Resistência de união de restaurações de resina composta à dentina, após tratamentos com biomodificadores naturais

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

MARCELA ALVAREZ FERRETTI

RESISTÊNCIA DE UNIÃO DE RESTAURAÇÕES DE RESINA

COMPOSTA À DENTINA, APÓS TRATAMENTO COM

BIOMODIFICADORES NATURAIS

Piracicaba – SP 2019

MARCELA ALVAREZ FERRETTI

RESISTÊNCIA DE UNIÃO DE RESTAURAÇÕES DE RESINA

COMPOSTA À DENTINA, APÓS TRATAMENTO COM

BIOMODIFICADORES NATURAIS

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Clínica Odontológica, na Área de Dentística

Orientador: Prof. Dr. Flavio Henrique Baggio Aguiar Coorientador: Prof. Dr. Klaus Heinz Rischka

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MARCELA ALVAREZ FERRETTI E ORIENTADA PELO PROF. DR. FLAVIO HENRIQUE BAGGIO AGUIAR.

Piracicaba – SP 2019

Ferretti, Marcela Alvarez,

F415r FerResistência de união de restaurações de resina composta à dentina, após tratamentos com biomodificadores naturais / Marcela Alvarez Ferretti. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2019.

FerOrientador: Flavio Henrique Baggio Aguiar. FerCoorientador: Klaus Heinz Rischka.

FerDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.

Fer1. Dopamina. 2. Dopa (Medicamento). 3. Ácido fítico. 4. Resistência à tração. 5. Microscopia confocal. 6. Adesivos dentinários. I. Aguiar, Flavio Henrique Baggio, 1977-. II. Rischka, Klaus Heinz. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Microtensile bond strength of the resin-dentin interface after treatment with natural biomodifiers

Palavras-chave em inglês: Dopamine Dopa Phytic acid Tensile strength Confocal microscopy Dentin-bonding agents

Área de concentração: Dentística

Titulação: Mestra em Clínica Odontológica Banca examinadora:

Flavio Henrique Baggio Aguiar [Orientador] Sérgio Eduardo de Paiva Gonçalves Marcelo Giannini

Data de defesa: 21-02-2019

Programa de Pós-Graduação: Clínica Odontológica

Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-3443-5021

- Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/6116409359541295

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada em 21 de Fevereiro de 2019, considerou a candidata MARCELA ALVAREZ FERRETTI aprovada.

PROF. DR. FLAVIO HENRIQUE BAGGIO AGUIAR

PROF. DR. SÉRGIO EDUARDO DE PAIVA GONÇALVES

PROF. DR. MARCELO GIANNINI

A Ata da defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho à minha família que sempre me apoiou em todas as situações da minha vida. Meus pais, que sempre acreditaram no meu potencial e me incentivam a seguir o caminho que eu escolhi, mesmo quando este caminho estivesse a quilômetros de casa, e aos meus irmãos que são parte essencial na minha história. Sem eles, grande parte das minhas memórias não seriam completas.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Primeiramente agradeço à Deus, por me dar a vida. Por ser capaz de abrir muitas portas, e me dar a oportunidade de conhecer o mundo com os meus olhos, para aprender as diferentes formas de ver as situações da vida e valorizar as pessoas que me amam.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Flavio Henrique Baggio Aguiar, pela dedicação, apoio e paciência. Agradeço imensamente por partilhar seus ensinamentos comigo, sendo sempre um exemplo a ser seguido de competência, ética profissional e pessoa. Agradeço pela oportunidade concedida e confiança para a realização desse projeto, além da minha formação acadêmica. Sempre levarei a sua dedicação à odontologia como exemplo para a minha vida.

AGRADECIMENTOS

Aos amigos,

Finalizada essa etapa de extrema importância na minha vida, não poderia deixar de agradecer a todas aquelas pessoas que fazem parte da minha história e que direta e indiretamente me ajudaram a trilhar o caminho que me encontro, tornando-me a pessoa que sou hoje.

Á minha mãe Marisa Alvarez Ferretti, pelo exemplo de mulher, mãe e profissional, me apoiando incondicionalmente nas minhas maiores façanhas. Por me ensinar que não existem coisas certas ou erradas, apenas a visão de cada um, e que estas devem ser respeitadas. E a enxergar o “copo meio cheio”, quando este parecia estar “meio vazio”.

Ao meu pai José Rafael Ferretti, por estar presente em todas as decisões importantes da minha vida. Por me ensinar a ser uma pessoa honesta, profissional e estudiosa, e me incentivar a ter uma das melhores experiências da minha vida, que foi meu intercambio universitário. Por acreditar no meu potencial, até mesmo quando eu não tinha mais forças.

Aos meus irmãos Rafaela Alvarez Ferretti e Gustavo Alvarez Ferretti, por todo apoio e carinho, por dividirem comigo uma das melhores fases de nossas vidas, a infância, além de estarem comigo em todas as fases da minha vida, sempre dipostos a me ajudar e me impulsionar. Obrigada por aprenderem junto comigo desde as pequenas até as maiores coisas da vida. Ter irmãos é ter uma infância sempre guardada na memória e no coração de outra pessoa.

Aos meus amigos, que me ensinam todos os dias como é ter irmãos de outras mães.

Á minha amiga Jéssica, que acreditou no meu potencial e sempre me elogiou para que eu nunca desistisse do caminho que queria trilhar. Por passar noites corrigindo meus textos, mesmo quando não tinha quase tempo para respirar. Por compartilhar seus conhecimentos comigo de forma tão singular. Tive muita sorte, por ter uma pessoa tão brilhante me ajudando e ensinando.

Á minha amiga Mayara, que sempre me acolheu tão bem em todas as situações. Que sempre me apoia e me dá força em todos os momentos. Uma amizade que me faz muito bem.

Á minha amiga Renata, que me incentivou e ajudou a voltar para um país que eu amava sempre me dando força, e que tenho como exemplo de pessoa e amiga.

À minha amiga Maria Jordão por estar disposta a dividir seus conhecimentos sobre o assunto, e estar disposta ajudar na execução deste trabalho.

Ao meu amigo Felipe Joia, que nas piores horas me manteve firme sobre o propósito deste trabalho, e que mesmo sem tempo disponibilizou toda a ajuda necessária

À minha amiga Bruna, por sempre ser tão carinhosa e amorosa em todas as situações, e por manter uma amizade sincera desde a época da graduação.

À minha amiga Michele, por me ensinar muitas coisas sobre a pós graduação e se manter sempre por perto no primeiro ano de clínica odontológica da graduação como pós-graduanda, passando seus conhecimentos didáticos e sempre sendo muito delicada e empenhada com a profissão.

À minha amiga Suelem, por partilhar suas experiências, por disponibilizar seu tempo e paciência durante a finalização desta etapa. Além disso, por todos os conselhos e amizade durante toda trajetória da pós-graduação.

Ao meu amigo Maicon, que sempre me ensina muito sobre o mundo da pesquisa, e por sua amizade desde os tempo de graduação.

À minha amiga e parceira de casa Beatriz Mendonça, por estar presentes nos bons e maus momentos desta jornada de pós-graduação.

À minha amiga Lucinha, por estar do meu lado, me apoiando e me incentivando a crescer.

Aos meus amigos da dentística, Matheus, Bruna Resende, Daylana, Mayara Noronha, Mariana Flor, Rodrigo, Danielle, Jorge, Maria Del Carmen, Joyce, Mari Miura, que sempre me ajudaram direta ou indiretamente para o sucesso da minha pesquisa, e que são exemplos de profissionais e pessoas, os quais admiro muito.

Aos Professores,

A Profo. Dr. Klaus Rischka, que com seu conhecimento químico, deu-me a oportunidade de trabalhar com materiais inovadores, e auxiliou desde o planejamento até a execução deste projeto. Agradeço imensamente aos conhecimentos transmitidos para que este trabalho.

Aos demais professores da Área de Dentística, Luis Roberto Marcondes Martins, Marcelo Giannini, Luis Alexandre Maffei Sartini Paulillo, Giselle Maria Marchi Baron e Débora Alves Nunes Leite Lima, pela convivência diária e pelo conhecimento transmitido por toda a minha graduação e agora na pós-gradução.

À Faculdade, À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), na pessoa do Magnífico Reitor, Prof. Dr. Marcelo Knobel.

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade de Campinas, na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Francisco Heiter Neto e do diretor associado Prof. Dr. Flavio Henrique Baggio Aguiar.

À Coordenadoria Geral da Pós- Graduação da FOP/UNICAMP, em nome da Profa. Karina Gonzalez Silvério Ruiz, por toda atenção.

Ao Coordenador de Pós- Graduação em Clínica Odontológica da FOP/UNICAMP, Prof. Dr. Valentim Adelino Ricardo Barão.

Aos Professores, pelo aceite em participar da banca de defesa deste trabalho.

Ao Centro de Microscopia Eletrônica pelas imagens obtidas em análises de microscopia.

Aos técnicos de Laboratório Marcos Blanco e Adriano Martins, por todo suporte dado para o uso dos equipamentos.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior- CAPES (Processo:001) pela concessão da bolsa de nível de mestrado.

Agradeço imensamente por toda dedicação, a todos que contribuíram para a realização deste trabalho!

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência de união de restaurações de resina composta à dentina, após tratamento com biomodificadores naturais,3,4 Diidróxifenilalanina (DOPA), Dopamina, e ácido fítico. Foram utilizados 60 blocos de dentina provenientes de terceiros molares humanos, os quais foram divididos em 6 grupos (n=10): AFosf- condicionamento com ácido fosfórico, AF- condicionamento com ácido fítico, AFosf+DOPA- condicionamento com ácido fosfórico e DOPA, AFosf+Dopamina- condicionamento com ácido fosfórico e dopamina, AF+DOPA- condicionamento com ácido fítico e DOPA, AF+Dopamina- condicionamento com ácido fítico e dopamina. Foi realizada a remoção da superfície oclusal dos espécimes através de lixas de carbeto de silício (SiC), em que, cada grupo recebeu o tratamento indicado e todos os espécimes restaurados com 4 mm de altura pela técnica incremental com compósito microhíbrido. Todos os incrementos foram fotoativados por 20 segundos. Após a restauração, foram obtidos palitos de cada espécime para que fosse realizado o teste de microtração. Os palitos foram submetidos ao teste, 24 horas após a restauração dos espécimes. Das mesmas amostras restauradas foram obtidas 3 fatias de 1mm de espessura de cada grupo, avaliadas 7 dias após a restauração, para que fosse realizado o teste de atividade de zimografia in-situ, avaliando a atividade enzimática de metaloproteinases (MMPs) nos substratos tratados ou não, através de Microscopia Confocal de Varredura à Laser (MCVL). Os dados de resistência de união foram avaliados pelo teste de Tukey-Kramer (α=5%), e para avaliação do padrão de fratura utilizou-se o teste de qui-quadrado. As estruturas observadas na avaliação microscópica foram descritas e comparadas entre os grupos. Os grupos sem tratamento de superfície (AFosf e AF) apresentaram valores de resistência de união (RU) significativamente maior que todos os outros grupos com tratamento de superfície após 24 horas de armazenamento. Os grupos em que a DOPA foi utilizada como biomodificador de superfície, em ambos os ácidos, apresentaram valores de RU menores do que quando a dopamina foi empregada na superfície em ambos os ácidos. Os grupos com ácido fosfórico apresentaram RU significativamente maior que os grupos em que o ácido fítico foi empregado, indiferentemente do tipo de tratamento empregado. O grupo AFosf apresentou maior fluorescência na camada híbrida do que todos os outros grupos. Entre os grupos sem tratamento, AF apresentou menor fluorescência que o grupo AFosf. Quando os biomodificadores foram associados ao condicionamento de superfície com Afosf, apresentaram menor fluorescência na camada híbrida. Os grupos AF+ DOPA e AF+Dopamina, apresentaram menor fluorescência que o grupo AF. Conclusão: a utilização de biomodificadores se apresentou interessante quanto a inibição de MMPS após sete dias de armazenamento, mas não apresentaram vantagens quanto ao aumento de resistência de união imediata.

Palavras Chave:Dopamina, DOPA, Ácido Fítico, Resistência à tração, Microscopia Confocal, Adesivos Dentinários.

Abstract:

This study aimed to evaluate composite restoration microtensile bond strength to dentin, after dentin surface treatment with natural biomodifiers: DOPA, dopamine, and phytic acid. Sixty dentin blocks from human third molars were randomly divided into 6 groups (n=10): AFosf- Phosphoric acid etched dentin; AF- phytic acid etched dentin; AFosf+DOPA- etched dentin with phosphoric acid and DOPA treatment; AFosf+Dopamina- etched dentin with phosphoric acid and dopamine treatment; AF+DOPA- etched dentin with phytic acid and DOPA treatment; AF+Dopamina-etched dentin with phytic acid and dopamine. Silicon carbide paper was used to remove the occlusal portion of the specimens, and each group received its corresponding treatment. All specimens were restored with a 4-mm high microhybrid composite block, and each resin increment was light-cured separately for 20 s. Then, stick-shaped specimens were obtained for the microtensile bond strength test. The fractured specimens were evaluated regarding failure mode by scanning electron microscopy (SEM). Three 1 mm-thick slices were obtained from the same specimens above mentioned in order to perform in situ zimography by confocal laser scanning microscopy (CLSM) 7 days after restoration. Bond strength data were evaluated by the Tukey-Kramer test (α=0.05), and the chi-square test was used for failure mode analysis. For in situ zimography, a descriptive analysis was carried out, describing and comparing the structures observed among groups. AFosf and AF groups presented significantly higher mean bond strength (BS) values than all the other groups at 24 hours. The groups in which DOPA was used as a surface biomodifier showed lower BS compared to dopamine, regardless of the acid used. The groups with phosphoric acid showed significantly higher BS than the groups in which phytic acid was used, regardless of the type of treatment. The AFosf group presented higher fluorescence in the hybrid layer than all the other groups. Among the groups without treatment, AF presented lower fluorescence than the AFosf. When biomodifiers were associated with phosphoric acid-etching, they led to lower fluorescence in the hybrid layer. The AF + DOPA and AF + dopamine groups presented lower fluorescence than the AF group. The biomodifiers used in this study were able to inhibit MMPs activity after 7 days of storage, but did not result in any increase in microtensile bond strength.

Keywords: Dopamine, DOPA, Phytic Acid, Tensile Strength, Microscopy- Confocal, Dentin-Bonding Agents.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 14

2 REVISÃO DE LITERATURA ... 17

3 PROPOSIÇÃO ...24

4 MATERIAL E MÉTODOS ...25

4.1 Preparo das Amostras...25

4.2Procedimento Restaurador...25

4.3 Atividade Gelatinolítica de Dentina –Zimografia in situ...32

4.4Análise topográfica da superfície por Micrsocopia Eletrônica de Varredura (MEV)………...34

4.5 Ensaio Mecânico de Microtração...34

4.6 Análise do padrão de Fratura- Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).35 4.7 Análise Estatística ...36

5 RESULTADOS ...36

5.1 Atividade gelatinolítica de Dentina –Zimografia in situ ...36

5.2 Análise topográfica da superfície por Micrsocopia Eletrônica de Varredura (MEV)………39

5.3 Resistência de união por microtração ...39

5.4 Padrão de fratura dos espécimes testados (em MEV)...40

6 DISCUSSÃO ...42

7 CONCLUSÃO ...47

REFERÊNCIAS ...48

ANEXO 1 – Certificado de aprovação – CEP - FOP/UNICAMP ...63

1.INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de materias adesivos vem tomando espaço na Odontologia moderna, proporcionando técnicas menos invasivas de reconstrução de substratos dentais perdidos, além de proporcionar maior biocompatibilidade com os tecidos dentais e estética (Manhart et al, 2004; Peumans et al, 2005). A união da resina composta à estrutura dental, se dá pela formação de uma camada intermediária híbrida. Entretanto, a principal razão de insucesso de restaurações adesivas, ocorre devido falha na camada híbrida formada por hidrólise e degradação das fibrilas de colágeno (Pashley, Tay e Breschi et al.,2011).

A camada híbrida é formada a partir do embricamento micromecânico dos monômeros adesivos com as fibrilas colágenas expostas por condicionamento ácido do substrato dental. Ao ser condicionada, a superfície dentinária perde parte de sua matriz mineralizada, composta principalmente por cristais de hidroxiapatita, e permite a exposição de fibrilas colágenas que estavam envoltas pela matriz mineralizada (Palosaari et al.,2003;Chaussain-Miller, Fioretti, Goldberg e Menashi, 2006; Hannas et al., 2007). Além, da exposição das fibrilas colágenas, a diminuição do pH do meio e dissolução dos cristais, permite que outros componentes também aprisionados neste substrato, sejam ativados por sua liberação, como as MMPs e cisteínas catepsinas (Tjäderhane et al.,1998; Sulkala et al.,2001; Chaussain et al.,2013). As MMPs são enzimas endógenas, cálcio e zinco dependentes, produzidas por odontoblastos na formação da matriz dentinária, e mineralizadas na maturação desta (Hannas et al, 2007; Mazzoni et al, 2012). Estas enzimas possuem atividade colagenolítica, quando o colágeno se encontra desprotegido da matriz mineralizada, modificando sua estrutura molecular tridimensional através de sua clivagem e desnaturando-os (Mazzoni et al., 2015).

Agentes biomodificadores de superfície dentinária vem sendo estudados, a fim de solucionar este problema. Estes agentes são responsáveis por preencher os sítios ativos locais de ligação das fibrilas colágenas, com o intuito de torná-las mais resistentes (Sabatini C e Pashley DH, 2014), além de inibir a ligação nestes sítios com MMPs, que ao se ligarem fazem sua deterioração. Na literatura, pode-se encontrar muitos agentes de biomodificação, como proantocianidina, glutaraldeído, riboflavina. Porém, existem algumas desvantagens que tornam suas aplicações

inviáveis (Xu e Wang, 2011; Perikamana et al., 2015; Forooshani et al., 2016). A proantocianidina prejudica a polimerização dos monômeros do adesivo, uma das principais causas de insucesso das restaurações adesivas (Wollensak G et al.,2007; Epasinghe DJet al., 2012). O glutaraldeído possui grande citotoxidade (Epasinghe DJ et al., 2012; Kalachandra S e Turner DT, 1989), e a riboflavina apresenta como limitação a ativação somentena presença de luz ultravioleta, a qual é extrememanete prejudicial aos tecidos humanos (Sionkowska, 2006; Wollensak et al., 2007).

A 3,4 diidróxifenilalanina (DOPA) é um aminoácido produzido por mexilhões, sendo o principal componente para que estes seres vivos fiquem aderidos em superfícies de alta umidade, orgânicas ou inorgânicas, e até mesmo metálicas (Faure et al., 2013; Perikamanas et al., 2015; Ahn et al.,2015; Forooshani e Lee, 2017). Possui um grupo catecol em sua composição molecular, que ao ser oxidado, promove adesão em várias superfícies, já supracitado. A dopamina, outro aminoácido derivado da DOPA, tem sido estudada quanto sua promoção de biomodificação de colágeno e aderência em superfícies variadas, por possuirem capacidade de adesão semelhantes (Waite, 1997). Para oxidar e catalizar a reação, tanto da DOPA, quanto da Dopamina, utiliza-se a lacase, uma enzima glicoproteíca, pertencente a família das oxidases de cobre azul. Esta oxidase é encontrada em uma grande variedade de fungos, e algumas plantas (Thurston, 1994).

Além dos agentes biomoidificadores naturais, existe também uma substância ácida que vem sendo pesquisada, o ácido fítico, que promove o condicionamento da superfície, através da dissolução de cristais de hidroxiapatita e eliminacao de smear layer, como também a biomodificação do colágeno exposto. A eliminação de smear layer ocorre pela capacidade de quelação deste ácido com os íons de cálcio da hidroxiapatita (Ravichandran et al., 2013; Lee et al.,2011; Cheryan, 1980). Além disso, quando comparado ao ácido fosfórico, que é comumente utilizado, promove menos injúrias aos tecidos pulpares, por apresentar menor citotoxicidade (Nassar et al.,2013).

Nesse contexto, DOPA, dopamina e ácido fítico poderiam ser uma alternativa ás substâncias já utilizadas para a estabilização do colágeno dentinário e proteção contra a degradação hidrolítica e proteolítica. Assim, estudos com estes novos

biomodificadores de colágeno tornam-se necessários, para avaliar se são mais eficientes e menos prejudiciais quanto aos outros biomodificadores existentes na literatura.

Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os biomodificadores de superfície DOPA, Dopamina e ácido fítico quanto seu efeito inibitório sobre as MMPs e se a utilização destes, afeta a resistência de união do adesivo na dentina. As hipóteses nulas deste estudo são de que o tratamento do colágeno com estes biomodificadores (I) evita a degradação do colágeno por metaloproteinases, como também (II) a resistência de união.

2.REVISÃO DE LITERATURA

A Odontologia adesiva foi introduzida, a fim de suprir as necessidades do material mais utilizado antigamente, o amalgáma de prata. Entre essas necessidades, as principais se resumiam na grande diferença do módulo de elasticidade com os tecidos dentais, técnica invasiva em tecidos sadios, a fim de gerar uma retenção mecânica do material na cavidade, e falta de estética (Burke et al., 2004).

Em busca de um material que proporcionasse essas melhorias, foram desenvolvidas as resinas compostas. Atualmente, é o material mais utilizado para restaurações diretas em dentes anteriores e posteriores. O processo mais importante para o sucesso destas restaurações adesivas está diretamente relacionado à camada híbrida formada, através da estabilidade de seus componentes, tal como as fibrilas colágenas envolvidadas e as cadeias poliméricas formadas(Nakabayashi, 1982 A).

O conceito de camada híbrida foi primeiramente utilizado por Nakabayashi et al., cerca de 40 atrás. Este era baseado na interligação da matriz de monômeros resinosos por entre as fibrílas de colágeno dentinárias expostas, previamente, por condicionamento ácido (Nakabayashi et al., 1982 B). Sabe-se que o tecido dentinário é estruturado por 70% de matriz mineralizada de cristais de hidroxiapatita, 20% de matriz orgânica (colágeno tipo I), enquanto os 10% restantes são de água (Nancy, 2008). A matriz é entremeada por túbulos dentinários, que começam sua propagação próximos a polpa e terminam na junção amelo-dentinária (Luz e Mano, 2010). Antes da mineralização dentinária, a matriz não mineralizada composta principalmente por colágeno, são permeadas por moléculas de água, que possuem ligações fortes e são extremamente organizadas. No processo de mineralização, essa água é substituida por minerais que fazem com que a estrutura de colágeno fique presa na estrutura mineral (Bella, Brodsky e Berman,1995; Tjäderhane e Haapasalo, 2012). Além disso, duas enzimas também são produzidas na formação da matriz dentinária: MMPS e cisteínas catepsinas (Palosaari et al, 2003; Hannas et al., 2007).

odontoblastos durante a formação da matriz dentinária (Palosaari et al, 2003; Hannas et al., 2007). Considerando seu alto poder de degradação de matrizes extracelulares, pode-se citar sua relevância nos processos biológicos e patológicos neste substrato (Hannas et al, 2007; Mazzoni et al, 2012). Um desses processos biológicos, além da degradação das matrizes extracelulares, é a capacidade das MMPs de conversão de matrizes não-colágenas em moléculas de sinalização, que atrapalham e afetam a proliferação, a diferenciação e supervivência celular (Page-McCaw, Ewald e Werb, 2007).

As MMPs são aprisionadas na matriz dentinária durante o processo de maturação (Palosaari et al, 2003; Hannas et al., 2007; Chaussain-Miller, Fioretti, Goldberg e Menashi, 2006). Se tornam ativas novamente, quando há decréscimo do pH do meio, tornando-se um meio ácido, o qual proporciona uma dissolução da matriz mineralizada e estas são desprendidas (Tjäderhane et al, 1998; Sulkala et al, 2001). Porém, as MMPs apresentam seu maior grau de atividade quando o pH ácido que as liberou, volta a subir e se torna neutro (Tjäderhane et al, 1998; Chaussain et al, 2013). No substrato dental, estas enzimas possuem capacidade colagenolítica, degradando o colágeno existente na matriz dentinária (Tjäderhane et al, 1998) e, consequentemente, interferindo na durabilidade da camada híbrida adesiva (Mazzoni et al, 2015), através de sua ligação em sítios ativos de colágeno.

Existem também as cisteínas catepsinas que também exercem atividade colagenolítica importante neste substrato (TersariolI et al, 2010). Estas outras enzimas presentes no substrato dentinário, são produzidas por células odontoblásticas, como também por células pulpares (Tersariol et al., 2010; Liu et al., 2011; Scaffa et al., 2012; Tezvergil-Mutluay et al., 2013; Tjäderhane et al., 2013). Ao contrário das MMPs, estas enzimas exercem melhor atividade em pH ácido, além de uma melhor estabilidade, que em pH neutro, o qual pode inativá-las de forma irreversível (Turk et al, 1995). Em relação a progressão da lesão de cárie, estas enzimas exercem grande influência (Nascimento et al, 2011; Liu et al, 2011; Vidal et al, 2014). A catepsina do tipo K é responsável por 98% das atividades de catepsinas contra o colágeno, e difere-se das outras catepsinas existentes no substrato dentinário, além das MMPs, clinvando o colágeno helicoidal em vários locais, gerando múltiplos fragmentos de colágeno (Garnero et al, 1999).

Durante o processo de condicionamento com ácido fosfórico, este volume mineral dentinário diminui cerca de 50% na superfície e subsuperfície dentinária, com a dissolução dos cristais de hidroxiapatita da dentina peritubular e intertubular, e são substituidos por água na lavagem do substrato. Portanto, o conteúdo de água no substrato passa a ser de 60% em volume, e as fibrilas colágenas que compreendem o conteúdo orgânico, ficam envoltas por água em sua superfície. A hidratação deste colágeno, após perder a matriz mineralizada que estava envolto e antes de receber os co-monômeros resinosos é muito importante, pois à água cria pontes de hidrogênio interpeptídicas entre as fibrilas de colágeno para que estas não sofram colabamento (Pashley et al, 2007). O conceito de adesão em dentina úmida, foi desenvolvido para que as fibrilas de colágeno expostas, não colapsassem por secagem com jatos de ar (Kanca,1992) devido ao baixo módulo de elasticidade após a desmineralização da estrutura mineral (Balooch et al., 1998), além de otimizar a infiltração de monômeros resinosos de adesivo por entre essas fibrilas de colágeno (Eick et al.,1997). Estes 60 % de volume aquoso devem ser completamente substituídos por co-monômeros de resina, se interligando micromecanicamente e quimicamente com o colágeno, o então processo de hibridização (Pashley, Horner e Brewer, 1992; Cadenaro et al, 2009). Dentre estes 20% de matriz orgânica, 90% compreende as fibras colágenas, principalmente do tipo I (Tjäderhane et al, 2009). O processo de hibridização então, acontece a partir do condicionamento ácido de dentina e esmalte, em que, parte dos cristais de hidroxiapatita presentes em dentina peritubular e intertubular são dissolvidos, ocasionando zonas desmineralizadas com profundidade aproximada de 1-10 µm dependendo do tipo de condicionamento utilizado. Esta desmineralização do substrato dental, também promove exposição

das fibrilas colágenas existentes (Eick et al.,1997; Wang e Spencer, 2004; Wang e Spencer, 2002). A camada híbrida é formada por meio do embricamento micromecânico e químico do sistema adesivo, neste substrato dentinário desmineralizado, assim como o entrelaçamento com as fibrilas colágenas expostas (Wang e Spencer, 2003).

Um problema que leva à maior degradação da camada híbrida é a incompleta penetração dos monômeros adesivos na dentina desmineralizada além de sua incompleta polimerização, deixando as fibrilas de colágeno desprotegidas e susceptíveis à processos de degradação (Pashley et al., 2007). Fibrilas colágenas

sem proteção se rompem por fadigas cíclicas mais facilmente do que as recobertas com o adesivo, como também sofrem desnaturação por enzimas endógenas como as metaloproteinases (MMPs) e cisteinas catepsinas, em atividades prolongadas (Fung et al., 2009), além da degradação hidrolítica. A degradação hidrolítica da camada híbrida acontece, pois a água consegue penetrar em sítios onde houve falhas na reticulação do monômero com a fibríla de colágeno. As partes hidrofílicas do adesivo também representam um grande papel nesta degradação, pois possuem baixo grau de conversão dos monômeros resinosos, devido à separação de fases adesiva, o que os tornam facilmente degradáveis (Spencer e Wang, 2002), além do mais, a falta de compatibilidade entre a fase hidrófila do adesivo e seu fotoiniciador hidrófobo é um fator predisponente (Ye et al, 2009). Quanto mais espaços prenchidos com água o sistema possui, mais rápido acontece à eluição das resina ao longo da camada (Breschi et al, 2008). Desta forma, há uma exposição das matrizes de colágeno, previamente infiltradas por resina, tornando-se vulneráveis as enzimas proteolíticas (Armstrong et al, 2004; Pashley et al, 2004).

A fim de se aumentar a resistência do colágeno dentinário contra a degradação, substâncias consideradas biomodificadoras estão sendo utilizadas. O objetivo principal da utilização de biomodificadores é aumentar as propriedades químico-mecânicas do colágeno dentinário (Bedran-Russo et al., 2007; Castellan et al., 2010; Liu et al., 2013; Xu e Wang, 2011) e, assim consequentemente, aumentar a durabilidade da interface de união (Ruijgrok, Dewijn e Boon, 1994). A dentina desmineralizada tratada pelo biomodificador, torna-se mais rígida, devido às ligações cruzadas entre as fibras colágenas promovidas pelo biomodificador, e consequentemente mais resistente aos efeitos da degradação, pois impedem a que a conformação helicoidal tripla do colágeno se desenrole(Sabatini e Pashley, 2014). A dentina tratada torna-se mais resistente à ação de colagenases, como MMPs e cisteínas catepsinas, que participam ativamente na degradação do colágeno dentinário (Bedran-Russo AKB et al., 2010; Green B et al., 2010). Além disso, o aumento de durabilidade da interface adesiva pode ser explicado pela expansão gerada pelo biomodificador na molécula do colágeno, permitindo assim uma melhor difusão da resina hidrófila e solventes presentes no adesivo por entre as fibras (Carvalho et al.,2003).

Substâncias, naturais ou sintéticas, consideradas biomodificadoras, como glutaraldeído, genipina, riboflavina, proantocianidina tem sido testadas em suas capacidades de promoção de ligações cruzadas entre as moléculas de colágeno dentinário, e inibição de MMPs (Xu e Wang, 2011; Khor, 1997). Estas substâncias biomodificadoras externas, produzem reticulações covalentes estáveis, as quais podem inativar sítios ativos das proteínas dentinárias, ou reduzir a mobilidade molecular destes sítios ativos, e até mesmo alterar os grupos carboxila ionizados negativamente em amidas carregadas positivamente. Desta forma, este aumento na extensão da reticulação das fibrilas de colágeno antes da aplicação do adesivo, pode resultar em uma maior resistência do colágeno (Frassetto et al., 2016).

Embora apresentem aumento da resistência de união à longo prazo, e inibição de MMPs, essas substâncias apresentam características indesejáveis, como alta toxicidade, no caso do glutaraldeído ( Khor, 1997; Gendler, Gendler e Nimni, 1984), necessidade de luz UV para que ocorra sua ação, para a riboflavina (Sionkowska, 2006; Wollensak et al., 2007), e ainda, a proantocianidina por exemplo, que prejudica a polimerização dos adesivos na camada híbrida quando utilizada em altas concentrações(Epasinghe et al., 2012; Kalachandra e Turner, 1989).

3,4 – Diidróxifenilalanina (DOPA) (Figura 1) são aminoácidos produzidos por mexilhões para se aderirem a vários tipos de substratos, sendo estes, inorgânicos, orgânicos, ou metálicos, em condições desfavoráveis e com alta umidade (Perikamanas et al., 2015; Forooshani e Lee, 2017; Faure et al., 2013; Ahn et al.,2015) .

Figura 1: Estrutura Molecular da DOPA (PubChem)

Este é o principal componente em proteínas adesivas de mexilhões, responsável por dar durabilidade à resistência adesiva, além de ser impermeável a água (Kim et al, 2014). O grupo catecol presente na DOPA tem a capacidade de se oxidar, e assim, formar radicais, os quais se aderem facilmente à superfícies (Kaushik NK et al.,2015; Nardo et al., 2015). Ainda, proteínas contendo DOPA são responsáveis pela estabilidade e resistência do colágeno presente nos bissos dos mexilhões (Silverman HG e Roberto FF, 2007; Rodriguez et al., 2015), como também seu derivado, a dopamina (Figura 2), que possuem caracaterísticas semelhantes a da DOPA, quando comparadas a sua capacidade biomodificadora de colágeno e adesão em ambientes úmidos (Waite, 1997). Quando sua polimerização oxidativa ocorre em meio aquoso, forma-se imediatamente a polidopamina, mimetizando a DOPA (Lee et al., 2007; Ye, Zhou e Liu, 2011; Cha , Hwang e Lim , 2008).

Para que ocorra a oxidação destas substâncias é necessário a associação com a enzima glicoproteíca lacase. Esta pertence a família das oxidases de cobre azul, e são encontradas em praticamente todos os fungos, e algumas plantas (Thurston, 1994). Por possuir cobre em sua composição, tem capacidade de oxidar elétrons de várias substâncias (Mate e Alcalde, 2016). O processo de oxirredução que a lacase realiza, acontece com a ajuda de um cluster de quarto átomos de cobre que formam o núcleo catalítico da enzima (Piontek et al., 2002).

Figura 2: Estrtutura molecular da Dopamina (PubChem).

Existe também uma subtância ácida que promove tanto condicionamento da superfície dental, quanto a biomodificação do colágeno (Nassar et al., 2013). O ácido fítico (Figura 3), conhecido como hexafosfato de inositol (IP6) é encontrado em sementes de plantas, e tem como principal função o armazenamento de fosfato nestas sementes (Kuwano et al., 2009). Na odontologia, há poucas informações sobre a utilização do ácido fítico, porém há evidências de que o ácido fítico possui efeito cariostático ou anticariogênico, através da redução da solubilidade do esmalte (Borggreven e Driessens,1983), ou até mesmo pela falta de afinidade com os cristais de hidroxiapatita, criando um efeito antiplaca, através da redução da adsorção de bactérias na superfíceis dental (Nordbo e Rolla, 1972). Possui capacidade de condicionamento da superfície dentinária removendo smear layer devido a seu efeito quelante com íons de cálcio (Ca2+), promovendo assim um melhor embricamento micromecânico do adesivo (Cowieson, Acamovic e Bedford, 2006), também torna o colágeno mais resistente contra seu colapso, através de uma interação eletrostática, entre os ânions do ácido e os cátions existentes na proteína (Ravichandran et al., 2013; Lee et al., 2011; Cheryan, 1980). Sabe-se também, que em relação a sua citotoxicidade em células pulpares, o ácido fítico, quando comparado ao ácido fosfórico, comulmente utilizado, tem um efeito mínimo, o que garante um melhor prognóstico em relação à injúrias aos tecidos pulpares (Nassar et al., 2013). De acordo com Nassar 2013, no grupo em que o ácido fítico foi utilizado como condicionador de superfície, foi observado aumento de padrões de falhas mistas na interface adesivo-resina, o que sugere uma maior resistência da camada híbrida (Nassar et al, 2013).

3. PROPOSIÇÃO:

O presente estudo teve como finalidade:

-Avaliação da atividade enzimática de metaloproteinases (MMPs) após tratamento da superfície dentinária com biomodificadores.

-Avaliação da resistência de união de restaurações de resina composta à dentina entre após o tratamento dentinário com biomodificadores;

4. MATERIAL E MÉTODOS:

• 4.1. Preparo das amostras:

Foram obtidos 60 terceiros molares humanos, aprovados pelo Comite de ética em pesquisa da FOP-UNICAMP( CAAE no _{79466117.3.0000.5418), extraídos e} armazenados em solução de água destilada, por tempo máximo de seis meses. Em seguida, todos os debris foram removidos inicialmente com ajuda de lâmina de bisturi e em seguida polidos utilizando taça de borracha com pedra pomes (SS White LTDA; Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e água. Os dentes foram pré-selecionados, em que, somente dentes que apresentavam coroas completamente hígidas, sem trincas, ou cáries, foram utilizados na pesquisa. Após este procedimento, os dentes limpos e selecionados foram armazenados em solução de timol 0,1% (Dinâmica, Piracicaba, São Paulo, Brasil).

• 4.2 Procedimento Restaurador:

Todos os dentes (Figura 4A) foram fixados em placas de acrílico com o auxilio de cola termoplástica (Figura 4B e 4C), para que as porções coronárias fossem separadas da porção radicular 2 mm abaixo do limite amelocementário, e após seccionadas 3 mm acima da altura do limite da junção cemento-esmalte através de seccionamento perpendicular do elemento dentário em relação a seu longo eixo, utilizando-se cortadeira metalográfica de precisão (Isomet 1000, BUEHLER Ltda. Lake Buff, IL, USA- Figura 4D), na qual um disco diamantado de alta concentração (Extec Corp., Enfield, CT, USA) foi adaptado e, girando em baixa velocidade, sob irrigação constante com água destilada, realizou os cortes necessários para a obtenção das amostras (Figura 4 E e F).

Figura 4: A-Terceiros molares hígidos / B e C- Dentes fixados em placa de acrílico com auxílio de cola termoplástica / D- Cortadeira metalográfica de alta precisão / E- Realização dos cortes para obtenção das amostras/ F- Espécimes prontos.

Após a remoção do esmalte e dentina oclusais e exposição de dentina do terço cervical, foi realizado o polimento desta superfície dentinária. Os espécimes foram fixados com auxílio de cola termoplástica em batoques para facilitar o manuseio das amostras durante a realização do polimento (Figura 5 A e B). Cada fragmento teve a superfície de dentina desgastada com lixas de carbeto de silício (SiC), de granulação #600 sob irrigação constante com água, utilizando-se uma politriz giratória (AropolE, Arotec, Cotia, SP, Brazil-Figura 5C) para planificar e polir a superfície, durante 30 segundos, a fim de se obter uma padronização de smear layer da superfície dentinária a ser tratada com os biomodificadores, simulando uma situação clínica da utilização de pontas diamantadas durante um preparo cavitário (Figura 5D).

Figura 5: A e B- Fixação dos espécimes em batoque com auxílio de cola termoplástica/ C- Politriz giratória / D-Planificação das amostras com lixas de carbeto de silício, em politriz giratória sob irrigação constante.

Todas as amostras foram distribuídas aleatoriamente nos seis grupos experimentais e receberam os tratamentos indicados (Tabela 1).

Previamente ao procedimento restaurador, a superfície de dentina dos grupos AFosf, AFosf+ DOPA e AFosf+dopamina, foram condicionadas com ácido fosfórico a 35% (Ultra-Echt - Ultradent, South Jordan, UT, EUA- Imagem 6A) por 15 segundos, lavadas também por 15 segundos(Imagem 6B), e secas com bolinha de algodão hidrófila(Imagem 6C) , a fim de se obter uma dentina úmida.

Figura 6 – A- aplicação de ácido fosfórico 35% (Ultra-Echt - Ultradent, South Jordan, UT, EUA) para condicionamento da superfície dentinária por 15 segundos/ B- Lavagem da superfície por 15 segundos com água/ C- Secagem da superfície com bolinha de algodão hidrófila.

Os grupos com apenas o condicionamento da superfície com ácido fítico(AF), AF, AF+DOPA e AF+Dopamina, tiveram sua superfície dentinária condicionadas por 30 segundos com uma solução de 1% de ácido fítico (Merck KGaA, Darmstadt, Germany- Imagem 7A ) pH 1.2, lavadas por 30 segundos (Kong et al., 2016-Imagem 7B) e secas com bolinha de algodão hidrófila (Imagem 7C), também para a obtenção de uma dentina úmida.

Figura 7- A condicionamento da superfície com solução de 1% de ácido fítico (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) pH 1.2/ b-Lavagem da superfície com água por 30 segundos/ C-Secagem com bolinha de algodão hidrófila.

Após este passo, cada grupo recebeu o tratamento de acordo com a solução biomodificadora referente ao seu grupo ( AFosf-apenas condicionamento com ácido fosfórico, AF- apenas condicionamento com 100µl de ácido fítico (Merck KGaA,

Darmstadt, Germany), AFosf+ DOPA- condicionamento prévio com ácido fosfórico 35% e aplicação de solução de DOPA (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), AFosf+ Dopamina- condicionamento prévio com ácido fosfórico e aplicação de solução de dopamina (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), AF+DOPA- condicionamento da superfície com ácido fítico e aplicação de solução de DOPA (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), AF+ Dopamina- condicionamento da superfície com ácido fítico e aplicação de solução de dopamina (Merck KGaA, Darmstadt, Germany).

Tabela 1: Tratamento de superfície dos grupos experimentais

Grupos (n=10) Protocolo de Tratamento da superfície dentinária Ácido Fosfórico +

Adesivo (AFosf)

Aplicação do ácido fosfórico 35% (Ultra-Echt - Ultradent, South Jordan, UT, EUA) por 15 segundos sobre a superfície dentinária exposta, lavagem com água e secagem com bolinha de algodão hidrófila, seguido de aplicação de adesivo de condicionamento total (Adper Scotchbond Multipurpose-3M ORAL CARE) (Imagem 7) e processo restaurador com resina composta convencional (Filtek Z250 XT /3M ORAL CARE).

Ácido Fítico + Adesivo

(AF)

Condicionamento da superfície dentinária exposta com 100 µl de

solução de 1% de ácido fítico (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) pH 1.2 por 30 seg (Kong et al., 2016-imagem 7), seguido de lavagem com água destilada e secagem com bolinha de algodão umedecida. Após o

condicionamento com ácido fítico (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) sobre a superfície, aplicação do adesivo de condicionamento total (Adper Scotchbond Multipurpose-3M ORAL CARE) e processo restaurador com resina composta convencional (Filtek Z250 XT /3M ORAL CARE).

Ácido fosfórico + DOPA+Adesivo

(AFosf+DOPA)

Condicionamento da superfície dentinária exposta com ácido fosfórico 35% (Ultra-Echt - Ultradent, South Jordan, UT, EUA) por 15 segundos, seguido de lavagem com água e secagem com bolinha de algodão umedecida. Após o condicionamento ácido, aplicação de 90µl de DOPA (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) concentração de 1mg para 10ml de solução (Fang H et al., 2017) de PBS (Phosphate Buffered Saline- pH=6), esperar 10 minutos, e seguir com aplicação de 10 µl de lacase (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) concentração de 1mg por 1 ml de solução de meio PBS (pH=6- Imagem 8A). Aguardar 12 horas para a oxidação do

material biomodificador (Imagem 8B), em ambiente úmido e estufa à 37oC. Posteriormente lavagem da superfície com água destilada (Imagem 8C), e secagem com bolinha de algodão. Após o tratamento com DOPA (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), aplicação do adesivo de condicionamento total (Adper Scotchbond Multipurpose-3M Oral Care) e posterior processo restaurador com resina composta convencional (Filtek Z250 XT /3M Oral Care).

Ácido Fosfórico+ Dopamina+adesivo

(AFosf+dopamina)

Condicionamento da superfície dentinária exposta com ácido fosfórico 35% (Ultra-Echt - Ultradent, South Jordan, UT, EUA por 15 segundos, seguido de lavagem com água destilada e secagem com bolinha de algodão umedecida. Após o condicionamento ácido, aplicação de 90 µl de Dopamina (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) concentração de 1mg para 10ml de solução (Fang H et al., 2017) de PBS (pH=6), esperar 10 minutos, e seguir com aplicação de 10µl de lacase (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) concentração de 1mg em 10 ml de solução de meio PBS (pH=6)(Imagem 9A). Aguardar 12 horas para a oxidação do material biomodificador (Imagem 9B), em ambiente úmido e estufa à 37o_{c. e posteriormente lavagem da superfície com água destilada} (Imagem 9C), e secagem com bolinha de algodão. Após o tratamento com Dopamina (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), haverá aplicação do adesivo de condicionamento total (Adper Scotchbond Multipurpose-3M Oral Care) e posterior processo restaurador com resina composta convencional (Filtek Z250 XT /3M Oral Care).

Ácido fítico+ DOPA+ Adesivo

(AF+DOPA)

Condicionamento da superfície dentinária exposta com 100 µl de solução de 1% de ácido fítico (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) pH 1.2 por 30 seg (Kong K et al., 2016), seguido de lavagem com água destilada e secagem por 30 segundos com bolinha de algodão umedecida. Após o condicionamento da superfície, aplicação de 90 µl de DOPA (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) de concentração 1mg para 10ml de solução (Fang H et al., 2017) em meio PBS(pH=6), esperar 10 minutos, e seguir com aplicação de 10µl de lacase (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) concentração de 1mg em 1 ml de solução meio PBS (pH=6)

(Imagem 8A). Aguardar 12 horas para oxidação do material biomodificador (Imagem 8B), em ambiente úmido e estufa à 37oC. Posteriormente lavagem da superfície com água destilada (Imagem 8C), e secagem com bolinha de algodão. Após, o tratamento com DOPA (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), haverá à aplicação do adesivo de condicionamento total (Adper Scotchbond Multipurpose-3M Oral Care) sobre a superfície tratada e posterior processo restaurador com resina composta convencional (Filtek Z250 XT /3M Oral Care).

Ácido fítico + Dopamina+

Adesivo (AF+Dopamina)

Condicionamento da superfície dentinária exposta com 100 µl de solução de 1% de ácido fítico (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) pH 1.2 por 30 seg (Kong K et al., 2016), seguido de lavagem com água destilada por 30 segundos e secagem com bolinha de algodão hidrófila. Após o condicionamento da superfície, aplicação de 90 µl de Dopamina (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) concentração de 1mg para 10ml de solução (Fang H et al., 2017) em meio PBS (pH=7), esperar 10 minutos e seguir com aplicação de 10 µl de lacase (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) concentração de 1 mg em 10 ml de solução de meio PBS (pH=6) (Imagem 9A) .Aguardar 12 horas para a oxidação do material biomodificador (Imagem 9B), em ambiente úmido e estufa à 37oC. Posteriormente lavagem da superfície com água destilada (Imagem 9C), e secagem com bolinha de algodão. Após, o tratamento com Dopamina (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), houve a aplicação do adesivo de condicionamento total (Adper Scotchbond Multipurpose-3M Oral Care) sobre a superfície tratada e posterior processo restaurador com resina composta convencional (Filtek Z250 XT /3M Oral Care).

Figura 8: A- aplicação de DOPA e lacase sobre a superfície/ B- Superfície após 12 horas de biomodificação, apresentando cor escurecida, demostrando oxidação do biomoficador/ C- Superfície lavada com água destilada para receber o processo restaurador.

Figura 9: A- aplicação de Dopamina e lacase sobre a superfície/ B- Superfície após 12 horas de biomodificação, apresentando cor escurecida, demostrando oxidação do biomoficador/ C- Superfície lavada com água destilada para receber o processo restaurador.

Após o tratamento de superfície, foi aplicado sob a superfície tratada uma camada do primer Adper Scotchbond Multipurpose Adhesive (3M Oral Care) com auxílio de um pincel descartável (Microbrush, KG), com leves movimentos de fricção (Figura 10A), por 15 segundos, e secagem com leve jato de ar por 15 segundos (Imagem 10B). Em seguida, os espécimes receberam uma camada de adesivo Adper Scotchbond Multipurpose Adhesive (3M Oral Care) com auxílio de um pincel descartável (Microbrush, KG-Figura 10C), e foram fotoativadas durante 10 segundos por aparelho fotoativador LED de 3ª geração (Valo – Ultradent-Imagem XD), de acordo com as recomendações do fabricante. O procedimento restaurador foi

realizado através da inserção do compósito, em cor A2 Filtek Z250 XT (3M Oral Care) através da técnica incremental, com incrementos de 2 mm na superfície dentinária do elemento dental, utilizando-se espátula Suprafill #1 (SS White Duflex), até a obtenção de uma restauração de 4mm de altura em relação a face oclusal biomodificada (Figura 10E). Cada incremento de compósito foi então fotoativado pelo aparelho fotoativador LED de 3ª geração (Valo – Ultradent) em modo Standard: 1000 mW/cm² durante 20 segundos (20 J/cm2 Imagem 10F). Desta forma, foram obtidos os 60 espécimes restaurados deste estudo (Imagem 10G).

Figura 10: A- Aplicação sob a superfície tratada uma camada do primer Adpter Scotchbond Multipurpose Adhesive (3M ORAL CARE) com auxílio de um pincel descartável (Microbrush, KG), com leves movimentos de fricção, por 15 segundos/ B- Secagem com leve jato de ar por 15 segundos/ C- Aplicação de camada de adesivo Adpter Scotchbond Multipurpose Adhesive (3M ORAL CARE) com auxílio de um pincel descartável (Microbrush, KG)/ D- Fotoativação pelo aparelho fotoativador LED de 3ª geração (Valo – Ultradent) em modo Standard: 1000 mW/cm² durante 10 segundos do sistema adesivo /E- procedimento restaurador com inserção do compósito, em cor A2 Filtek Z250 XT (3M Oral Care) através da técnica incremental, com incrementos de 2 mm na superfície dentinária do elemento dental, utilizando-se espátula Suprafill #1 (SS White Duflex), até a obtenção de uma restauração de 4mm de altura em relação a face oclusal biomodificada/ F- fotoativação de cada incremento pelo aparelho fotoativador LED de 3ª geração (Valo – Ultradent) em modo Standard: 1000 mW/cm² durante 20 segundos (20 J/cm2_{)/ G-Espécimes restaurados.}

• 4.3 Atividade Gelatinolítica de Dentina - Zimografia in situ

A atividade colagenolítica da dentina foi avaliada pela zimografia in situ usando um microscópio confocal de varredura à laser (MCVL) (Leica TCS-SP5; Leica Microsystems, Heidelberg GmbH, Alemanha) com uma objetiva de imersão em óleo de 63x NA1.4., após sete dias da restauração dos espécimes. A partir dos

espécimes restaurados foram obtidas três fatias no sentido ocluso-cervical de 1 mm de espessura de cada grupo para o teste de atividade gelatinolítica da dentina. Após sete dias de envelhecimento em água destilada e estufa à 37oC, as fatias de 1 mm foram polidas á mão utilizando lixas de carbeto de silício (SiC), de granulação decrescente #600, #1200 e #2000 sob irrigação com água constante, para planificar e polir a superfície. Após cada lixa, os espécimes foram levados à cuba ultrassônica com água destilada durante 3 min, para remoção de debris. Após o polimento das fatias, estas foram coladas com o auxílio de adesivo à base de cianoacrilato (Super Bonder Gel, Loctite, Henkel Ltda., Itapevi, SP, Brasil) em uma lamínula de microscópio. Previamente à análise no MCVL, as fatias foram incubadas com isotiocianato de fluoresceína conjugada (DQ 12055, Enzcheck Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA) e 1/8 partes de antifade Vectoshield 1000 (Vectashield, Vector Laboratories LTDA, Cambrigdegeshire, UK). Foi aplicado 20 µL sobre as fatias de dentina restauradas e armazenadas durante 24 h em estufa a 37o_{C (Figura 11). O sinal de fluorescência foi obtido utilizando um laser de Argônio} de 488 nm e a emissão registrada entre 520-540 nm, e fotomultiplicador da luz transmitida. A área central de cada interface de união foi avaliada e as imagens obtidas a partir de 5 µm da superfície e profundidade final de 10 µm, de 0,5 em 0,5 µm. Todas as imagens foram sobrepostas (Mazzoni et al., 2012 b).

4.4 Análise topográfica da superfície por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Um espécime de cada grupo experimental (AFosf+DOPA, AFosf+Dopamina, AF+DOPA, AF+ Dopamina) foi submetido à análise topográfica em MEV para caracterização da superfície dentinária após tratamento superficial.

4.5Ensaio Mecânico de Microtração

Obtenção dos espécimes para o ensaio de microtração:

Para o ensaio de microtração, as coroas dentais foram separadas da porção radicular na altura do limite amelocementário, através de seccionamento perpendicular do elemento dentário em relação ao seu longo eixo, utilizando disco diamantado dupla face (KG Sorensen Ind. E Com. Ltda, Barueri, SP, Brasil), sob refrigeração constante. Em seguida, as coroas foram fixadas em placas acrílicas com cera pegajosa (New Wax, Thechnew Com.e Ind.Ltda, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). O conjunto foi fixado na cortadeira metalográfica de precisão (Isomet 1000, BUEHLER Ltda. Lake Buff, IL, USA), na qual um disco diamantado de alta concentração (Extec Corp., Enfield, CT, USA) foi adaptado e, girando em baixa velocidade, sob irrigação constante de água, realizou cortes seriados no sentido mésio-distal, para se obter fatias com 0,7 mm de espessura. Após, o dente foi reposicionado e foram realizados cortes no sentido vestíbulo-lingual, obtendo-se palitos de, aproximadamente, 0,7 x 0,7 mm (Figura 12).

Ensaio mecânico de resistência à microtração:

Os palitos foram fixados ao dispositivo de microtração (Geraldeli) com adesivo à base de cianoacrilato (Super Bonder Gel, Loctite, Henkel Ltda., Itapevi, SP, Brasil) pelas suas extremidades, de modo a posicioná-los paralelamente ao carregamento de tração (Figura 13A). Foram, posteriormente, levados à máquina de ensaio universal (EZ Test L Shimadzu, Japão- Figura 13B) e o ensaio conduzido com célula de carga de 500 kgf, na velocidade de 0,5 mm/min, até a ruptura. A força necessária para causar a ruptura dos corpos de prova, em quilograma-força (kgf), foi anotada e as dimensões da interface adesiva dos espécimes aferidas com paquímetro digital (Mitutoyo Corporation, Tóquio, Japão). A resistência à fratura em MegaPascal (MPa) foi calculada de acordo com a fórmula matemática:

R= F (kgf) x 9,8/A (R= resistência de união em MPa, F= força em quilograma-força (kgf) e A=área em mm2_.

Figura 13: A- Corpo de prova fixado no dispositivo de microtração (Geraldeli)/ B- Máquina de ensaio universal EZ Test L Shimadzu.

4.6 Análise do Padrão de Fratura – Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV):

Após o teste de microtração, todas as amostras foram fixadas em stubs, com auxílio de fita adesiva dupla face de carbono, e levadas a um metalizador (SCD 050, BALTECAG, Balzers, Principado de Liechtenstein) para que as superfícies de fratura fossem revestidas com liga de ouro-paládio, sob alto vácuo. Em seguida, as amostras foram levadas ao microscópio eletrônico de varredura (MEV) (JSM 5600

LV, JEOL, Tóquio, Japão), para avaliar os padrões de fratura, e estes foram classificados como: (1) mista, (2) coesiva em resina, (3) coesiva em dentina e (4) adesiva. (Figura 14)

Figura 14: Amostras fixadas em stub e revestidas por fina camada de liga de ouro-paládio.

4.7 Análise estatística

Para analisar o teste de atividade gelatinolíca da dentina- zimografia in situ foi avaliado as diferenças visuais entre os grupos experimentais deste estudo. Foram utilizadas três fatias de cada um dos grupos experimentais para caracterizar as tendências de cada um dos grupos nas figuras obtidas por MCVL.

Para o teste de microtração e padrão de fratura, inicialmente foram realizadas análises exploratórias e descritivas dos dados de resistência de união indicando que atendem as pressuposições de uma análie paramétrica. Como foram avaliados palitos dentro de dentes, a análise foi realizada considerando modelo misto, levando-se em conta a dependência dos palitos do mesmo dente, de acordo com Armstrong et al. (2017). Foi considerado o modelo fatorial 2 (ácidos) x 2 (tratamento de superfície dentinária). As comparações múltiplas foram realizadas usando o teste ANOVA 2 fatores e teste de Tukey-Kramer.A análise do tipo de falha foi realizada pelo teste de qui-quadrado. As análises foram realizadas no programa SAS, com o nível de significância de 5%.

5. RESULTADOS:

5.1 Atividade Gelatinolítica de Dentina- Zimografia in situ

As figuras 15,16 e 17 foram obtidas através de análise por MCVL, em que os pontos fluorescentes, representados pela cor verde, significam atividade enzimática

de MMPs. As imagens foram obtidas sobrepondo-se as micrografias dos modos fluorescente, formando uma única imagem por grupo. A zona de interesse nesta avaliação qualitativa dos dados se encontra dentro do retângulo de cor vermelha. Esta zona destacada, representa a camada híbrida dos espécimes restaurados. Deve ser considerado que onde há fluorescência, compreende-se que houve atividade enzimática de MMPs (Mazzoni et al., 2012).

É possível observar que o grupo em que não houve tratamento de superfície, apenas o condicionamento com ácido fosfórico (AFosf), ao ser comparado com todas as outras imagens de todos os outros grupos, apresentou maior atividade enzimática que os demais, pois nota-se uma linha fluorescente contínua por toda a extensão da camada híbrida (Figura 15). Enquanto o grupo AF+DOPA e AF+Dopamina foram os que apresentaram menos fluorescência na camada híbrida, dentre todos os demais (Figura 17).

Observa-se uma menor fluorescência, quando se analisa o grupo AF, com o grupo AFosf, ambos apenas sem tratamento, apenas com o condicionamento ácido da superfície (Figura 17).

Dentre os grupos em que houve biomodificação de superfície, aqueles condicionados com ácido fítico (AF+DOPA e o AF+Dopamina) foram os que apresentaram menor fluorescência (Figura 17).

Figura 15: Imagem de fluorescência da camada híbrida, obtidas por MCVL do sgrupo AFosf e AF

Figura 16: Imagem de fluorescência da camada híbrida obtidas por MCVL dos grupos AFosf+DOPA e AFosf+Dopamina

Figura 17: Imagem de fluorescência da camada híbrida obtidas por MCVL dos grupos AF+DOPA e AF+Dopamina.

5.2 Análise topográfica da superfície por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A figura 18 foi obtida em microscopia eletrônica de varredura, a fim de caracterizar as superficies dos grupos experimentais tratados com DOPA e dopamina, em ambos condicionamentos ácidos. Em todos os grupo experimentais (Figura 18), nota-se a presença de película sobre dentina intertubular, além do tamponamento parcial de túbulos dentinários em determinadas áreas.

Figura 18: A-Imagem de MEV da superfície do grupo experimental AFosf+DOPA/ B- Imagem de MEV da superfície do grupo experimental AFosf+Dopamina/ C-Imagem de MEV da superfície do grupo experimental AF+DOPA/ D- Imagem de MEV da superfície do grupo experimental AF+Dopamina.

5.3 Resistência de União por Microtração:

Os grupos sem tratamento da superfície dentinária (AFosf e AF), nos dois ácidos, apresentaram resistência média significativamente maior que todos os outros grupos com tratamento de superfície (p<0,05), tabela 2 e gráfico 1(Figura 19). Os grupos com DOPA (AFosf+DOPA e AF+DOPA), em ambos os ácidos apresentaram resistência significativamente menor que os grupos tratados com dopamina (AFosf+Dopamina e AF+ Dopamina) (p<0,05). Os grupos com ácido fítico

apresentaram resistência significativamente menor que os grupos com ácido fosfórico, independentemente do tratamento de superfície dentinária (p<0,05).

Tabela 2. Média (desvio padrão) da resistência de união em Mega Pascal (MPa) em função do ácido e do tratamento de superfície.

Tratamento da superfície dentinária Ácido

Fosfórico Fítico

Sem tratamento 67,84 (17,76) Aa 57,70 (22,16) Ba

DOPA 21,03 (11,43) Ac 13,09 (6,04) Bc

Dopamina 44,18 (15,30) Ab 36,74 (19,41) Bb

Médias seguidas de letras distintas (maiúsculas na horizontal e minúsculas na vertical) diferem entre si (p<0,05). p(ácido)=0,0208; p(tratamento da superfície)<0,0001; p(ácido x tratamento)=0,8500.

Figura 19: Gráfico 1. Média e desvio padrão da resistência de união em MPa em função do ácido e do tratamento de superfície.

5.2 Padrão de Fratura dos espécimes testados (em MEV): Observa-se na tabela 3 e figura 20 (gráfico 2) que a falha mais observada em todos os grupos foi a falha adesiva. Nos grupos em que a DOPA (AFosf+ DOPA e AF+ DOPA) foi administrada como biomodificador, em ambos os grupos as falhas foram predominantemente adesivas.

Tabela 3. Distribuição do tipo de falha em função do grupo

p=0,0021. AFosf= ácido Fosfórico+ sistema adesivo;AF= Ácido Fítico+ sistema adesivo; AFosf+ DOPA=Ácido Fosfórico+ DOPA+ sistema adesivo; AFosf+ Dopamina=ácido Fosfórico+Dopamina+ sistema adesivo; AF+DOPA= Ácido fítico+DOPA+ sistema adesivo; AF+Dopamina=Ácido Fítico+ Dopamina+ sistema adesivo.

Figura 20: Gráfico 2. Distribuição dos tipos de falhas (%) em função do grupo. AFosf= ácido Fosfórico+ sistema adesivo; AF= Ácido Fítico+ sistema adesivo; AFosf+DOPA=Ácido Fosfórico+ DOPA+ sistema adesivo;

6.DISCUSSÃO

As hipóteses nulas testadas foram (I) os biomodificadores DOPA, Dopamina e ácido fítico não exerceriam influência na degradação do colágeno por metaloproteinases, e (II) os biomodificadores DOPA, Dopamina e ácido fítico não promoveriam alterações na resistência de união. Sendo assim, de acordo com os resultados do estudo realizado as duas hipótese foram negadas.

Quando os monômeros resinosos não conseguem se ligar com as fibrilas de colágenos expostas, estas são degradadas por dois fatores principais: ação de enzimas endógenas, MMPs (Hannas et al., 2007; Mazzoni et al., 2012; Fung et al., 2009), como também por degradação hidrolítica, através da água que não foi completamente substituída no sistema (Spencer e Wang, 2002).

A fim de solucionar este problema, biomodificadores de superfície dentinária vem sendo testados, a fim de tornar o colágeno mais resistente à degradação, através da ocupação de seus sítios ativos e promoção de ligações cruzadas, impedindo então, a atividade de degradação do colágeno por enzimas (Frassetto et al., 2016).

Ao se comparar as figuras 15,16 e 17 obtidas pelo microscópio confocal de varredura à laser (MCVL), pode-se concluir que o grupo que apresentou maior fluorescência, indicando uma maior atividade enzimática, foi o grupo em que apenas o ácido fosfórico foi empregado. Isso se deve a presença de metaloproteinases que conseguiram se ligar aos sítios ativos de colágeno (Frassetto et al., 2016), e conseguiram clivá-lo, emitindo a fluorescência observada. O aumento da atividade de metaloproteinases pode ser iniciado em dois processos: tanto no processo de desmineralização dentinária com exposição do colágeno, e após a aplicação de agentes adesivos. Desta forma, a presença de ácido polialcenóico presente no primer utilizado, Scotchbond Multipurpose (pH= 3.3), e até mesmo outros sistemas adesivos, que possuam em sua composição agentes ácidos podem continuar ativando MMPs no processo de hibridização (Nishitani et al., 2006; Tay et al., 2006; Mazzoni et al., 2006).

De acordo com Mazzoni et al., 2012, a zimografia in situ identificou que a principal atividade enzimática está ocorrendo na zona na camada híbrida, e acontecem após o condicionamento de superfície, além da atividade gelatinolítica de MMPs começar a ocorrer em dentina intertubular (Mazzoni et al. 2012b), em que

MMPs são liberadas da matriz mineral.

O ácido fítico, apresentou menor fluorescência após sete dias de armazenamento do que o ácido fosfórico. De acordo com Kong et al., 2016, ao se condicionar a dentina com ácido fítico, por ser um agente quelante de íons cálcio, sugere-se que ocorra uma interação química entre o ácido fítico, o colágeno e o cálcio da hidroxiapatita, formando um complexo ternário (colágeno-cálcio-fitato), o que pode levar à proteção do colágeno contra a degradação, mantendo sua estrutura tridimensional mais rígida (Kong et al., 2016), como também inativando os sítios ativos e demostrando menor fluorescência quando comparado com o ácido fosfórico após sete dias de armazenamento.

De acordo com Sabatini et al., 2014, a DOPA se une ao colágeno através de ligações de ponte de hidrogênio, em que o grupo catecol, existente na molécula de DOPA, se liga com o grupo amina existente na molécula de colágeno. Isso faz com que o colágeno se torne mais resistente a degradação de sua forma estrutural de tripla hélice (Sabatini et al. 2014). A mesma reação acontece com a dopamina.

Em meio aquoso, a dopamina sofre polimerização oxidativa, se transformando em polidopamina, mimetizando a DOPA, quanto ao seu grau de aderência (Lee et al.,

2007; Ye et al., 2011; Cha, Hwang e Lim, 2008; Chien et al.,2012). Estudos

realizados anteriormente, mostraram que a superfície modificada por polidopamina apresentou forte ligação com as fibrilas de colágeno (Yun-Zhi Zhoui et al., 2012) mantendo a conformação de tripla hélice do colágeno. Isso se dá pelas quantidades consideráveis de ligações de hidrogênio entre o catecol presente na molécula de dopamina e atômos de nitrogênio (aminas) presentes nas moléculas de colágeno que enrijecem as fibras (Zhu et al., 2016).

Além de aumentar a resistência do colágeno à degradação, estes agentes de ligação cruzada, podem se ligar aos sítios ativos e alostéricos enzimáticos, de forma a atrapalhar a ação das enzimas, as MMPS por exemplo (Sabatini et al., 2014). Isso acontece devido a capacidade do grupamento catecol existente na molécula de DOPA e de dopamina, que possui forte ligação quelante com metais, sendo capaz de se quelar com os íons de cálcio (Ca2+), e desta forma competir com as enzimas de colagenase (Fang et al.,2017; Yun-Zhi Zhoui et al., 2012), que são cálcio e zinco dependentes (Palosaari et al, 2003; Hannas et al., 2007). Isso explica a menor fluorescência encontrada nas imagens do MCVL, para os grupos em que a