UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
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ENANG
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IVANELLOF
ORMAÇÃO DE CONTAMINANTES(
ÉSTERES DEMCPD
E GLICIDOL)
E ALTERAÇÕES FÍSICO-
QUÍMICAS DURANTE A DESODORIZAÇÃO DO ÓLEO DEPALMA
FORMATION OF CONTAMINANTS (MCPD AND GLYCIDYL ESTERS) AND PHYSICOCHEMICAL CHANGES DURING THE DEODORIZATION OF PALM
OIL
Campinas 2019
F
ORMAÇÃO DE CONTAMINANTES(
ÉSTERES DEMCPD
E GLICIDOL)
E ALTERAÇÕES FÍSICO-
QUÍMICAS DURANTE A DESODORIZAÇÃO DO ÓLEO DEPALMA
FORMATION OF CONTAMINANTS (MCPD AND GLYCIDYL ESTERS) AND PHYSICOCHEMICAL CHANGES DURING THE DEODORIZATION OF PALM
OIL
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciência de Alimentos.
Dissertation presented to the Faculty of Food Engineering of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Food Science.
Supervisora/Orientadora: Adriana Pavesi Arisseto Bragotto
Este trabalho corresponde à versão final da dissertação defendida pelo aluno Renan Gusmão Tivanello e orientada pela Dra. Adriana Pavesi Arisseto Bragotto.
Campinas 2019
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Tivanello, Renan Gusmão,
T543f TivFormação de contaminantes (ésteres de MCPD e glicidol) e alterações físico-químicas durante a desodorização do óleo de palma / Renan Gusmão
Tivanello. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
TivOrientador: Adriana Pavesi Arisseto Bragotto.
TivDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Tiv1. 3-MCPD. 2. Óleo de palma. 3. Contaminantes. I. Arisseto, Adriana Pavesi. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Formation of contaminants (MCPD and glycidyl esters) and physicochemical changes during the deodorization of palm oil
Palavras-chave em inglês: 3-MCPD
Palm oil Contaminants
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Mestre em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Adriana Pavesi Arisseto Bragotto [Orientador] Ana Paula Badan Ribeiro
Stanislau Bogusz Junior Data de defesa: 08-08-2019
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-3222-8950 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/1885836218957177
Presidente da Banca Examinadora:
Profa. Dra. Adriana Pavesi Arisseto Bragotto
Faculdade de Engenharia de Alimentos
Universidade Estadual de Campinas
Comissão Examinadora:
Profa. Dra. Ana Paula Badan Ribeiro
Faculdade de Engenharia de Alimentos
Universidade Estadual de Campinas
Prof. Dr. Stanislau Bogusz Junior
Departamento de Química e Física Molecular
Universidade de São Paulo
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros
encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na
Secretaria do Programa da Unidade.
Gostaria, primeiramente, de agradecer minha família e a Tete, em especial meus pais, por todo o apoio e incentivo neste período. Além disso, meu irmão Allan não apenas pelo incentivo, mas também por ser uma inspiração para mim.
Aos amigos que sempre estiveram do meu lado, em especial a Neuza e aos amigos que fiz neste período, ao pessoal da república Mendeleev, Bonde dos tey tey pelos momentos de alegria e compreensão. Agradecer também ao pessoal do Laboratório de Análise de Alimentos I, incluindo a professora Dra. Helena por sempre me receber muito bem em sua casa.
Ao ITAL e seus colaboradores, em especial o Dr. Eduardo e a Dra. Roseli, por me auxiliar no desenvolvimento dos experimentos e pelo ensinamento passado neste processo.
Aos professores com quem tive o prazer de aprender muito, em especial minha orientadora, professora Dra. Adriana Pavesi, por ser uma inspiração para mim como profissional, pela sua paciência e orientação.
Às agências de fomento Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelos recursos oferecidos neste período, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa (Processo 168441/2017-9) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro dado ao projeto (Processo 2016/23958-3).
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
A formação de compostos tóxicos em alimentos durante o processamento é um tópico bastante estudado. Entre esses contaminantes, destacam-se os monoclopropanóis (MCPD), que incluem os ésteres de 3-MCPD (3-MCPDE) e de 2-MCPD (2-MCPDE), e os ésteres de glicidol (GE). Produzidos pelo tratamento térmico, estes compostos podem ser amplamente encontrados em óleos vegetais refinados, especialmente no óleo de palma. O refino destes óleos, particularmente a etapa de desodorização, utiliza temperaturas superiores a 200 °C, suficientes para desencadear as reações que resultam na formação destas substâncias e que têm como precursores componentes naturalmente presentes na matéria-prima. Quando ingeridos, estes ésteres podem ser hidrolisados no trato gastrointestinal, liberando suas formas livres e colocando em risco a saúde dos consumidores, uma vez que o 3-MCPD pode afetar a atividade renal e o glicidol possui caráter genotóxico e carcinogênico. A
International Agency for Research on Cancer (IARC) classifica o 3-MCPD e o
glicidol nos grupos 2B (possível carcinógeno humano) e 2A (provável carcinógeno humano), respectivamente. Ainda que haja alguns estudos sobre a formação destes contaminantes em óleos vegetais, não há uma confirmação da rota majoritária e nem de quais os precursores exatos estão envolvidos nestes mecanismos. Buscando gerar dados para um melhor entendimento da formação destes ésteres, o presente estudo avaliou o perfil de formação do 3-MCPDE, 2-MCDPE e GE durante a desodorização do óleo de palma em quatro temperaturas (210, 230, 250 e 270 °C) durante quatro tempos (30, 60, 90 e 120 minutos). Além disso, as alterações físico-químicas quanto à % ácidos graxos livres (AGL), composição de acilgliceróis e a cor (R: vermelho; Y: amarelo) também foram analisadas e correlacionadas com a formação dos compostos. As análises propostas seguiram os métodos oficiais da American Oil Chemists’
Society (AOCS). Para o 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE foram obtidos valores que
variam de 1,91 a 2,70 mg/kg, 0,68 a 1,44 mg/kg e de 0,12 a 8,51 mg/kg, respectivamente. Em geral, as concentrações dos contaminantes aumentaram com o aumento da temperatura e pouca influência do tempo foi observada. A % de AGL e os parâmetros de cor (R e Y) diminuíram com o aumento do tempo e da temperatura, como esperado, enquanto a proporção de acilgliceróis não
diretamente proporcional ao conteúdo de diacilgliceróis (DAG) e inversamente proporcional à cor.
The formation of toxic compounds in food during processing is a widely studied topic. Among these contaminants, monochloropropanols, including esters of 3-MCPD (3-3-MCPDE) and 2-3-MCPD (2-3-MCPDE), and esters of glycidol (GE) have attracted worldwide attention. Produced by thermal processing, these compounds are found in refined vegetable oils, especially in palm oil. The refining of vegetable oils, especially the deodorization step, employs temperatures above 200 °C, which is sufficient to trigger reactions that result in the formation of these substances through a combination of precursors naturally present in the raw material. When ingested, these esters can be hydrolyzed in the gastrointestinal tract, releasing their free forms and posing a health risk to consumers, as 3-MCPD has the potential to affect primarily the kidney while glycidol is genotoxic and carcinogenic. The International Agency for Research on Cancer (IARC) classifies 3-MCPD and glycidol in groups 2B (possible human carcinogen) and 2A (probable human carcinogen), respectively. Although there are some studies on the formation of these contaminants in vegetable oils, there is no confirmation of the major route and exact precursors involved in these mechanisms. In order to generate data for a better understanding of the formation of these esters, the present study evaluated the formation profile of 3-MCPDE, 2-MCDPE and GE during the deodorization of palm oil at four temperatures (210, 230, 250 and 270 °C ) and four times (30, 60, 90 and 120 minutes). In addition, physicochemical changes including % free fatty acids (FFA), composition of acylglycerols and colour (R: red; Y: yellow) were also analyzed and correlated with the formation of the compounds. The proposed analyzes followed the official methods of the American Oil Chemists' Society (AOCS). For 3-MCPDE, 2-MCPDE and GE, values ranging from 1.91 to 2.70 mg/kg, 0.68 to 1.44 mg/kg and from 0.12 to 8.51 mg/kg were obtained, respectively. In general, the concentrations increased with the increase of the temperature and little influence of time was observed. The percentage of FFA and colour parameters (R and Y) decreased with the increase of time and temperature, as expected, while the composition of acylglycerols did not show significant changes under the tested conditions. Only GE showed correlation
Introdução Geral ... 12
Capítulo 1: Revisão bibliográfica ... 15
1. Introdução ... 16
2. Toxicidade dos ésteres de 3-MCPD, 2-MCPD e glicidol ... 17
3. Ocorrência de 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE em alimentos e ingredientes ... 20
4. Formação de 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE em óleos vegetais ... 23
5. Métodos analíticos para a determinação do 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE ... 29
6. Aspectos regulatórios e mitigação ... 31
7. Conclusão ... 34
Referências bibliográficas ... 34
Capítulo 2: Formation of contaminants (MCPD and glycidyl esters) and physicochemical changes during the deodorization of palm oil ... 42
Abstract ... 43
1. Introduction ... 43
2. Material and methods ... 45
2.1. Palm oil sample ... 45
2.2. Solvents and reagents ... 45
2.3. Standards ... 45
2.4. Deodorization process ... 46
2.5. Determination of 3-MCPDE, 2-MCPDE and GE ... 46
2.6. Composition of acylglycerols ... 47
2.7. Free fatty acid (FFA) ... 47
2.8. Colour ... 47
2.9. Statistical analyses ... 47
3. Results and discussion ... 48
5. References ... 57
Conclusão ... 63
Introdução geral
Nos dias atuais, muito se busca elucidar sobre a formação de compostos tóxicos que são formados durante o processamento térmico de alimentos. Entre eles, as formas ligadas de cloropropanóis vêm sendo amplamente estudadas, sendo os ésteres de 3-monocloropropano-1,2-diol (3-MCPDE) e de 2-monocloropropano-1,3-diol (2-MCPDE) os de maior ocorrência em alimentos processados e ingredientes (CRAFT et al., 2013).
O primeiro relato na literatura sobre a presença de cloropropanóis ocorreu em proteína de soja hidrolisada por ácido clorídrico. Neste tipo de produto, os compostos foram identificados em suas respectivas formas livres (3-MCPD e 2-MCPD) (VELISEK et al., 1978). Já as formas ligadas dos contaminantes só foram observadas em alimentos processados algumas décadas depois e em concentrações significantemente mais altas quando comparadas às formas livres (SVEJKOVSKÁ et al., 2004).
Entre os alimentos processados, os óleos vegetais refinados, especialmente o de palma, apresentam as concentrações mais elevadas desses contaminantes. Embora seja conhecido que componentes naturalmente presentes no óleo, como compostos clorados e acilgliceróis, favoreçam tanto a formação de 3-MCPDE quanto de 2-MCPDE, os precursores exatos destes ésteres ainda não estão completamente elucidados. Pesquisas demostram que a desodorização é a etapa responsável pela geração da maior parte destes compostos em óleos vegetais refinados (HRNCIRIK, VAN DUIJN, 2011; FRANKE et al., 2009; ZELINKOVÁ et al., 2006).
Estudos toxicológicos confirmaram efeitos adversos associados à ingestão de 3-MCPD, principalmente nefrotoxicidade devido a alterações degenerativas em diferentes segmentos tubulares dos rins (CHO et al., 2008). Indícios de hidrólise dos ésteres de 3-MCPD durante a digestão foram observados (ABRAHAM et al., 2013), o que provoca a liberação de sua forma livre e aumenta a exposição da população ao contaminante. A International
(possível carcinógeno em humanos) (IARC, 2012). Não há dados na literatura sobre o potencial carcinogênico do 2-MCPD.
Órgãos como a European Food Safety Authority (EFSA) e o Joint
FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA), responsáveis pela
avaliação do risco de substâncias químicas em alimentos, publicaram pareceres divergentes sobre o estabelecimento de um parâmetro de ingestão segura para a forma livre do 3-MCPDE. Em 2017, o JECFA estabeleceu uma ingestão diária máxima tolerável provisória (PMTDI) cinco vezes maior do que a ingestão diária tolerável (TDI) definida anteriormente pela EFSA (EFSA, 2016; FAO/WHO, 2017). Diante da diferença, a EFSA reavaliou as informações disponíveis e publicou uma TDI atualizada para o 3-MCPD de 2 µg/kg pc. Por falta de dados na literatura no momento da avaliação, o 2-MCPD e suas formas ligadas não foram avaliados (EFSA, 2018).
Simultaneamente à formação dos ésteres de cloropropanóis durante o refino de óleos vegetais, constatou-se que ésteres de glicidol (GE), outro grupo de contaminantes químicos, poderiam ser gerados nas mesmas condições de processo (CRAFT et al., 2013; HRNCIRIK, VAN DUIJN, 2011).
A principal ocorrência de GE em alimentos acontece em óleos vegetais que apresentam uma grande quantidade de diacilgliceróis (DAG) e monoacilgliceróis (MAG) (ERMACORA e HRNCIRIK, 2014a). Estes componentes já foram demonstrados como precursores de GE e ocorrem na palma em níveis em torno de 5% para o DAG e menores que 1% para o MAG (MBA; DUMONT; NGADI; 2015). A maior parte dos acilgliceróis são triacilgliceróis (TAG), que em estudos mais recentes, também demonstraram que podem agir como precursores dos ésteres de 3-MCPD (SMIDRKAL et al., 2016; ERMACORA e HRNCIRIK, 2014a; DESTAILLATS et al., 2012a).
Estudos toxicológicos evidenciaram um aumento de incidência de câncer em ensaios in vivo e demonstraram, também, o potencial do glicidol (forma livre do GE) de causar dano e mutação do DNA, comprovado por resultados positivos de genotoxicidade em ensaios in vitro e in vivo (FAO/WHO, 2017; EFSA, 2016). Devidamente, esta característica inviabilizou a EFSA e o JECFA de estabelecerem um valor de ingestão segura deste contaminante. Além
disso, o glicidol desperta muita preocupação por ser classificado pela IARC no grupo 2A (provável carcinógeno em humanos) (IARC, 2000).
Ainda que haja alguns estudos sobre a formação destes contaminantes em óleos vegetais, não há uma confirmação da rota majoritária e nem de quais os precursores exatos estão envolvidos nestes mecanismos. Buscando gerar dados para um melhor entendimento da formação destes ésteres, o presente estudo avaliou o perfil de formação do 3-MCPDE, 2-MCDPE e GE durante a desodorização do óleo de palma em quatro temperaturas (210, 230, 250 e 270 °C) durante quatro tempos (30, 60, 90 e 120 minutos). Além disso, as alterações físico-químicas quanto à % ácidos graxos livres (AGL), composição de acilgliceróis e a cor (R: vermelho; Y: amarelo) também foram analisadas e correlacionadas com a formação dos compostos.
O Capítulo 1 desta dissertação trata-se de uma revisão bibliográfica sobre os ésteres de 3-MCPD, 2-MCPD e glicidol. São apresentados os grupos de contaminantes, suas estruturas, seus efeitos tóxicos, a ocorrência em alimentos, os parâmetros de processamentos e os principais precursores, além dos métodos analíticos e medidas de mitigação e regulamentação.
O Capítulo 2 apresenta um artigo a ser submetido para a revista “LWT -
Food Science and Technology”, da editora Elsevier. Nele estão contemplados
todos os resultados obtidos nos experimentos realizados ao longo do curso de mestrado.
Capítulo 1:
1. Introdução
O termo cloropropanóis é utilizado para definir um grupo de contaminantes químicos derivados do glicerol, caracterizados estruturalmente por álcoois e dióis de três carbonos ligados a um ou dois átomos de cloro. Os principais representantes desta classe de compostos são o 3-monocloropropano-1,2-diol (3-MCPD) e o 2-monocloropropano-1,3-diol (2-MCPD), que podem ocorrer tanto na forma livre quanto ligada a ácidos graxos (ésteres de cloropropanóis).
Na estrutura química do 3-MCPD e 2-MCPD livres, há uma molécula de glicerol ligada a um único átomo de cloro, sendo que este átomo halogênico encontra-se ligado aos carbonos das posições três e dois do glicerol, respectivamente. Já quando existem ácidos graxos esterificados com hidroxilas ligadas aos carbonos das outras posições, estes compostos passam a ser denominados de ésteres de 3-MCPD (3-MCPDE) e de 2-MCPD (2-MCPDE), respectivamente (DAVÍDEK et al., 1980). A Figura 1 apresenta as estruturas químicas destes compostos.
Figura 1. Estruturas químicas das formas livres do 3-MCPD e 2-MCPD (A) e de seus diésteres (B) e monoésteres (C) ligados a ácidos graxos (R1, R2 e R3).
Os ésteres de glicidol (GE) correspondem a outro grupo de contaminantes químicos, caracterizados por compostos orgânicos com a estrutura do glicerol contendo os grupos epóxido e álcool, no qual a hidroxila está esterificada com um ácido graxo. Ao contrário dos cloropropanóis, o glicidol é encontrado em alimentos apenas em sua forma esterificada (GE). A Figura 2 apresenta as estruturas dos compostos.
Figura 2. Estruturas químicas do glicidol livre (A) e de seus ésteres (B), sendo R1 = ácidos graxos.
2. Toxicidade dos ésteres de 3-MCPD, 2-MCPD e glicidol
A toxicidade dos ésteres de 3-MCPD, 2-MCPD e glicidol tem sido atribuída às formas livres dos compostos, uma vez que estudos sugerem a hidrólise total destes contaminantes no trato digestivo, especialmente o 3-MCPDE e GE (ABRAHAM et al., 2013). Esta mesma condição também é importante para simular o pior caso possível de exposição da população aos compostos, assumindo que o conteúdo ingerido oralmente destes ésteres será absorvido na forma livre.
O potencial tóxico do 3-MCPD tem sido bastante estudado (BAKHIYA et al., 2011). O composto tem demonstrado nefrotoxicidade e efeitos adversos na reprodução, como alterações funcionais e estruturais nos testículos, em estudos conduzidos in vivo. Evidências de carcinogenicidade foram verificadas em animais experimentais após a administração de altas doses de 3-MCPD (400 mg/kg peso corpóreo) por um período de dois anos (CHO et al., 2008).
Entretanto, o desenvolvimento de tumores tem sido associado a um mecanismo não genotóxico. O 3-MCPD foi classificado pela International
Agency for Research on Cancer (IARC) como possível carcinógeno humano –
grupo 2B (IARC, 2012).
Os efeitos tóxicos do 2-MCPD são menos conhecidos. Um estudo desenvolvido por Zhang et al. (2019) constatou em testes in vivo, utilizando camundongos, que os ésteres de 2-MCPD não apresentam efeitos tóxicos como nefrotoxicidade e toxicidade testicular como o 3-MCPDE. Segundo os autores, isso indicaria uma diferenciação importante entre ambos os compostos. O 2-MCPD não foi avaliado pela IARC em relação ao potencial de carcinogenicidade em humanos.
Já o glicidol apresentou propriedades genotóxica e carcinogênica em experimentos com animais (NTP, 1990; 2007). Além disso, o glicidol é classificado pela IARC como uma substância provavelmente carcinogênica para humanos (Grupo 2A) (IARC, 2000).
As rotas bioquímicas propostas para a metabolização dos ésteres de 3-MCPD e glicidol estão representadas na Figura 3. Com base em vias metabólicas de bactérias e mamíferos, o 3-MCPD pode ser metabolizado a ácido oxálico e eliminado pela urina (IARC, 2012). Além da formação de adutos com o DNA, o glicidol pode sofrer conjugação com glutationa para posterior eliminação na urina na forma de derivados de ácido mercaptúrico.
Em 2016 e 2017, a European Food Safety Authority (EFSA) e o Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) publicaram, respectivamente, seus pareceres sobre a avaliação de segurança do 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE. A EFSA estabeleceu uma ingestão diária tolerável (TDI) de 0,8 µg/kg peso corpório (pc) (EFSA, 2016) para o 3-MCPD enquanto o JECFA propôs uma ingestão diária máxima tolerável provisória (PMTDI) de 4 µg/kg pc (FAO/WHO, 2017) para este mesmo contaminante. Com a divergência, em 2018, a EFSA decidiu reavaliar os dados toxicológicos da substância e estabeleceu uma nova TDI de 2 µg/kg pc (EFSA, 2018). Devido à falta de dados na literatura no momento da avaliação, o 2-MCPD não foi considerado.
Figura 3. Rota bioquímica dos ésteres de 3-MCPD e glicidol. Sendo a = ação da enzima álcool desidrogenase; b = quebra enzimática envolvendo a halohidrina desalogenase, c = ação de conjugação utilizando a glutationa s-transferase; d = enzima epóxido-hidrolases; e = quebra enzimática / não enzimática. X = compostos orgânicos/ inorgânicos (adaptada de Arisseto et al., 2018).
As características genotóxica e carcinogênica do glicidol inviabilizaram o estabelecimento de uma ingestão segura, porém foi possível calcular um parâmetro conhecido como margem de exposição (MOE), que compara a exposição da população humana com uma dose que provocou efeito adverso em uma baixa proporção de animais em um estudo toxicológico, e indica um nível de preocupação que o contaminante representa. As MOEs obtidas para o glicidol sugeriram grande preocupação, especialmente para crianças, principalmente pelos altos teores de GE encontrados em produtos e fórmulas infantis e o baixo peso corpóreo destes indivíduos (EFSA, 2016).
3. Ocorrência de 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE em alimentos e ingredientes
Um estudo desenvolvido por Svejkovská et al. (2004) em diversos produtos alimentícios apresentou o primeiro relato, até então, da presença de ésteres de 3-MCPD em alimentos processados. Uma ampla amostragem foi realizada, englobando produtos de origem animal e vegetal, processados a altas temperaturas e alimentos com diferentes teores de água, gordura e sais. Os resultados mostraram elevadas concentrações de 3-MCPDE quando o processamento utilizava tratamentos térmicos em produtos com baixa umidade e alto teor de gordura.
A ocorrência de 3-MCPDE em óleos vegetais foi reportada posteriormente por Zelinková et al. (2006). Após isso, diversos estudos demonstraram a presença destes contaminantes em quantidades significativas nos óleos refinados (KAMIKATA et al., 2019; ARISSETO et al., 2014; MACMAHON et al., 2013; KUHLMANN, 2011). As Tabelas 1 e 2 apresentam concentrações de ésteres de 3-MCPD em diferentes alimentos e ingredientes.
Os ésteres de glicidol também são encontrados em quantidades relativamente elevadas em óleos e gorduras vegetais refinados, assim como na maioria dos produtos contendo estes ingredientes (BAKHIYA et al., 2011). A Tabela 3 apresenta concentrações reportadas na literatura (Chen et al., 2017).
Tabela 1 – Ocorrência de 3-MCPDE em diversas matrizes lipídicas.
Alimentos / Ingredientes 3-MCPDE (µg/kg)
(mín. – máx.)
Gordura animal < 100 – 300
Óleo vegetal (não refinado) < 100 – 400
Óleo vegetal refinado < 100 – 19000
Girassol 100 – 2100 Milho 120 – 470 Canola < 100 – 1000 Soja < 100 – 1234 Oliva < 100 – 2462 Coco 200 – 1694 Palma 1100 – 14400 Palmiste 200 – 1400 Margarina 400 – 4500 Maionese < 150 – 1040
Gordura para fritura 500 – 5200
Adaptado de Arisseto et al. (2013).
Tabela 2 – Ocorrência de 3-MCPDE em variados alimentos e ingredientes alimentícios.
Alimentos / Ingredientes 3-MCPDE (µg/kg)
(mín. – máx.) Biscoito 50 – 865 Cereal matinal nd - 43 Noodles nd - 210 Pão nd – 230 Café torrado nd – 390 Malte 4 – 650 Leite materno nd - 76
Calda e recheio de biscoitos < 100 - 7500
Chantilly 50 -730
Batata frita 37 – 6100
Frango empanado 9 -120
Tabela 3 – Ocorrência de GE em óleo vegetal. Óleo vegetal GE (mg/kg)* (mín. – máx.) Algodão - Canola - Cártamo - Coco 0,50 – 3,00 Colza 0,10 – 1,10 Girassol 0,02 – 0,90 Milho - Noz 0,70 – 1,40 Oliva - Palma 0,30 – 28,00 Uva 0,14 – 3,02
*Adaptado de Chen et al. (2017). “-“ não reportado no estudo.
Apesar de uma base de dados limitada, a ocorrência de 2-MCPDE em alimentos parece estar vinculada ao 3-MCPDE. Estudos desenvolvidos por Kuhlmann (2011) também mostraram a presença destes ésteres em óleos refinados. Mais recentemente, Kamikata et al. (2019) avaliaram a presença de 2-MCPDE em diferentes tipos de azeites de oliva comercializados no Brasil. As informações disponíveis sugerem que as concentrações de 2-MCPDE correspondem a aproximadamente 50% dos níveis de 3-MCPDE.
Conforme observado nas Tabelas 1, 2 e 3, entre os vários tipos de óleos, o óleo de palma é o que apresenta as maiores ocorrências destes contaminantes nos diversos estudos realizados ao redor do mundo (ARISSETO et al., 2014; MACMHON et al., 2013; DESTAILLATS et al., 2012b). O óleo de palma, originado do mesocarpo do fruto da Elaeis guineenses (Figura 4), tem uma ampla aplicação em diversas áreas, incluindo a produção de cosméticos e ceras. Porém, seu principal destino é a indústria alimentícia (EDEM, 2002), onde é largamente utilizado na formulação e preparação de biscoitos, sorvetes, margarinas, frituras e fórmulas infantis.
Em sua forma bruta, é conhecido também como azeite de dendê e utilizado na culinária dos estados do norte e nordeste do Brasil. Quando refinado, possui características interessantes para a indústria como insumo alimentício, principalmente por sua composição de ácidos graxos saturados e insaturados na proporção média de 1:1 (PANDE et al., 2012; EDEM, 2002). Esta característica atribui ao óleo uma textura semissólida, composta pela oleína (fração líquida) e estearina (fração sólida). Como alternativa para o uso da gordura hidrogenada, a fração sólida do óleo de palma é vista como o principal substituinte (KELLENS et al., 2007).
Apesar das diversas vantagens, a palma tem naturalmente na sua composição componentes que favorecem tanto a formação de 3-MCPDE e 2-MCPDE (triacilgliceróis e compostos clorados orgânicos e inorgânicos) quanto de GE (diacilgliceróis e monoacilgliceróis) (ERMACORA, HRNCIRIK, 2014a; NAGY et al., 2011).
Figura 4. À esquerda a espécie Elaeis guineenses, também conhecida como palmeira ou dendezeiro. À direito o óleo de palma clarificado (a) e desodorizado (b).
4. Formação de 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE em óleo vegetais
Os estudos iniciais sobre o mecanismo de formação dos cloropropanóis foram realizados com as formas livres. Posteriormente, as pesquisas foram
direcionadas para os mecanismos envolvendo a formação de suas formas esterificadas. Conforme descrevem Rahn e Yaylayan (2011), quatro rotas foram propostas e todas envolvem reações do tipo SN2, sendo duas delas
descrevendo ataques nucleofílicos diretos dos íons cloreto à estrutura do glicerol e as outras duas sugerindo a interação destes mesmos íons com estruturas intermediárias, como o íon aciloxônio e epóxidos. A Figura 5 apresenta os compostos em suas formas livres, esterificadas e seus possíveis intermediários.
Pesquisas conduzidas por Collier et al. (1991) estabeleceram a constituição de um intermediário na reação de formação do 3-MCPD conhecido como íon aciloxônio. Estes íons são formados a partir dos acilgliceróis, principalmente diacilgliceróis (DAG) e monoacilgliceróis (MAG), e também parecem estar envolvidos na formação das formas ligadas destes contaminantes. Estudos recentes também indicam os triacilgliceróis (TAG) como precursores na formação de 3-MCPDE, conforme mostra Smidrkal et al. (2016) e Destaillats et al. (2012a). Ainda não foi possível estabelecer uma correlação entre os acilgliceróis e a formação de 3-MCPDE, porém estes compostos podem ser facilmente convertidos em seus respectivos isômeros e HCl (HAMLET et al., 2010), favorecendo a formação destes ésteres.
Figura 5. Resumo dos mecanismos propostos para a formação de 3-MCPDE: A) ataque nucleofílico direto do cloro ao carbono do glicerol contendo um ácido graxo esterificado; B) ataque nucleofílico direto do cloro ao carbono do glicerol contendo uma hidroxila; C) formação do íon aciloxônio; D) formação de um epóxido. R1 e R2 = cadeia de ácido graxo (Adaptada de RAHN, YAYLAYAN, 2011).
Dependendo do precursor disponível, são propostos quatro mecanismos para a formação de ésteres de glicidol em óleos vegetais refinados e todos sugerem rearranjos intramoleculares de DAG e/ou MAG. Em geral, as rotas químicas envolvem a eliminação de água em MAG e/ou desacidificação de DAG, conforme demostrado na Figura 6 (CHENG et al. 2017).
Em meio ácido, o anel epóxido presente na molécula do GE é aberto, facilitando o ataque de íons aniônicos (CHENG et al. 2016). Na presença de íons cloro, estes ésteres podem ser convertidos em 3-MCPDE ou em 2-MCPDE, conforme descrito por Rahn e Yaylayan (2011). Nesta rota de formação, o GE acaba se tornando intermediário na reação dos cloropropanóis,
podendo elevar as concentrações destes compostos consideravelmente quando formados em grandes quantidades.
Figura 6. Resumo das rotas de formação propostas para o GE. a, c e c’) rearranjo intramolecular pela eliminação de água em MAG; b, b’ e d) rearranjo intramolecular pela eliminação de ácido graxo em DAG. R1, R2 e R3 = cadeia de ácido graxo e A = Migração intramolecular (adaptada CHENG et al., 2017).
Por ser pouco ou não detectado no óleo bruto, as reações responsáveis pela formação dos contaminantes são catalisadas principalmente durante o refino do óleo. No caso dos óleos refinados, para se chegar às características desejáveis do produto, é preciso a aplicação de altas temperaturas (DE GREYT, KELLENS, 2005), e estas, por sua vez, acabam propiciando as condições necessárias para desencadear as reações de formação destes contaminantes na presença de seus potenciais precursores (ZHAO et al., 2016;
CHENG et al., 2016; DESTAILLATS et al., 2012b; HRNCIRIK, van DUJIN, 2011).
São aplicados na indústria de óleo vegetais dois tipos de refino: o físico e o químico, apresentados na Figura 7 com suas principais etapas e seus respetivos objetivos (HARTMAN, ESTEVES, 1982). Para o óleo de palma, enquanto a degomagem e o branqueamento ocorrem em temperaturas entre 90 e 110°C, a desodorização opera em condições térmicas mais drásticas, podendo atingir até 270°C (BASIRON, 2005). A ausência da etapa de neutralização no refino físico é vantajoso para óleos que possuem elevada acidez, como por exemplo o de palma. Nesta etapa ocorre a formação de sabões, o que exige uma lavagem posterior causando a perda de óleo e, consequentemente, diminui a eficiência do processo.
Figura 7. Resumo das etapas de refino físico e químico de óleos vegetais com seus respectivos objetivos. (adaptada HARTMAN e ESTEVES, 1982). *AGL = Ácidos graxos livres
Por apresentarem diferentes rotas de formação e precursores, os estudos sobre a geração de MCPDE e GE possuem enfoques diferentes, embora a desodorização apresente o maior impacto na formação de ambos os grupos de contaminantes em óleo de palma, conforme demonstram estudos desenvolvidos por Hrncirik e van Duijn (2011), Pudel et al. (2011) e Zelinková et al. (2006). As demais etapas do refino, como degomagem e branqueamento tradicionais, estão relacionadas com a produção de substâncias que possam atuar como possíveis precursores dos contaminantes, conforme sugere Zulkurnain et al. (2012).
A temperatura utilizada durante o processamento é um fator indispensável para a formação do 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE em óleo de palma, conforme demonstram Hrncirik e van Duijn (2011). Neste mesmo estudo, é possível observar tanto a formação dos ésteres de 3-MCPD e 2-MCPD, como dos GE em de condições a 180 °C e, além disso, a temperatura apresentou maior influência na formação de GE do que na de 3-MCPDE. Assim como a condição térmica, o tempo de processo é um fator relevante na cinética da reação. Ermacora e Hrncirik (2014b) demostraram o efeito do processamento prolongado na degradação dos ésteres de 3-MCPD. O óleo de palma foi mantido sob aquecimento entre temperaturas de 180 – 260 °C por períodos de até 24 horas. O composto apresentou uma boa estabilidade térmica somente durante as duas primeiras horas, se decompondo em outros compostos ao longo do restante da desodorização.
Até o momento, sabe-se que as condições de formação de 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE também dependem da qualidade do óleo bruto utilizado no processo de refino. A acidez total, a concentração de DAG e MAG e a presença de compostos organoclorados são características que influenciam na formação destes ésteres. A condição ácida inical do óleo bruto demonstrou impacto na formação do 3-MCPDE, como reportado por Ramli et al. (2015). Além disso, a degradação de compostos clorados em ácido clorídrico (HCl) durante a etapa de desodorização do óleo de palma foi reportado como uma via de formação dos contaminantes clorados (DESTAILLATS et al., 2012b; CRAFT, DESTAILLATS, 2014).
Ainda não foi completamente elucidada a origem dos compostos clorados no óleo de palma, porém autores como Nagy et al. (2012) já detectaram a presença de compostos clorados inorgânicos, especialmente ligados a átomos de ferro, magnésio e cálcio, além das formas orgânicas, nessa matéria-prima. Zhao et al. (2016) confirmaram que compostos clorados inorgânicos, como o CaCl2, MgCl2, NaCl e outros apresentam a capacidade de
formar 3-MCPD quando reagem com acilgliceróis. A parte polar das substâncias organocloradas parece ser a mais afetada ao longo das etapas de refino, e quando o óleo é processado em temperaturas altas, a mesma comporta-se como doadora de íons cloro (ERMACORA, HRNCIRIK, 2014a).
Por se tratar de um produto lipídico, o óleo de palma refinado possui sua composição praticamente formada por acilgliceróis, especialmente o TAG, sendo uma pequena porção composta de DAG e uma minoria de MAG e ácidos graxos livres. Quando comparado com óleos de sementes, a concentração de DAG na palma é superior. O óleo de palma bruto, por exemplo, possui teores de DAG em torno de 5% (MBA; DUMONT; NGADI; 2015) do total da massa lipídica. Assim como precursores dos ésteres de cloropropanóis, os acilgliceróis também são precursores dos GE.
Ao contrário do 3-MCPDE e do GE, as informações sobre a formação de 2-MCPDE são escassas na literatura. Por possuir uma estrutura muito parecida com o 3-MCPDE, acredita-se que as suas rotas de formação, bem como as condições de processo, devam ser similares.
5. Métodos analíticos para a determinação de 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE
Dependendo da forma como os ésteres de 3-MCPD, 2-MCPD e glicidol são analisados, os métodos analíticos podem ser classificados como diretos ou indiretos. A principal diferença é que enquanto o primeiro analisa os compostos na forma ligada, o segundo utiliza a forma livre após transformação de suas formas esterificadas (JEDRKIEWICZ et al., 2016; ERCOMACORA, HRNCIRIK, 2014c; MACMAHON, 2014).
Os métodos indiretos foram os primeiros a serem usados para a detecção dos ésteres de 3-MCPD e usualmente emprega-se a cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas (GC-MS) (MACMAHON, 2014). Estes métodos exigem um menor número de padrões analíticos e mais tempo no preparo de amostras, por terem etapas como transesterificação, neutralização, salting out e derivatização. A clivagem dos ésteres para a liberação dos compostos em suas formas livres é catalisada pela presença de ácidos ou bases.
Ambas as catálises apresentam alguma interferência quando não otimizadas de maneira adequada. No meio básico, o 3-MCPDE e 2-MCPDE são instáveis e podem ser convertidos em outros compostos. Já a catálise ácida pode promover a formação de novas moléculas de 3-MCPD e/ou 2-MCPD na presença de íons cloro, podendo superestimar a concentração dos contaminantes na amostra. Os métodos que utilizam GC-MS necessitam da etapa derivatização, geralmente conduzida por solução de ácido fenilborônico (PBA) (ERCOMACORA, HRNCIRIK, 2014a; 2014c). Na Figura 8 é apresentado um esquema geral para os métodos indiretos.
Devido à complexidade do preparo de amostra necessário para os métodos indiretos, os métodos diretos propõe uma abordagem mais simples, analisando os compostos em sua forma esterificada e dispensando etapas de transesterificação e derivatização (MACMAHON, 2014). A principal desvantagem é a quantidades de padrões necessários para a detecção dos diversos tipos de ácidos graxos esterificados na molécula dos contaminantes.
Atualmente, existem disponíveis três métodos oficiais para a análise de ésteres de 3-MCPD, 2-MCPD e glicidol em óleos e gorduras vegetais (Cd 29a-13 (A), Cd 29b-29a-13 (B) e Cd 29c-29a-13 (C)) e um método para emulsões (Cd 30-15) pela American Oil Chemists’ Society (AOCS, 2013; 2015). Todos utilizam a abordagem indireta para a determinação dos compostos.
Figura 8. Esquema simplificado do preparo de amostra de métodos indiretos para a análise de 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE.
Entre os métodos Cd 29a-13 (A) e Cd 29b-13 (B), a principal diferença consiste na solução utilizada para transesterificação dos ácidos graxos; enquanto o método (A) utiliza uma solução ácida de metanol, o (B) aplica um solução alcalina alcoólica. O método Cd 29c-13 (C) utiliza uma metodologia diferencial, de modo que a quantificação de ésteres de 3-MCPD é feita em dois ensaios, sendo um com a conversão total do GE em 3-MCPDE (e uma pequena parte em 2-MCPDE na presença de íons cloros) e o outro onde se utiliza uma solução ácida de brometo de sódio, convertendo o GE em ésteres de 3-monobromopropane-1,2-diol (3-MBPDE). A diferença entre ambos os ensaios determina a concentração de 3-MCPD e do 2-MCPD em conjunto e do glicidol separadamente.
6. Aspectos regulatórios e mitigação
As altas concentrações reportadas na literatura, as avaliações de risco conduzidas pela EFSA e JECFA e o potencial genotóxico e carcinogênico do GE, mobilizou a União Europeia que publicou, em Fevereiro de 2018, uma
regulamentação onde estabeleceu limites máximo aceitáveis de ésteres de glicidol em óleos e gorduras vegetais de consumo direto e aqueles utilizados como insumo de produtos infantis (EU, 2018). Anteriormente, era sugerido que as concentrações fossem reduzidas aos menores níveis possíveis. Na Tabela 4 são apresentados os limites publicados pela União Europeia.
Os ésteres de 3-MCPD são mencionados nesta mesma publicação, mas as divergências entre os relatórios da EFSA e do JECFA impossibilitaram uma regulamentação apropriada no momento. Vale destacar que existem possibilidades de uma regulamentação no futuro para este contaminante.
Diante desse cenário, as pesquisas relacionadas ao desenvolvimento de técnicas para a mitigação de 3-MCPDE, 2-MCPDE e GE tornam-se imprescindíveis. Entretanto, muitas das estratégias disponíveis não apresentam resultados satisfatórios ainda, seja pela aplicabilidade nas refinadoras de óleo ou pela descaracterização do produto ao final do processo.
Em geral, o foco para a redução dos ésteres de 3-MCPD é evitar que o óleo carregue precursores para a etapa de desodorização (MATTHAUS et al., 2011). Entre as ações desenvolvidas até então, destaca-se a remoção de parte dos compostos clorados no óleo de palma.
Tabela 4 – Limites máximos aceitáveis de GE em óleos e gorduras vegetais de consumo direto ou utilizados como ingredientes.
Tipo de alimento Limite máximo (µg/kg)
Óleos e gorduras vegetais para consumo direto ou
usados como ingredientes*. 1000
Óleos e gorduras vegetais destinados para a produção de alimentos infantis e produtos à base de cereais para público infantil.
500 Fórmulas infantis com fins medicinais específicos
(em pó).
75 até 30.06.2019 50 após 01.07.2019 Fórmulas infantis com fins medicinais específicos
(líquidos).
10,0 até 30.06.2019 6,0 após 01.07.2019 Fonte: EC (2018). *Exceto para aqueles produtos descritos nos demais itens.
Devido à grande dificuldade de retirada das substâncias organocloradas do óleo, busca-se a redução de compostos clorados na forma inorgânica. A lavagem do óleo com água e/ou álcool parecia ser promissor, mas os dados disponíveis não são muitos satisfatórios. Com resultados similares aos de Matthaus et al. (2011), Silva et al. (2019) utilizaram diversas razões de água e etanol na lavagem do óleo de palma clarificado e uma redução pouco expressiva nos teores de 3-MCPDE e 2-MCPDE foi observada, variando aproximadamente de 0.7% a 17.1% e 9.8% e 56.4%, respectivamente.
Outra ação para a mitigação dos ésteres de MCPDs é a substituição da terra ativada pela terra neutra na etapa de clarificação do óleo. Tradicionalmente, aplica-se a terra ácida ativada por ácido clorídrico (HCl), o que causa a incorporação do cloro no produto e propicia as reações de formação do 3-MCPDE e 2-MCPDE na desodorização (FEDIOL, 2015; CCCF, 2019).
O estudo de Smidrkal et al. (2011) mostrou um impacto na redução de 3-MCPDE neutralizando os AGL no óleo antes do processamento, sugerindo a importância da acidez na formação dos contaminantes, sendo confirmado posteriormente por Ramli et al. (2015). Porém, o óleo obtido não foi avaliado em relação às suas características físico-químicas, deixando de mostrar quais os reais impactos nos parâmetros de qualidade do produto final.
Para o GE, as práticas de mitigação focam na utilização de óleo com baixos teores de DAG, esterilização dos frutos para inativação de lipases, uso de temperaturas inferiores a 250 °C durante a etapa final do refino e a remoção dos contaminantes já formados no óleo desodorizado (FEDIOL, 2015; MATTHAUS et al., 2011). Na retirada de ésteres de glicidol no produto final, um etapa adicional no processamento é necessário. A utilização de terra ácida para remover o contaminante do óleo no pós-refino é eficiente, porém uma nova desodorização tem que ser feita, o que pode contribuir para a formação de uma quantidade adicional de 3-MCPDE e 2-MCPDE (FEDIOL, 2015).
Com o objetivo de maximizar a mitigação dos ésteres de 3-MCPD e glicidol em óleos vegetais, o Codex Alimentarius está desenvolvendo um código de práticas no qual são descritas estratégias para a redução destes
contaminantes desde o plantio até o tratamento pós-refino (CCCF, 2019). Com as pesquisas ainda em andamento e até a elucidação e desenvolvimento de um sistema eficiente na redução dos contaminantes, este código pode ajudar o setor produtivo a atender aos limites regulatórios. Para isso, um melhor entendimento da formação destes compostos torna-se necessária.
7. Conclusões
A presença dos ésteres de 3-MCPD, 2-MCDP e glicidol nos alimentos processados pode representar uma preocupação à saúde humana, especialmente considerando a confirmação dos efeitos tóxicos dos contaminantes e as altas concentrações encontradas na dieta. Entre os óleos vegetais refinados, o óleo de palma é o que apresenta a maior ocorrência dessas substâncias. Ainda que existam dados sobre a formação dos ésteres de 3-MCPD e glicidol em óleo de vegetais, estes ainda necessitam de confirmação quanto aos precursores exatos envolvidos na reação. Os estudos que abordam a correlação entre a formação dos contaminantes e as alterações físico-químicas do óleo de palma durante a desodorização são escassos na literatura. Além disso, o perfil de formação dos ésteres de 2-MCPD não é bem conhecido, necessitando de informações que permitam um melhor entendimento de seus precursores e condições de processo, para que estratégias de mitigação possam ser desenvolvidas.
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Capítulo 2:
Formation of contaminants (MCPD and glycidyl esters)
and physicochemical changes during the deodorization
of palm oil
Renan G. TIVANELLO1, Maisa CAPRISTO1, Eduardo VICENTE2, Roseli A. FERRARI2,
Klicia A. SAMPAIO1, Adriana P. ARISSETO1.
1Faculty of Food Engineering, University of Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato 80, 13083-862, Campinas - SP, Brazil.
2 Institute of Food Technology (ITAL), Avenida Brasil 2880, C. P. 139, 13070-178, Campinas - SP, Brazil.
ABSTRACT
Esters of 3-MCPD, 2-MCPD, and glycidol (GE) are contaminants formed during thermal treatment of foods, especially in refined palm oil. Deodorization is the oil processing step that most contributes to the formation of these toxic compounds. Their adverse effects associated with nephrotoxicity in the 3-MCPDE case and GE has been demonstrated genotoxic activity. There are many published studies addressing the formation of 3-MCPDE, but the exact precursors for the formation reaction of these contaminants are still unknown. This study verified the formation profile of esters of 3-MCPD, 2-MCPD, and glycidol (GE), and evaluated physicochemical changes (free fatty acid, acylclycerols and colour) occurred during deodorization of palm oil in different conditions of time (30, 60, 90 and 120 min) and temperature (210, 230, 250 and 270ºC). The levels of 3-MCPD and 2-MCPD esters ranged from 1.91 to 2.70 mg/kg and 0.68 to 1.44 mg/kg, respectively, and were formed already at the mildest tested condition (210ºC, 30 min). No correlation was observed between these contaminants and physicochemical changes. GE levels varied from 0.12 to 8.51 mg/kg and showed correlation with colour and diacylglycerol content. While the temperature had little influence on the formation of esters of 3-MCPD and 2-MCPD, the same was not observed in relation to GE. The increase in the temperature raised the content of GE considerably, especially at 250 and 270°C.
Keywords: MCPD esters; palm oil; glycidyl esters; refined oil; processing
contaminants
1. INTRODUCTION
Elucidating the formation of toxic compounds during heat processing in food is an important knowledge to reduce risks to human health. Among emerging processing contaminants, the bound forms of chloropropanols, in particular esters of 3-monochloropropane-1,diol (3-MCPDE) and 2-monochloropropane-1,3-diol (2-MCPDE), have been intensively studied in the past few years and reported in several processed foods and food ingredients (Arisseto, Marcolino, & Vicente, 2014; B. Craft, Chiodini, Garst, & Granvogl,
2013; Svejkovská et al., 2004; Zelinková, Svejkovská, Velíšek, & Doležal, 2006). The formation of glycidyl esters (GE) has similarly attracted worldwide attention (Craft, Chiodini, Garst, & Granvogl, 2013; Hrncirik & van Duijn, 2011).
Refined vegetable oils have been reported with the highest concentrations of these contaminants, especially palm oil. Deodorization is the refining step that favors the formation of these compounds, as demonstrated by many authors (Franke, Strijowski, Fleck, & Pudel, 2009; Hrncirik & van Duijn, 2011; Zelinková et al., 2006). Chlorides and acylglycerols, mainly triacylglycerol (TAG), occur naturally in palm oil and can act as precursors of 3-MCPD esters (Destaillats, Craft, Sandoz, & Nagy, 2012; Ermacora & Hrncirik, 2014; Šmidrkal et al., 2016). High concentrations of diacylglycerols (DAG) and monoacylglycerols (MAG) play an important role in the formation of GE, besides the application of high temperatures (Ermacora & Hrncirik, 2014).
Toxicological studies have confirmed adverse effects associated with free 3-MCPD, mainly nephrotoxicity (Cho et al., 2008), while glycidol may cause DNA damage and mutation, as demonstrated by positive genotoxicity results in
in vitro and in vivo assays (FAO/WHO, 2017; EFSA, 2016). The International
Agency for Research on Cancer (IARC) classifies 3-MCPD in group 2B (possible human carcinogen) and glycidol in group 2A (probable human carcinogen) (IARC, 2012; 2000). The European Food Safety Authority (EFSA) and the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) published contrasting opinions on the establishment of a safe intake parameter for 3-MCPD. EFSA established a tolerable daily intake (TDI) of 0.8 μg/kg body weight (bw) in 2016 and JECFA a provisional maximum tolerable daily intake (PMTDI) of 4 μg/kg bw in 2017 (EFSA, 2016; FAO/WHO, 2017). In 2018, EFSA re-evaluated the available toxicological data and established a TDI for 3-MCPD of 2 μg/kg bw (EFSA, 2018).
There are some proposed mechanisms available in the literature to explain the formation of 3-MCPDE and GE in refined oils (Craft & Destaillats, 2014; Destaillats, Craft, Sandoz, et al., 2012; Rahn & Yaylayan, 2011; Zulkurnain et al., 2012), but the knowledge of the exact precursors and conditions involved in the generation of such contaminants are still incomplete. Moreover, data on the formation of 2-MCPDE is very limited in the literature. In
addition, the evaluation of physicochemical changes that occur simultaneously to the formation of the contaminants is something that has not been explored in published studies. Therefore, the focus of this study is to verify the formation profile of 3-MCPDE, 2-MCPDE, and GE in palm oil, as well as its relation with physicochemical changes along the deodorization process conducted under different conditions of time and temperature.
2. MATERIAL AND METHODS
2.1. Palm oil sample
A company in the region of Limeira – SP (Brazil) provided the bleached palm oil (BPO), which was characterized in relation to free fatty acid (FFA), composition of acylglycerols, colour and concentrations of 3-MCPDE, 2-MCPDE and GE.
2.2. Solvents and reagents
Heptane (purity ≥ 99%) and acetone were acquired from Scharlau Brand (Barcelona, Spain), while methanol was purchased from J. T. Baker (Mexico City, Mexico). Tetrahydrofuran (THF, inhibitor-free, purity ≥ 99,99%), toluene (purity ≥ 99,9%), sodium bicarbonate, sodium bromide (NaBr, purity ≥ 99,5%) and phenylboronic acid (PBA, purity ≥ 97%) were acquired from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Sodium sulfate and sulfuric acid were from Merck (Darmstadt, Germany) and phenolphthalein was obtained from Synth (Diadema, SP, Brazil). A Milli-Q Plus system from Millipore (Bedford, MA, USA) was used to obtain ultra pure water.
2.3. Standards
The standards rac 1,2-bis-palmitoyl-3-chloropropanediol (purity 98%), 1,3-dipalmitoyl-2-chloropropanediol (purity 98%), glycidyl palmitate (purity 98%), glycidyl palmitate-d5 (chemical purity 97% and isotopic purity 97.6%) and rac 1,2-bis-palmitoyl-3-chloropropanediol-d5 (purity 98%) were purchased from Toronto Research Chemicals Inc (Ontario, Canada). Monoglyceride (MAG),
diglyceride (DAG), and triglyceride (TAG) standards were purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).
2.4. Deodorization process
The deodorization process was performed in a laboratory-scale batch deodorizer and the system consisted of flow meter, hoses, adapters, thermometer, condenser, cold trap, vacuum pump, heating mantle, oil sample flask, flow control, and barometer. Four different temperatures (210 °C, 230 °C, 250 °C and 270 °C) and times (30, 60, 90 and 120 minutes) were applied to deodorize 100 g of BPO. Deodorization followed the recommendations from
Bailey's Industrial Oil and Fat Products (De Greyt & Kellens, 2005), with a fixed
pressure in the range of 1 to 4 mbar and steam injection set around 1%. A non-deodorized sample was used as control (time zero).
2.5. Determination of 3-MCPDE, 2-MCPDE and GE
The analyses of the contaminants were carried out by the official AOCS method Cd 29a-13 (AOCS, 2013). The method consists of the conversion of GE to esters of 3-bromopropane-1,2-diol (3-MBPDE) in the presence of acidic sodium bromide solution, followed by acid catalyzed transesterification and neutralization with sodium bicarbonate. Subsequently, a salting-out of the fatty acid methyl esters in the presence of sodium sulfate and derivatization of 3-MCPD, 2-MCPD and 3-MBPD released with phenylboronic acid (PBA) are performed. The samples were analyzed by gas chromatography coupled to an MSD 5975C mass spectrometer (Agilent Technologies, model 7890A, New Castle, DE, USA) using an HP1-MS (30 m x 0.25 mm, 1 µm, Agilent Technologies) capillary column. The following ions were monitored: m/z 147 (quantifier ion), 196 (qualifier ions) for 3-MCPD derivative, m/z 150 for the internal standard 3-MCPD-d5 derivative, m/z 196 (quantifier ion) for 2-MCPD derivative, m/z 147 (quantifier ion) for 3-MBPD derivative, and m/z 150 (quantifier ion) for the internal standard 3-MBPD-d5 derivative.
