Rafael Bezerra Cavalcante
CONSTRUÇÃO DE LINHAGEM RECOMBINANTE DE Enterococcus gallinarum PARA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA
Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Fernando Spiller Coorientador: Prof. Dr. Ricardo R. Mazzon
Florianópolis, SC. 2017
Rafael Bezerra Cavalcante
CONSTRUÇÃO DE LINHAGEM RECOMBINANTE DE Enterococcus gallinarum PARA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA
Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de “Mestre”, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-graduação em Farmacologia da Universidade Federal de Santa Catarina.
Dedicatória Este trabalho é dedicado aos meus pais, colegas e amigos de laboratório e aos meus queridos familiares.
SUMÁRIO SUMÁRIO ... 4 LISTA DE FIGURAS ... 6 RESUMO ... 15 ABSTRACT ... 16 1 INTRODUÇÃO ... 17 1.1 Pancreatite Aguda ... 17
1.2 Microbiota e Translocação Bacteriana ... 18
1.3 Antibioticoterapia ... 19
1.4 Enterococcus gallinarum ... 21
1.5 Recombinação Homóloga ... 23
1.6 Proteína EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) ... 24
1.7 Justificativa ... 24
2 MATERIAIS E MÉTODOS ... 26
2.1 Local de desenvolvimento do estudo ... 26
2.2 Enterococcus gallinarum ... 26
2.3 Extração plasmidial de Enterococcus gallinarum ... 26
2.4 Digestão do plasmídeo com enzima de restrição NruI ... 27
2.5 Crescimento de Enterococcus gallinarum em ágar LB (Lysogeny Broth) com e sem adição de sacarose ... 28
2.6 Oligonucleotídeos (Primers) ... 28
2.7 PCR de colônia... 29
2.8 Gel de Agarose ... 29
2.9 Eletroforese ... 30
2.10 Amplificação do gene vanC1 por PCR de colônia... 30
2.11 Construção de linhagem repórter de Enterococcus gallinarum ... 31
2.11.1 Reação de amplificação por PCR com GoTaq® DNA polimerase ... 31
2.11.2 Reação de amplificação por PCR com Phusion® High-Fidelity DNA polimerase ... 31
2.11.3 Amplificação da região promotora do operon codificante das subunidades β e β’ da DNA polimerase DNA-dependente (Promotor-βeta) por PCR de colônia ... 32
2.11.4 Amplificação dos fragmentos das regiões flanqueadoras (upstream e downstream) do gene do transportador de sacarose AL523_16890 ... 32
2.11.5 Amplificação do gene EGFP (Enhanced Green Flurescent
Protein) do plasmídeo pEGFP-N3 ... 32
2.12 Digestão do fragmento de 1000 pares de bases amplificado com Ega-P-βeta 1 e Ega-P-βeta 2... 33 2.13 Purificação dos produtos de PCR... 33 2.14 Fusão do βeta ao EGFP e amplificação do fragmento P-βeta-EGFP por PCR ... 34 2.15 Purificação da banda P-βeta-EGFP, de 1743 pares de bases, do gel de agarose ... 34 2.16 Adição de dATP ao P-βeta-EGFP (dATP tailing) ... 35 2.17 Inserção do P-βeta-EGFP no pGEM® T-Easy ... 35 2.18 Transformação do pGEMP-βeta-EGFP em E. coli DH5α termo-competente ... 35 2.19 Obtenção dos clones de E. coli DH5α positivos para presença do pGEMP-βeta-EGFP ... 36 2.20 Extração do plasmídeo pGEMP-βeta-EGFP de E. coli DH5α ... 36 2.21 Produção de Enterococcus gallinarum eletrocompetentes ... 36 2.22 Eletroporação em Enterococcus gallinarum
eletrocompetentes ... 37 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 38
3.1 As cepas de Enterococcus gallinarum utilizadas neste estudo não apresentaram o plasmídeo pA6981 ... 38 3.2 Amplificação do gene vanC1 ... 39 3.3 Amplificação da região promotora P-βeta de Enterococcus gallinarum (Ega P-βeta)... 41 3.4 Digestão do fragmento amplificado de 1000 pares de bases com a enzima de restrição XhoI ... 46 3.5 Amplificação da região promotora P-βeta por PCR com a enzima Phusion® High-Fidelity DNA polimerase ... 48 3.6 Amplificação por PCR do gene EGFP do plasmídeo pEGFP-N3 ... 50 3.7 Fusão do P-βeta ao EGFP, inserção no vetor pGEM®-T Easy e transformação em E. coli DH5α ... 51 3.8 Inserção do pGEMP-βeta-EGFP em Enterococcus gallinarum por eletroporação ... 56 4 CONCLUSÃO ... 61 Referências ... 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Extração e digestão plasmidial. ... 39
Figura 2: Amplificação do gene vanC1. ... 40
Figura 3: Representação da região promotora P-βeta. ... 41
Figura 4: Representação do gene AL523_16890 ... 42
Figura 5: Crescimento em ágar LB na presença ou ausência de sacarose. ... 43
Figura 6: PCR de colônia de Enterococcus gallinarum, Enterococcus gallinarum isolada de humanos e Enterococcus faecalis. ... 45
Figura 7: Confirmação da amplificação de P-βeta. ... 46
Figura 8: Digestão de P-βeta com a enzima XhoI. ... 47
Figura 9: Amplificação de P-βeta com Phusion® High-Fidelity e GC buffer. ... 49
Figura 10: Amplificação do EGFP. ... 51
Figura 11: Mapa do pGEM®-T Easy. ... 53
Figura 12: Seleção em ágar LB/Amp/IPTG/X-Gal. ... 54
Figura 13: Confirmação da presença do P-βeta-EGFP no pGEM® T-Easy. ... 55
Figura 14: Crescimento em meio com Ampicilina após eletroporação. ... 57
Figura 15: Visualização através de Microscopia de Fluorescência. .... 58
RESUMO
A Pancreatite Aguda é uma doença inflamatória causada pela obstrução dos ductos biliar e pancreático por cálculos biliares. Essa obstrução gera uma lesão levando à necrose pancreática que é inicialmente estéril, mas pode se tornar infectada devido à translocação de bactérias intestinais para o sítio necrótico. A utilização profilática de antibióticos ainda é comum na prática clínica apesar de não ser apoiado pelas diretrizes mais recentes para o tratamento da Pancreatite Aguda. Os antibióticos mais utilizados nesses quadros são os da classe dos Carbapenêmicos, onde os mais comuns são o Imipenem e o Meropenem. Em um modelo experimental de pancreatite aguda previamente realizado em nosso laboratório, animais tratados com Meropenem tiveram uma sobrevida menor comparado aos animais não tratados, além de apresentarem bactérias da espécie Enterococcus gallinarum no sangue. Esses microrganismos são habitantes comensais da microbiota intestinal classificados como patobiontes, ou seja, microrganismos simbióticos com potencial patogênico sob certas condições. Estudos anteriores realizados mostraram que em animais com Pancreatite Aguda o E. gallinarum foi capaz de translocar do intestino e atingir a corrente sanguínea. A hipótese é que a translocação ocorra através da parede intestinal ou do ducto biliopancreático. A alternativa para testar essa hipótese foi o desenvolvimento de uma linhagem recombinante de E. gallinarum que expresse a proteína EGFP, uma proteína que emite fluorescência verde, através de recombinação homóloga. A partir do genoma da E. gallinarum foi amplificado uma sequência de 1000 pares de bases nucleotídicas da região promotora das subunidades β e β’ da RNA polimerase que é expressa constitutivamente durante a vida do microrganismo. Foi realizada a fusão da região amplificada com o gene egfp e o novo fragmento foi inserido no plasmídeo pGEM®-T Easy, que posteriormente foi internalizado pela bactéria durante o processo de eletroporação. As colônias que receberam o plasmídeo foram selecionadas através da resistência à Ampicilina porém não foi observado a expressão da proteína EGFP. Portanto não foi possível a construção da linhagem recombinante de E. gallinarum para a expressão da proteína EGFP através da amplificação da região promotora da subunidade β e β’ da RNA polimerase.
Palavras-chave: Pancreatite Aguda, Inflamação, Microbiota, Enterococcus gallinarum.
ABSTRACT
Acute Pancreatitis is an inflammatory disease caused by obstruction of biliary and pancreatic duct by gallstones. This obstruction generates a lesion that leads to pancreatic necrosis, which is initially sterile but may become infected due to the translocation of intestinal bacteria to the necrotic site. Prophylactic use of antibiotics is still a common in clinical practice despite the lack of support from the most recent guidelines for the treatment for Acute Pancreatitis. The most used antibiotics in these cases are those of Carbapenem’s class, where the most common are Imipenem and Meropenem. In an experimental model of Acute Pancreatitis previously performed in our laboratory, animals treated with Meropenem had a shorter survival compared to untreated animals, and showed bacteria from Enterococcus gallinarum specie in the blood. These microorganisms are commensal inhabitants of intestinal microbiota classified as pathobionts, that is, symbiotic microorganisms with pathogenic potential under certain conditions. Previous studies shown that in animals with Acute Pancreatitis the E. gallinarum was able to translocate from intestine and reach the bloodstream. The hypothesis is that translocation occurs through the intestinal wall or the biliopancreatic duct. The alternative to test this hypothesis was the development of recombinant lineage of E. gallinarum that express the EGFP protein, a protein that emits green fluorescence. From the genome of E. gallinarum was amplified 1000 base pair sequence of the promoter region β and β’ subunit RNA polymerase which is constitutively expressed during the life of the microorganism. Fusion of the amplified region with egfp gene was performed and the new fragment was inserted into plasmid pGEM®-T Easy, which was later internalized by the bacterium during the electroporation process. The colonies that received plasmid were selected through resistance to Ampicilin however, no expression of protein EGFP was observed. Therefore, it was not possible the development of the recombinant E. gallinarum linage for EGFP protein expression by amplifying the promoter region of the β and β’ subunit of RNA polymerase.
Keywords: Acute Pancreatitis, Inflammation, Microbiota, Enterococcus gallinarum.
1 INTRODUÇÃO 1.1 Pancreatite Aguda
Com uma incidência de aproximadamente 16 casos por 100.000 habitantes ao ano (Dhiraj, Yadav, Albert B. 2014; De Campos et al. 2008), a Pancreatite Aguda (PA) é uma doença inflamatória causada principalmente pela presença de cálculos biliares que obstruem o ducto pancreático e o ducto biliar. Essa obstrução leva à autodigestão do pâncreas através da ativação do tripsinogênio em tripsina (Frossard et al. 2008). A tripsina nas células acinares pancreáticas leva à ativação de várias outras enzimas como a elastase e a fosfolipase A2 (Frossard et al. 2008) e à produção local de citocinas pró-inflamatórias, tais como interleucina 1β (IL-1β), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8) e Fator de Necrose Tumoral (TNF), pelos macrófagos locais (Norman 1998). A produção desses mediadores inflamatórios induz a migração de neutrófilos para o pâncreas e tecidos perivasculares pancreáticos ativando as células endoteliais e possibilitando a infiltração de leucócitos circulantes para o sítio inflamatório, amplificando assim a resposta no local (Dugernier et al. 2003; Mayer et al. 2000; Piccinini et al. 2010; Satoh et al. 1999). A resposta inflamatória amplificada pode levar à necrose do tecido pancreático assim como de tecidos peri-pancreáticos adjacentes, à Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS), à translocação bacteriana e à síndrome da disfunção de múltiplos órgãos (Zhang et al. 2013; Hoque et al. 2012).
As células do sistema imune inato expressam receptores reconhecedores de padrões (PRR) que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), como por exemplo o LPS, uma molécula comum às bactérias Gram-negativas e os ácidos lipoteicóicos presentes na parede celular de bactérias Gram-positivas; e padrões moleculares associados a dano tecidual (DAMPs). Como citado anteriormente, a obstrução do ducto pancreático leva à conversão do tripsinogênio em tripsina e autodigestão do pâncreas. A ativação da tripsina, e de outras enzimas digestivas, causa o rompimento da membrana dos ácinos pancreáticos, fazendo com que moléculas intracelulares sejam liberadas para o espaço extracelular. Essas moléculas liberadas, como por exemplo DNA mitocondrial (DNAmt), DNA nuclear (DNAn), ATP, são reconhecidas como DAMPs e tem a capacidade de se ligar aos receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) dos macrófagos presentes no tecido pancreático (Kono & Rock 2008; Norman 1998).
A lesão endotelial dos capilares pancreáticos é mediada pelos neutrófilos através da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) (Norman 1998). Após ocorrer o dano tecidual, o conteúdo intracelular liberado das células danificadas desencadeia a reação inflamatória ao ser reconhecido pelos PRRs dos macrófagos teciduais.
A lesão pancreática é inicialmente estéril. Porém, durante a segunda ou terceira semana cerca de 40-70% dos pacientes desenvolvem infecção no tecido necrótico do pâncreas. Essa complicação é a maior causa de morbidade e mortalidade desses pacientes (Frossard et al. 2008). A infecção pancreática pode ser causada por bactérias oriundas da microbiota intestinal que migram através da mucosa epitelial para locais extra intestinais (Cicalese et al. 2001; Fritz et al. 2010).
1.2 Microbiota e Translocação Bacteriana
Diversas espécies de microrganismos como bactérias, fungos e vírus habitam o corpo humano. Esses microrganismos colonizam os vários sistemas do nosso corpo e compõem a microbiota humana. No intestino, por exemplo, podem ser encontradas cerca de 500 à 1000 espécies de bactérias. Além da sua contribuição para a digestão de alguns polissacarídeos complexos, sua participação no metabolismo e na síntese de vitaminas, a microbiota intestinal tem importante papel no desenvolvimento, manutenção e regulação do sistema imunológico (Rooks & Garrett 2016). Vários estudos têm demonstrado que a microbiota intestinal é um eixo importante na regulação da inflamação local e sistêmica (Verdam et al. 2013; Cani et al. 2009; Mainous et al. 1995; DEITCH et al. 1992; Maslowski et al. 2009; Souza et al. 2004; Rakoff-Nahoum et al. 2004). Perturbações no equilíbrio da microbiota, modificações na motilidade intestinal e função da barreira epitelial, e alterações nas respostas do sistema imune podem levar à translocação bacteriana (Cicalese et al. 2001; van Minnen et al. 2007).
A translocação bacteriana foi definida por volta do ano de 1979, por Rodney D. Berg e Alva W. Garlington, pesquisadores da Universidade do Estado de Louisiana, EUA, como a passagem de bactérias viáveis (e seus metabólitos ou endotoxinas) da luz do trato gastrointestinal para os linfonodos mesentéricos e outros órgãos, como baço, fígado e rins, podendo atingir também a circulação sistêmica (Berg & Garlington 1979; Owens & Berg 1980).
A diminuição da motilidade intestinal é um dos eventos iniciais na pancreatite aguda e está relacionada à translocação bacteriana. Essa diminuição do trânsito intestinal permite a aderência de bactérias à parede
intestinal. A liberação de grandes quantidades de toxinas, por essas bactérias aderidas, leva à modificações na superfície epitelial que podem desencadear respostas como, por exemplo, a liberação de citocinas (Valori 1991; Sjogren et al. 1989; Leveau et al. 1996). Com o clearance peristáltico de bactérias prejudicado pelo atraso na motilidade gástrica, a estase intestinal gerada favorece a colonização e o crescimento excessivo de bactérias entéricas na luz do órgão, contribuindo para a ocorrência de translocação bacteriana (Leveau et al. 1996; Deitch et al. 1985; Wang et al. 1993). Em modelos experimentais de pancreatite aguda, induzida por obstrução do ducto biliopancreático, foi observado alteração na motilidade intestinal, crescimento exacerbado de bactérias no intestino delgado e aumento da permeabilidade intestinal (Deitch et al. 2003; Nieuwenhuijs et al. 2000).
A obstrução do ducto biliopancreático, por si só, causa um distúrbio no migrating motor complex (MMC), que são ondas eletromecânicas observadas no músculo liso intestinal que varrem o intestino em ciclos regulares durante os períodos de jejum. A alteração nesse padrão de motilidade intestinal favorece o crescimento exagerado de bactérias entéricas e facilita sua translocação para sítios extra intestinais. (Fritz et al. 2010; Nieuwenhuijs et al. 2000).
1.3 Antibioticoterapia
A complicação local mais grave na pancreatite aguda é a necrose pancreática, pois está frequentemente associada à infecção do tecido necrótico do pâncreas. Apresentando uma taxa de mortalidade média de 30%, podendo variar de 14% a 69% (Banks & Freeman 2006), a infecção do pâncreas necrótico é a maior causa de morbidade e mortalidade em pacientes com pancreatite aguda. Quando há confirmação de infecção do tecido pancreático inicia-se a antibioticoterapia intravenosamente (Frossard et al. 2008). Devido à característica da necrose pancreática poucos antibióticos conseguem penetrar o tecido necrosado, dentre eles estão os antibióticos da classe dos Carbapenêmicos (Pezzilli et al. 2015; Dick et al. 2016; Tenner et al. 2013).
O uso de antibióticos de forma profilática não tem sido recomendado pelas diretrizes mais recentes de pancreatite aguda (Dick et al. 2016; Pezzilli et al. 2015; Greenberg et al. 2016; Janisch & Gardner 2016). Os resultados obtidos nos estudos de metanálises não apoiam o uso de antibióticos para prevenção de infecção da necrose pancreática (Wittau et al. 2011; Bai et al. 2008; Villatoro et al. 2010; Jiang et al. 2012). Segundo o American College of Gastroenterology Guideline:
Management of Acute Pancreatitis, publicado em 2013, desde 1993
houve 11 ensaios randomizados prospectivos apropriados que avaliaram o uso profilático de antibióticos na pancreatite aguda grave. Baseado nos resultados dessas metanálises, para que 1 paciente apresentasse benefício com a profilaxia por antibióticos seria necessário tratar 1429 pacientes (Tenner et al. 2013). Portanto, é mínimo o número de estudos que mostram que o uso profilático de antibióticos reduz significativamente a taxa de mortalidade nos pacientes com pancreatite aguda grave. Porém, na prática clínica, a profilaxia com antibióticos continua sendo empregada nos quadros de pancreatite aguda grave (Jiang et al. 2012).
Os Carbapenêmicos são antibióticos muito utilizados nos quadros de pancreatite necrótica, devido à sua eficiência em penetrar o tecido pancreático e ao seu amplo espectro de atividade contra bactérias aeróbicas e anaeróbicas. Os medicamentos mais comuns dentro dessa classe são o Imipenem e o Meropenem. O Imipenem é o antibiótico de primeira escolha para o tratamento de infecções na necrose pancreática por apresentar, quando comparado a outras classes de antibióticos, maior atividade contra os microrganismos geralmente encontrados na infecção pancreática (Büchler et al. 1992; Bassi et al. 2003). O Meropenem é um fármaco também pertencente à classe dos Carbapenêmicos. Porém, devido a características estruturais, se apresenta mais estável frente à deidropeptidase renal-I, enzima que degrada o Imipenem, e se mostra mais eficaz contra microrganismos Gram-negativos, isso faz com que seu uso seja uma alternativa válida e segura ao Imipenem (Pezzilli et al. 2015; Drusano 1997; Dick et al. 2016; Bonfiglio et al. 2002).
Em um modelo experimental de pancreatite aguda induzida pela obstrução do ducto biliopancreático de camundongos, realizado previamente no laboratório, tanto os animais pré tratados, quanto os pós tratados com Meropenem (100 mg/Kg, 12/12 h durante 3 dias) apresentaram redução na sobrevida em comparação aos não tratados. O pré tratamento com Meropenem evidenciou a diminuição na sobrevida, e os animais apresentaram bactérias no sangue e no lavado peritoneal. Essas bactérias foram isoladas e submetidas à identificação. Todos os animais que receberam o tratamento com Meropenem apresentaram, no sangue, a espécie Enterococcus gallinarum, um microrganismo Gram-positivo comensal, móvel e multirresistente a antibióticos (FERNANDA SCHWEITZER SOARES 2013).
1.4 Enterococcus gallinarum
Microrganismos do gênero Enterococcus são habitantes comensais da microbiota intestinal humana. São conhecidos por causar endocardites, bacteremia, sepse neonatal e, mais raramente, meningite (Sood et al. 2008).
A importância dos Enterococcus como patógenos aumentou com o surgimento de altos índices de resistência à vários antimicrobianos (Marothi et al. 2005), incluindo a Vancomicina (Arias & Murray 2008). Devido à sua ação contra Staphylococcus resistentes à Meticilina e outros microrganismos Gram-positivos, a Vancomicina foi amplamente utilizada na terapia e na profilaxia contra infecções por microrganismos multiresistentes, por mais de 30 anos, sem que fosse observado o aparecimento de resistência acentuada (Ingerman & Santoro 1989; Wood et al. 1996).
Porém, em 1988 surgiram os primeiros relatos de Enterococcus resistentes à Vancomicina (VRE – Vancomycin Resistant Enterococcus). Utley et al foram os primeiros a relatar o aparecimento de E. faecalis e E.
faecium resistentes à Vancomicina na Inglaterra (Uttley et al. 1988),
enquanto nos EUA era feito o relato do primeiro caso de bacteremia por
Enterococcus resistente à Vancomicina. Andrew H. Kaplan et al isolaram
bactérias do sangue de um paciente em hemodiálise no North Carolina
Memorial Hospital, EUA. O paciente estava recebendo Vancomicina
como tratamento profilático, e as bactérias isoladas foram identificadas como Enterococcus gallinarum (Kaplan et al. 1988).
Infecções por Enterococcus tem se tornado mais importantes com o aumento da ocorrência de resistência à vários antimicrobianos como a Ampicilina, aminoglicosídeos e a Vancomicina (Marothi et al. 2005). Os Enterococcus que colonizam o trato intestinal de pacientes hospitalizados são a principal fonte de infecção, e a emergência de VRE tem alarmado a comunidade médica global de doenças infecciosas devido às poucas opções de tratamentos restantes (Arias & Murray 2008; Boost et al. 2004).
Pelo menos 12 espécies de Enterococcus podem causar infecções em humanos. As espécies clinicamente mais importantes são
Enterococcus faecalis, responsável por 80% a 90% dos casos de infecção
por Enterococcus, seguido da Enterococcus faecium, que, por sua vez, é encontrado em 10% a 15% dos casos. As outras espécies de Enterococcus são encontradas menos frequentemente e são responsáveis por cerca de 5% dos isolados clínicos (Sood et al. 2008). Dentre essas espécies de
casseliflavus e Enterococcus gallinarum. A proporção de Enterococcus
móveis encontrada na clínica é pequena, cerca de 2%. A identificação dessas espécies de Enterococcus móveis é importante devido à sua resistência intrínseca à Vancomicina. O tratamento inadequado nesses casos, com o uso inapropriado da Vancomicina, pode contribuir para a morbidade e mortalidade dos pacientes (Sood et al. 2008; Latika Shah, Summaiya Mulla, Kinjal G Patel 2012).
Existem, atualmente, seis grupos de genes, reconhecidos em
Enterococcus, que estão relacionados à resistência à Vancomicina, são
eles: vanA, vanB, vanC, vanD, vanE e vanG (Arthur & Courvalin 1993; Fines et al. 1999; Perichon et al. 1997; McKessar et al. 2000). A Vancomicina pertence à uma classe de antimicrobianos chamada de glicopeptídeos. A sua ação se dá através da interação com os precursores do peptidoglicano. Essa interação inibe as reações de transglicosilação e transpeptidação, que são reações importantes para a síntese da parede celular bacteriana (Arthur & Courvalin 1993). A formação da parede celular bacteriana depende da formação do precursor pentapeptídico do peptidoglicano. Em cepas que não apresentam resistência à Vancomicina, o dipeptídeo D-Alanil-D-Alanina se liga a um tripeptídeo para a formação do precursor pentapeptídico. Os antibióticos da classe dos glicopeptídeos tem como alvo de ação a porção C-terminal do precursor do peptidoglicano D-Alanil-D-Alanina, prejudicando assim a síntese da parede bacteriana (Ambúr et al. 2002).
O gene vanC confere resistência intrínseca à baixas concentrações de Vancomicina e é característico de Enterococcus
casseliflavus e Enterococcus gallinarum. As enzimas VanC1, VanC2 e
VanC3, específicas dessas espécies, estão envolvidas na síntese do penta-peptídeo da parede celular, e são responsáveis por uma modificação D-Alanil-D-Serina, na porção terminal, que diminui a afinidade pela Vancomicina. A variação na resistência à Vancomicina, observada em
Enterococcus que possuem o gene vanC, pode ser devida às quantidades
variáveis de D-Ala-D-Ala em relação a D-Ala-D-Ser. Uma quantidade maior do peptídeo não modificado, D-Ala-D-Ala, gera uma menor resistência, enquanto que uma quantidade maior do peptídeo modificado, D-Ala-D-Ser leva a um índice mais alto de resistência à Vancomicina (Murray et al. 1997; Wood & Murray 2000).
Os microrganismos da espécie Enterococcus gallinarum são habitantes comensais da microbiota humana. São classificados como patobiontes, ou seja, microrganismos simbióticos com potencial patogênico sob certas condições, que geralmente envolvem alterações ambientais ou genéticas (Round & Mazmanian 2009). Os
microrganismos classificados como patobiontes, que incluem o gênero
Enterococcus, estão relacionados à condições inflamatórias crônicas. Isso
os difere dos microrganismos oportunistas os quais geralmente estão associados à quadros de infecção aguda e são tipicamente adquiridos do ambiente ou outras partes do corpo. Além disso, os patobiontes se diferenciam também dos patógenos tradicionais, pois os mesmos são inofensivos ao hospedeiro saudável, enquanto que os patógenos tradicionais podem causar doenças mesmo nos hospedeiros saudáveis (Chow et al. 2011).
1.5 Recombinação Homóloga
Além de amplamente utilizada para o reparo de rompimentos na dupla fita de DNA, que podem ser prejudiciais para a célula, a recombinação homóloga também é importante para a variabilidade genética e adaptações, necessárias à sobrevivência da célula (Alberts et al. 2002).
O rompimento da dupla fita de DNA é um forte indutor de recombinação homóloga (Sung & Klein 2006). O modelo de reparo do rompimento da dupla fita de DNA através do mecanismo de recombinação homóloga pode ocorrer por diversas vias distintas. Esse modelo foi desenvolvido a partir de estudos de transformação de plasmídeos em leveduras. Os estudos envolviam a transformação de um plasmídeo linear contendo sequências de DNA cromossômico da levedura e o monitoramento da sua integração em sequências homólogas do DNA cromossomal da levedura (Orr-Weaver et al. 1981; Szostak et al. 1983).
No processo de recombinação homóloga a troca genética ocorre entre um par de sequências idênticas de DNA. O mecanismo de recombinação gênica garante que, somente se houver uma extensa região apresentando similaridade na sequência de nucleotídeos (homologia) é que ocorrerá a reação de recombinação (Alberts et al. 2002). Essa propriedade permite que certas manipulações genéticas sejam possíveis. Em vista disso, o presente estudo visa à inserção de um gene repórter, fusionado a uma região promotora de transcrição gênica de Enterococcus
gallinarum, no DNA cromossomal através do mecanismo de
recombinação homóloga. O gene repórter mais amplamente utilizado e conhecido é o gene da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) (Phillips 2001).
1.6 Proteína EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)
A proteína GFP (Green Fluorescent Protein) foi descoberta em 1962 por Shimomura et al. que extraíram, purificaram e descreveram propriedades de uma proteína bioluminescente isolada de Aequora
victoria, uma espécie de água-viva (SHIMOMURA et al. 1962). Essa
proteína, quando excitada no devido comprimento de onda, emite sua luminescência. Isso ocorre pela transferência de prótons dos cromóforos presentes na proteína (Tsien 1998). Na proteína GFP encontrada na natureza há a coexistência de cromóforos neutros e cromóforos aniônicos, o que confere a essa proteína dois picos de excitação e de emissão (Tsien 1998).
A proteína EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) faz parte de uma classe de GFPs que possuem o ânion fenolato no cromóforo. Essa classe de GFPs combina alto brilho com excitação e emissão simples. A ionização do grupamento fenol do cromóforo é causada por uma mutação nos aminoácidos da proteína. A mutação mais comum nessa classe de GFPs é a substituição da Serina da posição 65 por uma Treonina (S65T) (Tsien 1998). A proteína EGFP utilizada nesse estudo, amplificada a partir do plasmídeo pEGFP-N3 (Addgene®), possui uma dupla substituição de aminoácidos. A Fenilalanina da posição 64 é substituída por uma Leucina (Phe-64-Leu) e a Serina da posição 65 por uma Treonina (Ser-65-Thr). Essas substituições fazem com que a emissão de fluorescência pela EGFP, seja de 20 a 35 vezes mais intensa do que as emissões das GFPs sem substituição (Cormack et al. 1996).
1.7 Justificativa
Estudos anteriores realizados em nosso laboratório mostraram que, em animais com pancreatite aguda por obstrução do ducto biliopancreático e tratados com Meropenem (100 mg/Kg, 12/12 h durante 3 dias), o microrganismo patobionte Enterococcus gallinarum foi capaz de translocar do intestino e atingir a circulação sanguínea diminuindo a sobrevida desses animais. Porém, não se sabe ainda qual a rota de translocação desses microrganismos até a corrente sanguínea. Uma das hipóteses é que a translocação ocorra através da parede intestinal diretamente, ou ainda, através do ducto biliopancreático obstruído. Uma alternativa para testarmos essas hipóteses é a criação de uma linhagem recombinante de Enterococcus gallinarum que expresse a proteína GFP (Green Fluorescent Protein) tornando possível a visualização direta dessas bactérias nos tecidos. Um dos métodos para construção dessa
ferramenta é a inserção do gene recombinante desejado, o egfp nesse caso, e sua recombinação no genoma bacteriano através de recombinação homóloga.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Local de desenvolvimento do estudo
O trabalho foi realizado na Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), no laboratório de Imunobiologia (LIDI) do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia e Departamento de Farmacologia do Centro de Ciências Biológicas-CCB. 2.2 Enterococcus gallinarum
As cepas de Enterococcus gallinarum utilizadas nesse estudo foram isoladas do sangue de animais submetidos ao protocolo de indução de pancreatite aguda e que receberam o pré-tratamento com Meropenem. A identificação dessas bactérias foi realizada, previamente, através dos testes de coloração de Gram, prova da catalase, crescimento em ágar sangue, crescimento em caldo NaCl 6,5%, crescimento em ágar bile esculina, prova da optoquina, e finalmente a identificação da espécie bacterina foi feita através do cartão de identificação Vitek® 2 da bioMérieux.
Depois de identificadas, as amostras de bactéria foram aliquotadas e congeladas em meio de cultura BHI adicionado de glicerol para uso posterior.
A cepa de Enterococcus gallinarum isolada de humanos foi cedida pelo Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário Polydoro Ernani de São Thiago – UFSC.
2.3 Extração plasmidial de Enterococcus gallinarum
Foi plaqueado, em meio Mueller Hinton, 10 μL de uma suspensão da bactéria. A placa foi levada à estufa de incubação, por um período de 18 a 24 horas a temperatura de 37°C.
Após o período de incubação foi pinçada uma colônia e inoculada no meio líquido de crescimento BHI (Brain Heart Infusion
Broth). O inóculo foi incubado em estufa de crescimento overnight a
37°C, após esse período procedeu-se a extração plasmidial utilizando o
kit Pure Yield Plasmid Miniprep System, Promega®.
Em uma micro centrífuga foram centrifugados, a 12.100 x g, 4,5 mL do meio de cultura contendo as bactérias crescidas overnight. O sobrenadante foi descartado e o pellet de bactérias foi ressuspendido em 500 μL de água ultra pura. Foram adicionados 100 μL do Tampão de Lise
Celular e 100 μL de uma solução de 10 mg/mL de Lisozima. A homogeneização foi feita por inversão do tubo, cerca de 6 vezes, ou até misturar completamente o conteúdo.
Com o auxílio de um cronômetro foram marcados 2 minutos. Ao final do tempo marcado foram adicionados 350 μL da Solução de Neutralização, que deve ser mantida sob refrigeração (4 – 8°C) até o momento do uso. A homogeneização foi feita por inversão do tubo, pois o uso do vortex pode causar a fragmentação do material genético. Houve a formação de um precipitado amarelo, indicando que a reação de lise das células foi neutralizada.
Após a neutralização o tubo foi centrifugado durante 3 minutos a 12.100 x g. O sobrenadante foi transferido para uma coluna de membrana de sílica (PureYield™ Plasmid Miniprep System, Promega®) e o pellet, composto principalmente por restos celulares, foi descartado.
A coluna de sílica foi colocada na micro centrífuga e o sobrenadante foi passado pela coluna durante uma centrifugação de 15 segundos a 12.100 x g. Em seguida a coluna recebeu o Tampão de Lavagem e nova centrifugação de 15 segundos a 12.100 x g. Por fim, foram adicionados 30 μL de água ultra pura à coluna, para a eluição da amostra. Um tubo para coletar a amostra eluída foi acoplado à coluna e sucedeu-se uma última centrifugação de 30 segundos a 12.100 x g.
A amostra foi eluída da coluna e coletada no tubo coletor. O DNA da amostra foi quantificado em nanodrop através da leitura da absorbância em comprimento de onda de 230 nm.
2.4 Digestão do plasmídeo com enzima de restrição NruI
A digestão do plasmídeo foi feita com a enzima de restrição de corte duplo, a NruI. Para a reação foram misturados 5 μL do plasmídeo, 0,5 μL da enzima de restrição NruI (equivalente a 5 Unidades de enzima), 2 μL do NEBuffer 3.1 10x e 12 μL de água ultra pura. A mistura permaneceu durante 1 hora sob a temperatura de 37°C para a digestão. Após esse período o produto da digestão foi aplicado em um gel de agarose 0,8% (p/v) e submetido à corrida eletroforética sob tensão de 100 volts durante 50 minutos. Finalizada a corrida o gel foi corado, durante 20 minutos, em solução de brometo de etídio e visualizado em transluminador.
2.5 Crescimento de Enterococcus gallinarum em ágar LB (Lysogeny Broth) com e sem adição de sacarose
Em placas de Petri cobertas com ágar LB sem adição de sacarose e ágar LB adicionado de sacarose na concentração de 3,0 g/mL, foram inoculados 10 μL de Enterococcus gallinarum. As placas foram levadas à estufa de incubação onde permaneceram por um período de 18 horas e 36 horas a 37°C.
2.6 Oligonucleotídeos (Primers)
Os oligonucleotídeos utilizados foram desenhados utilizando como molde a sequência de DNA disponível da cepa de Enterococcus
gallinarum FDAARGOS_163, esta é a única cepa de Enterococcus gallianrum com o genoma completo sequenciado e anotado nos bancos
de dados até o momento. As regiões para amplificação foram escolhidas baseadas na conservação dessas regiões. Após a realização de um BLAST contra o gênero Enterococcus spp. foi observado alto grau de identidade entre a cepa de Enterococcus gallinarum FDAARGOS_163 e a cepa de
Enterecoccus casseliflavus EC20. Assumiu-se então que havendo alto
grau de identidade entre espécies diferentes há também homologia entre cepas diferentes, porém pertencentes a mesma espécie.
As regiões escolhidas para a amplificação foram: 1) a região promotora do operon codificante das subunidades β e β’ da RNA polimerase DNA-dependente de Enterococcus gallinarum
FDAARGOS_163; os oligonucleotídeos desenhados para essa região foram o Ega-P-βeta 1 (F) e o Ega-P-βeta 2 (R) (Tabela 1); 2) a região
upstream (a montante) da subunidade 2A de um putativo transportador de
sacarose de um sistema PTS codificado pelo gene AL523_16890 de
Enterococcus gallinarum FDAARGOS_163; os oligonucleotídeos
desenhados para essa região foram o Ega 1 Novo (F) e o Ega 2 (R) (Tabela 1); 3) e a região downstream (a jusante) da subunidade 2A deste transportador; os oligonucleotídeos desenhados para essa região foram o Ega 3 (F) e o Ega 4 (R) (Tabela 1). Todos os oligonucleotídeos citados acima foram adquiridos da ThermoFisher Scientific®. A região do gene VanC1 foi usada como controle positivo das reações, os oligonucleotídeos usados para amplificação dessa região foram o VanC1rt_F e o VanC1rt_R (Tabela 1) (Mazaheri Nezhad Fard et al. 2014). Foram desenhados oligonucleotídeos para a sequência da proteína EGFP do plasmídeo comercial pEGFP-N3 (Addgene®), EGFP 1 (F) e EGFP 2 (R) (Tabela 1).
Tabela 1: Sequências dos oligonucleotídeos utilizados.
Oligonucleotídeo Sequência (5’ – 3’) Sítios de restrição Ega-P-βeta 1 (F) GTT GCT TCA GAC AAA ATA
CCG C
Ega-P-βeta 2 (R) CCC TTG CTC ACC ATG CTC TTC ACC TCT TCA TAA AG
Overlay EGFP
Ega 1 (F) AAC TGC AGC TAT ATC AGT
GAA GAA AAG CGC Pst I
Ega 2 (R) TTC TAG AGT GGA ACC GGT
TCT ACA TTT G Xba I
Ega 3 (F) TTT TCT CGA GCA ATA AAT
AAT CCC TTG CTG TTC Xho I
Ega 4 (R) TTT TTG AAT TCC GTA GGA
TTG CTG TAT TCA GG EcoR I
EGFP 1 (F) ATG GTG AGC AAG GGC GAG
G
Overlay Ega-P-βeta
2
EGFP 2 (R) TAT GAT CTA GAG TCG CGG
CC Xba I
VanC1rt_F GGT ATC AAG GAA ACC TC
VanC1rt_R CTT CCG CCA TCA TAG CT
2.7 PCR de colônia
Foram plaqueados, em meio Mueller Hinton, 10 μL de uma suspensão contendo a bactéria. As placas foram levadas à estufa de incubação, por um período de 18 a 24 horas sob temperatura de 37°C.
Após o período de incubação foi pinçada uma colônia, ressuspendida em 50 μL de tampão Tris-HCl EDTA (TE) e submetida à uma temperatura de 95°C, onde permaneceram durante 5 minutos, e foram transferidas imediatamente para o gelo.
Essa suspensão foi usada como molde para as reações de PCR de colônia. 2.8 Gel de Agarose
Os géis de agarose foram feitos misturando-se 1% de agarose (g) a um volume (mL) de tampão Tris/Borato/EDTA (TBE) 1x. A mistura foi
aquecida em micro-ondas, para solubilização total da agarose em TBE, e colocada no molde do gel. A polimerização da solução e formação do gel ocorreu dentro de aproximadamente 15 minutos.
2.9 Eletroforese
Para visualização das bandas, os produtos das PCRs foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1% (p/v). No primeiro poço foi aplicado 5 μL do padrão de peso molecular (2kb – 100bp) e nos poços subsequentes foram aplicados 10 μL das amostras. As amostras no gel correram durante 40 minutos sob uma tensão de 90 volts.
Finalizado o tempo de corrida na cuba de eletroforese o gel foi submerso durante 20 a 30 minutos em solução de Brometo de Etídio, um agente intercalante de DNA visível quando exposto à luz ultravioleta. Em seguida o gel foi colocado em transluminador para visualização das bandas.
2.10 Amplificação do gene vanC1 por PCR de colônia
Para a amplificação do gene vanC1 por PCR foram misturados, em um tubo de 0,2 mL, 17,5 μL de água ultra pura, 5 μL do GoTaq®
Reaction Buffer 5x, 0,75 μL da mistura de nucleotídeos (dNTPs) a 10 mM
cada, 0,5 μL da suspensão molde, 0,5 μL do oligonucleotídeo VanC1rt_F a 10 mM, 0,5 μL do oligonucleotídeo VanC1rt_R a 10 mM e, por fim, 0,25 μL (1,25 u) da enzima GoTaq® DNA Polimerase.
A reação foi realizada em termociclador da marca Applied
Biosystems® da Life Technologies. Após a etapa inicial de desnaturação
da dupla fita de DNA, que consiste em 1 ciclo de 5 minutos a 94°C, a amplificação foi feita em 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 47°C por 30 segundos e extensão a 72°C com tempo de 1 minuto por cada 1000 pares de bases amplificados. Na etapa final os produtos da reação foram mantidos a 72°C durante 7 minutos para a extensão final. Finalizada as etapas da reação o produto foi mantido a 15°C até a sua retirada do equipamento. O produto da reação é um fragmento de 822 pares de bases, que corresponde ao gene de resistência à Vancomicina, vanC1.
2.11 Construção de linhagem repórter de Enterococcus gallinarum 2.11.1 Reação de amplificação por PCR com GoTaq® DNA polimerase
Para as amplificações das regiões desejadas, por PCR, foram misturados em um tubo de 0,2 mL, 17,5 μL de água ultra pura, 5,0 μL do
GoTaq® Reaction Buffer 5x, 0,75 μL da mistura de nucleotídeos (dNTPs)
a 10 mM cada, 0,5 μL do molde para reação de amplificação (suspensão da colônia), 0,5 μL do oligonucleotídeo Forward a 10 mM, 0,5 μL do oligonucleotídeo Reverse a 10 mM e, por fim, 0,25 μL (1,25 u) da enzima
GoTaq® DNA Polimerase.
A reação foi realizada em termociclador da marca Applied
Biosystems® da Life Technologies. Após a etapa inicial de desnaturação
da dupla fita de DNA, que consiste em 1 ciclo de 5 minutos a 94°C, a amplificação foi feita em 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 50°C por 30 segundos e extensão a 72°C com tempo de 1 minuto por cada 1000 pares de bases amplificados. Na etapa final os produtos da reação foram mantidos a 72°C durante 7 minutos para a extensão final. Finalizada as etapas da reação o produto foi mantido a 15°C até a sua retirada do equipamento. Uma alíquota dos produtos das reações foram aplicados em gel de agarose 1% e submetidos à eletroforese para a visualização das bandas obtidas.
2.11.2 Reação de amplificação por PCR com Phusion® High-Fidelity DNA polimerase
Para as amplificações das regiões desejadas, por PCR, foram misturados em um tubo de 0,2 mL, 33 μL de água ultra pura, 10 μL do
Phusion® GC Buffer 5x, 1,5 μL da mistura de nucleotídeos (dNTPs) a 10
mM cada, 2 μL do oligonucleotídeo Forward a 10 mM, 2 μL do oligonucleotídeo Reverse, 1 μL do molde para reação de amplificação (suspensão da colônia) e, por fim, 0,5 μL (1 u) da enzima Phusion®
High-Fidelity DNA Polimerase.
A reação foi realizada em termociclador da marca Applied
Biosystems® da Life Technologies. Após a etapa inicial de desnaturação
da dupla fita de DNA, que consiste em 1 ciclo de 5 minutos a 94°C, a amplificação foi feita em 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 50°C por 30 segundos e extensão a 72°C com tempo de 1 minuto por cada 1000 pares de bases amplificados. Na etapa final os produtos da reação foram mantidos a 72°C durante 7 minutos para
a extensão final. Finalizada as etapas da reação o produto foi mantido a 15°C até a sua retirada do equipamento. Uma alíquota dos produtos das reações foram aplicados em gel de agarose 1% e submetidos à eletroforese para a visualização das bandas obtidas.
2.11.3 Amplificação da região promotora do operon codificante das subunidades β e β’ da DNA polimerase DNA-dependente (Promotor-βeta) por PCR de colônia
Para o evento de recombinação homóloga e expressão da proteína EGFP em Enterococcus gallinarum, foram desenhados oligonucleotídeos (Ega-P-βeta 1 e Ega-P-βeta 2) (Tabela1) para amplificação de um fragmento de aproximadamente 1000 pares de bases contendo a região promotora do operon codificante das subunidades β e β’ da RNA polimerase DNA-dependente.
A reação de PCR para a amplificação procedeu como descrito no item 2.11.1 e posteriormente no item 2.11.2.
2.11.4 Amplificação dos fragmentos das regiões flanqueadoras (upstream e downstream) do gene do transportador de sacarose AL523_16890
Para inserir o gene EGFP em Enterococcus gallinarum através de um evento de dupla recombinação homóloga foram desenhados oligonucleotídeos (Ega 1, Ega 2, Ega 3 e Ega 4) (Tabela 1) para amplificação de fragmentos de aproximadamente 1000 pares de bases das regiões flanqueadoras, a montante e a jusante, do gene AL523_16890, responsável pelo transporte da sacarose extracelular para dentro da célula. A reação de PCR para amplificação procedeu como descrito no item 2.11.1.
2.11.5 Amplificação do gene EGFP (Enhanced Green Flurescent Protein) do plasmídeo pEGFP-N3
O gene da proteína EGFP foi amplificado por PCR, a partir do plasmídeo comercial pEGFP N3 (Addgene®). Foram desenhados oligonucleotídeos (EGFP 1 e EGFP 2) (Tabela 1) para a amplificação do fragmento de aproximadamente 743 pares de bases, correspondente ao gene EGFP.
A reação de PCR para amplificação procedeu como descrito nos itens 2.11.1 e 2.11.2.
2.12 Digestão do fragmento de 1000 pares de bases amplificado com Ega-P-βeta 1 e Ega-P-βeta 2
Para a digestão com a enzima de restrição XhoI foram misturados 5 μL do produto da amplificação por PCR dos oligonucleotídeos Ega-P-βeta 1 (F) e Ega-P-Beta 2 ®, 1 μL da enzima de restrição XhoI, 2 μL do NEBuffer 3.1 10x e 12 μL de água ultra pura. A mistura permaneceu durante 1 hora sob a temperatura de 37°C para a digestão. Após esse período o produto da digestão foi aplicado em um gel de agarose 1% (p/v) e submetido à corrida eletroforética sob tensão de 90 volts durante 40 minutos. Finalizada a corrida o gel foi corado, durante 20 minutos, em solução de brometo de etídio e visualizado em transluminador.
2.13 Purificação dos produtos de PCR
A purificação dos produtos das amplificações do P-βeta e do EGFP foram feitas através do kit illustra GFX PCR DNA and Gel Band
Purification da GE Healthcare.
Foram adicionados 500 μL do Capture buffer type 3 ao volume total da reação de PCR, 20 μL. Esse buffer contém um indicador de pH que identifica, através de uma reação colorimétrica, o pH ótimo para a ligação do DNA à membrana de sílica da coluna de separação.
Após a adição do Capture buffer type 3 a amostra foi transferida para uma coluna de membrana de sílica acoplada a um tubo coletor, incubada à temperatura ambiente durante 1 minuto e centrifugada a 12.100 x g durante 45 segundos. O líquido do tubo coletor foi descartado e à coluna de separação foram acrescentados 500 μL do Wash buffer type
1 adicionado de etanol absoluto. Procedeu-se uma centrifugação durante
45 segundos à 12.100 x g.
O tubo coletor foi descartado e a coluna de separação foi acoplada a um tubo de 1,5 mL. Foram adicionados 30 μL do Elution
buffer type 6, que consiste em água estéril livre de nucleases, incubado
durante 2 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação foi feita uma última centrifugação de 75 segundos a 12.100 x g e a amostra eluída foi coletada e armazenada em tubo de 1,5 mL.
2.14 Fusão do P-βeta ao EGFP e amplificação do fragmento P-βeta-EGFP por PCR
Após a purificação dos produtos das amplificações por PCR do P-βeta e do EGFP, procedeu-se a fusão entre os fragmentos purificados seguida da amplificação do produto da ligação, P-βeta-EGFP.
Em um tubo de 0,2 mL foram adicionados 34 μL de água ultra pura, 10 μL do 5x Phusion GC buffer, 1,5 μL da mistura dos nucleotídeos (dNTPs) a 10 mM cada, 1 μL do produto da amplificação purificada do P-βeta, 1 μL do produto da amplificação purificada do EGFP, 1 μL do oligonucleotídeo Ega P-βeta 1 a 10 mM, 1 μL do oligonucleotídeo EGFP 2 a 10 mM e, finalmente, 0,5 μL (1 u) da enzima Phusion® High-Fidelity DNA polimerase.
A reação foi realizada em termociclador da marca Applied
Biosystems® da Life Technologies. Após a etapa inicial de desnaturação
da dupla fita de DNA, que consiste em 1 ciclo de 5 minutos a 94°C, a ligação e amplificação foi feita em 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 50°C por 30 segundos e extensão a 72°C com tempo de 1 minuto por cada 1000 pares de bases amplificados (como o fragmento amplificado foi de 1743 pares de bases o tempo de amplificação foi de 1 minuto e 30 segundos). Na etapa final os produtos da reação foram mantidos a 72°C durante 7 minutos para a extensão final. Finalizada as etapas da reação o produto foi mantido a 15°C até a sua retirada do equipamento. Uma alíquota dos produtos das reações foram aplicados em gel de agarose 1% e submetidos à eletroforese para a visualização das bandas obtidas.
2.15 Purificação da banda P-βeta-EGFP, de 1743 pares de bases, do gel de agarose
A purificação da banda do gel foi feita através do do kit illustra
GFX PCR DNA and Gel Band Purification da GE Healthcare.
Um tubo de 1,5 mL foi pesado e seu peso anotado. Em seguida foi recortada a região do gel de agarose contendo a banda de 1743 pares de bases, correspondente ao P-βeta-EGFP, e colocado dentro do tubo previamente pesado. Foi feita uma nova pesagem para se obter o peso do fragmento do gel que foi recortado. Foram adicionados 500 μL do
Capture buffer type 3 ao tubo contendo o fragmento recortado do gel. Foi
feita uma incubação a 60°C por um período de 15 a 30 minutos, vertendo o tubo a cada 3 minutos, até que o gel fosse completamente dissolvido.
Os passos seguintes da purificação ocorreram conforme descrito no item 2.13.
2.16 Adição de dATP ao P-βeta-EGFP (dATP tailing)
Com objetivo de fazer a inserção do fragmento P-βeta-EGFP no plasmídeo de clonagem pGEM® T-Easy (Promega) foi realizada a ligação do nucleotídeo Adenosina às extremidades do P-βeta-EGFP. Para isso foram misturados 3 μL do P-βeta-EGFP purificado, 1 μL do GoTaq®
buffer, 0,5 μL de dATP a uma concentração de 5 mM, 1 μL (5 u) da
enzima GoTaq® DNA polimerase e 4,5 μL de água ultra pura. Foi feita uma incubação de 30 minutos à 70°C.
2.17 Inserção do P-βeta-EGFP no pGEM® T-Easy
Para a ligação do fragmento P-βeta-EGFP ao plasmídeo de clonagem pGEM® T-Easy (Promega) foram misturados em um tubo 0,5 μL do pGEM® T-Easy, 2 μL do P-βeta-EGFP com dATP, 2 μL do 10x
T4 DNA Ligase buffer, 2 μL da solução de PEG 4000 50%, 1 μL (5 u) da
enzima T4 DNA Ligase e 12,5 μL de água ultra pura. A mistura foi incubada overnight a 4°C.
2.18 Transformação do pGEMP-βeta-EGFP em E. coli DH5α termo-competente
Uma alíquota de E. coli DH5α (Hanahan 1983) foi descongelada em gelo. Em seguida foram adicionados 20 μL (volume total da reação) do pGEMP-βeta-EGFP ao tubo contendo a alíquota da bactéria já descongelada. O conteúdo foi homogeneizado cuidadosamente por inversão do tubo (não foi usada pipeta, pois esse microrganismos competentes são sensíveis) e acomodado no gelo durante 20 minutos. Finalizado o período no gelo o tubo foi submetido ao choque térmico. O tubo foi colocado em bloco térmico, pré-aquecido a 42°C, onde permaneceu por 45 segundos. Imediatamente após foi transferido para o gelo novamente, por mais 2 minutos. Foram adicionados 950 μL de meio líquido de crescimento SOC, que é um meio de crescimento com maior eficiência de transformação de plasmídeos. Posteriormente o tubo foi incubado durante 1 hora e 30 minutos a 37°C sob agitação.
Sobre a superfície de uma placa de Petri contendo ágar LB (Lysogeny Broth) (BERTANI 1951; Bertani 2004) e Ampicilina na concentração de 100μg/mL foram espalhados 100 μL de IPTG (Isopropyl
β-D-1-thiogalactopyranoside) a 100 mM e 50 μL de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) na concentração de 20 mg/mL.
Ao final da incubação o tubo contendo a E. coli DH5α + o pGEMP-βeta-EGFP foi centrifugado durante 10 minutos a 3500 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspendido em 100 μL do próprio meio de crescimento. Esse volume foi plaqueado na placa de Petri contendo o ágar LB, a Ampicilina (100μg/mL) e IPTG/X-Gal, previamente preparada. A placa foi incubada a 37°C por aproximadamente 18 horas em estufa de crescimento. Finalizado o período de incubação foram observadas colônias com coloração branca e colônias com coloração azul, foram selecionadas as colônias brancas.
2.19 Obtenção dos clones de E. coli DH5α positivos para presença do pGEMP-βeta-EGFP
Foram isoladas 8 colônias brancas da placa de ágar LB com Ampicilina (100μg/mL) IPTG/X-Gal e colocadas em tubos de contendo 1,5 mL de meio LB adicionado de Ampicilina (100μg/mL). Os tubos foram incubados a 37°C overnight. Após o período de incubação a confirmação da presença do pGEMP-βeta-EGFP foi realizada por PCR como descrito nos itens 2.7 e 2.11.1. Os primers utilizados foram P-βeta 1 e EGFP 2.
2.20 Extração do plasmídeo pGEMP-βeta-EGFP de E. coli DH5α A extração plasmidial foi realizada utilizando o kit de extração
Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System, Promega®. O
DNA plasmidial foi ressuspendido em água ultra pura e armazenado a -20°C.
2.21 Produção de Enterococcus gallinarum eletrocompetentes Inicialmente foi feito o preparo do meio de cultura M17 (5,0 g/L de Caseína, 5,0 g/L de Peptona de soja, 5,0 g/L de Extrato de carne, 2,5 g/L de Extrato de levedura,0,25 g/L de Sulfato de Magnésio, pH fianl de 6,8 – 7,0). Foi inoculada 1 colônia de Enterococcus gallinarum em 5 mL do meio M17 e incubado overnight a 37°C. Ao final da incubação foi transferido 1 mL da cultura para um novo tubo contendo 50 mL do meio SGM17 (meio M17 suplementado com 0,5 M de Sacarose e 2% de Glicina) fresco e foi realizada uma nova incubação a 37°C durante 18 horas. Em seguida o tubo foi centrifugado a 1000 x g durante 10 min a
4°C. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi lavado, por duas vezes, com tampão de eletroporação (0,5 M de Sacarose e Glicerol 10%) gelado. Após a última lavagem o pellet foi ressuspendido em um volume mínimo do tampão de eletroporação gelado e colocado imediatamente no gelo. A suspensão foi dividida em alíquotas de, aproximadamente, 40 µL e armazenadas a -70°C (Shepard & Gilmore 1995).
2.22 Eletroporação em Enterococcus gallinarum eletrocompetentes Para o processo de eletroporação foi utilizada uma cubeta estéril de 0,1 cm previamente resfriada durante 5 minutos. Foram descongeladas, no gelo, uma alíquota de Enterococcus gallinarum eletrocompetente e uma alíquota do plasmídeo pGEMP-βeta-EGFP.
Em seguida foi adicionado 1 µL do DNA plasmidial às células eletrocompetentes e gentilmente homogeneizados sem o auxílio do vórtex. O volume total da suspensão foi transferido para a cubeta pré resfriada, tomando cuidado para que a suspensão atingisse o fundo do recipiente. Antes de receber o pulso elétrico toda humidade externa à cubeta foi cuidadosamente retirada. O pulso elétrico recebido pela suspensão foi de 12,5 kV/cm.
Imediatamente após o pulso elétrico foi adicionado, à cubeta, 1 mL do meio SGM17MC (meio SGM17 suplementado com 10 mM de cloreto de Magnésio e 10 mM de cloreto de Cálcio) previamente resfriado e o recipiente foi acomodado no gelo durante 5 minutos. Após esse processo as células foram incubadas overnight a 37°C.
Finalizada a incubação as células foram espalhadas em placas de Petri cobertas meio sólido de crescimento SR, composto de Triptona (10,0 g/L), Sacarose (200,0 g/L), Estrato de levedura (5,0 g/L), Glicose (10,0 g/L), Ágar (15,0 g/L), cloreto de Magnésio (2,5 mM), cloreto de Cálcio (2,5 mM) e suplementada com Ampicilina (100μg/mL). As placas foram levadas à estufa, onde permaneceram durante 48 horas a 37°C (Cruz-Rodz & Gilmore 1990; Shepard & Gilmore 1995).
Para controle, o mesmo processo foi efetuado porém sem o pulso elétrico.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 As cepas de Enterococcus gallinarum utilizadas neste estudo não apresentaram o plasmídeo pA6981
O plasmídeo pA6981 foi descrito por Eshaghi, A. et al em uma cepa de Enterococcus gallinarum altamente resistente à Vancomicina. A cepa foi isolada de um paciente de 52 anos de idade, residente em Ottawa, Canadá. Contendo 35.608 pares de bases, o pA6981 é um plasmídeo considerado grande. Esse plasmídeo comporta diferentes genes envolvidos na resistência à Vancomicina, vanZ, vanY, vanX, vanA, vanH, regulados pelo sistema de dois componentes vanS/vanR. Esse conjunto de genes confere à essa cepa de Enterococcus gallinarum alta resistência à Vancomicina. Além disso, o plasmídeo pA6981 possui um sistema toxina-antitoxina que promove sua estabilidade no genoma sem a necessidade de pressão seletiva externa (Eshaghi et al. 2015).
Baseados nesse dado, foi testada a hipótese de que a cepa com a qual trabalhamos também possui o plasmídeo pA6981. As cepas utilizadas neste estudo apresentam resistência intermediária à Vancomicina, logo a probabilidade de haver um plasmídeo semelhante ao encontrado na cepa A6981 é muito baixa. Entretanto foi avaliada a possibilidade de haver um plasmídeo semelhante ao pA6981 nas cepas utilizadas neste trabalho.
Após o crescimento das bactérias em meio de cultura líquido, procedeu-se à extração do plasmídeo através do kit de extração plasmidial
PureYield™ Plasmid Miniprep System, Promega®.
O plasmídeo pA6981 possui dois sítios de restrição NruI que dividem o plasmídeo em duas bandas, uma de 16.194 pares de bases e uma outra de 19.414 pares de bases. Como esperávamos encontrar um plasmídeo semelhante ao já descrito pA6981, em tamanho, presença de sítios de restrição, sistema toxina-antitoxina e regiões promotoras, foi realizada, após a extração plasmidial, uma digestão com a enzima de restrição NruI. O objetivo da digestão com essa enzima foi dividir o plasmídeo em dois fragmentos menores, lineares e com tamanhos conhecidos afim de facilitar a eletroforese. As amostras, digerida e não digerida, foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8%, que permite melhor resolução de bandas com tamanhos grandes.
Nos resultados observados (Figura 1), após a eletroforese e coloração do gel, não foram visualizadas as bandas esperadas, nem nas amostras do plasmídeo digerido e nem nas amostras que não passaram pela digestão. Esse resultado sugere que a cepas de Enterococcus
gallinarum utilizadas neste estudo não possuem plasmídeo semelhante ao
pA6981 descrito por Eshaghi, A. et al.
Gel de agarose 0,8% após eletroforese (40 minutos, 90 volts) com a amostra da extração plasmidial através do kit Pure Yield Plasmid Miniprep System,
Promega®. Uma alíquota da amostra foi submetida à digestão com a enzima de restrição NruI. 1 – Ultra High Molecular Wheight (UHMW); 2 – Amostra digerida com NruI; 3 – Amostra não digerida.
3.2 Amplificação do gene vanC1
O gene vanC é um dos genes responsáveis por conferir resistência à Vancomicina em Enterococcus spp. Esse gene confere resistência baixa a intermediária a esse antibiótico. O fenótipo de baixa resistência à Vancomicina foi descrito em Enterococcus casseliflavus e
Enterococcus gallinarum e é intrínseco dessas espécies (Latika Shah,
Summaiya Mulla, Kinjal G Patel 2012; Sood et al. 2008; Wood & Murray 2000).
A amplificação de gene vanC1 foi usado como controle positivo das reações de PCR, uma vez que é característico de Enterococcus
gallinarum.
Após a eletroforese dos produtos da reação de amplificação através de PCR foi possível observar, no gel de agarose 1%, bandas de aproximadamente 800 pares de bases, com e sem adição de DMSO 5%. Figura 1: Extração e digestão plasmidial.
O Dimetil sulfóxido - (CH3)2SO (DMSO) é um composto organosufurado usado nas reações de amplificação por PCR. Além de diminuir a formação de estruturas secundárias no DNA molde e nos oligonucleotídeos, ele se liga a resíduos de Citosina e muda a sua conformação, facilitando a desnaturação da dupla fita de DNA e o anelamento dos oligonucleotídeos. Na reação de amplificação do gene vanC1 não foi observada diferença entre a reação suplementada com DMSO (Figura 2 box vermelho) e a reação sem a adição de DMSO (Figura 2 box azul). Os oligonucleotídeos utilizados para amplificação, VanC1rt_F e VanC1rt_R, amplificam uma região de 822 pares de bases do gene vanC1. As bandas observadas no gel correspondem ao tamanho esperado para a região do gene vanC1 e corroboram a resistência a baixas concentrações de Vancomicina observadas nas cepas de Enterococcus gallinarum.
Figura 2: Amplificação do gene vanC1.
Gel de Agarose 1% após eletroforese dos produtos da amplificação do gene vanC1 de Enterococcus gallinarum por PCR. 1 – PCR de colônia de E. gallinarum (Ega) com os primers VanC1rt_F e VanC1rt_R (azul). 2 – PCR de colônia de E. gallinarum (Ega) com os primers VanC1rt_F e VanC1rt_R (vermelho 1) e adição de DMSO 5% (vermelho 2). MW: Molecular Weighth (2000 – 100 pares de bases).
3.3 Amplificação da região promotora P-βeta de Enterococcus gallinarum (Ega P-βeta)
Para que ocorra a transcrição de um gene é necessário que a enzima polimerase se ligue ao DNA em uma região próxima ao gene. A região do DNA que inicia a transcrição de um gene específico é chamada de região promotora. Os promotores contem sequências específicas de nucleotídeos que garantem um local de ligação para a enzima polimerase. As regiões promotoras se encontram upstream ao início de transcrição do gene, podem ter de 100 a 1000 pares de bases e se localizam próximas ao sítio inicial de transcrição do gene (Sharan et al. 2007). Ao observarmos, através do BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool), a sequência de nucleotídeos da região promotora do operon codificante para as subunidades β e β’ da RNA polimerase (P-βeta), notamos um alto grau de conservação desta região entre os genomas das espécies Enterococcus
gallinarum e Enterococcus casseliflavus. Por definição, operon é uma
unidade funcional do DNA genômico contendo um grupo de genes sob o controle de um único promotor (Sadava et al. 2009). O operon codificante das subunidades β e β’ da RNA polimerase (P-βeta) é de expressão constitutiva durante a vida do microrganismo. A sua expressão máxima se encontra na fase exponencial de crescimento, onde a taxa de replicação e transcrição gênica são altas. Em diversos organismos essa região configura-se como um excelente gene de referência em estudos de expressão relativa (Tasara & Stephan 2007; Savard & Roy 2009; Pratt et al. 2010). A partir dessa observação assumimos que, devido ao alto grau de conservação encontrado nas duas espécies diferentes de Enterococcus, o promotor P-βeta poderia ser uma região conservada também entre diferentes cepas da mesma espécie, nesse caso a Enterococcus
gallinarum.
Figura 3: Representação da região promotora P-βeta.
Esquema representativo do operon codificante das subunidades β-β’ da RNA polimerase DNA-dep e dos respectivos sítios de anelamento dos oligonucleotídeos.
Além da estratégia envolvendo a amplificação do promotor P-βeta, a segunda estratégia pensada envolve a amplificação das regiões flanqueadoras do gene do transportador de sacarose. Esse gene tem a função de codificar a proteína responsável por transportar a sacarose extracelular para dentro da célula bacteriana. O gene do transportador de sacarose (AL523_16890) possui um sistema de regulação que é um repressor do tipo LacI dependente de sacarose. Ou seja, a expressão do transportador de sacarose depende da presença de sacarose no meio como única fonte de carbono disponível.
Figura 4: Representação do gene AL523_16890
Esquema representativo do gene do transportador de sacarose (AL523_16890) com as regiões flanqueadoras (Repressor LacI-type Sac-dep e Sacarose 6-fosfato hidrolase) e os respectivos sítios de anelamento dos oligonucleotídeos.
Como demonstrado na Figura 5, a sacarose é importante para o crescimento da Enterococcus gallinarum. A presença da sacarose como única fonte de carbono favorece o crescimento dessa bactéria quando comparado ao crescimento no meio não suplementado com esse dissacarídeo. O transporte de sacarose é uma característica que pode não afetar significativamente a virulência desse microrganismo, pois em modelos murinos in vivo, a sacarose será quebrada em glicose, logo não será a única fonte de carbono disponível no meio. O mesmo se aplica aos humanos, onde a presença de sacarose no intestino, proveniente da alimentação, poderia favorecer o crescimento de microrganismos que possuem esse sistema de transporte da sacarose apenas em situações de competição e escassez de glicose por exemplo. Portanto a diferença de crescimento observada é, para nós, apenas um meio de selecionarmos as colônias que sofrerem a substituição do gene AL523_16890 devido aos eventos da dupla recombinação (discutido adiante).
Crescimento de Enterococcus gallinarum em placas de ágar LB (esquerda) e LB suplementada com 3 mg/L de sacarose (direita) após 36 horas de incubação a 37°C.
Após analisarmos cuidadosamente o genoma anotado da cepa FDAARGOS_163 de Enterococcus gallinarum, optamos pela estratégia de substituir o gene do transportador de sacarose, o AL523_16890, pelo gene repórter P-βeta-EGFP (descrito adiante), através de um evento de dupla recombinação homóloga. Para isso foram desenhados oligonucleotídeos a fim de amplificar as regiões flanqueadoras (1000 pares de bases upstream e 1000 pares de bases downstream) do gene do transportador de sacarose.
A estratégia consiste em ligar os fragmentos flanqueadores amplificados do gene do transportador de sacarose intercalados pelo fragmento EGFP, de forma a obtermos o gene repórter P-βeta-EGFP flanqueado pelas regiões upstream e downstream do gene do transportador de sacarose. Em seguida fazer a inserção do novo fragmento no plasmídeo pMR20 e introduzir a construção pMR20ΔsacT::P-Beta-EGFP em E. gallinarum. Uma vez dentro da bactéria a integração da construção ao genoma se dá através do evento de dupla recombinação homóloga.
O evento de dupla recombinação homóloga ocorre em duas etapas. Na primeira etapa o fragmento com o gene repórter é integrado ao genoma através de um primeiro evento de recombinação homóloga. As colônias que sofreram a primeira recombinação são então selecionadas através da resistência à Tetraciclina conferida pelo plasmídeo. O segundo evento de recombinação homóloga ocorre na etapa seguinte, onde o gene Figura 5: Crescimento em ágar LB na presença ou ausência de sacarose.
