1. Animais
Foram utilizados camundongos machos selvagens de linhagem C57BL/6 adquiridos no CEMIB/UNICAMP, mantidos em biotério do Departamento de Biologia Celular e Estrutural da UNICAMP sob responsabilidade da Profa. Dra. Cristina Pontes Vicente. Este trabalho teve a aprovação do comitê de ética da UNICAMP (CEUA n° 3892-1).
2. Grupos experimentais
Neste estudo foram testadas quatro condições de tratamento em camundongos C57BL/6: i) animais lesionados e não tratados ii) animais lesionados e tratados com dermatan sulfato iii) animais lesionados e tratados com heparina não fracionada iv) animais lesionados e tratados com heparina de baixo peso molecular.
Os quatro grupos de animais foram analisados sob as circunstâncias:
3. Tratamentos com GAGs
Nos grupos de animais com lesão arterial (LA) e analisados imediatamente após a lesão (tempo 0) a administração foi realizada da seguinte forma:
HNF – administração intravenosa (Cristália, SP) (1 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer;
HBPM – administração intravenosa (Clexane) (1 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer;
DS – administração intravenosa (Sigma, Saint Louis, MO) (10 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer;
Nos grupos de animais com lesão arterial e analisados 14 dias após a administração foi realizada da seguinte forma:
HNF – administração intravenosa (1 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer; 12 horas, 24 horas e 48 horas após a lesão arterial ocorrer;
HBPM – administração intravenosa (1 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer; 12 horas, 24 horas e 48 horas após a lesão arterial ocorrer;
DS – administração intravenosa (10 mg/kg animal), 10 minutos antes do procedimento de lesão arterial ocorrer; 12 horas, 24 horas e 48 horas após a lesão arterial ocorrer.
4. Modelo de indução de trombose arterial
Camundongos pesando 25g entre 6-7 semanas de idade foram anestesiados com 16 mg/kg de cloridrato de xilazina 2% e 100 mg/kg de ketamina. Após uma incisão na cervical média e após isolar a artéria carótida comum direita (figura 10A e 10B), foi provocada a lesão química (figura 10C). Colocou-se sobre a artéria um papel de 1mm² (Whatmann 3MM) previamente preparado com 15% de concentração de cloreto férrico, por 2 minutos (figura 10C), após este tempo o papel foi removido e o vaso lavado com PBS para evitar lesões em locais indesejados. Depois desse procedimento, foi posicionada uma sonda de ultrassom abaixo do vaso para medição do fluxo sanguíneo. A mensuração do fluxo foi registrada usando um modelo de ultrassom (Transonic System TS 420) (figura 10D). Foram utilizados 6 camundongos por grupo.
Para a preparação do papel com cloreto férrico, cortou-se papeis filtro no tamanho de 1 mm², sendo estes embebidos em uma solução de 15% de cloreto férrico por 24h. Após este tempo estes papeis foram secos em estufa por um período de 1h, e utilizados então, para o procedimento de lesão arterial.
Figura 10.Modelo de indução de lesão por cloreto ferrico. (A e B) Isolamento da artéria carótida comum, (C) indução da trombose arterial com papel saturado com cloreto férrico, (D) posicionamento da sonda de ultrassom para medição do fluxo sanguíneo.
5. Tempo de Trombose Arterial
Após a denudação arterial por modelo de cloreto férrico mencionada anteriormente, foi posicionada uma sonda de ultrasson (Transonic Flowprobe MAO 5 PBS) no vaso lesionado, e o fluxo sanguíneo registrado pelo programa DATAQ. O tempo entre a retirada do papel contendo a solução de cloreto férrico e o posicionamento da sonda de ultrasson na artéria carótida não ultrapassou o tempo de 1 minuto nos animais analisados.
Para o tempo de oclusão foi utilizada uma medida do tempo entre o fluxo inicial e o tempo onde o fluxo parou por oclusão do vaso pela formação do trombo. Foi medido o tempo de oclusão nos animais lesionados sem tratamento, lesionado e tratados com heparina, lesionados e tratados com HBPM, lesionados e tratados com DS.
6. Cálculo da área de trombo
A área de trombo analisada no tempo inicial após lesão arterial foi calculada pela subtração da área oclusa de lúmen da área total encoberta pela lâmina elástica interna. A área média foi calculada, em μm², pela subtração da área encoberta pela lâmina elástica interna da lâmina elástica externa.
7. Microscopia Intravital
A análise da formação de trombo nas artérias carótidas por meio da microscopia intravital foi realizada nos 4 grupos: 1) Lesão arterial e não tratado, 2) Lesão arterial e tratado com DS, 3) Lesão arterial e tratado Heparina e 4) Lesão arterial e tratado com HBPM.
A administração dos fármacos nos respectivos grupos foi feita como descrito no item 3, 10 minutos antes do procedimento de lesão ocorrer por cloreto férrico acontecer. Após esse período, foi aplicada na veia da cauda desses animais uma solução de Rodamina 6G na concentração de 0,1% em água (Sigma Aldrich, St Louis-USA). A Rodamina 6G é um corante fluorescente que tem afinidade pela membrana mitocondrial, que cora plaquetas e glóbulos brancos, excluindo os eritrócitos. Injetada a solução, os animais foram lesionados na artéria carótida direita com o papel embebido em solução de cloreto ferrico 15% por 2 minutos. As imagens foram captadas com auxílio de câmera Axiocam HSm e o experimento foi realizado no microscópio modelo Carl Zeiss Imager. A.2 gentilmente cedido pelo prof. Fábio Maranhão Costa. A filmagem foi feita por 12 minutos e as fotos obtidas nos tempos 0, 5 e 10 min foram analisadas para a verificação do tamanho do trombo. Após a captura de imagens, o software ImageJ foi utilizado para medição da fração do trombo formado no vaso nos três tempos analisados (0, 5 e 10 minutos).
8. Determinação do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) O TTPa é o tempo medido entre a adição de cálcio, na presença de uma cefalina (fator de contato) e a coagulação do plasma. A presença de um fator de contato (cefalina) ativa as reações da via intrínseca da coagulação. O TTPa corresponde ao tempo gasto para ocorrer a coagulação do plasma recalcificado em presença de cefalina. Esta substitui o fosfolipídio da membrana plaquetária. O TTPa foi medido no plasma com citrato de sódio 3,8% de camundongos selvagens nos grupos controle, lesão tratados com DS, lesão
tratados com Heparina e lesão tratados com HBPM utilizando o kit TTPA Clot (Bios Diagnostica, SP). Em cada grupo foi feita a análise 12 e 24 após a lesão arterial, avaliada em triplicata. Para cada grupo foi utilizado n=3 animais.
O teste é usado na avaliação da via intrínseca de coagulação e monitoramento de terapias com agentes anticoagulantes. O ensaio foi realizado da seguinte maneira: 50 uL de amostras foram pré-aquecidas à 37°C durante 2 minutos em um bloco térmico; foram adicionados 50uL de reagente de TTPA clot ao tubo e incubou-se por 2 minutos à 37°C. Em seguida, adicionou-se 50 uL de cloreto de cálcio (CaCl2 pré-aquecido à 37°C) e iniciou-se a medição do tempo no coagulômetro CLOTimer (Clot, S.P, Brasil).
9. Determinação do tempo de protrombina (TP)
O TP avalia a atividade extrínseca do sistema de coagulação. O reagente para análise contém fator tecidual, fosfolipídios e cálcio. A determinação do tempo de protrombina é adequada para acompanhamento de terapias com drogas antitrombóticas. O tempo de protrombina foi dosado em plasma citratado (1 parte de citrato de sódio 3,8%: 9 partes de sangue venoso) de camundongos nos 4 grupos citados anteriormente neste estudo. A análise foi feita utilizando-se o kit TP Clot (Bios Diagnostica, SP). O ensaio foi realizado da seguinte maneira: pipetou-se em uma cubeta pré-aquecida à 37°C 50uL de plasma e incubou-se por 1 minuto à 37°C; adicionou-se 100uL de reagente para teste de protrombina previamente preparado e também pré-aquecido à 37°C. Com a adição do reagente, iniciou-se a medição no coagulômetro (tempo medido em segundos). As amostras foram feitas em triplicata para cada grupo de animal, onde foi utilizado n=3 animais.
10. Determinação do Tempo de Sangramento (TS)
Realizou-se uma incisão longitudinal de 3 mm de comprimento por 2 mm de profundidade, na face ventral da cauda do animal, entre 1,5 cm do final desta, evitando- se grandes veias. A cauda foi mergulhada em uma proveta com solução salina a 37ºC (Dejana et al., 1979). O tempo de sangramento foi mensurado desde o momento da incisão até o final do sangramento (Liu et al.; Broze et al., 2001).
11. Análise Histológica
As artérias carótidas obtidas nos diferentes tempos foram coletadas e embebidas em OCT (Tissue Tek Optimal Cutting temperature compound, Torrance – USA), e armazenadas no biofreezer a -80°C. Em seguida foram feitos cortes transversais de 8 µm de espessura em criostato, com 20 lâminas de cada vaso com 5 cortes por lâmina, também armazenados em biofreezer a -80°C. Os cortes foram descongelados e as lâminas 1, 5, 10, 15 e a 20 foram coradas com hematoxilina-eosina. As lâminas foram montadas com Cytoseal 60 (Richard Allan Scientific) e examinadas em microscópio Olympus BX600. As imagens foram feitas com câmera Olympus Optical U-ULH e analisadas com o programa ImageJ. Para a área de trombo foi escolhido o corte com maior obstrução ao longo do vaso, e a área do trombo foi calculada pela subtração da área ocluída do vaso pela área total do vaso delimitada pela lâmina elástica.
12. Ensaio de Imunofluorescência
Realizou-se imunohistoquímica para a análise de marcadores expressos pelas células no vaso. Para isso, foram utilizados os anticorpos rat anti-mouse CD 31 (Invitrogen), para a visualização das células endoteliais maduras, para que houvesse uma análise da capacidade dos glicosaminoglicanos na proteção dessas células após a denudação endotelial, rat anti mouse CD 34 (eBioscience), um marcador para células progenitoras endoteliais para que se identificasse a mobilidade destas para o vaso após lesão, o rat anti-mouse CD11b, característicos de células leucocitárias envolvidas na inflamação e anti-ICAM-1 (eBioscience, San Diego, CA), molécula de adesão intercelular envolvida na transmigração de leucócitos. Os anticorpos foram diluídos conforme instruções do fabricante, e depois de incubados por pelo menos 2 horas, lavou- se para retirar o excesso de anticorpo e incubou-se com o anticorpo secundário anti-rat FITC (eBiocience) por 45 minutos. Em seguidas as amostras foram lavadas e os núcleos corados com DAPI por 15 minutos. As lâminas foram montadas e examinou-se em microscópio Olympus BX600. As imagens foram feitas com câmera Olympus Optical U- ULH. Após revelação das imagens, utilizou-se o programa ImageJ para quantificação das marcações fluorescentes dos cortes de artérias carótidas. Uma lâmina sem o anticorpo primário (controle negativo) foi feita para subtração da autofluorescência das artérias. Em cada lâmina contendo cinco cortes, foi escolhido o corte com mais marcações. Para cada grupo analisado, foram utilizadas três lâminas diferentes de animais.
13. Cálculo área da neoíntima
A área de neoíntima analisada 14 dias após lesão arterial foi calculada pela subtração da área de neoíntima formada no lúmen da área total encoberta pela lâmina elástica interna. A área média foi calculada, em μm², pela subtração da área encoberta pela lâmina elástica interna da lâmina elástica externa.
14. Zimografia ‘in situ’
Metaloproteinases (MMPs), como as colagenases, gelatinases degradam colágeno, gelatina e outros componentes da matriz extracelular, contribuindo no processo inflamatório e mediando o remodelamento vascular. As principais gelatinases envolvidas no processo de remodelamento tecidual são MMP-2 e MMP-9. A atividade destas enzimas foi analisada artérias carótidas obtidas dos diferentes grupos de tratamento. Considerou-se o aumento da fluorescência como proporcional a atividade proteolítica das gelatinases. As artérias carótidas foram obtidas como descrito anteriormente; os cortes foram incubados em câmara úmida escura por 2 horas com 100 μg/mL de DQ gelatina em solução tampão de acordo com as instruções do fabricante. Depois os cortes foram analisados com microscópio de fluorescência (Observer Z1, Zeiss) usando lentes objetivas de 20x e câmera AxioCam MRm (Zeiss) e as imagens capturadas usando o programa AxioVision Release 4.8.2.0. A atividade proteolítica foi detectada por um aumento da intensidade de fluorescência devido à atividade gelatinolítica, e a intensidade de fluorescência nos diferentes cortes foi quantificada no programa Image J (NIH). O corte apresentando maior fluorescência foi selecionado. Foi feita lâmina sem a solução de DQ-gelatina como controle negativo. Foram utilizados n=3 animais em cada grupo. A análise de zimografia ‘in situ’ foi feita no tempo inicial após lesão arterial e 14 dias após lesão arterial.
15. Agregação plaquetária
Realizou-se a coleta de sangue venoso periférico humano de doador em jejum (período de 12 horas) em tubos contendo citrato de sódio a 3,2%. Após a centrifugação do sangue por 15 minutos a 100xg foi obtido o plasma rico em plaqueta (PRP) e por 20 minutos a 2400xg para obtenção do plasma pobre em plaqueta (PPP). Para medição da agregação foi utilizado um agregômetro de dois canais (490-2D, Chrono-log Corporation, Havertown, PA, USA). A calibração inicial do aparelho foi feita com concentração de
500 μL de PPP. Em cada amostra foi utilizado 500 μL de PRP, o qual foi mantido em 37°C antes de iniciar o ensaio. Após isso, adicionou-se o agente agonista trombina na concentração de 0,25 U/ml no plasma e mediu-se a agregação plaquetária por 14 minutos. Os grupos analisados foram controle: PRP+ trombina; DS: PRP + dermatan sulfato + trombina; Heparina: PRP + Heparina+ trombina e HBPM: PRP + HBPM + trombina.
16. Análise Estatística
A análise de cada grupo individual foi expressa pela média ± desvio-padrão. A avaliação da média entre os grupos foi realizada através do teste Mann Whitney, com critério de significância estatística p≤ 0,05.