PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA E BIOCIÊNCIAS
Daniela Sousa Coelho
Desenvolvimento de sistemas nanoestruturados contendo chalconas com liberação controlada para o tratamento tópico de leishmaniose cutânea
FLORIANÓPOLIS 2020
Daniela Sousa Coelho
Desenvolvimento de sistemas nanoestruturados contendo chalconas com liberação controlada para o tratamento tópico de leishmaniose cutânea
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do título de doutor em Biotecnologia e Biociências.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Maraschin
Florianópolis 2020
Daniela Sousa Coelho
Desenvolvimento de sistemas nanoestruturados contendo chalconas com liberação controlada para tratamento tópico de leishmaniose cutânea
O presente trabalho em nível de doutorado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof.(a) Letícia Mazzarino, Dr.(a) Nanoscopping: soluções nanotecnológicas
Prof.(a) Alcilene Monteiro Fritz, Dr.(a) Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Aguinaldo Pinto, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de doutor em Biotecnologia e Biociências.
____________________________ Coordenação do Programa de Pós-Graduação
____________________________ Prof. Marcelo Maraschin, Dr.
Orientador
Florianópolis, 2020. Assinado de forma digital por Marcelo Maraschin:60975946900 Dados: 2020.05.19 10:47:10 -03'00'
Documento assinado digitalmente Glauber Wagner
Data: 19/05/2020 16:08:25-0300 CPF: 007.019.139-59
Este trabalho é dedicado à minha família e aos colegas do laboratório de morfogênese e bioquímica vegetal.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador profº Marcelo Maraschin, pela oportunidade e orientação durante a realização desta tese e, principalmente, pela confiança em meu trabalho e por ser tão generoso com todos os alunos que passam pelo laboratório de morfogênese e bioquímica vegetal (LMBV).
À Beatriz Veleirinho, por ter me acolhido novamente ao grupo LMBV com a missão de entender sobre matrizes nanofibrosas, nanoemulsão e leishmaniose. Obrigada por ser este exemplo de cientista desde 2009 e agora exemplo de empreendedora e mãe.
Ao profº Rosendo, coordenador do projeto de pesquisa/MCTI/CNPq/Universal 14/2014. A contribuição científica e financeira para este projeto foi fundamental para os resultados alcançados.
Ao profº Mário Steindel pela paciência e ensinamentos em absolutamente todos os experimentos realizados com as formas parasitárias e, principalmente, por ter me dado liberdade e independência para conduzir esta tese, contribuindo para o meu crescimento profissional.
À profª Patrícia Stocco pelas dicas e sugestões do projeto desde a etapa da seleção e no exame de qualificação. Obrigada pela ajuda com os qPCR´s.
A todos os colegas do laboratório de protozoologia, principalmente às alunas Milene Hoer Moraes e Carime Lessa pela ajuda com os experimentos com as formas parasitária in vitro e in vivo, respectivamente.
Aos funcionários e técnicos dos laboratórios multiusuários da UFSC. O laboratório de microscopia eletrônica (LCME) e laboratório multiusuário de estudos biológicos (LAMEB) a importância destes laboratórios deve ser reconhecida pela grande contribuição nos resultados gerados.
Aos meus queridos colegas do LMBV. Foram tantas pessoas maravilhosas que cruzaram meu caminho, grata por todo o conhecimento, risadas, aflições que dividimos diariamente (Fernanda Ramlov, Ana, Helô, Thaís, Bruno, Lucas, Rê Eva, Rê Afonso, Cláudia, Carol, Deise, Aline, Bruna, Thaíse, Rodolfo, Luísa, William, Débora, Dn. Márcia, Eliz, Manu, Susi, Roni, Simone, Bianca, Rúbia, Amanda, Igor) foi um prazer dividir meus dias com vocês. Um agradecimento especial à Letícia Mazzarino, por me apresentar ao encantador mundo da nanotecnologia do qual não pretendo mais sair. Lê, muito obrigada por tanto ensinamento você é outro grande exemplo de mulher, mãe e empreendedora que faz tudo parecer fácil com sua simpatia e dedicação. Te admiro muito.
À profª Cláudia Albuquerque e a técnica Elisia Barbosa, do laboratório de histotécnica da FURB pela contribuição na avaliação histológica da pele de camundongos infectados com Leishmania amazonensis.
À CAPES e CNPq, pela concessão de bolsas e apoio financeiro.
Ao programa de Biotecnologia e Biociências e todos os professores pela troca de conhecimento.
À Universidade Federal de Santa Catarina por ser minha segunda casa desde 2008, quando entrei na graduação em farmácia. Tenho muito orgulho de ter feito parte da história da UFSC.
Às minhas eternas amigas lageanas Aline, Bárbara, Camilla, Daniela e Francis. À minha família, minha mãe Vânia, minha irmã Maria Fernanda e meu pai Fernando por me darem apoio emocional e suporte financeiro ao longo do doutorado.
Ao meu namorado Rafael, por ter me acompanhado durante esta trajetória. Obrigada pelo carinho, atenção e apoio em todos os momentos.
Educar é ensinar os outros a viver; é iluminar caminhos alheios; é amparar debilitados, transformando-os em fortes; é mostrar as veredas, apontar as escaladas, possibilitando avançar, sem muletas e sem tropeços. (Antonieta de Barros)
RESUMO
A leishmaniose cutânea constitui um problema de saúde pública mundial. As terapias convencionais, além do alto custo, apresentam muitos efeitos adversos, e evidências clínicas de resistências dos parasitas. A utilização de chalconas sintéticas tem sido uma opção estratégica para o desenvolvimento de medicamentos com atividade leishmanicida. Nesse trabalho, buscou-se desenvolver um sistema nanoestruturado utilizando matrizes nanofibrosas de álcool polivinílico (PVA) associado às nanoesmulsões (NE) contendo chalcona. As nanoemulsões foram desenvolvidas pelo método de emulsificação espontânea seguida de evaporação de solvente e apresentou características físico-quimicas de tamanho (<200nm), índice de polidispersão (PDI<0,3) e potencial zeta (<-30mV) adequados para este tipo de dispersão coloidal. A eficiência de encapsulação e o teor de ativo ficaram próximos 100%. As NE contendo chalcona foram associadas ao PVA e processados por electrospinning para obtenção de matriz nanofibrosas. A permeação cutânea das formulações foi avaliada em modelo bicompartimental de célula de difusão do tipo Franz, utilizando pele de orelha suína como membrana. Os resultados mostraram que os tratamentos com as matrizes nanofibrosas as chalconas ficaram retidas em maior quantidade no estrato córneo enquanto que as nanoemulsões permearam para derme. Além disso, as NE foram avaliadas quanto a atividade citotóxica in vitro em queratinócitos HaCat, fibroblastos 3T3 e macrófagos THP-1. O percentual de inibição de crescimento parasitário foi avaliado em cepas de Leishmania amazonensis. Por fim a atividade leishmanicida foi avaliada in vivo em camundongos balb/c fêmeas infectados no dorso com L. amazonensis, o crescimento da lesão foi monitorado ao longo de 45 dias e a carga parasitária foi determinada por PCR quantitativo (qPCR). Os resultados mostraram que os tratamentos propostos neste trabalho não foram capazes de diminuir a carga parasitária em animais contaminados. No entanto o sinergismo da nanoemulsão contendo chalcona com o tratamento tópico referência se mostrou eficaz na diminuição do tamanho da lesão e redução da carga parasitária similar ao tratamento via oral de referência de uso veterinário. Nossos resultados mostraram que apesar de não desenvolver a ação leishmanicida proposta, um sistema nanoestruturado foi desenvolvido com sucesso e mais estudos precisam ser realizados para avaliar a associação do sistema aqui desenvolvido com outros tratamentos já aplicados na terapêutica.
Palavras-chave: Chalconas, matrizes nanofibrosas, nanoemulsões, emulsificação espontânea, electrospinning., leishmaniose cutânea, trans-chalcona, 3´-(trifluormetil)-chalcona, Leishmania amazonensis .
ABSTRACT
Cutaneous leishmaniasis is a worldwide public health problem. Conventional therapies, in addition to the high cost, have many adverse effects, and clinical evidence of parasite resistance. The use of synthetic chalcones has been a strategic option for the development of drugs with leishmanicidal activity. In this work, we sought to develop a nanostructured system using nanofibrous matrices of polyvinyl alcohol (PVA) associated with nanosmulsions (NE) containing chalcone. The nanoemulsions were developed by the spontaneous emulsification method followed by solvent evaporation and presented physico-chemical characteristics of size (<200nm), polydispersion index (PDI <0.3) and zeta potential (<-30mV) suitable for this type of colloidal dispersion. The encapsulation efficiency and the active content were close to 100%. The chalcone containing NE were associated with PVA and processed by electrospinning to obtain a nanofiber matrix. The skin permeation of the formulations was evaluated in a two-compartment diffusion cell model of the Franz type, using porcine ear skin as a membrane. The results showed that the treatments with the nanofibrous matrices, chalcones were retained in greater quantity in the stratum corneum while the nanoemulsions permeated the dermis. In addition, NEs were evaluated for cytotoxic activity in vitro on HaCat keratinocytes, 3T3 fibroblasts and THP-1 macrophages. The percentage of inhibition of parasitic growth was evaluated in Leishmania amazonensis strains. Finally, leishmanicidal activity was evaluated in vivo in female balb / c mice infected with L. amazonensis, lesion growth was monitored over 45 days and the parasitic load was determined by quantitative PCR (qPCR). The results showed that the treatments proposed in this work were not able to reduce the parasitic load in contaminated animals. However, the synergism of the nanoemulsion containing chalcone with the reference topical treatment proved to be effective in decreasing the size of the lesion and reducing the parasitic load similar to the oral reference treatment for veterinary use. Our results showed that although the proposed leishmanicidal action did not develop, a nanostructured system was successfully developed and further studies need to be carried out to evaluate the association of the system developed here with other treatments already applied in therapy.
Keywords: Chalcones, Nanofibers, Nanoemulsion, spontaneous emulsification, electrospinning, cutaneous leishmaniasis., trans-chalcone, 3´-(trifluormethyl)-chalcone, Leishmania amazonensis
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida da Leishmania sp ... 46 Figura 2. Ilustração esquemática da pele e anexos epidérmicos ... 5353 Figura 3. Aspecto e histologia da lesão causada por leishmaniose cutânea ... 55 Figura 4. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de substâncias através do estrato córneo ... 56 Figura 5. Esquema ilustrativo do aparato de electrospinning ... 59 Figura 6: Esquema ilustrativo da matriz de PVA associada às nanoemulsões contendo chalcona
para o tratamento tópico de leishmaniose
cutânea...62 Figura 7. Esquema ilustrativo do ensaio colorimétrico para triagem de compostos leishmanicidas ... 66 Figura 8. Percentual de inibição de crescimento de amastigotas de Leishmania amazonensis pelo método colorimétrico ... 70 Figura 9. Curva de toxicidade em amastigota de L. amazonensis para 3´-(trifluormetil)-chalcona e trans-chalcona ... 7273 Figura 10. Aspecto visual das nanoemulsões desenvolvidas ... 82 Figura 11. Distribuição do tamanho de partículas nos sistemas nanoestruturados em estudo . 83 Figura 12.Detalhe do precipitado de 3`-(trifluormetil)-chalcona e trans-chalcona na nanoemulsão em estudo ... 86 Figura 13.Micrografia eletrônica de transmissão das nanoemulsões de trans-chalcona e 3´-(trifluormetil)-chalcona ... 88 Figura 14. Ensaio de estabilidade da nanoemulsão de trans-chalcona armazenada em temperatura ambiente e em geladeira ... 90 Figura 15. Ensaio de estabilidade da nanoemulsão de 3´-(trifluormetil)-chalcona armazenada em temperatura ambiente e em geladeira ... 91 Figura 16. Estabilidade das nanoemulsões de trans-chalcona e 3´-(trifluormetil)-chalcona quanto ao teor de princípio ativo ... 9192 Figura 17. Caracterização das matrizes nanofibrosas de álcool polivinílico (PVA) nas concentrações de 10, 12 e 15% (m/v) ... 100 Figura 18. Perfil cromatográfico obtido por CLAE das nanoemulsões contendo trans-chalcona e 3´-(trifluormetil)-chalcona associadas as matrizes de PVA ... 104
Figura 19. Gráfico da distribuição de tamanho de partícula após a associação do polímero PVA na nanoemulsão de trans-chalcona ... 105 Figura 20. Micrografias obtidas por análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) das nanomatrizes desenvolvidas ... 106 Figura 21. Ensaio de hidratação das matrizes nanofibrosas contendo nanoemulsão de trans-chalcona e 3´-(trifluormetil)-trans-chalcona ... 107 Figura 22. Micrografia obtidas por análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV) das nanomatrizes contendo trans-chalcona e 3´-(trifluormetil)-chalcona submetidas ao ensaio de hidratação in vitro ... 108 Figura 23. Toxicidade indireta das matrizes nanofibrosas de PVA em fibroblasto 3T3 ... 110 Figura 24. Efeito da trans-chalcona na forma livre e nanoencapsulada na toxicidade de Fibroblasto 3T3 e Queratinócito HaCat... 119 Figura 25. Efeito da 3´-(trifluormetil)-chalcona na forma livre e nanoencapsulada na toxicidade de Fibroblasto 3T3 e Queratinócito HaCat ... 121 Figura 26. Percentual de solubilidade em soluções supersaturadas das chalconas ... 124 Figura 27. Curva de Calibração de trans-chalcona em solução extratora (metanol) ... 126 Figura 28. Curva de calibração de 3´-(trifluormetil)-chalcona em solução extratora (metanol) ... 126 Figura 29. Curva de calibração de trans-chalcona em solução aceptora (tampão: etanol) ... 127 Figura 30. Curva de calibração de 3´-(trifluormetil)-chalcona em solução aceptora (tampão: etanol) ... 127 Figura 31. Perfil de permeação das formulações através da pele de orelha suína ... 129 Figura 32. Esquema ilustrativo dos grupos experimentais do ensaio in vivo...137 Figura 33. Evolução da lesão de leishmaniose cutânea no dorso de camundongos BALB/c fêmea ... 142 Figura 34. Fotografias da evolução das lesões do grupo tratado com Milteforam. ... 143 Figura 35. Fotografias da evolução da lesão de leishmaniose cutânea nos animais do grupo tratado com matriz de PVA associado à nanoemulsão contendo trans-chalcona (MNTCh) . 144 Figura 36. Fotografias da evolução das lesões do grupo tratado com matriz de PVA associada a nanoemulsão contendo 3´-(trifluormetil)-chalcona (MN3TFCh) ... 145 Figura 37.Fotografias da evolução da lesão de leishmaniose cutânea nos animais do grupo tratado com matriz branca (MNBr) ... 146 Figura 38. Fotografias da evolução da lesão de leishmaniose cutânea nos animais do grupo tratado com sulfato de paramomicina ... 147
Figura 39. Fotografias da evolução da lesão de leishmaniose cutânea nos animais do grupo tratado com associação de sulfato de paramomicina + MN3TFCh148Figura 40. Fotografias da evolução da lesão de leishmaniose cutânea nos animais do grupo tratado com sulfato de paramomicina+ MNTCh... 149 Figura 41. Fotografias da evolução da lesão de leishmaniose cutânea nos animais do grupo sem tratamento ... 150 Figura 42. Gráfico representativo de % de cicatrização das lesões cutâneas de leishmaniose em camundongos BALB/c fêmea ... 151 Figura 43. Quantificação da carga parasitária pelo método de qPCR ... 152 Figura 44.Fotomicrofia de lâminas histológicas de lesão de leishmaniose cutânea em camundongos BALB/c coradas com hematoxilina e eosina ... 153 Figura 45. Score de infiltrado inflamatório obtidos pela análise das lâminas histológicas .... 154 Figura 46. Score de infiltrado inflamatório obtidos pela análise das lâminas histológicas .... 154 Figura 47. Score de proliferação de fibroblastos obtidos pela análise das lâminas histológicas ... 157 Figura 48. Score de produção de colágeno obtidos pela análise das lâminas histológicas .... 157 Figura 49. Fotomicrografia de lâmina histológica de camundongo com lesão inicial de leishmaniose cutânea ... 158 Figura 50. Score de proliferação vascular pela análise de lâminas histológicas ... 158
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Quadro 1 – Padrões histopatológicos utilizados na clínica humana para estadiamento das lesões de leishmaniose cutânea ... 155
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1. Cálculo da viabilidade celular (%)... 68
Equação 2. Cálculo da eficiência de encapsulação (%) ... 790
Equação 3. Solubilidade das matrizes nanofibrosas de PVA associadas as nanoemulsões contendo chalcona ... 97
Equação 4. Cálculo do coeficiente de permeabilidade (Kp) ... 115
Equação 5. Cálculo do limite de Detecção (LD) ... 116
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estrutura química e potencial leishmanicida de chalconas naturais ... 501 Tabela 2. Detalhes da estrutura química e do peso molecular das chalconas selecionadas para estudo de atividade leishmanicida no presente trabalho. ... 69 Tabela 3. Perfil de toxicidade celular (CI50) das chalconas de escolha à atividade leishmanicida ... 72 Tabela 4. Composição das nanoemulsões (% m/v) ... 78 Tabela 5.Caracterização físico-química das nanoemulsões em estudo ... 8384 Tabela 6. Características físico-químicas das nanoemulsões contendo trans-chalcona nas concentrações de 0,1 e 1% (m/v) ... 85 Tabela 7. Parâmetros físico-químico das nanoemulsões contendo trans-chalcona e 3´-(trifluormetil)- chalcona ... 87 Tabela 8. Caracterização química das matrizes de PVA quanto ao teor de trans-chalcona recuperado ... 104 Tabela 9. Proporções de solventes utilizados para teste de solubilidade para ensaio de permeação cutânea (% v/v)... 113 Tabela 10. Atividade leishmanicida das nanoemulsões contendo chalcona ... 12123 Tabela 11. Permeação das formulações contendo trans-chalcona e 3´-(trifluormetil)-chalcona em pele de orelha suína ... 12930 Tabela 12. Grupos experimentais por n amostral...135
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3T3- Linhagem de fibroblasto 3T3, clone a31; AnfoB- Anfotericina B;
CC50- Citotoxicidade celular capaz de matar 50%; CLAE- cromatografia líquida de alta eficiência; CPRG- clorofenol vermelho β-D-galatopiranosídeo; DAD- Detector de arranjo Diodo;
DAF- Departamento de Assistência Farmacêutica; DMC- 2,6-dihidroxi-4-metoxi-chalcona;
DMEM- Meio de cultura modificado Dubeccos; DMSO- Dimetilsulfóxido;
EE- Eficiência de encapsulação;
FURB- Universidade Regional de Blumenau G6PDH- gene de glicose-6-fosfato desidrogenase; HaCat- Queratinócito imortalizado humano; HE- hematoxilina e eosina;
IC50- Concentração inibitória de 50%; IHLP- Infiltrado Histiolinfoplasmocitário; IS- Índice de seletividade;
JSS- Fluxo de permeação Kp- Coeficiente de permeação LC-leishmaniose cutânea; LD- Limite de detecção LMC-Leishmaniose mucocutânea; LQ- Limite de quantificação LT- Leishmaniose tegumentar; LV- Leishmaniose Visceral;
MET- Microscopia eletrônica de transmissão; MEV- microscopia eletrônica de varredura; mf- massa seca final em (g)
mi- Massa seca inicial da amostra (g)
MNBr- Matriz branca
MNTCh- Matriz associada a nanoemulsão contendo trans-chalcona MTT- 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil bromo tetrazólio; NE-nanoemulsão;
OMS- Organização Mundial da Saúde; PBS- Tampão fosfato salina;
PDI- Índice de polidispersão; PEG- Polietilenoglicol
PEPTS/Fiocruz- Programa de evidências em políticas e tecnologias de saúde; PLA- Ácido Poli-láctico
PLGA- Poli-lático-coácido glicólico; PLLA- ácido poli-L-lático;
PMA- Forbol-12-miristato-13-acetato PTC- Parecer técnico científico; PVA- Álcool polivinílico; PZ- Potencial Zeta;
qPCR- Reação em cadeia da polimerase quantitativo; QSP- Quantidade suficiente para;
RPMI- Roswell Park Memorial Institute Sol.- Solubilidade em água
SUS- Sistema único de saúde TCM- triglicerídeo de cadeia média;
THP-1- Linhagem de monócitos de leucemia monocítica aguda; UHPLC- Ultra high performace liquid chromatography;
LISTA DE SÍMBOLOS ® - marca registrada ~ - aproximadamente % - percentual / porcentagem ≤- menor ou igual ≥ - maior ou igual < - menor > - maior
ϭ - desvio padrão (DP) do intercepto da curva com o eixo Y da linha de regressão
SUMÁRIO
Diagrama Conceitual do trabalho ... 39
1 INTRODUÇÃO ... 40
2 OBJETIVOS ... 43
2.1 Objetivo Geral ... 43
2.1.1 Objetivos Específicos ... 43
3 Capítulo 1 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 45
3.1 LEISHMANIOSE: DOENÇA NEGLIGENCIADA ... 45
3.1.1 Leishmaniose Visceral (LV) ... 46
3.1.2 Leishmaniose Mucocutânea (LMC)... 47
3.1.3 Leishmaniose Cutânea (LC) ... 47
3.2 FÁRMACOS PARA O TRATAMENTO DAS LEISHMANIOSES ... 48
3.2.1 Chalconas ... 50
3.3 LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS POR VIA TÓPICA ... 52
3.3.1 A pele ... 53
3.3.1.1 Epiderme ... 53
3.3.1.2 Derme ... 54
3.3.1.3 Hipoderme ... 54
3.3.1.4 Características de uma pele com LC ... 54
3.4 Liberação de fármacos na pele ... 55
3.4.1 Estratégias para melhorar a passagem de fármacos através da pele ... 57
3.4.2 Estratégias nanotecnológicas para tratamento de leishmaniose cutânea... 58
3.4.2.1 Nanomatrizes produzidas pela técnica de electrospinning ... 58
3.4.2.2 Nanoemulsões ... 60
4 Capítulo 2 - Determinação da atividade leishmanicida e toxicidade celular em linhagem macrofágica das chalconas sintéticas. ... 63
4.1 Material e métodos ... 64
4.1.2 Métodos ... 64
4.1.2.1 Seleção das chalconas de interesse ... 64
4.1.2.2 Triagem das chalconas... 64
4.1.2.3 Ensaio de citotoxicidade ... 66
4.1.2.3.1 Células THP-1 ... 67
4.1.2.3.2 Células 3T3 e HaCat ... 67
4.2 Resultados e Discussão ... 68
4.2.1 Estratégias de escolha de derivados sintéticos de chalconas ... 68
4.2.2 Triagem da atividade leishmanicida das chalconas selecionadas ... 70
5 Capítulo 3 – Nanoemulsões contendo chalconas ... 74
5.1 Material e Métodos ... 75
5.1.1 Material ... 75
5.1.2 Métodos ... 75
5.1.2.1 Desenvolvimento das nanoemulsões ... 75
5.1.2.2 Caracterização físico-química das nanoemulsões ... 78
5.1.2.3 Quantificação de chalconas nas nanoemulsões ... 78
5.1.2.4 Determinação da eficiência de encapsulação (EE) e teor das chalconas nas nanoemulsões... 78
5.1.2.5 Avaliação da morfologia das nanoemulsões ... 79
5.1.2.6 Estudo de estabilidade das nanoemulsões ... 79
5.2 Resultados e Discussão ... 80
5.2.1 Estudo da formulação ... 80
5.2.2 Avaliação da morfologia das nanoemulsões ... 86
5.2.3 Estudo da estabilidade das nanoemulsões contendo chalconas... 87
6 Capítulo 4 - Desenvolvimento de matrizes nanométricas a base de PVA contendo nanoemulsões de chalcona ... 93
6.1 Material e Métodos ... 93
6.1.2 Métodos ... 93
6.1.2.1 Desenvolvimento e otimização das matrizes de PVA ... 93 6.1.2.2 Otimização das configurações do aparato de electrospinning... 94 6.1.2.3 Caracterização das nanomatrizes de PVA ... 94 6.1.2.3.1 Análise subjetiva ... 94 6.1.2.3.2 Análise microscópica ... 94 6.1.2.3.3 Desenvolvimento das matrizes nanofibrosos de PVA associadas às nanoemulsões contendo chalcona ... 95 6.1.2.3.4 Ensaio de solubilidade das matrizes ... 95 6.1.2.3.5 Citotoxicidade indireta das nanomatrizes ... 96 6.2 Resultados e Discussão ... 96
6.2.1 Desenvolvimento e otimização de nanomatrizes de PVA ... 96
6.2.1.1 Associação das nanoemulsões contendo chalcona à matriz de PVA ... 100 6.2.1.2 Teste de degradação in vitro das matrizes poliméricas ... 105
7 Capítulo 5 – Avaliação da toxicidade, potencial leishmanicida e
permeação/retenção cutânea das formulações desenvolvidas utilizando métodos
alternativos ao uso de animais. ... 111
7.1 Material e Métodos ... 112
7.1.1 Material ... 112 7.1.2 Métodos ... 112
7.1.2.1 Avaliação da toxicidade celular ... 112 7.1.2.2 Estudo de permeação e retenção cutânea das chalconas in vitro ... 113 7.1.2.2.1 Avaliação da solubilidade e estabilidade das chalconas na solução
aceptora 113
7.1.2.2.2 Estudo de permeação cutânea das chalconas utilizando célula de difusão do tipo Franz ... 114 7.1.2.2.3 Preparação das membranas para difusão ... 114 7.1.2.2.4 Cinética de permeação ... 114
7.1.2.2.5 Estudos da retenção cutânea das chalconas ... 115 7.1.2.2.6 Linearidade ... 116 7.1.2.2.7 Limites de detecção e de quantificação ... 116 7.2 Resultados e Discussão ... 117
7.2.1 Determinação da toxicidade celular em fibroblastos 3T3 e queratinócitos HaCat 117
7.2.2 O potencial leishmanicida das formas nanoemulsionadas de trans-chalcona e 3’- (trifluormetil)-chalcona ... 121 7.2.3 Estudo da permeação e retenção cutânea das chalconas utilizando célula de difusão do tipo Franz ... 123 8 Capítulo 6 - Atividade leishmanicida in vivo de nanomatrizes associadas às nanoemulsões contendo chalconas ... 132
8.1 Material e Métodos ... 132
8.1.1 Material ... 132 8.1.2 Método ... 132
8.1.2.1 Animais e aprovação no comitê de ética ... 132 8.1.2.2 Modelo de lesão na base da cauda ... 133 8.1.2.3 Grupos experimentais ... 133 8.1.2.4 Mensuração das lesões no dorso dos animais ... 136 8.1.2.5 Biópsia das lesões ... 137 8.1.2.6 Imprinting em lâminas ... 137 8.1.2.7 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) ... 137 8.1.2.8 Avaliação histológica ... 138 8.2 Resultados e Discussão ... 140
8.2.1 Monitoramento do tamanho da lesão de camundongos infectados ... 140 8.2.2 Quantificação da carga parasitária por qPCR ... 150 8.2.3 Análise histopatológica das lesões de leishmaniose cutânea ... 151 9 Discussão Geral... 159
10 Conclusões Gerais... 164 11 REFERÊNCIAS ... 167 12 Apêndice ... 181
12.1 Produção científica ... 181
12.1.1 Capítulos de livro... 181 12.1.2 Artigos completos publicados em periódicos ... 182
Diagrama Conceitual do trabalho
Desenvolvimento de um sistema nanoestruturado contendo chalcona para o tratamento tópico de leishmaniose cutânea
Por quê?
• Os tratamentos convencionais são de alto custo pois necessitam de internação e monitoramento por exames laboratoriais;
• Efeitos colaterais diminuem adesão do paciente ao tratamento;
• Já tem sido descrito na literatura casos clínicos de resistência do parasita ao tratamento.
O que está sendo feito:
• Alguns grupos de pesquisa têm intensificado as buscas de novos princípios ativos eficientes contra as formas parasitárias da leishmaniose;
• As chalconas são compostos com potencial atividade leishmanicida;
• Poucos são os trabalhos que mostram o desenvolvimento de formulações tópicas eficientes para tratamento de leishmaniose.
Hipótese da pesquisa:
Uma associação de nanoemulsões contendo chalconas com nanomatrizes, de álcool polivinílico (PVA), vai facilitar a permeação da chalcona pelas camadas da pele, levando a uma maior eficiência do tratamento tópico da leishmaniose cutânea.
Método científico:
• Seleção de chalconas sintéticas com atividade leishmanicida comprovada por ensaios in vitro com cepas de L. amazonensis;
• Desenvolvimento de nanoemulsões contendo chalcona;
• Associação das nanoemulsões contendo chalcona em nanofibras poliméricas de álcool polivinílico (PVA);
• Avaliação do potencial leishmanicida in vivo.
Respostas:
• Identificação de chalconas com potencial leishmanicida;
• Desenvolvimento de um sistema nanoestrutura baseado na associação das nanofibras de PVA com as nanomeulsões contendo chalcona;
• Validação de métodos que comprovem a atividade terapêutica;
1 INTRODUÇÃO
O termo leishmaniose inclui um grande espectro de doenças causada por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania que são transmitidos pela picada do inseto vetor, os flebótomos dos gêneros Lutzomya e Phlebotomus (BRASIL, 2017). Os parasitas são inoculados na pele dos mamíferos vertebrados no momento do repasto sanguíneo do inseto e as formas promastigotas do parasita são capturadas por células do sistema fagocitário mononuclear (SFM). Dentro dos macrófagos, as formas promastigotas de diferenciam em amastigotas e se proliferam estabelecendo a infecção (KEVRIC; CAPPEL; KEELING, 2015). As leishmanioses englobam as formas visceral e cutânea. A leishmaniose visceral (LV) é fatal se não tratada e é a forma mais severa da doença na qual os parasitas migram para órgãos vitais. A leishmaniose tegumentar ou cutânea (LC) é uma das dermatoses com maior significância em saúde pública, pois é endêmica em 88 países, no entanto, recebe menos atenção de políticas de saúde pública por não ser diretamente fatal (SCOTT; NOVAIS, 2016).
Em geral, o tratamento para ambas as formas de leishmaniose supracitadas consiste basicamente em administrações parenterais ou intralesionais com os antimoniais pentavalentes. No entanto, o uso sistêmico desta classe de medicamentos é associada a considerável toxicidade e por este motivo os pacientes devem ser monitorados ao longo da terapia, necessitando de internação (ALMEIDA, OLGA; LAURA ; SANTOS, 2011). Além disso, tem sido reportado na literatura casos de resistência do parasita a este medicamento, que perdura como tratamento de primeira linha há mais de 60 anos (HANDLER et al., 2018). O antifúngico Anfotericina B e outros antibióticos como a pentamidina e o sulfato de paromomicina têm sido utilizados como terapias alternativas nos casos de intolerância ou resistência à terapia de primeira escolha. No entanto, estes fármacos têm seu uso limitado pela alta toxicidade (hepatotoxicidade, cardiotoxicidade) e eficácia variável entre os estudos clínicos realizados (ARANA et al., 2001; ROSSI-BERGMANN et al., 2011; TRINCONI et al., 2016). É importante considerar que a maior parte dos casos ocorre em áreas de difícil acesso, em meio a florestas ou áreas rurais, o que dificulta tanto a aplicação parenteral dos fármacos como o monitoramento de seus efeitos colaterais. Nesse sentido, a incorporação de tecnologias mais seguras e acessíveis que facilitem o acesso ao tratamento dos pacientes com LC devem ser priorizadas.
Nesse contexto, as chalconas, moléculas bioprecursoras dos flavonoides em plantas, tem sido investigada para o tratamento leishmanicida. Os efeitos biológicos/farmacológicos das chalconas incluem propriedades antimicrobiana, fungicida, antiviral e antioxidante, bem como leishmanicida em diferentes espécies daquele parasita em modelos in vitro e in vivo (TAJUDDEEN et al., 2018). Apesar do potencial efeito contra o parasita, uma via de administração menos invasiva para tratamento das lesões ainda é um desafio. A pele tem como uma de suas principais funções evitar a perda de água e proteger contra agentes externos danosos, dificultando a penetração de alguns ativos com potencial atividade terapêutica (KOLARSICK, PAUL, KOLARSICK, 2011). Neste sentido, inúmeras substâncias ativas, quando veiculadas em formas farmacêuticas convencionais, apresentam dificuldade de permear até camadas mais profundas da pele, como, por exemplo, a derme, local onde o parasita se encontra. Além disto, quando permeiam, somente quantidades subterapêuticas são detectadas. Diversas estratégias têm sido empregadas para contornar as limitações impostas pela baixa absorção e permeação percutânea de fármacos (SCHÄFER-KORTING; MEHNERT; KORTING, 2007).Sistemas coloidais lipídicos como nanoemulsões, por exemplo, parecem ser uma boa alternativa para carrear as chalconas para dentro da derme. Este tipo de dispersão coloidal tem despertado grande interesse à área farmacotécnica, principalmente devido à versatilidade de compostos que podem ser associados a este sistema e as vantagens de solubilizar fármacos apolares em sistemas aquosos utilizando química verde, ou seja, sem a utilização de solventes orgânicos. Isso inclui um maior grau de segurança, biocompatibilidade, biodegradabilidade e estabilidade do(s) composto(s) ativo(s), podendo ainda ser adaptada a uma ampla gama de formulações, de acordo com a via de administração ou doença (MASON et al., 2006).
O papel da nanotecnologia na melhoria da atual terapêutica tópica é discutido levando em consideração os benefícios da liberação controlada, melhorando a permeação do composto na pele. Diante disso, é proposto neste trabalho associar as nanoemulsões de chalconas em nanomatrizes poliméricas de álcool polivinílico (PVA). Este material já possui biocompatibilidade e biodisponibilidade bem descritos na literatura. Sua similaridade estrutural com a matriz extracelular faz com que atue como suporte ao crescimento celular, auxiliando nos processos de cicatrização tecidual das lesões ulcerativas e desfigurantes, protegendo
inclusive de outras infecções e criando uma barreira entre a pele e o ambiente externo (TORRES-SANTOS ET AL, 1999, ANDRIGHETTI-FROHNER ET AL, 2009; TAJUDDEEN ET AL, 2018).
Assim, a hipótese deste trabalho considera que nanomatrizes baseadas em álcool polivinílico, associadas a nanoemulsões contendo chalconas, são uma alternativa eficaz ao tratamento tópico de lesões ulcerativas características da leishmaniose cutânea.
Esta tese está organizada em 6 capítulos. O primeiro capítulo apresenta uma revisão bibliográfica sobre os principais temas abordados na tese, enquanto o capítulo 2 expõe os critérios utilizados à seleção das chalconas investigadas. O capítulo 3 descreve o desenvolvimento e caracterização físico-química das nanoemulsões contendo chalconas, bem como a estabilidade das formulações. O capítulo 4 descreve o desenvolvimento de uma nanomatriz de PVA associada à nanoemulsão de chalconas e os perfis de degradação e liberação destas neste sistema. O capítulo 5 descreve os resultados experimentais obtidos nos ensaios biológicos in vitro de toxicidade celular e de permeação cutânea e, por fim, o capítulo 6 abrange os resultados do experimento in vivo.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver nanoemulsões contendo chalcona e associá-las à matrizes poliméricas nanofibrosas e biodegradáveis de PVA visando liberação tópica de chalconas para o tratamento de leishmaniose cutânea.
2.1.1 Objetivos Específicos
⎯ Selecionar chalconas sintéticas com potencial atividade leishmanicida para o estudo, a partir da literatura;
⎯ Avaliar, a citotoxicidade e seletividade das chalconas de escolha em L. amazonensis e macrófagos THP-1, utilizando modelos experimentais in vitro;
⎯ Desenvolver nanoemulsões contendo as chalconas, e caracterizar as formulações quanto ao tamanho de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, morfologia, teor de ativo e eficiência de encapsulação;
⎯ Avaliar e comparar, in vitro, a citotoxicidade das formulações contendo chalconas em cultura de fibroblasto 3T3 e queratinócitos HaCat;
⎯ Desenvolver matrizes poliméricas nanofibrosas de álcool polivinílico contendo nanoemulsões de chalcona;
⎯ Caracterizar as matrizes associadas à nanoemulsão contendo chalconas, quanto à espessura das fibras e presença de beads por microscopia eletrônica de varredura e determinar o teor de chalcona nas matrizes por cromatografia líquida de alta eficiência;
⎯ Determinar os perfis de hidratação/degradação das matrizes nanofibrosas e de liberação dos compostos ativos em sistema Dubinhoff, mimetizando as condições fisiológicas;
⎯ Avaliar e comparar a permeação e retenção das chalconas a partir das suspensões de nanoemulsão em modelo bicompartimental de célula de difusão tipo Franz, usando orelha de suína como membrana;
⎯ Avaliar, in vivo, o potencial das matrizes nanofibrosas associadas às nanoemulsões contendo chalcona no tratamento de leishmaniose cutânea, utilizando modelo de infecção na base da cauda em camundongo BALB/c.
3 Capítulo 1 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 LEISHMANIOSE: DOENÇA NEGLIGENCIADA
A leishmaniose é uma doença endêmica em países de clima tropical, sendo considerada a segunda doença parasitária mais prevalente no mundo, apenas atrás da malária (KUMAR & ENGWERDA 2014). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 350 milhões de pessoas estejam expostas ao risco de adquirir a doença, com registro aproximado de dois milhões de novos casos das diferentes formas clínicas por ano, causando entre vinte e quarenta mil mortes/ano (WORD HEALTH ORGANIZATION (WHO), 2018). Apesar dos números alarmantes, poucos são os investimentos para desenvolver tratamentos mais eficazes, além disso, os maiores índices de casos estão localizados em países em desenvolvimento, sendo, portanto, classificada como uma doença negligenciada (GHORBANI MASOUD; FARHOUDI RAMIN, 2018; SUNDAR; CHAKRAVARTY; MEENA, 2018).
A leishmaniose é transmitida por um flebótomo, popularmente conhecido como mosquito-palha (gêneros Lutzomya e Phlebotomus). A Leishmania ssp. são protozoários pertencente à família Trypanossomatidae, parasita intracelular obrigatório, com ciclo de vida heteróxeno, que se inicia quando a fêmea do flebótomo pica o vertebrado durante o repasto sanguíneo. Assim, juntamente com o sangue, o vetor ingere os macrófagos infectados com a forma amastigota do parasita. No trato digestório do inseto, as formas amastigotas se transformam em promastigotas flagelados móveis que proliferam no tubo digestivo do inseto, posteriormente evoluindo à forma altamente infectante de promastigotas metacíclicos que se acumulam na porção hipofaringe do inseto. Estes, durante o próximo repasto sanguíneo do inseto, são regurgitados na derme do hospedeiro (IQBAL et al., 2016; KEVRIC; CAPPEL; KEELING, 2015). No hospedeiro, os parasitas inoculados são reconhecidos pelo sistema fagocitário mononuclear e, em seguida são fagocitados por macrófagos, onde são internalizados no vacúolo parasitóforo, que logo se liga aos lisossomos, dando origem ao vacúolo fagolisossomal, onde o parasito permanece em um ambiente hostil, contendo enzimas lisossomais e espécies reativas de oxigênio. No entanto, devido a diversos mecanismos de evasão à resposta imune do hospedeiro, o parasita se adapta ao ambiente celular onde se
multiplica por divisão binária, causando ruptura da célula infectada e liberação de formas amastigotas que são fagocitadas por outros macrófagos (Figura 1) (SCOTT & NOVAIS 2016).
Figura 1. Ciclo de vida da Leishmania sp
Fonte: Adaptado de Kaye & Scott, 2011.
A variedade de espécies do parasita associada às diferentes respostas imunológicas do hospedeiro constitui o principal fator envolvido nas distintas formas clínicas da doença que podem ser classificadas como visceral (LV), cutânea (LC) e mucocutânea (LMC) (PIÑERO ET AL.,2006; GUPTA ET AL., 2014).
A LC é dividida em 3 principais fenótipos clínicos: leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose cutânea difusa (LCD) e a mucocutânea (LM). Uma quarta forma acontece como sequela da LV conhecido como leishmaniose cutânea pós-kalazar (LCPK)(ARONSON; JOYA, 2019).
3.1.1 Leishmaniose Visceral (LV)
A LV também conhecida como Kalazar, é a forma mais grave das leishmanioses. Quando não tratada, pode levar ao óbito em aproximadamente 95% dos casos. Os principais sintomas são: febre, perda de peso e o característico aumento de volume do baço e fígado. A
maioria dos casos, cerca de 90%, estão concentrados no Brasil e outros países da América do Sul, além do leste da Ásia (WHO,2018).
3.1.2 Leishmaniose Mucocutânea (LMC)
Forma responsável por causar lesões desfigurantes, destruindo a membrana da mucosa oral e nasal. A LMC ocorre em percentual que varia de 3 a 5% dos casos de infecção por Leishmania (Vianna) braziliensis, sendo esta, a forma mais grave da Leishmaniose Tegumentar Americana, podendo deixar graves sequelas. Geralmente, inicia-se meses ou anos após a involução das lesões de pele, podendo gerar complicações como rinite, sinusite, meningite e broncopneumonia, sendo esta última a principal responsável pelo óbito. Mais de 90% dos casos de LMC ocorrem no Brasil, Bolívia, Etiópia e Peru (BRASIL, 2017).
3.1.3 Leishmaniose Cutânea (LC)
A LC é a forma mais prevalente das leishmanioses (ROSSI; FASEL, 2018). Apresenta como sintomas clínicos pápulas eritematosas, únicas ou múltiplas, localizadas na região exposta do tegumento, que evoluem para úlceras com bordas elevadas, contornos regulares e com granulações grosseiras, recobertas - ou não - por exsudato sero-purulento. No Brasil, a LC tem sido documentada em todas as regiões, sendo mais comum nas regiões Norte e Nordeste, devido ao avanço das zonas rurais e urbanas sobre as matas nativas, principalmente devido ao desmatamento, mudanças climáticas e à migração de famílias para zonas urbanas constituindo, portanto, uma das afecções dermatológicas que merece grande atenção dos profissionais de saúde, devido a sua magnitude, ao risco de ocorrência de deformidades, à tendência de crescente avanço às áreas urbanas, aos danos psicológicos causados ao doente e aos reflexos gerados no campo social e econômico (ALMEIDA & SANTOS, 2011).
Embora eficazes, as terapias leishmanicidas empregadas atualmente são desconfortáveis ao paciente, envolvendo injeções diárias por períodos de tempo prolongado, necessitando hospitalização e, consequentemente, aumentando os custos do tratamento. Assim, os fatores descritos acima colaboram para a descontinuidade do tratamento, podendo aumentar o risco de resistência do parasita (ALMEIDA & SANTOS, 2011; DE MELLO ET AL., 2015).
3.2 FÁRMACOS PARA O TRATAMENTO DAS LEISHMANIOSES
As alternativas terapêuticas contra a leishmaniose ainda são muito restritas. Os antimoniais pentavalentes permanecem como os tratamentos de primeira escolha há mais de 50 anos (KEVRIC ET AL., 2015). Comercialmente, estão disponíveis as seguintes formulações: o antimoniato de N-metilglucamina (Glucantime®, Aventis, França) e o estibogluconato de sódio (Pentostam®, GSK, Reino Unido). Apesar destes medicamentos provocarem uma regressão rápida das manifestações clínicas e hematológicas da doença, as baixas dosagens e a descontinuidade dos tratamentos têm levado a falhas na terapia e, consequentemente, à resistência do parasita ao tratamento (ALMEIDA & SANTOS, 2011). Os mecanismos de ação dos antimoniais ainda são praticamente desconhecidos. Sabe-se que essas substâncias são absorvidas pelos macrófagos, onde se transformam na forma ativa da molécula interferindo diretamente nos processos energéticos do parasita e, como consequência, causam uma diminuição da carga parasitária (SAMPAIO, LUCAS, TAKAMI, 2007). O tratamento com esses medicamentos pode ser administrado pelas vias intramuscular ou endovenosa contra a forma visceral e também intralesional para a forma cutânea da doença (ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2009).
A anfotericina B (AnfoB), fármaco de segunda escolha, é utilizada quando os pacientes não são responsivos aos antimoniais. Seu mecanismo de ação se dá pela ligação com esteróis da membrana celular do parasito, promovendo a morte celular. Contudo, é um composto que apresenta alta toxicidade, com efeitos adversos severos como cardiotoxicidade, hepatotoxicidade. Formulações lipídicas (lipossomas, dispersão coloidal e complexo lipídico) contendo Anfotericina B são atualmente utilizadas no tratamento da leishmaniose. O encapsulamento do composto em sistemas colidais diminuiu sua toxicidade e os efeitos colaterais mais frequentes, i.e., a urticária e insuficiência renal. No entanto, é um medicamento de alto custo que requer, muitas vezes, a hospitalização dos pacientes para sua administração, gerando uma menor adesão ao tratamento (BELLO et al., 2011; KEVRIC; CAPPEL; KEELING, 2015; RIBEIRO et al., 2014).
Para aumentar a adesão ao tratamento pelos pacientes, outros fármacos têm sido empregados por diferentes vias de administração, a exemplo do Milteforam ®, um agente quimioterápico. O Milteforam ® foi inicialmente desenvolvido como um fármaco
anticancerígeno, sendo o primeiro medicamento oral efetivo contra a LV, constituindo um grande avanço na quimioterapia à doença (SUNDAR & Chakravarty, 2015). Seu principal mecanismo de ação decorrente da modulação dos receptores de superfície celular, do metabolismo do inositol, da ativação das fosfolipases e das proteínas quinases C, além das vias mitogênicas, resultando em apoptose (VERMA; DEY, 2004). Os principais efeitos colaterais do Milteforam ® incluem distúrbios gastrointestinais (transitórios ou reversíveis), no entanto, a teratogenicidade é um problema em potencial (KEVRIC; CAPPEL; KEELING, 2015). Em 2015, o programa de evidências em políticas e tecnologias de saúde (PEPTS/Fiocruz) elaborou um parecer técnico científico (PTC) com o objetivo de revisar as evidências para a eficácia e segurança do Milteforam ® em monoterapia, ou em associação medicamentosa para tratamento de LT (RAMOS, et al.,2015). O objetivo foi acelerar o processo para que o medicamento fosse inserido no plano de demandas de 2019 do Departamento de Assistência Farmacêutica (DAF/MS). A estimativa era que o medicamento estivesse disponível a partir de março/2019, a depender da data de incorporação no SUS (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018). No entanto os pacientes necessitam de um mandato judicial para ter acesso a este tratamento.
Outra alternativa terapêutica considera a utilização tópica de sulfato de paramomicina, um fármaco utilizado no tratamento de parasitas entéricos, tendo sua atividade leishmanicida sido avaliada em ensaios clínicos, principalmente no Oriente Médio e que no Brasil ainda não é reconhecido pelas agências fiscalizadoras como alternativa ao tratamento de LC (NASSIF et al., 2017). Entretanto, a resposta de cura das lesões variou de 17% a 86%. Os efeitos adversos mais comuns associados a este medicamento foram irritação no local da aplicação e prurido, ou seja, sintomas leves que não levaram à descontinuação do tratamento (ARANA et al., 2001; MATTOS et al., 2015). Porém, a eficácia contra as variadas espécies de parasita ainda permanece por ser investigada (NASSIF ET AL. 2017).
Este cenário demonstra a urgência pela busca de tratamento alternativos, de fácil administração, com menor toxicidade e maior eficácia no combate da doença. Vários grupos de pesquisa têm intensificado as buscas de novos princípios ativos com ação leishmanicida, sendo as chalconas uma das classes de compostos de interesse.
3.2.1 Chalconas
As chalconas (benzilideno acetofenona, ou 1,3-diaril-2propen-1-ona) são metabólitos secundários vegetais, precursores de flavonoides e isoflavonóides (SAKAGAMI, et al., 2017). Diversas chalconas naturais e sintéticas apresentam uma vasta gama de perfis farmacológicos e terapêuticos, como atividade antiinflamatória (ROZMER; PERJÉSI, 2016), tripanomicida (LUNARDI et al., 2003), antibacteriana (BOECK et al., 2006) e antileishmania (ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2009; DE MATTOS et al., 2015; NASSIF et al., 2017; PIÑERO et al., 2006; TAJUDDEEN et al., 2018).
Historicamente, compostos naturais têm servido como fonte de medicamentos seguros e efetivos para doenças em humanos (TAJUDDEEN ET AL., 2018). A primeira chalcona reportada na literatura com atividade leishmanicida foi a licochalcona A, isolada a partir do extrato alcoólico das raízes da planta chinesa Glycyrrhiza glabra (Fabaceae). O composto inibiu o crescimento da forma promastigotas de L. majos e L. donovani. Nas formas amastigotas de L. major, este composto inibiu o crescimento parasitário em 95% (CHEN et al., 1994).
A ação leishmanicida desta substância ocorre via inibição de determinadas enzimas do metabolismo celular do parasita e de alterações na morfologia das mitocôndrias (CHEN et al., 2001; ZHAI et al., 1999). Em outro estudo, Torres-Santos e colaboradores (1999) isolaram da inflorescência de Piper aduncum (Piperaceae) o composto 2, 6-dihidroxi-4-metoxi-chalcona (DMC) que demonstrou atividade tóxica em promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, mostrando-se inócuo aos macrófagos nas concentrações testadas. A partir destes estudos, uma série de chalconas foram extraídas e isoladas de diversas espécies vegetais principalmente da família Piperaceae (Tabela 1).
Tabela 1. Estrutura química e potencial leishmanicida de chalconas naturais
O H O O CH3 OH C H3 CH3 CH3 Licochalcona A Extrato etanólico da raíz de Glycyrrhiza glabra IC50=2,4µg/mL em promastigotas de L. major e L. donovani e IC50 de 1µg/mL em amastigota de L. major (CHEN et al., 1993) O H O C H3 OH O 2´, 6´-dihidroxi-4´-metoxichalcona (DMC) Extrato em diclorometano da inflorescência de Piper aduncum IC50=0,5µg/mL em promastigotas de L. amazonensis e IC50= 24µg/mL em amastigota de L. amazonensis.
Nenhum efeito tóxico em macrófagos até 100µg/mL. (TORRES-Santos, et al., 1999) OH O OH O C H3 C H3 CH3 O O O CH3 O H Adunchalcona Extrato etanólico da folha de Piper aduncum IC50= 11,03; 26,70 e 11,26 µg/mL contra promastigotas de L. amazonensis; L. braziliensis e L. chagasi, respectivamente. índice de seletividade < 5,00.
(Dal PICOLO, et al., 2014) OH O C H3 O OH 2´, 6´-dihidroxi-4´-metoxidihidrochalcona Extrato etanólico da parte aérea da Piper elongatum IC50= 15,30µg/mL em promastigotas de L. infantum; IC50= 27,04 e 21,29 µg/mL em promastigotas de L. braziliensis e L. tropica, respectivamente. Toxica para macrófagos.
(HERMOSO,et al., 2003) OH O C H3 O OH OH 2´, 6´4´-trihidroxi-4´-metoxidihidrochalcona Extrato etanólico da parte aérea da Piper elongatum IC50=3,82 e 6,36 µg/mL em promastigotas de L. tropica e L. infantum.
Tóxica para macrófagos
(HERMOSO, et al., 2003)
Fonte: Do autor.
A promissora atividade leishmanicida de algumas chalconas naturais e a possibilidade de torná-las mais efetivas na inibição do crescimento do parasita fez crescer o interesse pela
busca de síntese química destes metabólicos secundários. Dentre os compostos sintéticos obtidos, várias substituições e modificações na cadeia principal da trans-chalcona têm sido exploradas. Boeck e colaboradores, (2006), observaram que a substituição de hidroxilas por radicais dos grupos nitro, flúor e bromo aumentam a atividade contra o parasita. A chalcona nitrosilada foi aplicada in vivo, por injeção intralesional, demonstrando ser mais potente que o antimonial de referência no controle de crescimento da lesão e da infecção parasitária (BOECK et al., 2006).
Apesar do potencial de derivados sintéticos das chalconas no tratamento da LC, estudos prévios demonstram que a aplicação destes compostos utilizando formas de apresentação mais simples, e.g., pomadas, cremes e géis, não tem sido efetiva no combate à doença (ARANA et al., 2001). O baixo poder de penetração através das camadas lipídicas da pele parece ser a principal razão para essa baixa eficácia (TORRES-SANTOS et al., 2009). Um aumento da permeabilidade celular através de modificações estruturais dos compostos em estudo, aliado ao desenvolvimento de materiais inovadores que atuem como veículos e possibilitem a máxima ação destas drogas são determinantes à consolidação desta classe de compostos como tratamento da LC. Neste contexto, a utilização de técnicas de liberação controlada de fármacos, com polímeros biodegradáveis e nanoemulsões, pode ser uma alternativa viável ao desenvolvimento de uma nova forma de administração para o tratamento da doença.
Alguns estudos tem sido conduzidos para investigar os efeitos da encapsulação de chalconas com atividade leishmanicida com nanopartículas. Nanopartículas contendo DMC na concentração de 1µg/mL de ativo e 5 µg de polímero, foi observado um incremento na atividade de inibição de crescimento parasitários in vitro quando comparado com DMC livre (TORRES-SANTOS et al., 1999). Mattos e colaboradores (2015), demostraram que nanoemulsão com lecitina de soja e polisorbato 20 (Tween 20) mostraram ter atividade leishmanicida in vitro contra a forma amastigota de L. amazonensis
3.3.1 A pele
A pele além de ser o maior órgão do corpo humano, exerce várias funções como, controle de perda de água, da perda de eletrólitos, regulação da temperatura corporal, atua como órgão sensorial (tato e percepção de dor) e executa funções do sistema endócrino (síntese de vitamina D). Entretanto, sua principal função é a de barreira protetora contra agentes químicos, mecânicos e microbiológicos (KOLARSICK, PAUL; KOLARSICK, 2011).
A pele humana compõe-se de três camadas de tecidos: a epiderme, a derme e a hipoderme Figura 2.
Figura 2. Ilustração esquemática da pele e anexos epidérmicos
Fonte: Adaptada de Prausnitz, Mitragotri, & Langer, (2004).
3.3.1.1 Epiderme
A epiderme é a camada mais externa da pele. Histologicamente, é classificada com um tecido epitelial escamoso estratificado, constituído por algumas populações celulares como
melanócitos, células de Langerhans e células de Merkel. No entanto, o tipo celular majoritário são os queratinócitos. A epiderme é comumente dividida em quatro camadas de acordo com o nível de diferenciação e morfologia dos queratinócitos, i.e., camada basal, camada escamosa, camada granular e estrato córneo (KOLARSICK, PAUL; KOLARSICK, 2011).
3.3.1.2 Derme
A derme consiste de um tecido conectivo fibroso amorfo, composta por mucopolissacarídeos (FOLDVARI, 2000). Este tecido acomoda terminações nervosa e uma rica rede vascular, responsável pelo suprimento sanguíneo e aporte nutritivo da pele, regulação de temperatura, e mobilização de células de defesa. O principal tipo celular encontrado nesta camada são os fibroblastos que sintetizam e secretam proteínas fibrosas como o colágeno e a elastina, dando sustentação, flexibilidade, elasticidade e resistência ao tecido (KOLARSICK, PAUL; KOLARSICK, 2011).
3.3.1.3 Hipoderme
A hipoderme, ou tecido subcutâneo, é composta basicamente de células que armazenam gordura (adipócitos). Essa gordura subcutânea funciona como fonte de energia, amortecedor mecânico e barreira térmica (AULTON, 2005).
3.3.1.4 Características de uma pele com LC
A LC é caracterizada inicialmente pela presença de um nódulo na pele que eventualmente evoluirá para uma úlcera e crescerá com o passar do tempo. Contrariamente, poderá ocorrer um processo de autocura, dependendo do tipo de resposta imune do paciente. A inflamação, com a produção local de quimiocinas atrativas de macrófagos, favorecerá o desenvolvimento da lesão. A epiderme se apresenta mais espessa por causa da hiperplasia e a matriz de colágeno na derme é interrompida, resultando em necrose como mostrado na Figura 3.
Figura 3. Aspecto e histologia da lesão causada por leishmaniose cutânea
Legenda: Lesão de leishmaniose em desenvolvimento. A) Aspecto macroscópico da lesão ulcerosa. B) Representação esquemática da localização do infiltrado inflamatório com macrófagos infectados no início da lesão com a pele ainda intacta (quadro da esquerda), após algumas semanas ou meses um estágio mais avançado da lesão é estabelecido, macrófagos infectados localizados nas bordas da pele. Macrófagos lisados são encontrados nas regiões necróticas na área ulcerada (quadro da direita). C) Micrografia histológica de pele de um rato não infectados (esquerda) e uma pele de rato infectado, mostrando abundancia em vacúolo parasitóforo em macrófagos infectados na derme, destacados pelas setas. Fonte: (ROSSI-BERGMANN et al., 2011).
3.4 Liberação de fármacos na pele
A principal vantagem da administração tópica reside no fato que esta via contorna o meio hostil do estômago e o metabolismo pré-sistemico intestinal e hepático, acarretando em uma maior aderência ao tratamento pelo paciente. Como desvantagem, a administração via tópica pode levar a ocorrência de irritação, dermatite de contato, ou reação alérgica causada pelo fármaco e/ou veículo, além da dificuldade de fármacos em permear a camada córnea, devido a sua complexa estrutura e a alta lipofilicidade (ASHARA, et al., 2014).
A permeação cutânea de um fármaco ocorre predominantemente por difusão passiva, através de duas vias: a via transepidermal, a qual é subdividida entre as microvias intercelular,
passando pelos lipídios intercelulares e a transcelular). A Figura 4 mostra uma representação esquemática dos diferentes tipos de penetração de substâncias pela pele.
Figura 4. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de substâncias através do estrato córneo
Fonte: Adaptado de Moser e colaboradores 2001).
Outros fatores são também responsáveis por afetar a penetração cutânea de fármacos e incluem o grau de hidratação desta e seu pH. A melhora da hidratação do estrato córneo diminui a resistência do mesmo, aumentando a permeação de fármacos, provavelmente por provocar um intumescimento das estruturas compactas da camada cornificada e a criação de canais aquosos que permitem a difusão dos mesmos. Como o pH afeta o grau de ionização das moléculas e, embora apenas moléculas não ionizadas passem prontamente através das membranas lipídicas, tem sido observado que moléculas ionizadas penetram no estrato córneo até um determinado nível. Uma vez que estas moléculas apresentam maior concentração do que as neutras quando em solução saturada ou próxima da saturação, elas acabam exercendo uma contribuição significativa para o fluxo total dos compostos (AULTON, 2005). Assim, para que um fármaco aplicado topicamente possa exercer um efeito terapêutico local ou sistêmico, é preciso que seja capaz de atravessar o estrato córneo.
3.4.1 Estratégias para melhorar a passagem de fármacos através da pele
Embora o tratamento tópico apresente vantagens irrefutáveis, a adequada penetração cutânea de compostos ativos para produzir uma resposta terapêutica ainda é um grande desafio no desenvolvimento de medicamentos. A pele é muito efetiva como uma barreira à penetração, sendo que a epiderme exerce o maior controle, deixando penetrar apenas algumas substâncias em determinadas condições. A camada córnea, constituída por uma estrutura lipídica altamente ordenada, age como a principal barreira protetora, tanto para a excessiva perda de água, quanto para danos provocados por agentes tóxicos e microrganismos do ambiente. Neste sentido, substâncias ativas quando veiculadas em formas farmacêuticas convencionais, não alcançam concentrações apreciáveis nas camadas mais profundas da pele, fazendo com que as quantidades permeadas alcancem unicamente níveis subterapêuticos, tornando necessário assim o emprego de estratégias que aumentem a penetração cutânea dos mesmos. (SCHÄFER-KORTING; MEHNERT; KORTING, 2007). Diferentes estratégias têm sido empregadas para contornar as limitações impostas pela baixa absorção percutânea de fármacos. Os promotores de absorção como, por exemplo, o etanol, Tween 80 e o taurocolato de sódio, têm demonstrado ser efetivos. Entretanto, muitos deles induzem ao aparecimento de dermatite irritativa, a qual está de fato associada ao aumento de até 80 vezes na penetração cutânea de substâncias ativas (LASHMAR, HADGRAFT, & THOMAS, 1989). Além dos promotores químicos, técnicas envolvendo processos físicos têm sido testadas com sucesso e incluem: (i) iontoforese, na qual a penetração de compostos químicos com carga através da pele é induzida por meio da aplicação de um campo elétrico; (ii) fonoforese, que consiste na utilização do ultrassom de alta freqüência, e (iii) eletroporação, a qual envolve a criação de poros aquosos na bicamada lipídica por meio da aplicação de pulsos elétricos curtos. A formação de pares iônicos e a perfuração da pele com o uso de microagulhas são outras estratégias descritas na literatura com o intuito de aumentar a penetração de fármacos (BOCXLAER et al., 2016).
3.4.2 Estratégias nanotecnológicas para tratamento de leishmaniose cutânea
Avanços científicos nas áreas de química, engenharia e biologia têm permitido grandes progressos no campo da nanotecnologia. Assim, a utilização de biomateriais de origem natural ou sintética tem se tornado um grande aliado no campo da biomedicina, no desenvolvimento de novos produtos, principalmente nas áreas de engenharia tecidual e nas metodologias de liberação controlada de fármacos (GEETHA et al., 2017; KAMBLE et al., 2017).
3.4.2.1 Nanomatrizes produzidas pela técnica de electrospinning
O electrospinning se popularizou, graças a sua capacidade e versatilidade de produção de materiais micro e nanofibrosos a partir de soluções poliméricas. Sendo essa uma técnica simples e de baixo custo, consistindo, em sua configuração padrão, de um sistema com uma fonte de alta voltagem, uma bomba de infusão, uma seringa e um coletor metálico (Fig. 5). Nesse sistema, a solução polimérica é bombeada através de uma seringa até a agulha, conectada a em uma fonte de alta tensão, quando a tensão elétrica aplicada supera a tensão superficial da solução polimérica, esta é ejetada em direção ao coletor (MOHEMAN; ALAM; MOHAMMAD, 2016).
A manipulação das características de matrizes poliméricas produzidas por electrospinning, tais como a composição polimérica, a morfologia, distribuição de diâmetros das fibras, áreas de poros e a porosidade, permitirá o controle da biodegradabilidade das mesmas, bem como o desenvolvimento de sistemas de liberação controlada. Assim, alguns parâmetros durante o processo devem ser otimizados, objetivando produzir uma matriz com características ideais para a sua aplicação, e.g. fluxo da solução polimérica, distância da agulha até o coletor, voltagem aplicada e o tipo de coletor metálico utilizado (ALBERTI et al., 2017; VELEIRINHO et al., 2012).
Figura 5. Esquema ilustrativo do aparato de electrospinning
Legenda: Detalhe dos componentes do aparato de electrospinning. A solução polimérica é bombeada através da seringa. A agulha é conectada a uma fonte de alta voltagem, que injeta uma carga no polímero. A força eletrostática criada pela repulsão das cargas supera a tensão superficial da solução. O esquema ainda mimetiza um fluxo de 8ul/min e uma distância entre seringa e coletor de 14cm. Fonte: do autor.
O álcool polivinílico (PVA) é um polímero hidrofílico com boa estabilidade química e térmica. Este polímero tem sido utilizado em aplicações biológicas e farmacêuticas devido a diversas vantagens como biodegradabilidade, e bom desempenho na formação de hidrogéis e nanofibras (KHARAGHANI et al., 2019; PANT; PARK; PARK, 2019). Assim, no presente estudo, o PVA foi utilizado como polímero base à produção de nanomatrizes pela técnica de electrospinning. Tais matrizes nanométricas atuarão como suporte e veículo de liberação controlada de chalconas com atividade antileishmania e, eventualmente, auxiliando no processo de regeneração tissular das lesões cutâneas. A estrutura microporosa destas nanomatrizes pode, ainda, conferir uma proteção adicional aos tecidos lesados, prevenindo a ocorrência de infecções secundárias (VELEIRINHO et al. 2012).
Alguns estudos têm relatado o efeito da encapsulação sobre a atividade das chalconas com potencial leishmanicida. Entre eles, Torres-Santos e colaboradores (1999) testaram a atividade in vitro contra a forma amastigota de L. amazonensis, encapsulando o 2’, 6’-dihidroxi-4’-metoxichalcona (DMC) em nanopartículas de ácido poli-L-lático (PLLA). Nesse trabalho, o sistema nanoparticulado inibiu o crescimento intracelular do parasita em 53%, enquanto a forma livre do composto foi capaz de inibir somente 23%. Além disso, o tratamento in vivo,
utilizando camundongos, reduziu a carga parasitária em 90% em animais tratados com as nanopartículas contendo DMC. Em contrapartida, Pinero (2006), desenvolveu implantes com poli (ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) e trans-chalcona e verificou que animais tratados com o implante tiveram uma diminuição da carga parasitária. Estes resultados promissores incentivam a utilização de outras técnicas de nanoencapsulamento, a fim de desenvolver novos produtos para o tratamento da leishmaniose.
3.4.2.2 Nanoemulsões
Nanoemulsões (NE) podem ser definidas como sistemas cineticamente estáveis, apresentando gotículas de diâmetro inferior a 1 micrômetro, compostos por dois líquidos imiscíveis, estabilizados por um sistema adequado de tensoativos (BRUXEL et al., 2012). As nanoemulsões têm sido utilizadas em pesquisas recentes com a finalidade de aperfeiçoar o desempenho terapêutico de diversos fármacos apolares, pois aumentam a sua solubilidade aparente, taxa de dissolução e permeação em membranas biológicas (KOROLEVA; YURTOV, 2012). Além disso, as nanoemulsões podem ser utilizadas em todas as vias de administração e mostram-se muito vantajosas para tratamentos na via tópica, já que apresentam baixa irritabilidade, alto poder de penetração e alta capacidade de veicular grandes quantidades de fármacos (TADROS et al, 2004; JAISWAL e DUDHE, 2015).
Basicamente existem dois principais métodos de desenvolvimento de nanoemulsões de alta e baixa energia (YUKUYAMA, et al., 2016 ALBERTI, et al., 2017). Os métodos que empregam alta energia requerem dispositivos mecânicos para produzir fortes forças disruptivas para romper as gotículas da fase dispersa (oleosa/aquosa) para obter nanoemulsões com diâmetros reduzidos. Estes métodos incluem a microfluidização, homogeneização à alta pressão e sonicação. Nestes métodos, a preparação da nanoemulsão ocorre, geralmente em duas etapas: a primeira consiste na produção de uma emulsão grosseira e a segunda na redução do diâmetro de gotícula com auxílio de equipamento ou dispositivo específico (Bruxel et al., 2012 Alberti et al., 2017). Os métodos de baixa energia, por sua vez, não fazem uso de energia extrema gerada por dispositivos mecânicos e sim do potencial químico dos componentes da formulação (YUKUYAMA, et al., 2016; ANTON;VANDAMME, 2011). Em um método de baixa energia, usualmente, realiza-se uma suave agitação para gerar nanoemulsões. Este processo depende,
