistas logradas pois “por mais longa que seja a caminhada, o mais importante é dar o primeiro passo” (Vinícius de Moraes).

RESUMO

A trombose arterial é uma doença na qual ocorre interrupção do fluxo sanguíneo de uma artéria, levando a isquemia do vaso. No caso de uma artéria que oxigena o cérebro, pode levar ao acidente vascular cerebral isquêmico (AVC) e em uma artéria coronariana pode levar ao infarto do miocárdio. A trombose ativa também o processo inflamatório e, depois de alguns dias, pode promover a proliferação exacerbada de células musculares lisas da camada média para a intima do vaso, ocluindo o lúmen do vaso e formando a camada de neointima que pode obstruir o vaso (1).Agentes como o dermatan sulfato (DS), Heparina e a Heparina de baixo peso molecular (HBPM) são glicosaminoglicanos (GAGs), utilizados na clínica médica e que possuem atividade anticoagulante, antiinflamatória e antitrombótica. No presente estudo, comparamos o efeito destes três agentes na prevenção inicial de trombose e no processo inflamatório após a lesão vascular e na formação de neointima quatorze dias após injúria arterial em camundongos C57BL/6 pelo modelo de lesão arterial por cloreto férrico. O tempo de trombose foi determinado por medição do fluxo sanguíneo no vaso lesionado. A resposta inflamatória e o remodelamento dos vasos foram determinados quantificando-se por ensaio de imunofluorescência a presença da molécula de adesão intercelular I (ICAM) e a molécula marcadora de leucócitos (CD11b). O marcador CD34 foi analisado para se verificar a presença de progenitores endoteliais e o CD31 para a presença de endotélio nos vasos. Além disso, analisamos se estes GAGs interferem na coagulação sanguínea por análise de TTPA, tempo de protrombina e de sangramento e verificamos se interferem na atividade de metaloproteinases. A formação de trombo em animais é menor no tratamento com Heparina e o DS é mais eficiente que a HBPM. O TTPA é prolongado cerca de 5 vezes pela heparina, 1,9 vezes pela HBPM e 1,7 pelo DS em 24 horas após lesão vascular; o tempo de sangramento foi prolongado em cerca de 5 vezes pela heparina, cerca de 1vez pela HBPM e 3 vezes pelo DS. A presença de células CD 11b positivas foi cerca de 3 vezes menor no tratamento com DS comparando-se com Heparina e HBPM e a marcação com ICAM-1 não foi alterada em animais tratados com DS e cerca de 40% maior que o controle em animais tratados com Heparina e com HBPM. As artérias lesionadas de animais tratados com DS, Heparina e HBPM apresentaram cerca de 3 vezes mais CPEs. O tratamento com DS diminuiu a atividade de gelatinases no tempo inicial em relação a heparina e de forma semelhante em 14 dias após a lesão e a HBPM foi a menos eficiente neste processo. A formação de

neointima analisada 14 dias após lesão foi menor nos animais tratados com DS que os com Heparina e HBPM. Desde modo, pudemos observar que o tratamento com os glicosaminoglicanos melhora de uma forma geral o processo trombótico inicial e o remodelamento vascular permitindo uma recuperação melhor do endotélio lesionado com diminuição da formação da neointima. No entanto, observamos que o DS foi o agente mais eficiente na diminuição da neointima e, embora a heparina seja mais eficiente na diminuição da formação do trombo inicial e prolongue acentuadamente o tempo para a formação de trombo, o DS inibe mais eficientemente a migração de células inflamatórias para o local da lesão e também proporciona grande migração de CPEs. Deste modo podemos sugerir que o tratamento com DS pode ser adjuvante a lesão arterial, não só diminuindo restenose vascular, mas também proporcionando a melhor recuperação do endotélio após a lesão sem os riscos produzidos pelo tratamento com a heparina como processo hemorrágicos e a trombocitopenia induzida por heparina.

ABSTRACT

Arterial thrombosis is a disease in which arterial blood flow ceases, leading to vessel ischemia. In the case of an artery that oxygenates the brain, thrombosis can lead to ischemic stroke (IS)) and in a coronary artery can lead to myocardial infarction. Thrombosis also activates the inflammatory process and, after a few days, can promote exacerbated proliferation of smooth muscle cells from the middle layer to the lumen of the vessel, occluding it and forming the neointima layer that obstruct the vessel. Agents such as dermatan sulfate (DS), heparin and low molecular weight heparin (LMWH) are glycosaminoglycans (GAGs), used in medical practice that have anticoagulant, anti-inflammatory and antithrombotic activities. In the present study, we compared the effects of these three agents on the initial prevention of thrombosis and inflammatory processes after vascular injury and in the formation of neointima fourteen days after arterial injury in C57BL / 6 mice using the ferric chloride-induced thrombosis model. Thrombosis time was determined by measuring the blood flow in the injured vessel. The inflammatory response and vessel remodeling were determined by quantifying the presence of intercellular adhesion molecule I (ICAM) and the leukocyte marker molecule (CD11b). The CD34 marker was used to analyzed the presence of endothelial progenitors cells and CD31 for the presence of endothelial cells in the vessels. In addition, we analyzed whether these GAGs interfere with blood coagulation by APTT analysis, prothrombin time and bleeding time, and we also verifed whether they interfere with the activity of metalloproteinases (gelatinases). As a result we observed that thrombus formation in animals is decreased after heparin treatment and DS is more efficient than LMWH. Heparin, 1.9 fold by LMWH and 1.7 by DS within 24 hours after vascular injury prolong about APTT 5 times. Bleeding time was prolonged 5 times by heparin, 1 time by LMWH and 3 times by DS. The presence of CD 11b positive cells was about 3-fold lower in DS treatment compared to Heparin and LMWH, and the ICAM-1 labeling was unchanged in DS treated animals and about 40% higher than the control in animals treated with Heparin and LMWH. The injured arteries of animals treated with DS, Heparin and LMWH exhibited about 3 times more CPEs. DS treatment further decreased gelatinases activity at time zero than heparin and similarly at 14 days post-injury and LMWH was the least efficient in this process. The formation of neointima analyzed 14 days after injury was lower in DS treated animals than those with Heparin and LMWH. Thus, it has been

observed that treatment with glycosaminoglycans generally decreases the initial thrombotic process and vascular remodeling allowing better recovery of the injured endothelium with decreased neointima formation. However, we observed that DS was the most efficient agent in the reduction of neointima and that although heparin is more efficient at decreasing initial thrombus formation and markedly prolongs the time to thrombus formation. DS more effectively inhibits the migration of inflammatory cells to the lesion site and also enhances extensive migration of CPEs. Thus we may suggest that DS may be used as an arterial injury treatment, not only for decreasing vascular restenosis, but also to provide better recovery of the endothelium after injury without the risks produced by treatment with heparin, such as hemorrhage and thrombocytopenia induced by heparin.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Morte por doenças cardiovasculares ... 16

Figura 2. Proporção de óbitos por causa em 2012 no Brasil ... 17

Figura 3.Corte histológico de artéria de um camundongo ... 19

Figura 4. Recrutamento de plaquetas ... 20

Figura 6. Novo modelo da cascata de coagulação ... 22

Figura 5.Leucócitos no processo inflamatório ... 24

Figura 7.Sequência pentassacarídica de ligação entre HNF e AT... 28

Figura 8.Inativação dos fatores de coagulação pelo complexo HNF + antitrombina ... 29

Figura 9.Estrutura do Dermatan Sulfato... 32

Figura 10.Modelo de indução de lesão por cloreto ferrico ... 38

Figura 11. Tempo de formação do trombo na artéria carótida ... 45

Figura 12. Análise da formação de trombo por histologia ... 46

Figura 13.Porcentagem de formação de trombo. ... 47

Figura 14.Formação de trombo por microscopia intravital ... 48

Figura 16.Análise da porcentagem da área de neointima 14 dias após lesão arterial... 50

Figura 17.Área da camada média (μm2) ... 51

Figura 18.Tempo Parcial de Tromboplastina ativada (TTPa) ... 52

Figura 19.Tempo de sangramento ... 53

Figura 20.TP dosado em camundongos C57BL/6 no período de 12 e 24 horas após o procedimento de lesão arterial... 54

Figura 21.Extensão da lesão arterial provocada por cloreto férrico ... 56

Figura 22.Contagem de células CD34+ na artéria após lesão provocada por cloreto férrico ... 57

Figura 23.Contagem de células CD11b+ na artéria ... 59

Figura 24.Contagem de ICAM-1. ... 60

Figura 25.Atividade de metaloproteinases no vaso no tempo inicial após a lesão ... 63

Figura 26.Atividade de gelatinases no vaso 14 dias após a lesão. ... 65

LISTA DE ABREVIATURAS AT Antitrombina CD11b Marcador leucocitário CD31 Cluster of differentiation 31 CD34 Cluster of differentiation 34

CML Célula muscular lisa

CPE Célula progenitora endotelial

C57BL/6 Camundongos da linhagem black 6

DAPI 4’6 diamino – 2 fenilindole

DS Dermatan sulfato

FITC Isotiocianato de Fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate) FT Fator tecidual

GAG Glicosaminoglicano

GalNAC N-Acetilgalactosamina

Glc Glicoproteínas

HBPM Heparina de baixo peso molecular

HCII Cofator II da heparina HNF Heparina não fracionada

ICAM-1 Molécula de adesão intercelular

LTA Ácido lipoteicoico

MAC-1 Antígeno de macrófago-1

MEC Matriz extracelular

MMPs Metaloproteinases

MNC Células mononucleares

NAc N-Acetilcisteína

NS Grupo sulfato

PA1 Ativador de Plasminogênio

PAF Fator de ativação plaquetária

PSGL1 Glicoproteína ligante de P-selectina TFI Inibidor do fator tecidual

TFPI Inibidor da via do fator tecidual TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinase

Sumário Agradecimentos ... 5 RESUMO ... 7 ABSTRACT ... 9 LISTA DE FIGURAS ... 11 I. INTRODUÇÃO ... 16

1. Mortalidade por doenças cardiovasculares ... 16

2. O processo de trombose: ... 18

3. A trombose ... 19

4. As Metaloproteinases e o seu papel no remodelamento vascular ... 25

5. Formação da camada neoíntima ... 26

6. Os Glicosaminoglicanos e suas vias de atuação na trombose ... 27

7. A heparina não fracionada ... 27

7.1 Histórico ... 27

7.2 Estrutura e mecanismo de ação ... 28

8. Heparina de baixo peso molecular ... 30

8.1 Estrutura e mecanismo de ação ... 30

9. O Dermatan Sulfato ... 31

9.1 Estrutura de mecanismo de ação ... 31

10. Modelo de lesão arterial por cloreto férrico ... 33

II. OBJETIVO ... 35

Objetivo geral ... 35

Objetivos específicos ... 35

III. MATERIAIS E METODOS ... 36

1. Animais ... 36

2. Grupos experimentais ... 36

3. Tratamentos com GAGs ... 36

4. Modelo de indução de trombose arterial ... 37

5. Tempo de Trombose Arterial ... 38

6. Cálculo da área de trombo ... 39

7. Microscopia Intravital ... 39

8. Determinação do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) ... 39

9. Determinação do tempo de protrombina (TP) ... 40

10. Determinação do Tempo de Sangramento (TS) ... 40

12. Ensaio de Imunofluorescência ... 41

15. Agregação plaquetária ... 42

16. Análise Estatística ... 43

IV. RESULTADOS ... 44

1. Peso dos Animais ... 44

2. Tempo de formação do trombo nos tratamentos com DS, Heparina e Heparina de baixo peso molecular inicialmente após o procedimento cirúrgico ... 44

3. Área do trombo por histologia ... 45

4. Área do trombo por microscopia intravital ... 47

5. Formação de neoíntima é atenuada no tratamento com DS, Heparina e HBPM .... 49

6. GAGs alteram o TTPA, TP e TS ... 51

7. Expressão de marcadores após tratamento com os GAGs ... 54

7.2 Efeito de GAGs na migração de células progenitoras endoteliais ... 56

8. Expressão de moléculas marcadores de inflamação: CD11b e ICAM-1 ... 58

9.1 CD11b ... 58

9.2 ICAM-1 ... 59

9. Análise da atividade gelatinolítica nas artérias carótidas ... 61

10. Agregação plaquetária em diferentes tratamentos com GAGs ... 65

RESUMO DOS DADOS OBTIDOS ... 75

CONCLUSÃO ... 76

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 77

I. INTRODUÇÃO

1. Mortalidade por doenças cardiovasculares

De acordo com os dados da Organização Mundial da Saúde, aconteceram 17,5 milhões de mortes no ano de 2012 devido às doenças cardiovasculares, sendo que 7,4 milhões foram relacionadas a doenças cardíacas isquêmicas e 6,7 milhões ao acidente vascular cerebral. Apenas em 1999, essas enfermidades representaram um terço da mortalidade global, no qual os países mais pobres contribuíram com 78% do total (Mackay et al., 2004). Segundo projeções para as próximas décadas, o número de mortes por doenças cardiovasculares irá dobrar nos países em desenvolvimento (Boutayeb e Boutayeb, 2005). O gráfico abaixo mostrado na figura 1 mostra a taxa de mortalidade por doenças cardiovasculares no mundo no ano de 2012:

Figura 1. Morte por doenças cardiovasculares. Representam as maiores proporções de morte no grupo de doenças crônicas não transmissíveis (NCDs) no mundo, ocorrendo principalmente em países de baixa e média renda(Who, 2014).

Ainda de acordo com a WHO, a taxa de mortalidade por doenças crônicas não transmissíveis no Brasil no ano de 2012 que incluem as doenças cardiovasculares, doenças respiratórias, câncer, diabetes, entre outras, apresentaram como maior fator de óbito as doenças cardiovasculares, como exemplificado na figura 2:

Figura 2. Proporção de óbitos por causa em 2012 no Brasil. As doenças cardiovasculares foram e continuam a ser, apesar de sua diminuição, a principal causa de morte no Brasil e geram o maior custo referente a internações hospitalares no sistema de saúde nacional. Gráfico modificado do Atlas global do perfil de doenças crônicas não

transmissíveis por perfil de país, 2014.

(Http://www.who.int/nmh/countries/bra_en.pdf?ua=1).

A OMS destacou que aproximadamente 80% dos óbitos por doenças crônicas não transmissíveis (doenças cardiovasculares, cânceres, doenças respiratórias crônicas e diabetes) ocorreram em países de baixa ou média renda com 29% dos óbitos em adultos com menos de 60 anos, menor renda e escolaridade, por serem exatamente a classe mais exposta aos fatores de risco e com menor acesso às informações e aos serviços de saúde,

Injúrias; 12% Condições comunicável,mater nal,perinatal e nutricional ; 13% Outras NCDs; 15% Diabetes; 6% Doenças respiratórias; 6% Câncer; 17% Doenças cardiovasculares; 31%

acentuando ainda mais as desigualdades sociais enquanto naqueles de alta renda esse percentual era de apenas 13% (Alwan et al., 2010).

Em consequência da gravidade das doenças cardiovasculares no atual cenário, essas enfermidades são responsáveis por um grande impacto econômico nos sistemas de saúde em todos os países (Roger et al., 2012). De acordo com os custos diretos dos sistemas de saúde com as doenças cardiovasculares foi de aproximadamente € 106 bilhões em 2009 nos países da Europa; os custos totais levando em conta a perda de produtividade devido à mortalidade e morbidade e os custos informais, chegam a € 195 bilhões.

2. O processo de trombose:

A Hemostasia é um processo fisiológico que garante o equilíbrio dinâmico da forma fluida do sangue. Ao mesmo tempo em que previne que o sangue se solidifique dentro dos vasos sanguíneos, impedindo a formação do trombo (trombose), a hemostasia protege o organismo da perda sanguínea em um eventual rompimento de vasos (hemorragia)(Zarbock et al., 2007). As células endoteliais formam o revestimento interno da parede dos vasos da chamada íntima, esta camada deve estar íntegra pois sua função é a regulação da homeostase do vaso e a troca de constituintes do sangue circulante para os tecidos e órgãos, através das junções intercelulares, que, em geral, são impermeáveis às grandes moléculas. As camadas de células endoteliais devem responder a uma variedade de estímulos patológicos ajustando suas funções habituais e expressando novas propriedades adquiridas quando há disfunção no vaso sanguíneo, onde ocorre um desequilíbrio na produção endotelial de mediadores que regulam o tônus vascular, agregação plaquetária, coagulação e fibrinólise.

A disfunção endotelial está presente em diversas doenças como obesidade, diabetes, hipertensão arterial e dislipidemia e em acidentes vasculares ou isquêmicos como o acidente vascular cerebral (AVC) e a trombose. Estas doenças estão integradas a fatores de risco herdados e/ou adquiridos, ou seja, algumas condições clínicas como hipertensão, diabetes, câncer, inflamações, traumas e cirurgias podem aumentar a incidência destes distúrbios hemostáticos (Lorenzi, 2006).

Nestas doenças as células endoteliais deixam de produzir as substâncias responsáveis pela homeostase vascular que tornam o endotélio antitrombótico. Elas passam a liberar então fatores pró-inflamatórios como moléculas de adesão celular e

citocinas que estimulam a migração e adesão de monócitos, linfócitos e neutrófilos para o espaço subendotelial (Previtali et al., 2011) com consequente acontecimento de processos inflamatórios e trombóticos.

Figura 3.Corte histológico de artéria de um camundongo. O vaso é composto por 3 túnicas (íntima, média e adventícia) sendo a camada íntima que reveste internamente o vaso contém as células endoteliais. Corte corado com Hematoxilina e Eosina. Foto: Andressa Costa

3. A trombose

Quando a integridade da parede vascular é interrompida, ocorre a ativação do sistema hemostático. Este fenômeno envolve diversas interações entre componentes endoteliais e subendoteliais, plaquetas e outras células sanguíneas periféricas e proteínas pró-coagulantes circulantes (Hoffbrand et al., 2011)(Figura 4). Após a lesão vascular as plaquetas encontram constituintes da matriz extracelular, especialmente o colágeno e são ativadas. Em contato com a matriz, as plaquetas atuam de três formas: 1) aderem-se à ela; 2) secretam conteúdos de seus grânulos; 3) iniciam a agregação a outras plaquetas. As plaquetas se aderem à matriz extracelular através do fator de von Willebrand (FvW) que faz a ligação entre o colágeno e o receptor de glicoproteína Ib/IX-V plaquetário. A secreção do conteúdo granular é promovida pela ligação de agonistas aos receptores de superfícies nas plaquetas. O difosfato de adenosina (ADP) é um dos elementos secretados e atua no recrutamento de mais plaquetas (Rondaij et al., 2006). A agregação plaquetária induzida pelo ADP (contido no grânulo plaquetário), e pelo tromboxano A2 (também sintetizado com a ativação plaquetária) leva a formação do tampão hemostático. Com a

Lúmen do vaso

Camada íntima do vaso contendo células

Camada média do vaso contendo células musculares lisas

ativação de outros fatores da cascata de coagulação, a trombina gerada liga-se à superfície plaquetária, resultando em mais agregação. O fibrinogênio é um outro fator atuante na agregação plaquetária, que associa-se as plaquetas através de receptores de glicoproteínas IIb/IIIa (Ruggeri e Mendolicchio, 2007). A Glicoproteína Ib/IX-V liga a plaqueta ao FvW. (Alevriadou et al., 1993)

Figura 4. Recrutamento de plaquetas. A) A interação entre Gp plaquetária e o colágeno é estabilizada pelo Fator de von Willebrand. A aderência plaquetária ocorre sobre o colágeno da superfície subendotelial (endotélio lesado). B) Glicoproteínas da superfície plaquetária são mediadoras da adesão e ativação plaquetária juntamente com o fator tecidual (FT). Gp = Glicoproteína; FT = Fator Tecidual; FvW = Fator de von Willebrand. Imagem: Andressa Costa.

Fibrinogênio Complexo II b-III a

A)

FT

FT

B)

Simultaneamente a este processo, o sistema de coagulação se ativa através de clivagens proteolíticas de zimogênios em enzimas. Recentemente foi proposto o novo modelo de coagulação baseado em superfícies celulares, considerando a interrelação dos processos físicos, celular e bioquímicos e não em duas vias (intrínseca e extrínseca) como antes (Hoffman, 2003). O novo modelo propõe a ocorrência das fases de iniciação, amplificação, propagação e finalização.

A fase de iniciação acontece quando células que expressam o fator tecidual (FT) em sua superfície são expostas após lesão vascular (Vine, 2009). O FT liga-se ao FVII e o ativa FVIIa, esse complexo é responsável pela ativação dos fatores FIX e FX. O fator Xa em associação com o fator Va transforma pequenas quantidades de protrombina em trombina. Na fase de amplificação pequenas quantidades de trombina produzidas por células que expressam o FT interagem com as plaquetas e FVIII que está ligado ao fator de von Willebrand. No processo de lesão as plaquetas interagem com componentes da matriz extracelular exposta, onde são ativadas, resultando em um tampão plaquetário. A trombina gerada é responsável pela ativação máxima de plaquetas. Dessa forma, inicia-se a formação de fibrina estável, que consolida o tampão plaquetário inicial (Monroe e Hoffman, 2009). As plaquetas também permitem a entrada de íons cálcio e expressão de quimiocinas que atraem os fatores de coagulação para sua superfície, além de liberar o FV parcialmente ativado. A fase de propagação é destacada pelo recrutamento de mais plaquetas para o local lesionado e pela formação do complexo tenase e protrombinase na superfície das plaquetas ativadas (Boucher e Traub, 2009). Nesse processo, o fator FIXa liga-se ao fator FVIIIa na superfície de plaquetas (complexo tenase), este por sua vez ativa o fator X em Xa, o qual associa-se com o fator Va que está ligado à plaqueta, resultando no complexo protrombinase, que converte a protrombina em trombina, esta quebra o fibrinogênio em fibrina, que é o principal componente de consolidação do trombo (Riddel et al., 2007). O trombo de fibrina formado deve limitar-se ao local lesionado para que não venha a ocorrer oclusão trombótica no vaso. Para isso, anticoagulantes naturais agem nesse processo, como a antitrombina (AT), cofator II de heparina, inibidor da via do fator tecidual (TFPI), a proteína C (PC) e proteína S (OS). As células endoteliais produzem uma variedade de GAGs, que funcionam como sítios de ligação, de alta afinidade, para a AT, que são importante na inativação da trombina (Cerinic et al., 2003).

A atividade da coagulação sanguínea pode ser feita por análise laboratorial da coagulação, in vitro, o teste de tromboplastina parcial ativada (TTPa) analisa os níveis de fatores procoagulante envolvidos na produção de trombina na superfície de plaquetas e o tempo de protrombina (TP) avalia os níveis de fatores procoagulante envolvidos na fase de iniciação da coagulação (Spronk et al., 2003).

Figura 5. Novo modelo da cascata de coagulação. Representação do modelo da coagulação baseado em superfícies celulares compreendendo as fases de iniciação, amplificação e propagação. Fator tecidual (FT), ativado (a). (Ferreira et al., 2010)

Além da ativação de plaquetas e da cascata de coagulação, uma outra característica da trombose é a inicialização de uma resposta inflamatória. Nesse processo ocorre o recrutamento rápido de leucócitos do sangue para o local da lesão, sendo os neutrófilos as primeiras células a chegarem no sítio (Muller, 2003). Na inflamação tanto células endoteliais como leucócitos circulantes são ativados por citocinas inflamatórias circulantes. A interação dos leucócitos ocorre por meio de seus receptores, L-selectinas (presente em leucócitos e que promove a ligação leucócito e endotélio), com os receptores P-selectinas (expresso pelo endotélio e plaqueta ativada), onde promovem uma adesão fraca que produz a fase de rolamento dos leucócitos no endotélio (Mitchell et al., 2006).

A adesão firme de leucócitos ao endotélio ocorre em seguida ao rolamento e se dá através de proteínas transmembranas de superfície celular, as integrinas, as quais irão se ligar as imunoglobulinas expressas por células endoteliais(Stewart et al., 1995) (figura 5). Cada integrina contém cadeias α e β, definidas em relação a sua cadeia β: β1-integrinas expressas por leucócitos irão interagir com a molécula de adesão celular vascular (VCAM-1); β2-integrinas conhecidas são as LFA (também denominadas de CD11a/ CD18 OU αLβ2) e MAC-1 (conhecidas como CD11b/CD18 ou αMβ2). A MAC-1 e LFA-1 são as moléculas mais estudadas pois atuam na adesão e na transmigração de leucócitos pelo endotélio (Simon et al., 2000). As imunoglobulinas expressas pelo endotélio como VCAM-1 (molécula de adesão celular vascular) e ICAM-1 (molécula de adesão intercelular-1) são os principais receptores para as β2-integrinas dos leucócitos. O ICAM-1 possui cinco domínios extracelulares, um ligado ao LFA (CDICAM-1ICAM-1a/CDICAM-18) e outro a MAC-1 (CD11b/CD18) (Diacovo et al., 1996). Essas moléculas de adesão são importantes pois fornecem ancoragem firme aos leucócitos (Schneider e Sobel, 2007). A adesão e transmigração leucocitária são afetadas por mediadores químicos, os quais podem gerar uma cascata capaz de ampliar e liberar outros fatores estimulantes, esses mediadores podem ser agentes vasoativos como a histamina, serotonina, prostaglandinas, leucotrienos e lipoxinas, proteínas plasmáticas, fator de ativação das plaquetas (PAF), TNF-α, Interleucina-1 e óxido nítrico (Marcos Da Silveira, 2004).

Figura 6.Leucócitos no processo inflamatório. Adesão leucocitária é um evento fundamental para o processo inflamatório, culminando com o carreamento de células de defesa mediante ação de citocinas e moléculas de adesão. Entre as moléculas de adesão, três grandes são conhecidas: as integrinas, imunoglobulinas e selectinas. Essas moléculas coordenam as várias fases da adesão, rolamento e transmigração leucocitária ao endotélio, contribuindo na resposta inflamatória aguda, segundo (Francischetti, 2010)

Após a formação do trombo e a migração de células inflamatórias, se inicia o processo de reabsorção do trombo e do remodelamento do vaso, com produção de células endoteliais, células musculares lisas e matriz extracelular que irão propiciar a regeneração do tecido vascular. Um dos principais agentes responsáveis pelo remodelamento do vaso são as enzimas do tipo metaloproteinases. Estas enzimas podem participar do remodelamento positivo estimulando a modificação da matriz extracelular, crescimento de células endoteliais e a reconstituição do endotélio funcional ou um processo negativo, onde ocorre maior proliferação de células musculares lisas e de matriz para o lúmen do vaso, levando a oclusão deste (Bosman e Stamenkovic, 2003).

4. As Metaloproteinases e o seu papel no remodelamento vascular

A angiogênese é a formação de novos vasos a partir de vaso pré-existentes, sendo um processo estritamente regulado necessário durante a reprodução, desenvolvimento, inflamação e reparo de lesões (Arnold, 1991). O remodelamento da matriz extracelular é um evento crucial durante a angiogênese, onde as células endoteliais estimuladas por fatores angiogênicos produzem enzimas que degradam a matriz, incluindo as metaloproteinases (MMPs). As MMPs são uma grande família de metaloendopeptidases que degradam componentes proteicos da matriz extracelular (MEC) e da membrana basal. Existe um delicado balanço fisiológico entre degradação, reconstrução e remodelamento dos colágenos na MEC. As MMPs apresentam especificidade por substratos como, colágeno, colágenos da membrana basal, proteoglicanos, elastinas e fibronectinas. Algumas MMPs, como MMP-2, MMP-3, MMP-9 e MMP-12 hidrolisam elastina e tem importância na parede vascular arterial (Busti et al., 2010). As MMPs podem ser conhecidas como colagenases (MMP-1, 8, 13 e 18), gelatinases (MMP-2 e 9) estromelisinas (MMP-3, 10 e 11), matrilisinas (MMP-7 e 26) e MMPs de membrana ou MT-MMPs (MMP-14, 15, 16, 17, 24 e 25). Quanto maior a sinalização e ação das MMPs na MEC mais robusto será o mecanismo de reparo da síntese de colágeno recém-formado (Hayden et al., 2005).

O balanço entre os níveis de MMPs e os seus inibidores teciduais (TIMPs) é conhecido por ter um papel central no remodelamento vascular (Visse e Nagase, 2003). Sob condições patológicas associadas com um desequilíbrio das atividades das MMPs, mudanças nos níveis de TIMPs são consideradas importantes porque afetam diretamente os níveis das atividades das MMPs. O desequilíbrio entre MMPs e TIMPs pode levar a um excesso do acúmulo ou degradação de MEC (Bode e Maskos, 2003).

A MMP-2 é uma das gelatinases mais expressas por células endoteliais e células musculares lisas e possui importante papel na angiogênese. MMP-2 está envolvida também na formação de lesão aterosclerótica e neointima (Kuzuya et al., 2003).A MMP-9 possui um papel fundamental na neovascularização através do efeito direto no deslocamento de células progenitoras endoteliais (CPEs) da medula óssea para o tecido isquêmico. A inibição de MMP-9 promove redução na mobilização CPEs e vasculogênese, comprovado em animais MMP-9 (-/-) (Huang et al., 2009).

Uma alteração na atividade das MMPs pode estar diretamente relacionada com o remodelamento positivo ou negativo do vaso lesionado (Giagtzidis et al., 2015). Após a ativação da trombose, do processo inflamatório e da ativação das enzimas de matriz extracelular o vaso começa o processo de recuperação, no qual poderá ou não resultar na formação de neointima como será descrito a seguir.

5. Formação da camada neoíntima

O procedimento cirúrgico mais utilizado na restauração do fluxo sanguíneo vascular após obstrução das artérias coronarianas é a angioplastia por implante de próteses medicamentadas (stents), com taxa de lesões residuais menores que 50% e ausência de complicações maiores que 90% (Bauters et al., 1996). A reestenose é a principal limitação desses procedimentos, ocorre em cerca de 20 a 40% das desobstruções feitas com sucesso. A reestenose desenvolve-se, fundamentalmente, nos primeiros meses após a angioplastia, tendo máxima incidência entre o 3º e o 6º mês após o procedimento (Marquez-Gonzalez et al., 2017).

Inicialmente após o procedimento cirúrgico, plaquetas e fibrina são depositadas no vaso lesionado e as plaquetas ativadas expressam moléculas de adesão como as p-selectinas, que interagem com prostanglandinas-1 (PSGL-1) na superfície dos leucócitos, ocasionando a adesão e rolamento dos mesmos na superfície do vaso. A migração dos leucócitos pela camada de plaquetas ocorre também por agentes quimiotáticos que são liberados por células musculares lisas e macrófagos que estão na parede do vaso (Gawaz et al., 1996).

A próxima etapa é a de proliferação celular que ocorre quando plaquetas, leucócitos e células musculares lisas liberam fatores de crescimento e estimulam a migração de mais células musculares lisas da camada média para a camada íntima, formando a neoíntima. Esta consiste na proliferação exacerbada de células musculares lisas, matriz extracelular e macrófagos durante o período de várias semanas (Schwartz Rs Fau - Holmes et al., 1992). Dependendo do estímulo que recebe, as CMLs podem assumir dois diferentes fenótipos. O fenótipo contrátil, ou quiescente, é o aspecto normal da CML da camada média arterial ou fenótipo ativado ou proliferativo, que é a forma predominante em vasos lesionados (Kocher et al., 1991). Após o período de meses é observado o remodelamento vascular com a degradação de matriz extracelular e sua

re-síntese no lúmen do vaso juntamente com as CMLs proliferativas, reduzindo o diâmetro do vaso e bloqueando a passagem de fluxo sanguíneo, sendo o principal mecanismo da formação de neoíntima em artérias tratadas com implante de stent (Carter et al., 1994). A necessidade de procedimentos diagnósticos e terapêuticos repetitivos determina um marcante prejuízo à evolução dos pacientes que desenvolvem reestenose e tornam altos os custos do tratamento.

Uma variedade de agentes terapêuticos tem sido empregada para tentar modular a função vascular e regenerar as células endoteliais nos estágios pós-operatórios de pacientes submetidos à angioplastia, dentre estes agentes, pode-se destacar a utilização de glicosaminoglicanos, que estão diretamente envolvidos em processos anti-inflamatórios, antitrombóticos e anticoagulantes.

6.

Os glicosaminoglicanos são heteropolissacarídeos de caráter ácido, compostos de cadeias lineares de unidades dissacarídicas repetitivas, formadas por unidades alternadas de hexosamina e um ácido urônico. Dentre os GAGs presentes em tecidos animais estão a heparina, heparan sulfato, dermatan sulfato, condroitin 4 e 6 sulfato, queratam sulfato e o ácido hialurônico (Taylor e Gallo, 2006). Muitos glicosaminoglicanos são utilizados como drogas antitrombóticas e anticoagulantes no tratamento de doenças cardiovasculares, portanto o estudo comparativo dos efeitos destas moléculas na trombose e na revascularização do endotélio são de grande interesse atualmente.

7. A heparina não fracionada

7.1 Histórico

A heparina não fracionada (HNF) foi descoberta por McLean em 1916 que a caracterizou como um eficiente anticoagulante, (Mc, 1959) utilizado mundialmente em muitos distúrbios trombóticos arteriais e venosos, até os dias atuais. Conhecida por ser um dos anticoagulantes mais antigos, ela é amplamente utilizada em medicina desde 1930 (Jaques, 1979). O seu principal mecanismo de ação consiste em acelerar em cerca de 1000 vezes, a velocidade com que a antitrombina (AT), uma proteína anticoagulante circulante no plasma atua sobre as serino-proteases da cascata de coagulação sanguínea, dentre elas a trombina e o fator X ativo (Rosenberg e Damus, 1973).

7.2 Estrutura e mecanismo de ação

A HNF é constituída por uma cadeia linear de tamanho variável entre 10 e 200 unidades dissacarídicas de glucosamina e ácido urônico, ligados através de ligações glicosídicas α ou β (1 → 4). O ácido urônico pode ser ácido β-D-glicurônico (GlcA) ou α-L-idurônico (IdoA), enquanto que a glucosamina pode ser apenas α-D-glucosamina (GlcN) (Silva, 1975). A presença de vários grupos sulfatos ligados a HNF, conferem a ela a maior densidade de carga aniônica que qualquer outra molécula biológica conhecida (figura 7). Ela apresenta em média 3,5 cargas negativas por unidade dissacarídica (Nader e Dietrich, 1994). A HNF é encontrada exclusivamente em grânulos secretores no interior de mastócitos, enquanto o heparan sulfato é abundante em superfícies celulares, ligado a receptores de diversos tecidos (Sasisekharan e Venkataraman, 2000).

Ela atua aumentando a ação inibitória exercida pelas serpinas, como a antitrombina (AT) e o cofator II da heparina, uma outra proteína anticoagulante presente no plasma. (Rosenberg e Lam, 1979) demonstraram a presença de uma sequência pentassacarídica, na molécula de heparina, importante para a ligação com a AT. Essa sequência contém uma unidade glucosamina, com um único grupo O-sulfato na posição 3, que é crítico para o papel anticoagulante da heparina (Choay et al., 1983) (Figura 6).

Figura 7.Sequência pentassacarídica de ligação entre HNF e AT.Seta vermelha: pode ser GlcNAc6SO3 ou GlcNSO3,6SO3; seta verde: GlcNSO3-3, 6SO3; seta laranja: Glc; seta preta: IdoA2SO3. O asterisco na seta laranja indica o resíduo de glucosamina supersulfatado característico dessa unidade. Círculo amarelo: grupo sulfato essencial para a interação com AT. (Casu et al., 2007).

A ligação HNF/AT causa uma mudança conformacional neste cofator, resultando em uma inativação acelerada das serino-proteases como os fatores IXa, Xa, XIa, XIIa e IIa (trombina)(Linhardt, 2003). Neste processo é formado um complexo covalente AT/trombina/HNF que inativa a enzima ligada permanentemente. Aproximadamente,

apenas um terço das moléculas de HNF se liga à AT as quais contêm a sequência pentassacarídica.

Figura 8.Inativação dos fatores de coagulação pelo complexo HNF + antitrombina. A trombina e o fator Xa são as proteínas mais suscetíveis, sendo a trombina 10 vezes mais sensível à inibição que o fator Xa. Adaptado de (Hirsh et al., 1995)

A HNF atua também através da interação com o cofator II da heparina, inibindo apenas a ação da trombina e não outras enzimas da cascata de coagulação (Young, 2008). No mecanismo antitrombótico da HNF também se observa redução da atividade do complexo fator tecidual/fator VIIa, pois há aumento do inibidor da via do fator tecidual (TFPI) pelo endotélio e, também, há redistribuição do TFPI, com sua diminuição por ser direcionado a superfície celular. O TFPI forma um complexo com fator Xa, inativando-o, e este complexo inativa o complexo fator VIIa + fator tecidual (Lupu et al., 1999).

(Nader et al., 1989) demonstraram outro mecanismo de inibição antitrombótica e observaram que ela aumentava, em cerca de 2 a 3 vezes, a síntese de heparan sulfato pelas células endoteliais da aorta de coelhos, em meio de cultura, e que esse aumento ocorria imediatamente após a exposição das células endoteliais à HNF. Demonstraram também, que ocorria aumento do grau de sulfatação nos resíduos de ácido urônico do heparan sulfato proveniente destas células.

A HNF é efetiva para prevenção e tratamento das tromboses arteriais, venosas e embolia pulmonar. É também empregada no tratamento de pacientes com angina e infarto agudo do miocárdio e em alguns casos iniciais de coagulação intravascular disseminada. É importante durante cirurgia cardíaca com circulação extracorpórea, hemodiálise,

cirurgia vascular, angioplastia e colocação de stents e endopróteses vasculares (Hirsh et al., 2001).

Apesar de ser efetiva como droga e amplamente utilizada, seus efeitos adversos levam a procura de outros substitutos. Dentre esses efeitos adversos pode-se citar a hemorragia e a trombocitopenia induzida por heparina (TIH) (Gupta et al., 2015). A TIH é uma resposta imunológica devido ao uso da HNF. Essa reposta é atribuída a anticorpos que identificam a formação do complexo heparina mais fator plaquetário 4, os quais ligam-se a esse complexo levando à formação de lesões no vaso, trombose e coagulação disseminada podendo se expressar depois de cinco a sete dias ou até mesmo no primeiro contato com o fármaco (Warkentin et al., 2008). A HNF também liga-se a proteínas plasmáticas durante sua administração e células endoteliais, resultando em uma resposta anticoagulante variável (Barzu et al., 1986). Além disso, o tratamento anticoagulante com demanda monitoramento diário de sua atividade que, em geral, demanda internação para a observação do paciente.

8. Heparina de baixo peso molecular

8.1 Estrutura e mecanismo de ação

Em 1980 teve início a introdução das heparinas de baixo peso molecular. As HBPM são porções da heparina não fracionada produzidas pela despolimerização de cadeias de polissacarídeos, seja quimicamente ou por uma reação enzímica, processo que reduz seu peso molecular cerca de 4.000 a 6.000 Da. As HBPM são extraídas de mucosa intestinal porcina (Fareed et al., 2004) e também do tecido pulmonar bovino (Andréo Filho, 2009).

A interação da HBPM ocorre pela antitrombina, sendo mediada por uma sequência de pentassacarídeo, a qual ocorre em menos de um terço das moléculas das HBPM que está distribuída de forma aleatória ao longo de sua cadeia. Possuindo peso molecular menor, a capacidade para inibir a trombina diminui, pois moléculas com menos de 18 sacarídeos não são capazes de formar o complexo ternário heparina-AT-trombina (Harenberg, 1990). Esta interação entre pentassacarídeo e antitrombina é também responsável pelo efeito anticoagulante das HBPM, via inibição do fator Xa.

A redução do peso molecular reflete no mecanismo de inibição sobre a trombina e o fator Xa. A trombina, além de converter o fibrinogênio, promove uma retroalimentação positiva ativando os fatores V e VIII. Como as HBPM possuem baixa atividade inibitória de trombina devido ao seu tamanho reduzido, não são capazes de impedir a formação dos fatores V e VIII, importantes complexos procoagulante (Holmer et al., 1986). Há, portanto, diferença entre a potência das HBPM e HNF, cuja atividade anticoagulante permanece maior.

As HBPM possuem menor interação com as plaquetas, fator de von Willebrand, endotélio e atuam menos sobre a permeabilidade vascular, o que proporcionaria menor ocorrência de processos hemorrágicos em relação as heparinas não fracionadas (Horlocker e Heit, 1997). Possuem uma meia-vida plasmática duas a quatro vezes maior do que as heparinas não fracionadas, além de maior absorção subcutânea, o que permite a aplicação de doses mais espaçadas. O monitoramento laboratorial é dispensável na maioria dos pacientes, consequência da sua relação dose-efeito (Hull et al., 1992). Este melhor perfil de desempenho das HBPM reflete-se em seu custo que é cerca de 10 a 20 vezes maior. A meia-vida da atividade de inibição do fator Xa das HBPM varia entre 3 e 10 minutos após injeção intravenosa e entre 3 e 5 horas após injeção subcutânea apresentando variação também entre uma e outra HBPM (Andrassy e Eschenfelder, 1996)

9. O Dermatan Sulfato

9.1 Estrutura de mecanismo de ação

O dermatan sulfato é um glicosaminoglicano composto de cadeias lineares polissacarídicas formadas por unidades dissacarídicas contendo uma hexosamina, N-acetil galactosamina (GalNAC) ou ácido idurônico (GlcA) unidos por ligações β 1→4 ou β 1→3 respectivamente.

O dermatan Sulfato possui um mecanismo de ação na coagulação como inibidor seletivo da trombina através da catálise do cofator II da heparina (Tovar, M. F. et al., 2005). Diferente das heparinas não fracionadas e de baixo peso molecular, o dermatan sulfato não influencia na antitrombina III e, portanto, não inibe o Fator Xa. Ele é efetivo não somente na trombina livre, mas também na trombina ligada à fibrina. O dermatan sulfato não interfere com as plaquetas ou na função plaquetária. Assim, quando complexo

cofator II de heparina e DS é formado, o efeito anticoagulante é aumentado em até 1000 vezes (Tollefsen, 2007).

Figura 9.Estrutura do Dermatan Sulfato. Possui alta afinidade para o cofator II de heparina. Um pequeno fragmento de DS que se liga ao HCII com alta afinidade é um hexassacarídeo contendo 3 unidades dissacarídicas de IdoA2SO3 → GalNAc4SO3 (Maimone e Tollefsen, 1990).

Foi observado que o DS é o principal polissacarídeo antitrombótico e anticoagulante nas paredes dos vasos sanguíneos de artéria aorta humana e veia safena em relação aos outros GAGs, em tecidos afetados pela aterosclerose. Foi observado haver uma mudança entre a proporção de heparan sulfato/dermatan ao longo do desenvolvimento da doença no vaso afetado (Tovar, A. M. et al., 2005). Foi demostrando por (He et al., 2008) que o DS está localizado principalmente na camada adventícia da artéria carótida e que após a injúria arterial o HCII é capaz de se difundir do plasma para esta camada onde é ativado.

Um estudo de nosso laboratório demonstrou que o DS foi capaz de diminuir a presença de P-selectina (moléculas de adesão presente no endotélio que promove a adesão de leucócitos às células endoteliais ativadas durante a resposta inflamatória) no local da lesão vascular, indicando uma possível função antiinflamatória desse GAG (Godoy et al., 2015). (Vicente et al., 2007) demonstraram que a administração de dermatan sulfato 48 horas após a injúria vascular inibiu a formação da neointima em camundongos normais, mas não em camundongos deficientes de HCII. Em outro trabalho de nosso laboratório observamos que a administração de células mononucleares da medula óssea de camundongos C57BL6 juntamente com o DS ajudou a prevenir formação da neoíntima após lesão arterial e aumentou a migração destas células para o local da lesão arterial (Godoy et al., 2011).

10. Modelo de lesão arterial por cloreto férrico

Estudo in vivo em modelos de animais são críticos para melhor entendimento dos mecanismos envolvidos em desordens trombóticas (Bayes-Genis et al., 2000). Dentre os diversos métodos utilizados para induzir a formação do trombo em modelos de animais, encontra-se o modelo químico utilizando o cloreto férrico (FeCl3).

Em 1994, o FeCl3 foi inicialmente utilizado na veia cava inferior de coelhosa fim de induzir a trombose (Reimann-Hunziker, 1944), este método foi adaptado para carótida de ratos em 1990 por Kurz e colaboradores mostrando que uma solução de FeCl3 aplicada na artéria carótida exposta de ratos, induzia trombose oclusiva. Em 1998, o modelo de trombose arterial causada pelo FeCl3 foi adaptado para camundongos no estudo da deficiência do inibidor do ativador do plasminogênio (Konstantinides et al., 2001).

Um dos benefícios desse modelo é que diferentes concentrações de cloreto férrico geram lesões de níveis diferentes e consequentemente, tempo de oclusão do vaso sanguíneo variado. Dessa forma, com estabelecimento da concentração de FeCl3 e tempo de aplicação, a técnica tem se mostrado reprodutível (Ciciliano et al., 2015).

Este modelo é simples e sensitivo, tanto a drogas anticoagulantes como antiplaquetárias, motivo pelo qual foi escolhido como modelo para estudo neste trabalho. Tem sido realizado em artérias carótida e femoral, veia jugular, arteríolas e vênulas mesentérica e cremastérica em ratos, camundongos, mini pigs e coelhos (Wiedermann et al., 1994; Hehrlein et al., 1996; Day et al., 2004)

A técnica consiste na colocação de um papel filtro com medida de um mm² embebido em FeCl3 sobre o vaso e deixado por alguns minutos. A lesão é devida à capacidade do cloreto férrico de penetrar a parede vascular, causando desnudação de células endoteliais e expondo o subendotélio juntamente com fibras de colágeno. A exposição ativa a cascata de coagulação, culminando com formação de trombo e posterior crescimento da camada neointimal (Eckly et al., 2011)

Neste modelo o tempo de oclusão é considerado como o tempo ocorrido após o início da lesão vascular até a completa oclusão do vaso através da interrupção do fluxo sanguíneo, que pode ser medido por um equipamento de aferição de fluxo de Doppler ou análise com microscopia intravital. Trabalhos anteriores utilizando camundongos C57BL6 observaram um tempo de oclusão variando de 5 a 30 minutos, devido as

diferentes concentrações de FeCl3 que são utilizadas, tempo de exposição, tipos de anestesia, técnicas cirúrgicas, a idade e o background genético dos animais, o método de medição do fluxo sanguíneo, e outras variáveis ambientais surtirão efeito significativo neste modelo (Robertson et al., 2009; Owens e Mackman, 2010).

II. OBJETIVO

Objetivo geral

Analisar o efeito do dermatan sulfato, heparina e heparina de baixo peso molecular na formação e dissolução do trombo na artéria carótida, remodelamento e reendotelização do vaso após lesão arterial promovida por cloreto ferrico in vivo.

Objetivos específicos

1. Determinar o tempo de trombose e o tamanho de trombo arterial no tempo imediatamente após a lesão química com cloreto férrico nos diferentes grupos tratados com GAGs (tempo zero);

2. Avaliar a influência dos tratamentos dos diferentes GAGs no tempo de sangramento, tempo de trombina e tempo de tromboplastina parcial ativada no plasma obtido dos animais tratados;

3. Observar o processo de recuperação do vaso após lesão arterial através da quantificação de células progenitoras endoteliais para o local da lesão (células CD34) e de células endoteliais (CD31) nos diferentes grupos tratados com GAGs; 4. Avaliar a influência dos GAGs na inflamação inicial pela presença células

inflamatórias no vaso (CD11b e ICAM-1);

5. Analisar a influência dos diferentes GAGs na formação da camada neointima quatorze dias após a lesão química;

6. Quantificar a atividade das metaloproteinases (gelatinases) no remodelamento vascular, observando a atividade destas nos vasos em diferentes tratamentos com GAGs.

III. MATERIAIS E METODOS

1. Animais

Foram utilizados camundongos machos selvagens de linhagem C57BL/6 adquiridos no CEMIB/UNICAMP, mantidos em biotério do Departamento de Biologia Celular e Estrutural da UNICAMP sob responsabilidade da Profa. Dra. Cristina Pontes Vicente. Este trabalho teve a aprovação do comitê de ética da UNICAMP (CEUA n° 3892-1).

2. Grupos experimentais

Neste estudo foram testadas quatro condições de tratamento em camundongos C57BL/6: i) animais lesionados e não tratados ii) animais lesionados e tratados com dermatan sulfato iii) animais lesionados e tratados com heparina não fracionada iv) animais lesionados e tratados com heparina de baixo peso molecular.

Os quatro grupos de animais foram analisados sob as circunstâncias:

3. Tratamentos com GAGs

Nos grupos de animais com lesão arterial (LA) e analisados imediatamente após a lesão (tempo 0) a administração foi realizada da seguinte forma:

 HNF – administração intravenosa (Cristália, SP) (1 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer;

 HBPM – administração intravenosa (Clexane) (1 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer;

 DS – administração intravenosa (Sigma, Saint Louis, MO) (10 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer;

Nos grupos de animais com lesão arterial e analisados 14 dias após a administração foi realizada da seguinte forma:

 HNF – administração intravenosa (1 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer; 12 horas, 24 horas e 48 horas após a lesão arterial ocorrer;

 HBPM – administração intravenosa (1 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer; 12 horas, 24 horas e 48 horas após a lesão arterial ocorrer;

 DS – administração intravenosa (10 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer; 12 horas, 24 horas e 48 horas após a lesão arterial ocorrer.

4. Modelo de indução de trombose arterial

Camundongos pesando 25g entre 6-7 semanas de idade foram anestesiados com 16 mg/kg de cloridrato de xilazina 2% e 100 mg/kg de ketamina. Após uma incisão na cervical média e após isolar a artéria carótida comum direita (figura 10A e 10B), foi provocada a lesão química (figura 10C). Colocou-se sobre a artéria um papel de 1mm² (Whatmann 3MM) previamente preparado com 15% de concentração de cloreto férrico, por 2 minutos (figura 10C), após este tempo o papel foi removido e o vaso lavado com PBS para evitar lesões em locais indesejados. Depois desse procedimento, foi posicionada uma sonda de ultrassom abaixo do vaso para medição do fluxo sanguíneo. A mensuração do fluxo foi registrada usando um modelo de ultrassom (Transonic System TS 420) (figura 10D). Foram utilizados 6 camundongos por grupo.

Para a preparação do papel com cloreto férrico, cortou-se papeis filtro no tamanho de 1 mm², sendo estes embebidos em uma solução de 15% de cloreto férrico por 24h. Após este tempo estes papeis foram secos em estufa por um período de 1h, e utilizados então, para o procedimento de lesão arterial.

Figura 10.Modelo de indução de lesão por cloreto ferrico. (A e B) Isolamento da artéria carótida comum, (C) indução da trombose arterial com papel saturado com cloreto férrico, (D) posicionamento da sonda de ultrassom para medição do fluxo sanguíneo.

5. Tempo de Trombose Arterial

Após a denudação arterial por modelo de cloreto férrico mencionada anteriormente, foi posicionada uma sonda de ultrasson (Transonic Flowprobe MAO 5 PBS) no vaso lesionado, e o fluxo sanguíneo registrado pelo programa DATAQ. O tempo entre a retirada do papel contendo a solução de cloreto férrico e o posicionamento da sonda de ultrasson na artéria carótida não ultrapassou o tempo de 1 minuto nos animais analisados.

Para o tempo de oclusão foi utilizada uma medida do tempo entre o fluxo inicial e o tempo onde o fluxo parou por oclusão do vaso pela formação do trombo. Foi medido o tempo de oclusão nos animais lesionados sem tratamento, lesionado e tratados com heparina, lesionados e tratados com HBPM, lesionados e tratados com DS.

6. Cálculo da área de trombo

A área de trombo analisada no tempo inicial após lesão arterial foi calculada pela subtração da área oclusa de lúmen da área total encoberta pela lâmina elástica interna. A área média foi calculada, em μm², pela subtração da área encoberta pela lâmina elástica interna da lâmina elástica externa.

7. Microscopia Intravital

A análise da formação de trombo nas artérias carótidas por meio da microscopia intravital foi realizada nos 4 grupos: 1) Lesão arterial e não tratado, 2) Lesão arterial e tratado com DS, 3) Lesão arterial e tratado Heparina e 4) Lesão arterial e tratado com HBPM.

A administração dos fármacos nos respectivos grupos foi feita como descrito no item 3, 10 minutos antes do procedimento de lesão ocorrer por cloreto férrico acontecer. Após esse período, foi aplicada na veia da cauda desses animais uma solução de Rodamina 6G na concentração de 0,1% em água (Sigma Aldrich, St Louis-USA). A Rodamina 6G é um corante fluorescente que tem afinidade pela membrana mitocondrial, que cora plaquetas e glóbulos brancos, excluindo os eritrócitos. Injetada a solução, os animais foram lesionados na artéria carótida direita com o papel embebido em solução de cloreto ferrico 15% por 2 minutos. As imagens foram captadas com auxílio de câmera Axiocam HSm e o experimento foi realizado no microscópio modelo Carl Zeiss Imager. A.2 gentilmente cedido pelo prof. Fábio Maranhão Costa. A filmagem foi feita por 12 minutos e as fotos obtidas nos tempos 0, 5 e 10 min foram analisadas para a verificação do tamanho do trombo. Após a captura de imagens, o software ImageJ foi utilizado para medição da fração do trombo formado no vaso nos três tempos analisados (0, 5 e 10 minutos).

8. Determinação do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) O TTPa é o tempo medido entre a adição de cálcio, na presença de uma cefalina (fator de contato) e a coagulação do plasma. A presença de um fator de contato (cefalina) ativa as reações da via intrínseca da coagulação. O TTPa corresponde ao tempo gasto para ocorrer a coagulação do plasma recalcificado em presença de cefalina. Esta substitui o fosfolipídio da membrana plaquetária. O TTPa foi medido no plasma com citrato de sódio 3,8% de camundongos selvagens nos grupos controle, lesão tratados com DS, lesão

tratados com Heparina e lesão tratados com HBPM utilizando o kit TTPA Clot (Bios Diagnostica, SP). Em cada grupo foi feita a análise 12 e 24 após a lesão arterial, avaliada em triplicata. Para cada grupo foi utilizado n=3 animais.

O teste é usado na avaliação da via intrínseca de coagulação e monitoramento de terapias com agentes anticoagulantes. O ensaio foi realizado da seguinte maneira: 50 uL de amostras foram pré-aquecidas à 37°C durante 2 minutos em um bloco térmico; foram adicionados 50uL de reagente de TTPA clot ao tubo e incubou-se por 2 minutos à 37°C. Em seguida, adicionou-se 50 uL de cloreto de cálcio (CaCl2 pré-aquecido à 37°C) e iniciou-se a medição do tempo no coagulômetro CLOTimer (Clot, S.P, Brasil).

9. Determinação do tempo de protrombina (TP)

O TP avalia a atividade extrínseca do sistema de coagulação. O reagente para análise contém fator tecidual, fosfolipídios e cálcio. A determinação do tempo de protrombina é adequada para acompanhamento de terapias com drogas antitrombóticas. O tempo de protrombina foi dosado em plasma citratado (1 parte de citrato de sódio 3,8%: 9 partes de sangue venoso) de camundongos nos 4 grupos citados anteriormente neste estudo. A análise foi feita utilizando-se o kit TP Clot (Bios Diagnostica, SP). O ensaio foi realizado da seguinte maneira: pipetou-se em uma cubeta pré-aquecida à 37°C 50uL de plasma e incubou-se por 1 minuto à 37°C; adicionou-se 100uL de reagente para teste de protrombina previamente preparado e também pré-aquecido à 37°C. Com a adição do reagente, iniciou-se a medição no coagulômetro (tempo medido em segundos). As amostras foram feitas em triplicata para cada grupo de animal, onde foi utilizado n=3 animais.

10. Determinação do Tempo de Sangramento (TS)

Realizou-se uma incisão longitudinal de 3 mm de comprimento por 2 mm de profundidade, na face ventral da cauda do animal, entre 1,5 cm do final desta, evitando-se grandes veias. A cauda foi mergulhada em uma proveta com solução salina a 37ºC (Dejana et al., 1979). O tempo de sangramento foi mensurado desde o momento da incisão até o final do sangramento (Liu et al.; Broze et al., 2001).

11. Análise Histológica

As artérias carótidas obtidas nos diferentes tempos foram coletadas e embebidas em OCT (Tissue Tek Optimal Cutting temperature compound, Torrance – USA), e armazenadas no biofreezer a -80°C. Em seguida foram feitos cortes transversais de 8 µm de espessura em criostato, com 20 lâminas de cada vaso com 5 cortes por lâmina, também armazenados em biofreezer a -80°C. Os cortes foram descongelados e as lâminas 1, 5, 10, 15 e a 20 foram coradas com hematoxilina-eosina. As lâminas foram montadas com Cytoseal 60 (Richard Allan Scientific) e examinadas em microscópio Olympus BX600. As imagens foram feitas com câmera Olympus Optical U-ULH e analisadas com o programa ImageJ. Para a área de trombo foi escolhido o corte com maior obstrução ao longo do vaso, e a área do trombo foi calculada pela subtração da área ocluída do vaso pela área total do vaso delimitada pela lâmina elástica.

12. Ensaio de Imunofluorescência

Realizou-se imunohistoquímica para a análise de marcadores expressos pelas células no vaso. Para isso, foram utilizados os anticorpos rat anti-mouse CD 31 (Invitrogen), para a visualização das células endoteliais maduras, para que houvesse uma análise da capacidade dos glicosaminoglicanos na proteção dessas células após a denudação endotelial, rat anti mouse CD 34 (eBioscience), um marcador para células progenitoras endoteliais para que se identificasse a mobilidade destas para o vaso após lesão, o rat anti-mouse CD11b, característicos de células leucocitárias envolvidas na inflamação e anti-ICAM-1 (eBioscience, San Diego, CA), molécula de adesão intercelular envolvida na transmigração de leucócitos. Os anticorpos foram diluídos conforme instruções do fabricante, e depois de incubados por pelo menos 2 horas, lavou-se para retirar o excesso de anticorpo e incubou-lavou-se com o anticorpo lavou-secundário anti-rat FITC (eBiocience) por 45 minutos. Em seguidas as amostras foram lavadas e os núcleos corados com DAPI por 15 minutos. As lâminas foram montadas e examinou-se em microscópio Olympus BX600. As imagens foram feitas com câmera Olympus Optical U-ULH. Após revelação das imagens, utilizou-se o programa ImageJ para quantificação das marcações fluorescentes dos cortes de artérias carótidas. Uma lâmina sem o anticorpo primário (controle negativo) foi feita para subtração da autofluorescência das artérias. Em cada lâmina contendo cinco cortes, foi escolhido o corte com mais marcações. Para cada grupo analisado, foram utilizadas três lâminas diferentes de animais.

13. Cálculo área da neoíntima

A área de neoíntima analisada 14 dias após lesão arterial foi calculada pela subtração da área de neoíntima formada no lúmen da área total encoberta pela lâmina elástica interna. A área média foi calculada, em μm², pela subtração da área encoberta pela lâmina elástica interna da lâmina elástica externa.

14. Zimografia ‘in situ’

Metaloproteinases (MMPs), como as colagenases, gelatinases degradam colágeno, gelatina e outros componentes da matriz extracelular, contribuindo no processo inflamatório e mediando o remodelamento vascular. As principais gelatinases envolvidas no processo de remodelamento tecidual são MMP-2 e MMP-9. A atividade destas enzimas foi analisada artérias carótidas obtidas dos diferentes grupos de tratamento. Considerou-se o aumento da fluorescência como proporcional a atividade proteolítica das gelatinases. As artérias carótidas foram obtidas como descrito anteriormente; os cortes foram incubados em câmara úmida escura por 2 horas com 100 μg/mL de DQ gelatina em solução tampão de acordo com as instruções do fabricante. Depois os cortes foram analisados com microscópio de fluorescência (Observer Z1, Zeiss) usando lentes objetivas de 20x e câmera AxioCam MRm (Zeiss) e as imagens capturadas usando o programa AxioVision Release 4.8.2.0. A atividade proteolítica foi detectada por um aumento da intensidade de fluorescência devido à atividade gelatinolítica, e a intensidade de fluorescência nos diferentes cortes foi quantificada no programa Image J (NIH). O corte apresentando maior fluorescência foi selecionado. Foi feita lâmina sem a solução de DQ-gelatina como controle negativo. Foram utilizados n=3 animais em cada grupo. A análise de zimografia ‘in situ’ foi feita no tempo inicial após lesão arterial e 14 dias após lesão arterial.

15. Agregação plaquetária

Realizou-se a coleta de sangue venoso periférico humano de doador em jejum (período de 12 horas) em tubos contendo citrato de sódio a 3,2%. Após a centrifugação do sangue por 15 minutos a 100xg foi obtido o plasma rico em plaqueta (PRP) e por 20 minutos a 2400xg para obtenção do plasma pobre em plaqueta (PPP). Para medição da agregação foi utilizado um agregômetro de dois canais (490-2D, Chrono-log Corporation, Havertown, PA, USA). A calibração inicial do aparelho foi feita com concentração de

500 μL de PPP. Em cada amostra foi utilizado 500 μL de PRP, o qual foi mantido em 37°C antes de iniciar o ensaio. Após isso, adicionou-se o agente agonista trombina na concentração de 0,25 U/ml no plasma e mediu-se a agregação plaquetária por 14 minutos. Os grupos analisados foram controle: PRP+ trombina; DS: PRP + dermatan sulfato + trombina; Heparina: PRP + Heparina+ trombina e HBPM: PRP + HBPM + trombina.

16. Análise Estatística

A análise de cada grupo individual foi expressa pela média ± desvio-padrão. A avaliação da média entre os grupos foi realizada através do teste Mann Whitney, com critério de significância estatística p≤ 0,05.