Obtenção, caracterização e avaliação microbiológica de uma nova forma farmacêutica contendo hidroquinona

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE UMA NOVA FORMA FARMACÊUTICA CONTENDO HIDROQUINONA. SIMONE SANTOS BEZERRA. Recife, 2003.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE UMA NOVA FORMA FARMACÊUTICA CONTENDO HIDROQUINONA. Dissertação. de mestrado submetida ao. Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas do Departamento de Farmácia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como pré-requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas, na área de concentração: Tecnologia Farmacêutica.. Mestranda: Simone Santos Bezerra Orientadora: Profa Dra Nereide Stela Santos Magalhães. Recife, 2003.

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(4) Dedico este trabalho A minha mãe, Maria Ignez Santos Bezerra, aos meus avós, Antônio Menezes dos Santos e Helena Mattos dos Santos e à minha irmã, Suely Santos, os quatro pilares desta conquista..

(5) AGRADECIMENTOS. A Deus, por ter permitido que eu vivesse para realizar tudo isso, e à Virgem Maria, que sempre me protegeu e me deu conforto nos momentos de angústia;. A minha mãe, por seu amor incondicional e por tudo mais;. A minha família (os mais próximos e mesmo os mais distantes), pelo apoio e pelo carinho;. Ao meu pai, Armando Gomes Bezerra, a minha prima Rachel Bastos e a minha tia-avó, Hermé de Almeida Mattos, pelos exemplos de vida;. Aos meus amigos Anita Esmeralidina B. Lima, Ladjane Duarte, Eduardo A. Lira e Michele Lira Rodrigues porque sem eles minha vida seria muito “cinza”;. Á minha orientadora, Professora Nereide Magalhães, pela paciência, pela confiança, pelos ensinamentos e por ter me incentivado a prosseguir quando eu quis desistir desta caminhada;. A Profª Nelly Caetano, do Departamento de Farmácia da UFPE, pelo carinho, pelos ensinamentos e pela contribuição técnica;.

(6) A Profª Silene Carneiro, do Departamento de Antibióticos da UFPE, pelo apoio e disponibilidade com que sempre contei;. Ao Prof. Davi Santana, do Departamento de Farmácia da UFPE, por ter gentilmente cedido seu laboratório e suas células de Franz para que eu pudesse realizar alguns dos meus experimentos;. A Profª Elba Lúcia Amorim, do Departamento de Farmácia da UFPE, por ter igualmente cedido seu laboratório para que eu pudesse realizar alguns dos meus experimentos;. A Iguaci da Costa Duque, secretária da Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas/ UFPE, por ter sido sempre tão solícita e amável;. Ao Prof° Dr. José Luiz de Lima Filho, Diretor do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA)/UFPE, e ao Prof° Dr. Luiz Bezerra de Carvalho, responsável pelo setor de Bioquímica do LIKA, no qual foi realizada a maior parte deste trabalho, pela gentileza com que sempre me trataram;. Aos funcionários do LIKA, que sempre estiveram dispostos a resolver meus problemas técnico-administrativos e que me trataram tão cordialmente todo este tempo, em especial a Vera Lúcia, Luiz Felipe Viegas, Moisés Melo e Rafael Padilha;. Ao pessoal dos setores de Biotecnologia e Biologia Molecular do LIKA pelos muitos empréstimos, e em especial aos colegas do Setor de Patologia Carmelita B. Lima, Mário de.

(7) Melo Júnior e Prof°. Nicodemos Teles pelas fotos das minha formulações e pela excelente vizinhança;. Aos meus amigos do Setor de Bioquímica do LIKA, em especial a Givanildo e Luciana Oliveira, Luciana da Mata e Ian porto por terem tornado, com seus sorrisos, mais agradáveis meus dias de trabalho e por terem me ajudado a superar muitas das dificuldades que encontrei para realizar a parte prática da minha dissertação;. Aos meus amigos do grupo Sistemas de Liberação Controlada (SLC) por todos os momentos e experiências que compartilharam comigo, em especial a Noêmia Santos, Hercília Rolim, Margareth Mayer, Lúcio Pimentel, Rosângela Vidal, Robson Amaro da Silva, Marcela Outtes e Agenor Tavares;. A Dayse Maria Vasconcelos de Deus, pela amizade e por ter sido minha “fiel escudeira” quando eu quis lutar como “Dom Quixote”;. Aos meus companheiros de Mestrado, em especial a Risonildo Pereira Cordeiro, pela mão amiga e pela disponibilidade profissional;. A Roseane Maria Ribeiro Costa, pela contribuição inestimável para a realização deste trabalho e por ter sido tão boa companheira neste período importantíssimo da minha vida pessoal e profissional;.

(8) A Jaqueline Rodrigues, minha ex-colega do grupo SLC, pelos conselhos e pela ajuda essencial;. A Andréa Duarte Tavares pelas inúmeras vezes em que esteve disponível para esclarecer minhas dúvidas;. A João Eudes do Nascimento, meu amigo e professor, e Ana Amélia Moreira Lira, minha querida colega da graduação e do mestrado, pela ajuda de valor incalculável que me deram na etapa final de desenvolvimento deste trabalho;. A Dilcélia Leite Nóbrega por não ter deixado que eu desistisse do meu título de Mestre quando tive meus momentos de fraqueza;. Aos que confiaram na minha capacidade profissional, porque me serviram de estímulo, e aos que não confiaram nela, porque me obrigaram a trabalhar minha auto-estima;. Meus sinceros agradecimentos enfim a todos que direta ou indiretamente contribuíram para que esta dissertação pudesse existir..

(9) “Eu pedi força e Deus me deu dificuldades para superar; Eu pedi sabedoria e Deus me deu problemas para resolver; Eu pedi prosperidade e Deus me deu cérebro e músculos para trabalharem juntos; Eu pedi coragem e Deus me deu perigos para enfrentar; Eu pedi amor e Deus colocou em meu caminho pessoas para eu ajudar; Eu pedi favores e Deus me deu oportunidades; Eu pedi tudo o que queria e Ele me deu, enfim, exatamente o que eu precisava...” Autor desconhecido.

(10) SUMÁRIO. Agradecimentos Lista de Figuras Lista de Tabelas Lista de Gráficos Resumo Abstract. 1.INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------02 2.REVISÃO DA LITERATURA --------------------------------------------------------04 2.1 Pele e Pigmentação----------------------------------------------------------------------04 2.2 Sistemas de Liberação Controlada de Fármacos e Formas Farmacêuticas Aplicadas à Pele--------------------------------------------------------------------------10 2.3 Microemulsão Transdérmica P.L.O. (Pluronic®Lecithin Organogel)------------12 2.4 Hidroquinona: Generalidades----------------------------------------------------------13 2.5 Atuação da hidroquinona como despigmentante------------------------------------17 2.6 Atividade da hidroquinona frente a melanomas in vitro e in vivo----------------19 2.7 Atividade Antimicrobiana da Hidroquinona------------------ ----------------------20 2.8 Hidroquinona: Toxicologia------------------------------------------------------------24.

(11) 3. OBJETIVOS -----------------------------------------------------------------------------27 4. ARTIGO ---------------------------------------------------------------------------------31 5. CONCLUSÕES ------------------------------------------------------------------------56 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS --------------------------------------------58. ANEXO I Resumos enviados para congresso ANEXO II Resultados adicionais: tabelas, gráficos e análises estatísticas ANEXO III Normas do periódico Drug Development and Industrial Pharmacy.

(12) LISTA DE FIGURAS Revisão da Literatura Figura 1.. Unidade epidérmica de melanização (de acordo com W.C. QUEVEDO. Jr.).____________________________________________________________________05 Figura 2.. Diagrama. do. folículo. piloso. (pêlo+glândulas):. localização. da. papila.__________________________________________________________________06 Figura 3.. Rota biossintética da melanina __________________________________ 08. Figura 4.. Micela “lipossomal” do Pluronic® Lecithin Organogel _______________12. Figura 5.. Staphylococcus aureus - Ilustração do aspecto de células coradas de S.. aureus, vistas ao microscópio óptico e aspecto das células em Microscopia Eletrônica de Transmissão_____________________________________________________________20 Figura 6. Alvos de ação de drogas antimicrobianas na célula bacteriana______________22 Figura 7. Amamentação___________________________________________________24 Esquema 1. Matriz ácido-base e oxidação-redução para hidroquinona (HQ), semiquinona (SQ) e benzoquinona (BQ). _________________________________________________16. Artigo Figure 1. Photomicrography of HQ-loaded PLOme analysed by optical microscopy____44 Figure 2A. TEM of an unloaded PLOme formulation____________________________45 Figure 2B. TEM of a loaded PLOme formulation_______________________________45.

(13) Figure 3A.: 25°C pH evolution within short-term thermal stability assay for formulations B, E and their respective hydroquinone-free formulations_________________________46 Figure 3B.: 37°C pH evolution within short-term thermal stability assay for formulations B, E and their respective hydroquinone-free formulations_________________________46 Figure 4A: Hydroquinone content analysis within short-term thermal stability assay at 25°C___________________________________________________________________47 Figure 4B: Hydroquinone content analysis within short-term thermal stability assay at 37°C___________________________________________________________________47 Figure 5. Long-term pH evolution of Pluronic Lecithin Organogel formulations containing hydroquinone.___________________________________________________________49 Figure 6A: In vitro kinetic profile of hydroquinone encapsulated into a Pluronic Lecithin Organogel formulation made with propyleneglycol._____________________________50 Figure 6B: In vitro kinetic profile of hydroquinone encapsulated into a Pluronic Lecithin Organogel formulation made with polyethyleneglycol 200.________________________50 Figure 7: Comparative antimicrobial activity of hydroquinone and tetracycline against S. aureus strains.

(14) LISTA DE TABELAS Revisão da Literatura Tabela 1: Componentes das “preparações combinadas” ___________________________19 Artigo Table 1: Constituents/concentrations variation within A-J formulations.______________37 Table 2: Origin of Staphylococcus aureus strains selected for the antimicrobial activity test _______________________________________________________________________41 Table 3: Sensitivity/resistance charactheristics of Staphylococcus aureus strains selected for the antimicrobial activity tests.____________________________________________42 Table 4: Results of the accelerated stability testing for formulations A-J when compared with their respective hydroquinone-free (unloaded) formulations.___________________44 Table 5. Evaluation of the stability of hydroquinone incorpotrated into Pluronic Lecithin Organogel (PLOme) formulations B and E, containing propylene gycol and polyethylene glycol 200 respectively. ___________________________________________________48 Table 6. Comparative Minimal Inhibitory Concentration of Tetracycline and Hydroquinone against Staphylococcus aureus strains. ________________________________________49.

(15) ABSTRACT Hydroquinone (HQ) is a drug reported to possess manifold biological activities, such as depigmenting, antimicrobial and antitumour properties. The PluronicLecithin Organogel (PLOme) is a phospholipidic microemulsion particularly implied when a high cutaneous permeability and systemic absorption of a drug is suitable. Once that HQ is highly unstable into various topical vehicles and it presents low topical bioavailability and toxicity, the HQ appears as a fulfilling drug to this liposomal pharmaceutical form. The aim of this work was therefore to incorporate such a drug into this transdermal drug delivery system. Furthermore, the stability and the kinetic profile as well as the antimicrobial activity of both free and incorporated forms of HQ were evaluated. HQ-loaded PLOme and unloaded PLOme were prepared according to the supplier directions. The samples were then submitted to accelerate and long-term stability tests. Thermal stability studies were also performed monitoring the pH and the HQ content into PLOme formulations stored at 25oC and 37oC. The HQ content was assayed by high performance liquid chromatography using the United States Pharmacopoeia method. A method of drug extraction from PLOme formulations was developed and validated. The in vitro HQ kinetic profile from the best formulations at 0.1% concentration was examined using the Franz cells method. A cellulose membrane was used to separate the donors and the aqueous receptor medium. The antimicrobial activity against ATCC and resistant Staphylococcus aureus strains was determined for free and encapsulated HQ forms (Staphylococcus aureus ATCC chosen were the ATCC 6538/ FDA 209 and the ATCC 6538P/ FDA 209P). The multi inoculation.

(16) agar dilution susceptibility testing method were used. No microscopic or microscopic alterations were detected after accelerated stability testing, but the presence of darkness of HQ loaded PLOme. Long-term stability testing also revealed darkness for HQ-loaded formulations. Neither detectable increase on the particle size nor modification on particle shape occurred until 120 days. No relevant pH evolution was observed for both HQ-free and HQ-loaded PLOme. Concerning the HQ content, no degradation was noticed under unfavorable thermal conditions. The pH changes were not detected in the short-term thermal stability analysis. In contrast, the long-term stability showed a second-order HQ degradation, which leads to a short shelf life. The HQ rate obtained from microemulsion was close to 1.5 times lower than that one derived with HQ in a gel matrix at a similar drug concentration. Free PLOme-encapsulated hydroquinone showed to have great in vitro inhibitory potential against strains of S. aureus (including multi resistant ones); PLOmeencapsulated hydroquinone had better activity than hydroquinone against two of the testing-strains.The transdermal gel containing HQ, otherwise, seems not to be enough stable under the above mentioned stability tests. As a consequence, further investigation is required on the stability and kinetic of this pharmaceutical form before commercialization..

(17) RESUMO O p-diidroxibenzeno (hidroquinona) é um princípio ativo dotado de várias atividades biológicas, sendo relatado por diferentes autores como sendo despigmentante, antimicrobiano e quimioterápico. O Pluronic® Lecithin Organogel (PLOme) é uma microemulsão fosfolipídica particularmente indicada. quando. é desejável. maior. permeabilidade ou mesmo absorção sistêmica de uma droga. Considerando a instabilidade da. hidroquinona. em. diferentes. veículos. cosméticos,. bem. como. sua. baixa. biodisponibilidade tópica e sua conhecida toxicidade, este ativo surge como interessante candidato a ser contido numa forma farmacêutica lipossomal. O objetivo deste trabalho é então incorporar a hidroquinona num sistema transdérmico de liberação de drogas, a microemulsão PLOme. Além disso, foram avaliados os parâmetros cinéticos das formulações obtidas, bem como a atividade antimicrobiana da hidroquinona nas formas livre e micromulsionada. Foram preparadas, de acordo com indicações do fabricante, formulações de Pluronic® Lecithin Organogel (gel transdérmico) contendo hidroquinona em diferentes concentrações, bem como as formulações “brancas” correspondentes. As amostras foram submetidas a testes de estabilidade acelerada (resistência a centrifugação, stress mecânico, elevação de temperatura e ciclos gelo-degelo) e em longo prazo (acompanhamento do pH e conteúdo ao longo do tempo). Para a determinação do conteúdo de hidroquinona em cada amostra foi utilizada Cromatografia Líquida de Alta Precisão (HPLC): as condições cromatográficas empregadas foram aquelas recomendadas pela Farmacopéia Americana (USP23); foi desenvolvido e validado um método para a extração.

(18) da droga a partir das microemulsões PLOme. Foram investigados os parâmetros cinéticos das melhores formulações. Nestes ensaios a hidroquinona foi utilizada a 0,1% ; alíquotas de cada amostra foram dispostas sobre membranas de celulose em células de Franz, tendo sido escolhida a água como meio receptor. O potencial antimicrobiano da hidroquinona livre e microemulsionada foi determinado frente a duas cepas padrão ATCC e frente a 18 cepas resistentes de Staphylococcus aureus, principal microrganismo causador da mastite em mulheres no período de amamentação (Staphylococcus aureus ATCC 6538/ FDA 209; Staphylococcus aureus ATCC 6538P/ FDA 209P foram utilizados como padrões). Para tal foi utilizada a técnica de microdiluição em Agar, com o auxílio do multi-inoculador de Steers. Não foram observadas alterações macro ou microscópicas após os testes de estabilidade acelerada, exceto pelo escurecimento que apresentaram as formulações com hidroquinona. Os estudos de estabilidade em longo prazo revelaram alteração de cor das amostras, mas não aumento no diâmetro das partículas ou modificação no formato das mesmas num período de 120 dias. Não ocorreu perda de conteúdo nem alteração de pH nas formulações analisadas durante os ensaio de estabilidade térmica em curto prazo. No estudo em longo prazo a temperatura ambiente, ao contrário, observou-se significativa perda de hidroquinona das formulações, evidenciada por cinéticas de degradação de segunda ordem e curtos prazos de validade, mas sem significativa variação de pH. As cinéticas in vitro revelaram que a uma matriz de gel libera comparativamente para o meio receptor uma maior quantidade de hidroquinona em relação à microemulsão testada. A hidroquinona, em suas formas livre e encapsulada, demonstrou possuir atividade inibitória frente a diversas cepas de Staphylococcus aureus (incluindo cepas multi-resistentes); duas das cepas testadas foram melhor inibidas pela hidroquinona encapsulada (PLOme-HQ) do que pela hidroquinona livre. O gel transdérmico contendo hidroquinona, no entanto, parece não ser.

(19) suficientemente estável nas condições testadas. Conseqüentemente, é necessária investigação adicional a respeito da estabilidade e do perfil cinético desta forma farmacêutica antes de sua comercialização..

(20) INTRODUÇÃO ______________________________________________________________________.

(21) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 2. 1. INTRODUÇÃO. O avanço e a perspectiva de novos ativos com finalidades dermocosméticas têm aumentado significativamente o número de substâncias ativas a serem utilizadas em formulações de uso tópico/transdérmico. Esse grande número de ativos disponíveis no mercado. médico-farmacêutico,. com. diferentes. propriedades. físico-químicas. e. farmacodinâmicas exige, cada vez mais, o desenvolvimento de bases cosméticas compatíveis com a manutenção da estabilidade da formulação final para que não ocorra comprometimento da ação farmacodinâmica do produto no seu sítio de ação (Gonçalves & Maia-Campos, 1995). Um recente avanço em dermocosmética é o desenvolvimento de um agente de natureza fosfolipídica (Pluronic® Lecithin Organogel-PLOme), o qual é capaz de penetrar a mucosa e tecidos cutâneos e carrear o princípio ativo com ele para o sítio de ação. Há, no entanto, dados limitados a respeito da eficácia destas novas formulações, e são ainda necessárias pesquisas adicionais a respeito das mesmas (Padilla et al, 2000). O p-diidroxibenzeno (hidroquinona) é um princípio ativo dotado de várias atividades biológicas, relatado por diferentes autores como sendo despigmentante, antimicrobiano e quimioterápico. Considerando sua instabilidade em diferentes veículos cosméticos, bem como sua baixa biodisponibilidade tópica e sua conhecida toxidade, a hidroquinona é uma interessante candidata a ser contida numa nova forma farmacêutica. A presente dissertação é constituída de: uma revisão da literatura sobre preparações para uso dermatológico, bem como sobre as diversas propriedades da hidroquinona; de um artigo científico a ser submetido ao periódico “Drug Development and Industrial Pharmacy”, resultado do desenvolvimento prático deste trabalho, e finalmente das referências bibliográficas. consultadas. para. a. elaboração. do. mesmo..

(22) REVISÃO DA LITERATURA ____________________________________________________________________.

(23) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 4. 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Pele e Pigmentação. A Pele Na superfície da pele existe uma película de material emulsificado, composta por uma complexa mistura de sebo e suor, além de uma lâmina córnea descamativa (a última das camadas) composta de células epidérmicas mortas, chamada de “camada córnea” ou “estrato córneo”, situada imediatamente sob a película de material emulsificado. Abaixo da camada córnea encontra-se uma “camada de barreira”, constituída pela epiderme viva ou estrato germinativo e pela derme ou pele verdadeira. Os capilares sangüíneos e as fibras nervosas emergem do tecido adiposo subcutâneo, atravessam a derme e chegam à epiderme. As glândulas sebáceas presentes no tecido subcutâneo liberam seus produtos através de ductos sudoríparos que atravessam a superfície da pele. As glândulas sebáceas e os folículos pilosos originam-se na derme e nas camadas subcutâneas e atingem a superfície da epiderme na forma de ductos e pêlos, respectivamente. Estrutura e Funções do Sistema Pigmentar A epiderme, os pêlos e os cabelos do homem são coloridos devido à presença dos pigmentos melânicos e da hemoglobina, os quais absorvendo especificamente certas porções do espectro luminoso são responsáveis pelas variações constatadas. A unidade de melanização é uma unidade funcional e estrutural comum à epiderme e aos pêlos. Formada por um melanócito que sintetiza um pigmento (a melanina) associado aos queratinócitos aceptores deste último, esta unidade assegura a proteção contra as radiações não-ionizantes. Na ausência desta proteção a vida não poderia existir. Desde a primeira enzima da rota biossintética da melanina – a tirosinase- até a eliminação da melanina.

(24) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 5. dispersada com as camadas córneas, uma cadeia de eventos complexos determina a adaptação do tegumento às agressões das radiações solares. O melanócito pode ser considerado uma glândula unicelular, secretando grânulos de pigmento que são destinados a ser absorvidos pelas células da vizinhança: os queratinócitos. Ele está inserido na camada basal das células da epiderme, e se apóia por seu pólo inferior sobre a membrana basal (Fig.1). Os prolongamentos dendríticos melanocitários se insinuam entre os queratinócitos, deprimindo as paredes dos mesmos.. Fig. 1- Unidade epidérmica de melanização. O esquema mostra as relações entre o melanócito (m) inserido na camada basal da epiderme e os queratinócitos (k) vizinhos. Uma célula de Langerhans (L) está esquematizada na altura da 4ª camada suprabasal (de acordo com W.C. QUEVEDO Jr.) A unidade de melanização é constituída por um melanócito circundado de 30 queratinócitos aproximadamente, repousando sobre a membrana basal, e de um número variável de queratinócitos engajados no processo de maturação rumo às camadas córneas. Os.

(25) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 6. dendritos do melanócito entram em contato lateralmente e para o alto com o ambiente ceratinocitário. No pêlo, os melanócitos estão concentrados no topo da papila (Fig. 2) e fornecem seu pigmento para os queratinócitos que formam um circuito na luz virtual. O pigmento se distribui na periferia do cabelo, no córtex. Na maioria dos mamíferos os melanócitos estão concentrados no pêlo (os melanócitos epidérmicos estão ausentes ou em pequeno número). É no homem que a organização epidérmica do sistema melanocitário apresenta seu desenvolvimento máximo (Cesarini, 1994 ).. Fig.2- Diagrama do folículo piloso (pêlo+glândulas): localização da papila. 1: Haste pilar; 2: Epiderme; 3: músculo horripilador; 4: glândula sebácea; 5: canal excretor da glândula apócrina; 6: glândula apócrina; 7: bainha epitelial externa; 8: bainha epitelial interna; Haarscheibe; 10: bulbo pilar; 11: papila do pêlo (de acordo com Agache, 1994). A síntese da melanina A cor da pele é, principalmente, determinada pela quantidade de melanina sintetizada pelos melanócitos, normalmente encontrados na camada basal da epiderme (Su, 1999). Os pigmentos melânicos (melaninas) podem ser divididos esquematicamente em dois grupos..

(26) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 7. Alguns dão cores escuras (negro e pardo), sendo outros responsáveis pelas cores claras, formando um vasto caleidoscópio do amarelo pálido ao vermelho brilhante. Os pigmentos de cor escura, as eumelaninas, são insolúveis em álcalis e formadas por polímeros irregulares de unidades 5,6-diidroxiindol mais ou menos oxidados. As cores claras são formadas por melaninas que compreendem vários tipos de pigmentos com propriedades físicas e químicas particulares, e que são agrupadas sob o termo de feomelaninas. Estas últimas são solúveis em álcalis. Sabe-se que elas contêm sulfetos e grupamentos azotados. Prota e Thomson (1976) estudaram um grupo de pigmentos feomelânicos especiais denominados tricocromos. Estes compostos de peso molecular baixo são isolados de certos tipos de cabelos loiros e ruivos humanos, e são os únicos pigmentos melânicos cuja estrutura é bem conhecida. Eles são formados de 2 unidades ligadas de 1-4-benzotiazina associadas a uma molécula contendo enxofre (cisteína ou glutation). Embora muito diferentes por seus pesos moleculares e propriedades físicas gerais, eumelaninas, feomelaninas e tricocromos estão ligados do ponto de vista metabólico, derivando notadamente da DOPA-quinona, que é o composto intermediário chave do sistema (Fig.3). A DOPA-quinona deriva da tirosina e da diiidroxifenilalanina por ação das tirosinases em duas etapas enzimáticas. As eumelaninas são formadas pela conversão da DOPA-quinona em compostos escuros por uma série de completa de reações espontâneas que implicam uma ciclização e uma polimerização por oxidação. Outro mecanismo, no entanto, conduz à formação de feomelaninas contendo enxofre pela intervenção de compostos sulfídricos: a cisteína ou o glutation se combinam com a DOPA-quinona por reação rápida para formar as cisteinil-DOPA, as quais, por sua vez, por oxidação formarão polímeros de feomelaninas ou tricomelaninas (Carriço & Bergold, 2000)..

(27) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... CO 2 H. CO 2 H. HO T irosinase. HO. NH2. CO 2 H. O. NH2. NH2. O. HO. Tirosina. 8. Dopaquinona. Dopa. Glutation ou Cisteína. C. CO 2 H. NH2. N H Leucodopacromo. S. O. HO. CO2 H. CisteinilDOPA. CO 2 H. HO. N. HO DHI. DOPAcromo Dopacromotautoisomerase. CO 2 H. HO. HO. T irosinase e/ou Peroxidase. CO 2 H HO NH. NH2. N S. NH. Alanil-benzotiazina. DHICA. Indol-5,6-quinona O Eume laninas. O. Feomelaninas CO 2 H NH. 5,6-Diidroxindol-2-carboxiácido. Fig.3- Rota biossintética da melanina Distúrbios do sistema melanocitário: Tipos de Hiperpigmentação mais conhecidos -. Cloasma ou Máscara de Gravidez: É constituído por manchas marrons de contornos irregulares, localizadas simetricamente no rosto, desencadeadas pela gravidez ou por anticoncepcionais adminstrados por via oral.. -. Dermatite por perfume: São manchas de contornos irregulares, localizadas no rosto e no colo, conseqüência da ação sensibilizante de substâncias contidas nos perfumes..

(28) Bezerra, S.S.. -. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 9. Efélides ou sardas da cor ruiva: São pequenas manchas planas, de cor marrom-ocre, que aumento quando em exposição aos raios ultra violeta, disseminadas no rosto e nas partes descobertas do corpo.. -. Hipercromias pós-inflamatórias: Aparecem após agressão à pele, tais como queimaduras ou processo inflamatório.. -. Hiperpigmentação periorbital: É uma melanose redonda perto das pálpebras e região periocular, onde há aumento da melanina dos melanócitos da epiderme. Ë um quadro hereditário que não tem tratamento.. -. Lentigens: São manchas lenticulares bem limitadas, planas ou pouco salientes, de coloração que varia do amarelo ao marrom-escuro. Não aparecem por causa da exposição ao sol e aumentam o numero de melanócitos na camada basal da epiderme.. -. Lentigens senis ou de luz do sol: São manchas escuras que aparecem em pessoas com mais de 50 anos de idade com histórico repetido de exposição à luz solar.. -. Melanodermatites por fotossensibilização: São pigmentações generalizadas devidas à fotossensibilização medicamentosa.. -. Melanose de Riehl: São manchas com pontas de pequeno tamanho que se ampliam, formando um reticulado nos dois lados do pescoço e na base do bulbo capilar. Esta pigmentação difusa é conseqüente a fatores cosméticos, endócrinos e nervosos.. -. Melasma: Corresponde à hipermelanogênese facial marrom-escura que se desenvolve lenta e simetricamente, principalmente em mulheres, e que vem sendo associada a fatores hormonais, uso de perfumes e cosméticos, exposição à luz solar e herança familiar.. -. Queratoses senis ou actínicas ou melanoses solares: São manchas senis de cor variável,. queratósicas, escamosas, com crostas e que podem evoluir para um carcinoma (Nicolleti et al., 2002)..

(29) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 10. 2.2 Sistemas de Liberação Controlada de Fármacos e Formas Farmacêuticas Aplicadas à Pele Pomadas, cremes, sistemas transdérmicos de liberação de fármacos, loções e soluções tópicas são as formas farmacêuticas dermatológicas utilizadas com mais freqüência; entretanto, outras preparações, tais como pastas, linimentos, pós, géis, tinturas e aerossóis também são usados. As preparações são aplicadas à pele por sues efeitos físicos, ou seja, sua capacidade de agir como protetores, lubrificantes, emolientes, secantes, etc, ou devido ao efeito específico de seu(s) princípio(s) ativo(s). As preparações vendidas sem prescrição médica freqüentemente contêm misturas de fármacos usados no tratamento de afecções como pequenas infecções cutâneas, coceiras, queimaduras, assaduras, picadas de insetos, pé de atleta, calos, calosidades, verrugas, caspa, acne, psoríase e eczema. As aplicações cutâneas que exigem prescrição médica geralmente contêm um único princípio ativo que visa tratar uma condição específica diagnosticada (Ansel et al., 2000). Embora seja importante que o fármaco aplicado no tratamento de doenças da pele penetre além da superfície, normalmente não se deseja (exceto nos sistemas transdérmicos) que o medicamento entre na circulação sistêmica. Contudo, após passar na epiderme, o fármaco encontra-se na proximidade dos capilares sangüíneos que alimentam os tecidos subcutâneos e a absorção pela circulação sistêmica não é improvável. De fato, essa absorção comumente ocorre após aplicação tópica de determinadas preparações, conforme evidenciado pelas concentrações sangüíneas do fármaco e por sua excreção urinária ou de seus metabólitos. Entretanto, a maioria dos materiais empregados para uso tópico não-sistêmico é suficientemente atóxica nas quantidades absorvidas e os efeitos da absorção não são percebidos pelo paciente. Os sistemas transdérmicos de liberação de fármacos existem há bastante tempo. No passado, os sistemas mais comumente utilizados eram cremes topicamente aplicados e.

(30) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 11. pomadas para desordens dermatológicas. A ocorrência de efeitos colaterais sistêmicos com algumas destas formulações foi indicativa de ocorria absorção através da pele. Um grande número de drogas tem sido aplicado à pele para tratamento sistêmico. Num sentido amplo, o termo sistema de liberação transdérmica inclui toda as formulações contendo ativos aplicadas topicamente e desenvolvidas para veicular o ingrediente ativo através da pele em direção à corrente sangüínea. A relativa impermeabilidade da pele é bem conhecida, e isto é relativo à sua dupla função de barreira protetora contra a invasão de microrganismos e de prevenção contra a perda de substâncias essenciais como a água. A elucidação de fatores que contribuem para esta impermeabilidade têm tornado possível a utilização da pele como rota para a liberação controlada de drogas. Basicamente, existem quatro sistemas disponíveis, os quais permitem a absorção efetiva de princípios ativos através da pele. O primeiro deles, cuja liberação é controlada por partição, consiste de um reservatório de princípio ativo preenchido com uma suspensão saturada deste último num solvente miscível com água e homogeneamente disperso numa matriz constituída por um elastômero de silicone. O segundo tipo seria o matricial, estando neste caso o princípio ativo disperso numa malha de polímero biodegradável, a partir da qual estaria sendo controladamente liberado. O mais amplamente utilizado é o de permeação controlada através de membranas poliméricas. Um quarto sistema, recentemente disponível, é o de gradiente de carga. Adicionalmente, carreadores transdérmicos mais avançados incluem sistemas tais como o iontoforético e o sonoforético, os géis com viscosidade termocontrolada, as pró-drogas e os lipossomas. Muitas drogas têm sido formuladas em sistemas transdérmicos e outras estão sendo analisadas quanto à viabilidade de serem veiculadas em tais sistemas (por exemplo: antihistamínicos, beta bloqueadores, bloqueadores dos canais de cálcio, antiinflamatórios não-esteroidais, contraceptivos, antiarrítmicos, anti-virais, insulina, hormônios, alfa-interferon, e quimioterápicos para o tratamento do câncer). A pesquisa também continua em torno de vários promotores químicos.

(31) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 12. de absorção, os quais podem permitir absorção de determinadas sustâncias por facilitar sua passagem através da pele. Promotores químicos, como a azona, por exemplo, podem fazer com que sejam absorvidas moléculas de grande tamanho, tais como proteínas e polipetídeos (Ranade, 1991). 2.3 Microemulsão Transdérmica P.L.O. (Pluronic®Lecithin Organogel) Pluronic® Lecithin Organogel (P.L.O.) é uma microemulsão fosfolipídica, empregada para a administração de fármacos pela via transdérmica. É um veículo de alta permeabilidade cutânea, com capacidade de carrear fármacos(s) incorporados(s), tais como anti-inflamatórios, analgésicos, anti-eméticos e outros, ideal para ser utilizado em situações nas quais se deseja uma. maior. permeabilidade. cutânea. e/ou. um. alcance. sistêmico. do. fármaco.. O organogel é na verdade uma emulsão que apresenta um toque sensorial de gel. Essa emulsão consiste de uma fase hidrossolúvel (gel aquoso de polaxamer 407 de 20 a 40%) e de uma fase lipossolúvel (palmitato de isopropila, lecitina e ácido sórbico). Tendo-se em mãos o gel aquoso de polaxamer e a solução L.I.P.S., o fármaco pode ser incorporado no organogel através do emprego de uma farmacotécnica simples que envolve a aplicação da força de extrusão. A força de extrusão é a força necessária para a formação de micelas “lipossomais” e consequentemente a encapsulação do fármaco incorporado (Fig. 4) Para aplicação de tal força, utiliza-se duas seringas conectadas por um adaptador e mistura-se o conteúdo das duas seringas, já com o fármaco incorporado na solução L.I.P.S.. Fig. 4. Micela “lipossomal” do Pluronic Lecithin Organogel. Fonte: Embrafarma Pharmaceutical. Expertise,. http://www.embrafarma.com.br/noticias.asp?nCod=30..

(32) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 13. Em 1992, Williman e colaboradores relataram que o organogel de lecitina (PLO) interagia com o estrato córneo na pele e desorganizava as camadas lipídicas para que a droga que carreava penetrasse mais facilmente. Eles então concluiram que o organogel poderia ser uma forma de liberação transdérmica diferenciada e eficaz. É importante ressaltar que o organogel desorganiza as camadas lipídicas da pele sem dissolvê-las como faz o DMSO. O organogel permite que a droga carreada penetre pelo estrato córneo até a circulação sistêmica via fluxo dérmico-epidérmico (Embrafarma Pharmaceutical Expertise, http://www.embrafarma.com.br/noticias.asp?nCod=30).. 2.4 Hidroquinona: Generalidades Propriedades Físico-Químicas, Manufatura e Processamento. OH. OH. A hidroquinona é representada pela estrutura acima, quimicamente conhecida como pdiidroxibenzeno ou 1,4 –benzenodiol. Esta matéria-prima se apresenta sob a forma de cristais aciculares cuja faixa de fusão está compreendida entre 170 e 172°C. A faixa de ebulição, por sua vez, está compreendida entre 285 e 287°C. Quanto à solubilidade, comporta-se da seguinte maneira: é solúvel em 14 partes de água, completamente solúvel em álcool e éter, levemente solúvel em benzeno. Soluções de hidroquinona tornam-se marrons devido à oxidação pelo ar. A oxidação é muito rápida em presença de álcalis (Merck Index). Soluções de hidroquinona em propilenoglicol/álcool a 70°GL são estáveis por um período de até 90 dias em presença de antioxidante e em pH ácido (Carriço & Bergold, 2000). Os diidroxibenzenos são industrialmente preparados de acordo com quatro principais rotas: (1) oxidação da anilina (conduz seletivamente à hidroquinona); (2) fusão alcalina do ácido m-benzenodissulfônico (conduz seletivamente ao resorcinol); (3) oxidação do p- ou –m-.

(33) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 14. diisopropil benzeno (conduz à hidroquinona ou ao resorcinol); (4) hidroxilação do fenol por peróxido de hidrogênio ( conduz à hidroquinona ou ao catecol). No período compreendido entre 1980 e 1990 algumas inovações foram descritas na literatura. A hidroxilação do fenol por peróxido de hidrogênio tem sido extensivamente estudada na tentativa de melhorar o sistema catalítico e maximizar a relação de hidroquinona em relação ao catecol (Othmer, 1995).. Emprego na Medicina e na Indústria A hidroquinona é uma substância química amplamente comercializada (DeCaprio, 1999), a qual vem sendo aproveitada para diversos fins na indústria e na Medicina (Wester et al, 1998). Além disso, é possível encontrá-la naturalmente na fumaça dos cigarros, nas folhas e cascas de várias espécies vegetais sob a forma de um glicopiranosídeo (o arbutin), bem como em alimentos provenientes de plantas, a exemplo do café, do vinho tinto e dos derivados do trigo (Deisinger & English, 1999). Representando o papel de matéria-prima industrial, a hidroquinona é empregada: na revelação de fotografias em preto-e-branco, como agente redutor; na manufatura da borracha, como antioxidante e finalmente na fabricação de materiais poliméricos, como inibidor da polimerização de monômeros vinílicos e acrílicos (Corley et al, 2000). Na clínica dermatológica, as formulações com hidroquinona têm demonstrado ser eficazes no tratamento de vários tipos de distúrbios da pigmentação da pele, incluindo melasma (cloasma), efélides, lentigo, lentigo solar, nevo melanocítico e hipercromias pósinflamatórias. Além disso, a hidroquinona vem sendo prescrita como agente tópico em associação com cirurgias cosméticas para minimizar pigmentações inesperadas. Este princípio ativo, por outro lado, foi introduzido em formulações de cremes clareadores “de venda livre”,.

(34) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 15. com o intuito de servir como alternativa mais segura e eficaz para substituir agentes ineficazes e potencialmente tóxicos como os derivados do mercúrio (Matsubayashi et al, 2002). A eficácia da hidroquinona como despigmentante foi comprovada em experimentos tanto com humanos quanto com animais (Wester et al, 1998). Atualmente é o agente despigmentante mais utilizado (Carriço & Bergold, 2000). Durante uma mesa-redonda a qual discutia o uso de cremes clareadores, membros do FDA (Food and Drug Administration, 1978-1982) chegaram à conclusão de que a hidroquinona seria o único princípio ativo eficaz para o clareamento da pele, e determinaram que seu uso prolongado era seguro, desde que numa concentração inferior a 2% (w/v) (David et al, 1998), que é seu nível de uso mais comum. Estudos do tipo “screening” têm sido realizados para descobrir e definir drogas que detenham uma ação citotóxica sobre melanócitos anormais, e nas últimas décadas diversos estudos foram direcionados para a determinação do potencial efeito anti-melanoma dos fenóis (Passi et al, 1987). Vários autores demonstraram que a hidroquinona é também capaz de destruir seletivamente células de melanoma maligno in vitro e in vivo (Borovanski, 1997; Doodley et al, 1994; Picardo Et Al, 1987; Passi et al, 1987; Abramowitz & Chavin, 1980; Chavin et al, 1980). Chew e colaboradores mencionam numa publicação de 1985 que a hidroquinona apresenta atividade frente aos microrganismos causadores da mastite bovina, no entanto existem poucos trabalhos envolvendo a atividade antimicrobiana deste princípio ativo. Seus derivados, no entanto, foram bastante investigados neste sentido (Trevors & Basaraba, 1980; Beckman & Siedow, 1985; Fung et al, 1985; Robertson et al, 1988; Johnson et al, 1989; Kumagai et al, 1992). Existem problemas para estabilizar as formulações com hidroquinona (estabilidade da formulação, neste contexto, refere-se à estabilidade de cor da mesma). Quando exposta ao ar, a hidroquinona é oxidada à forma de quinona, um composto amarelo, e a quinona.

(35) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 16. subseqüentemente sofre oxidação a hidroxiquinona, outro composto amarelo que é instável e polimeriza formando produtos cor marrom escuro (Esquema 1). Antioxidantes (por exemplo, o metabissulfito de sódio) podem muitas vezes melhorar a estabilidade da cor de formulações que contenham hidroquinona. Evitar o contato com o ar, com equipamentos metálicos, calor e luz também são fatores que protegem a formulação das alterações de cor (Carriço & Bergold, 2000; Su, 1999). ________DEPROTONAÇÃO________________________ O BQ. OH. OH. +. + +. O X I D A Ç Ã O. O. O. -. O. OH. OH. OH. R E D U Ç Ã O. + O. O-. O. -. SQ. O. OH. OH. OH. O. -. OH. HQ. PROTONAÇÃO. Esquema 1: Matriz ácido-base e oxidação-redução para hidroquinona (HQ), semiquinona (SQ) e benzoquinona (BQ). As reações de transferência de próton e elétron são mostradas nos eixos vertical e horizontal, respectivamente. As espécies mais estáveis sob condições fisiológicas aquosas estão indicadas em negrito. As demais espécies são menos favorecidas..

(36) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 17. As interconversões entre HQ, SQ e BQ acontecem via transferência simultânea elétronpróton (setas diagonais interrompidas -----). Fonte: DeCaprio, 1999. 2.6 Atuação da hidroquinona como despigmentante A hidroquinona, um composto químico hidroxifenólico, inibe a conversão de DOPA a melanina através da inibição da enzima tirosinase (Palumbo et al, 1991). Ela também pode atuar interferindo com a formação ou degradação dos melanossomos ou inibindo a síntese de DNA e RNA nos melanócitos. Sua semelhança química com certos precursores de melanina (tirosina e diidroxifenilalanina) explica sua habilidade para ser metabolizada nos melanócitos e sua ação seletiva frente à melanogênese. Diferente de seu derivado monobenziléter, a hidroquinona não é metabolizada a radicais livres citotóxicos, e portanto não é um agente melanocida ( Fisher, 1982). A hidroquinona afeta somente células com tirosinase ativa, como é o caso dos melanócitos da epiderme (Jimbow et al, 1974). Ela é menos ativa em condições nas quais predomina a melanina dérmica, uma vez que esta última é usualmente armazenada nos macrófagos, os quais possuem pouca ou nenhuma atividade de tirosinase. Estudos clínicos têm comprovado o efeito terapêutico benéfico da hidroquinona no tratamento do melasma e de outras desordens da pigmentação. Em resumo, a hidroquinona a 2% tem, segundo estes estudos, demonstrado produzir um decréscimo na hiperpigmentação o qual foi avaliado como bom a excelente em 14 –70% dos pacientes tratados (Pathak et al, 1986; Glenn et al, 1991; Verallo-Rowell et al, 1989). Concentrações maiores que 2% parecem ser mais efetivas, mas foram associadas com acréscimo de efeitos colaterais. Preparações combinadas, contendo hidroquinona e outros agentes, parecem por outro lado ser mais efetivas que a monoterapia (Katasambas & Stratigos, 2001)..

(37) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 18. Recentemente a hidroquinona tem sido utilizada em combinação com terapias a laser, dermoabrasões e peelings químicos (Yoshimura et al, 1999). O efeito clareador da hidroquinona é usualmente observado depois de algumas semanas ou alguns meses de aplicação diária. Sua eficácia como despigmentante depende de vários parâmetros, tais como concentração, estabilidade química e veículo utilizado (Katasambas & Stratigos, 2001). Preparações combinadas Desde que Kligman et al. (1975) relataram que o uso tópico combinado de tretinoína, dexametasona e hidroquinona era mais efetivo como formulação despigmentante que a utilização isolada de cada agente, a hidroquinona tem sido largamente empregada em combinação com a tretinoína e os corticosteróides (Gano & Garcia, 1979; Pathak et al, 1986; Yoshimura et al, 1999; Yoshimura et al, 2001). As combinações mais conhecidas estão descritas na Tabela 1. Na fórmula de Kligman a tretinoína funciona como irritante para facilitar a penetração epidermal da hidroquinona, e também desempenha o papel de antioxidante. A dexametasona, por sua vez, é utilizada para diminuir a irritação causada pela hidroquinona ou pela tretinoína e para inibir a síntese de melanina pela diminuição da atividade metabólica celular. Os autores da chamada fórmula de Pathak sugerem, por outro lado, que a aplicação tópica de esteróides não é necessária para que se atinja um clearance mais rápido dos ativos, e que seu uso deve ser restrito a pacientes que sofrem de irritação com a hidroquinona ou a tretinoína. O efeito clareador da N-acetilcisteína na fórmula de Westhorf está provavelmente relacionada com o aumento do glutation intracelular, o qual estimula a síntese de.

(38) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 19. feomelanina ao invés de eumelanina após se ligar à dopaquinona, clinicamente produzindo pigmento mais claro. A N-acetilcisteína e o glutation exercem um efeito inibitório frente à tirosinase, o que pode responder por suas propriedades clareadoras Existem muitas variações das fórmulas acima, principalmente no que diz respeito à concentração dos diferentes ingredientes e ao tipo de esteróide tópico empregado (Katasambas & Stratigos, 2001).. Nome da Fórmula. Ingredientes Ativos. Fórmula de Kligman. Hidroquinona 5% Tretinoína 0,05-0,1% Dexametasona ou Valerato de betametasona 0,1% Em base hidroalcoólica, creme ou pomada. Fórmula de Pathak. Hidroquinona 2% Tretinoína 0,05-0,1% Em base hidroalcoólica, creme ou pomada. Fórmula de Westhorf. N-acetilcisteína 3% Hidroquinona 2% Hidrocortisona 1% Em pomada. Tabela 1: Componentes das “preparações combinadas” 2.7 Atividade da hidroquinona frente a melanomas in vitro e in vivo Embora. os. agentes. denominados. melanocitolíticos. destruam. seletivamente. melanócitos anormais, que não sejam tegumentares, o estudo do mecanismo de ação destes compostos tem sido limitado. Segundo Chavin e Schlesinger (1966), a hidroquinona destrói efetivamente o melanoma maligno metastático geneticamente induzido in vivo. Comprovou-se, através de ensaios in vitro, que esta droga também destrói células de melanomas dos tipos B-16 (Hu, 1966) e S-91 (Pawelek et al, 1973) de camundongos..

(39) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 20. Bleehen (1976) relatou que o 4-isopropilcatecol e o 4-hidroxianisol causam “sangramento” da membrana celular, perda de adesão entre os dendritos, vacuolização citoplasmática e rompimento da arquitetura subcelular em cultura de células de melanomas dos tipos HP, B-16 e humano. As mesmas alterações melanocitolíticas foram descritas em melanócitos normais e de melanoma após tratamento com outros compostos melanocitolíticos, incluindo a hidroquinona. Culturas de fibroblastos de camundongos e humanos não são afetadas por estas substâncias (Abramowits & Chavin, 1980). Em fêmeas de camundongos BALB/c com transplantes de melanoma, a incidência de mortes é reduzida e o tempo de sobrevida é aumentado com a hidroquinona. O mecanismo de ação da droga parece acontecer via DNA (Chavin et al, 1980).. 2.8 Atividade Antimicrobiana da Hidroquinona Staphylococcus aureus x resistência a antimicrobianos Staphylococcus aureus é uma bactéria que se apresenta em forma de cocos Grampositivos e produz um amplo espectro de doenças desde lesões superficiais até severas infecções sistêmicas, no homem e outros animais. É um importante patógeno nosocomial, sendo descrito como agente etiológico significativo em infecções hospitalares, adquiridas desde 1950; é também o mais freqüente microrganismo associado às mastites humana e bovina (vide fig 5).. Figura 5.

(40) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 21. Figura 5. Staphylococcus aureus - Ilustração do aspecto de células coradas de S. aureus, vistas ao microscópio óptico (esquerda) e aspecto das células em Microscopia Eletrônica de Transmissão (direita). Fonte: http://www.biologianaweb.com/biomural/divulga/staph/socorro1.html. O uso abusivo e indiscriminado de agentes antimicrobianos na prática clínica humana e veterinária tem um efeito seletivo no surgimento e manutenção de resistência a drogas. Particularmente em S. aureus, sua versatilidade no desenvolvimento de resistência a vários agentes antimicrobianos contribui para a sua sobrevivência em ambientes hospitalares e difusão entre os pacientes. Este é o caso de linhagens de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA), um antibiótico do grupo das penicilinas (β-lactâmicos) que age ao nível da parede celular. Curiosamente, os MRSA que usualmente são também resistentes às penicilinas e cefalosporinas apresentam ainda resistência a outros grupos de antibióticos, tais como aminoglicosídeos, lincomicinas, tetraciclinas, rifampicinas (vide Figura 6). Estes antibióticos agem em outros alvos dentro da célula (Pereira, 2003). O fenômeno de gene-resistência observado com a linhagem de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) e que é também resistente à maioria das drogas usadas na prática clínica tem sido associado à presença de elementos genéticos transponíveis. Tais elementos são segmentos de DNA altamente móveis que ajudam a transferir genes de resistência de plasmídeos para cromossomos e de cromossomos para plasmídeos. No patógeno MRSA este elemento é bastante grande albergando os genes necessários aos eventos de transposição, à resistência a meticilina e à resistência. a. outros. antibióticos. não. β-lactâmicos. (Hiramatsu. et. al.,. 2001).. O surgimento de níveis elevados de resistência à penicilina, seguido do desenvolvimento e disseminação de cepas resistentes às penicilinas semi-sintéticas (meticilina, naficilina e oxacilina),macrolídeos, tetraciclinas e aminoglicosídeos, tem.

(41) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 22. transformado em desafio global a terapia contra doenças causadas por S. aureus. Nos anos 80, por causa da ampla ocorrência de MRSA’s, a terapia empírica para infecções estafilocócicas, particularmente sepsis nosocomiais, voltou-se para a vancomicina em muitas instituições hospitalares. Difundiu-se então o emprego da vancomicina e já nos anos 90 se verificava um aumento significativo na utilização deste antibiótico. A conseqüência deste fato foi o estabelecimento de uma pressão seletiva que eventualmente levou ao surgimento de cepas de S. aureus (bem como de outras espécies de staphyloccoci) com reduzida sensibilidade a vancomicina e outros glicopeptídeos (Tenover et al, 2001).. Figura 6. Alvos de ação de drogas antimicrobianas na célula bacteriana. Fonte: http://www.biologianaweb.com/biomural/divulga/staph/socorro1.html O problema da resistência bacteriana a drogas é grave e demanda medidas de controle urgentes para reduzir ao máximo a pressão dos antimicrobianos no ambiente: a redução do uso de antimicrobianos em hospitais, a realização de antibiogramas, bem como a realização de campanhas educativas sobre os perigos da auto medicação e o desenvolvimento da resistência.

(42) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 23. a drogas, seriam bom exemplos destas medidas, as quais associadas à pesquisa na busca de novos agentes antimicrobianos (seja a partir de microrganismos, produtos animais ou extratos de plantas) poderão contribuir em longo prazo na redução do desenvolvimento da resistência (Pereira, 2003). Staphylococcus aureus, mastite e hidroquinona. Condições inflamatórias da mama podem ser observadas em períodos puerperais ou não - puerperais. A mastite, na ocasião do pós-parto, é identificada pela presença de uma área cuneiforme, eritematosa e dolorida no seio. A lactação predispõe pacientes a esta doença. Recentemente, estudos demonstraram que a mastite clinicamente aparente afeta 2030% das mulheres que amamentam. A presença do leite no ducto, combinada com rachaduras no mamilo por causa do processo de amamentação, cria um ambiente favorável à infecção. O processo começa com estase do leite. Com a obstrução persistente do fluxo de leite, a mastite não infecciosa pode se desenvolver. Se um inóculo bacteriano considerável for introduzido no sistema de ductos, a mastite infecciosa pode ocorrer. A bactéria pode ser proveniente da boca do lactente ou da pele da mãe. A doença, se não tratada, pode interromper a amamentação e até provocar a formação de abcessos na mama. A mastite puerperal é comumente causada por Staphylococcus aureus. Outros organismos menos freqüentemente isolados incluem streptococcus dos grupos A e βhemolíticos do grupo B, bem como Escherichia coli e espécies de bacterióides. O tratamento requer antibioticoterapia, administração de analgésicos. A mastite não-puerperal é uma condição menos comum resultante na maioria das vezes de uma metaplasia escamosa do sistema ductal a qual pode levar à obstrução dos ductos e subseqüente formação de abcesso. O tratamento requer excisão do ducto envolvido e reconstrução cuidadosa do mamilo..

(43) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 24. A mastite pode também resultar de estados infecciosos incomuns tais como tuberculose e outras causadas por Corynebacterium striatum e Pseudomonas aeroginosa, por exemplo ( Ripley,1999; Semba et al, 1999) .. Fig. 7- Amamentação Fonte: http://www.rnw.nl/parceria/assets/images/borstvoeding240.jpg Desde 1985 (Chew et al, 1985) várias pesquisas na área da Medicina Veterinária vêm sendo realizadas com os derivados fenólicos (incluindo os derivados de hidroquinona) para determinação de seu efeito antimicrobiano, inclusive frente aos microorganismos causadores da mastite bovina, sendo satisfatórios muitos dos resultados. As propriedades antimicrobianas da hidroquinona e de outros derivados fenólicos contra patógenos causadores da mastite humana, no entanto, ainda carecem de investigação, e caso seja comprovada a eficácia destes compostos no tratamento da doença em questão surge uma alternativa para o problema da resistência microbiana à antibioticoterapia convencional que vem sendo atualmente utilizada. 2.9 Hidroquinona: Toxicologia DeCaprio e colaboradores (1999), em seu rico trabalho de revisão bibliográfica a respeito das características toxicológicas da hidroquinona, citam que muitos estudos nesta área vêm sendo realizados com este princípio ativo especialmente por causa de se tratar o.

(44) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 25. mesmo de um metabólito do benzeno. Como conclusão de seu trabalho, os referidos autores sugerem que a exposição à hidroquinona, sob condições ambientais e ocupacionais, oferece pouco risco. Tal exposição, mesmo considerados os piores casos quantitativos, está muito abaixo dos níveis associados com danos moderados à saúde humana, segundo relatos de Whysner et al (1995), bem como da OECD (Organization for Economic Cooperation and Development, 1997). Embora a hidroquinona seja também apenas moderadamente irritante para a pele quando testada em bioensaios clássicos para irritação dérmica aguda, o uso prolongado de preparações tópicas que a contenham está relacionado a vários relatos de reações adversas. A aplicação repetida de alguns produtos clareadores, segundo Findley et al (1982), é responsável pelo aparecimento da ocronose exógena especialmente em indivíduos com a pele altamente pigmentada. Outras reações do tipo irritação, leucoderma ou sensibilização foram descritas por diferentes autores (Bentley-Phillips & Bayles, 1975; Fisher, 1982). As reações adversas mencionadas, no entanto, ocorreram primeiramente quando a concentração de hidroquinona excedeu o nível de 2% recomendado pelo FDA (David et al., 1998)..

(45) OBJETIVOS _______________________________________________________________________.

(46) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 27. 3. OBJETIVOS. 3.1 Geral. O principal objetivo deste trabalho consiste na obtenção e caracterização de uma microemulsão (microemulsão fosfolipídica Pluronic® Lecithin Organogel - PLOme) para via transdérmica contendo hidroquinona, visando-se a melhora do perfil terapêutico deste princípio ativo e a descoberta de novas aplicações biológicas.. 3.2 Específicos. •. Obter microemulsões fosfolipídicas (Pluronic®Lecithin Organogel) contendo hidroquinona;. •. Avaliar a estabilidade e o perfil cinético da hidroquinona a partir das formulações obtidas;. •. Determinar a ação da hidroquinona como agente antimicrobiano frente a diversas cepas resistentes de Staphylococcus aureus..

(47) ARTIGO ___________________________________________________________________.

(48) A NEW TRANSDERMAL DRUG DELIVERY SYSTEM CONTAINING HYDROQUINONE. Trabalho a ser submetido ao periódico “Drug Development and Industrial Pharmacy”.

(49) A NEW TRANSDERMAL DRUG DELIVERY SYSTEM CONTAINING HYDROQUINONE. S. S. Bezerra1, D.M.V. de Deus1, R. M. R. Costa1, M. N. P. Caetano2, N. S. SantosMagalhães1,3*. 1Laboratory of Immunopatology Keizo-Asami (LIKA), Federal University of Pernambuco (Brazil). 2Laboratory of Microbiological Analisys, Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Health Sciences Center, Federal University of Pernambuco, Brazil. 3Biochemistry Department, Health Sciences Center, Federal University of Pernambuco, Brazil.. Keywords: Hydroquinone; stability; transdermal liposome; Pluronic® Lecithin Organogelkinetics; antimicrobial activity; Staphylococcus aureus. * Corresponding author: Dr. Nereide Stela Santos Magalhães Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) Grupo Sistemas de Liberação Controlada de Medicamentos Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária, CEP 50670-901, Recife-PE, Brasil. Tel.: +55-081-32718584; Fax: +55-081-32718485 E-mail: nssm@ufpe.br.

(50) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 31. ABSTRACT Hydroquinone (HQ) is a drug reported to possess manifold biological activities, such as depigmenting, antimicrobial and antitumour properties. The PluronicLecithin Organogel (PLOme) is a phospholipidic microemulsion particularly implied when a high cutaneous permeability and systemic absorption of a drug is suitable. Once that HQ is highly unstable into various topical vehicles and it presents low topical bioavailability and toxicity, the HQ appears as a fulfilling drug to this liposomal pharmaceutical form. The aim of this work was therefore to incorporate such a drug into this transdermal drug delivery system. Furthermore, the stability and the kinetic profile as well as the antimicrobial activity of both free and incorporated forms of HQ were evaluated. HQ-loaded PLOme and unloaded PLOme were prepared according to the supplier directions. The samples were then submitted to accelerate and long-term stability tests. Thermal stability studies were also performed monitoring the pH and the HQ content into PLOme formulations stored at 25oC and 37oC. The HQ content was assayed by high performance liquid chromatography using the United States Pharmacopoeia method. A method of drug extraction from PLOme formulations was developed and validated. The in vitro HQ kinetic profile from the best formulations at 0.1% concentration was examined using the Franz cells method. A cellulose membrane was used to separate the donors and the aqueous receptor medium. The antimicrobial activity against ATCC and resistant Staphylococcus aureus strains was determined for free and encapsulated HQ forms (Staphylococcus aureus ATCC chosen were the ATCC 6538/ FDA 209 and the ATCC 6538P/ FDA 209P). The multi inoculation agar dilution susceptibility testing method were used. No microscopic or microscopic alterations were detected after accelerated stability testing, but the presence of darkness of.

(51) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 32. HQ loaded PLOme. Long-term stability testing also revealed darkness for HQ-loaded formulations. Neither detectable increase on the particle size nor modification on particle shape occurred until 120 days. No relevant pH evolution was observed for both HQ-free and HQ-loaded PLOme. Concerning the HQ content, no degradation was noticed under unfavorable thermal conditions. The pH changes were not detected in the short-term thermal stability analysis. In contrast, the long-term stability showed a second-order HQ degradation, which leads to a short shelf life. The HQ rate obtained from microemulsion was close to 1.5 times lower than that one derived with HQ in a gel matrix at a similar drug concentration. Free PLOme-encapsulated hydroquinone showed to have great in vitro inhibitory potential against strains of S. aureus (including multi resistant ones); PLOmeencapsulated hydroquinone had better activity than hydroquinone against two of the testing-strains.The transdermal gel containing HQ, otherwise, seems not to be enough stable under the above mentioned stability tests. As a consequence, further investigation is required on the stability and kinetic of this pharmaceutical form before commercialization..

(52) Bezerra, S.S.. Obtenção, Caracterização e Avaliação Biológica.... 33. 1. Introduction. Advances on new substances with dermocosmetic activity has increased the number of available topical/transdermal systems. A huge number of drugs available in the medicalpharmaceutical market with different physicochemical and pharmacological properties, lead pharmacists to have know how on cosmetic base compatibility with the maintenance of the final formulation stability to avoid loss of pharmacological activity of the product in its site of action (1). A clear advancement in the delivery of some drugs was the development of a vehicle-carrier agent which can penetrate the mucosa and cutaneous tissues to carry the active agent to the treatment site. A new phospholipidic microemulsion formulation - Pluronic® Lecithin Organogel, consists of a lecithin, isopropyl palmitate and sorbic acid organic phase emulsionated with a gel phase of polaxamer 407 and sodium sorbate (2). The major caveat underlying this transdermal delivery treatment strategy is that except for patient testimony and a few studies, there are limited empirical data on the efficacy of most of these new formulations, and additional research is clearly needed (3). Hydroquinone (HQ), a melanocytolytic agent, is reported to hold different biological properties, such as bleaching trough inhibition of melanogenesis (4,5). It also presents activity against murine and human melanoma (6,7). Its chemical derivatives are known to have antimicrobial action. Fung and co-workers (8) mentioned in a review article a good inhibition of different Staphylococcus aureus strains by low concentrations of tertiary butylhydroquinone (TBHQ). The activity of TBHQ against Staphylococcus aureus was also confirmed by Chew et al (9)..