PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
LIANY BARROS RIBEIRO
RESISTÊNCIA PRIMÁRIA E ADQUIRIDA À PIRAZINAMIDA
EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR
ATENDIDOS EM HOSPITAL DE REFERÊNCIA PARA
TRATAMENTO DE TUBERCULOSE
RECIFE/PE
2012
RESISTÊNCIA PRIMÁRIA E ADQUIRIDA À PIRAZINAMIDA
EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR
ATENDIDOS EM HOSPITAL DE REFERÊNCIA PARA
TRATAMENTO DE TUBERCULOSE
Orientadora: Profª. Dra. Vera Magalhães da Silveira
Co-orientador: Prof. Dr. Marcelo Magalhães
RECIFE/PE 2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical
R484r Ribeiro, Liany Barros.
Resistência primária e adquirida à pirazinamida em pacientes com tuberculose pulmonar atendidos em hospital de referência para tratamento de tuberculose / Liany Barros Ribeiro. – Recife: O autor, 2012.
72 folhas: il. ; 30 cm.
Orientador: Vera Magalhães da Silveira.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco, CCS, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2012.
Inclui bibliografia, apêndices e anexos.
1. Tuberculose pulmonar. 2. Pirazinamida. 3. Antibióticos antituberculose. 4. Resistência a medicamentos. 5. Pernambuco. I. Silveira, Vera Magalhães da (Orientador). II. Título.
616.9883 CDD (23.ed.) UFPE (CCS2012-106)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO (UFPE)
PRÓ-REITORIA PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO (PROPESQ) CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE (CCS)
PROGRAM A DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL (PPGMEDTROP)
RELATÓRIO DA BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DA MESTRANDA LI A N Y BA R R O S RI B E I R O
No dia 01 de março de 2012, às 10h00, na Sala de Aula do PPGMEDTROP (CCS/UFPE), os Membros Doutores: a Profª. Drª. Maria Amélia Vieira Maciel –
Presidente da Banca (UFPE), a Profª. Drª. Líbia Cristina Rocha Vilela de Moura (UFPE) e a Profª. Drª. Marília Montenegro Cabral (UPE), componentes
da Banca Examinadora, em sessão pública, arguiram a mestranda LIANY BARROS
RIBEIRO sobre a sua Dissertação intitulada “RESISTÊNCIA PRIMÁRIA E
ADQUIRIDA À PIRAZINAMIDA EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR ATENDIDOS EM HOSPITAL DE REFERÊNCIA PARA TRATAMENTO DE TUBERCULOSE”, a qual foi orientada pela Profª. Dra.
Vera Magalhães da Silveira (UFPE). Ao final da arguição de cada membro da
Banca Examinadora e resposta da mestranda, as seguintes menções foram publicamente fornecidas.
Profa. Dra. Maria Amélia Vieira Maciel APROVADA Profa. Dra. Líbia Cristina Rocha Vilela de Moura APROVADA Profª. Drª. Marília Montenegro Cabral APROVADA
Profa. Dra. Maria Amélia Vieira Maciel
Profa. Dra. Líbia Cristina Rocha Vilela de Moura
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
REITOR
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Francisco de Souza Ramos
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
José Thadeu Pinheiro
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Valdênia Maria Oliveira de Souza
CORPO DOCENTE
Ana Lúcia Coutinho Domingues Célia Maria Machado Barbosa de Castro Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto
Fábio André dos Santos Brayner Heloísa Ramos Lacerda de Melo
Maria Amélia Vieira Maciel
Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque Maria do Amparo Andrade
Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho Marli Tenório Cordeiro
Ricardo Arraes de Alencar Ximenes Valdênia Maria Oliveira de Souza
Vera Magalhães da Silveira Vláudia Maria Assis Costa
Dedico este trabalho às pessoas que sempre estiveram ao meu lado, acreditando no meu potencial e me apoiando diante de todos os desafios já enfrentados: minha família.
À minha família, pelo carinho e pelo incentivo durante todo o meu crescimento pessoal e profissional.
Ao meu marido Japhet, pelo seu amor e companheirismo.
À minha orientadora, Profa. Dra. Vera Magalhães da Silveira, pelo apoio e dedicação em todos os momentos da realização deste trabalho.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Marcelo Magalhães, pelos importantes ensinamentos científicos e orientação.
À minha tia Euliene Staudinger, pelos seus ensinamentos.
À minha amiga Marta Coelho, pelo apoio durante a realização deste trabalho.
A toda equipe do ambulatório de Tuberculose do Hospital Otávio de Freitas, em especial à Dra. Paula Athayde, pelo carinho e apoio recebidos.
Às minhas queridas companheiras de mestrado, Fabiana Beserra Caraciolo e Maria de Fátima de Melo Gonçalves pelo conforto nas horas difíceis.
Aos professores da Pós-Graduação em Medicina Tropical da UFPE, pelos conhecimentos transmitidos; conhecimentos estes que foram fundamentais para a realização deste trabalho.
RIBEIRO, Liany Barros. Resistência primária e adquirida à pirazinamida em
pacientes atendidos com tuberculose pulmonar em Hospital de referência para tratamento de tuberculose. 2012, 72f. Dissertação de Mestrado Universidade
Federal de Pernambuco - Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical. Recife. Pernambuco
Os dados sobre tuberculose multirresistente são escassos no grupo dos vinte e dois países responsáveis por 80% dos casos de tuberculose no mundo. No Brasil, há poucos dados consolidados sobre a prevalência de multirresistência. Esta pesquisa teve como principal objetivo verificar a resistência primária e adquirida à pirazinamida em isolados de Mycobacterium tuberculosis provenientes de amostras de escarro de pacientes com tuberculose pulmonar, assim como a sensibilidade às outras drogas de primeira linha antituberculose. O estudo foi prospectivo, descritivo, realizado no período de abril a novembro de 2011, em hospital de referência para tratamento de tuberculose no estado de Pernambuco. Utilizou-se formulário próprio da pesquisa. Cultura e testes de sensibilidade para micobactérias e o teste da produção da pirazinamidase foram realizados em laboratório particular de Recife. Para análise dos dados foram utilizadas distribuições absolutas e percentuais uni e bivariadas para as variáveis categóricas e foram utilizados os testes: t-Student com variâncias iguais e Qui-quadrado de Pearson ou o teste Exato de Fisher quando as condições para utilização do teste Qui-quadrado não foram verificadas. Dos 71 pacientes incluídos no estudo, todos (37) do grupo virgem de tratamento (VT) foram sensíveis a pirazinamida, 1/37 (2,7%) foi resistente à isoniazida e 1/37 (2,7%) foi resistente à estreptomicina. No grupo em retratamento (RT), 29/34 (85,3%) eram resistentes à isoniazida, 22/34 (64,7%) à rifampicina, 19/34 (55,9%) ao etambutol, 17/34 (50,0%) à estreptomicina, 14/34 (41,2%) à pirazinamida e 12/14 (85,7%) dos isolados resistentes à Z também apresentavam resistência à H e à R. Todos os isolados pertencentes ao grupo VT e susceptíveis à pirazinamida produziram pirazinamidase. Entre as cepas de M. tuberculosis recuperadas de pacientes do grupo RT, 10 (90,9%) que exibiram PZase inativa apresentaram resistência à Z. Por outra parte, 19 (82,6%) dos isolados PZase positivos eram sensíveis àquela droga. Os resultados do estudo sugerem que a elevada frequência de cepas resistentes à pirazinamida (41,2%) em pacientes com falha terapêutica para tratamento da tuberculose destaca a necessidade de realização de testes de sensibilidade à pirazinamida antes de se escolher novo esquema de resgate.
RIBEIRO, Liany Barros. Primary and acquired resistance to pyrazinamide in
patients treated for pulmonary tuberculosis in a reference hospital for tuberculosis treatment. 2012, 72 f. Dissertation, Federal University of Pernambuco -
Health Sciences Center Graduate Program in Tropical Medicine. Recife. Pernambuco.
Data on drug-resistant tuberculosis are scarce in the group of twenty-two countries account for 80% of cases of tuberculosis worldwide. In Brazil, there is little consolidated data on the prevalence of multidrug resistance. This research aimed to verify the primary and acquired resistance to pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis isolates from sputum samples from patients with pulmonary tuberculosis, as well as sensitivity to other first-line antituberculosis drugs. The study was prospective, descriptive, conducted from April to November 2011, in referral hospital for treatment of tuberculosis in the state of Pernambuco. We used a specific form of research. Culture and sensitivity tests for mycobacteria and test production of pyrazinamidase were performed in a private laboratory in Recife. For data analysis were used absolute and percentage distributions univariate and bivariate analyzes for categorical variables and tests were used: t-Student test with equal variances and chi-square test or Fisher's exact test when the conditions for using the chi- Square has not been verified. Of the 71 patients included in the study, all (37) of treatment-naïve group (VT) were sensitive to pyrazinamide, 1/37 (2,7%) were resistant to isoniazid and 1/37 (2,7%) was resistant streptomycin. In the retreatment group (RT), 29/34 (85,3%) were resistant to isoniazid, 22/34 (64,7%) to rifampicin, 19/34 (55,9%) to ethambutol, 17/34 (50,0%) to streptomycin, 14/34 (41,2%) to pyrazinamide and 12/14 (85,7%) of Z-resistant isolates also showed resistance to H and R. All isolates belonging to the group and VT susceptible to pyrazinamide produced pyrazinamidase. Among the strains of M. tuberculosis recovered from patients in the RT group, 10 (90,9%) presented inactive PZase exhibited resistance to Z. On the other hand, 19 (82,6%) of positive isolates were sensitive PZase to that drug. The study results suggest that the high frequency of strains resistant to pyrazinamide (41,2%) in patients failing therapy for tuberculosis highlights the need for testing sensitivity to pyrazinamide before choosing new salvage regimen.
Tabela 1 – Caracterização dos pacientes com diagnóstico de tuberculose pulmonar
por grupo: virgem de tratamento (VT) e em falha terapêutica (FT) atendidos em hospital de referência para tratamento de tuberculose (TB) em Pernambuco no período de abril a novembro de 2011 ... 48
Tabela 2 – Resultados dos testes de sensibilidade para cada uma das cinco drogas
dos isolados de M. tuberculosis de pacientes com tuberculose pulmonar virgens de tratamento (VT) e em falha terapêutica (FT), atendidos em hospital de referência para tratamento de tuberculose (TB) em Pernambuco no período de abril a novembro de 2011 ... 50
Tabela 3 – Resultados do teste da pirazinamidase (PZase) e o teste de sensibilidade
à pirazinamida em isolados de M.tuberculosis por grupo atendidos em hospital de referência para tratamento de tuberculose (TB) em Pernambuco no período de abril a novembro de 2011 ... 51
BAAR Bacilo álcool-ácido resistente BCG Bacilo Calmette-Guérin
CIM Concentração inibitória mínima
CNCT Comissão Técnica da Comissão Nacional Contra a Tuberculose E Etambutol
Et Etionamida FT Falha terapêutica H Isoniazida
HIV Vírus da imunodeficiência humana HGOF Hospital Geral Otávio de Freitas LJ Lowensten-Jensen
Mtb Mycobacterium tuberculosis OMS Organização Mundial de Saúde
OPAS Organização Pan-Americana de Saúde PAS Ácido p-amino salicílico
PCR Reação em cadeia polimerase
PZase Enzima pirazinamidase-nicotinamidase R Rifampicina
S Estreptomicina TB Tuberculose
TB-MDR Tuberculose multirresistente
TB-XDR (TB extremely drug resistant) Tuberculose super-resistente TS Teste de sensibilidade
VT Virgem de tratamento Z Pirazinamida
1 APRESENTAÇÃO ... 12
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 14
2.1 O agente etiológico da tuberculose ... 14
2.2 Fatores associados à tuberculose pulmonar ... 15
2.3 O diagnóstico bacteriológico de tuberculose pulmonar ... 16
2.4 A história do tratamento quimioterápico da tuberculose pulmonar ... 18
2.5 A resistência aos fármacos antituberculose ... 21
2.6 Resistência e testes de sensibilidade à pirazinamida ... 24
3 OBJETIVOS ... 28 3.1 Geral ... 28 3.2 Específicos ... 28 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 29 4.1 Desenho do estudo ... 29 4.2 Local do estudo ... 29 4.3 População do estudo ... 30 4.3.1 Tipo de amostragem ... 30 4.3.2 Critérios de elegibilidade ... 30 4.3.2.1 Critérios de inclusão ... 30 4.3.2.2 Critérios de exclusão ... 31
4.4 Definição e categorização das variáveis ... 31
4.5 Plano de coleta de dados ... 33
4.6 Coleta e transporte de amostras ... 33
4.7 Análise do material coletado ... 34
4.7.1 Digestão e descontaminação do escarro ... 34
4.7.2 Pesquisa direta de bacilos álcool-ácido resistente ... 34
4.7.3 Cultura do escarro para micobactérias ... 35
4.7.4 Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos ... 35
4.7.5 Teste da pirazinamidase ... 36
4.7.6 Controles ... 37
4.8 Plano de tabulação e análise de dados ... 37
5 LIMITAÇÕES METODOLÓGICAS ... 38
8.1 ARTIGO:
RESISTÊNCIA PRIMÁRIA E ADQUIRIDA À PIRAZINAMIDA EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR ATENDIDOS EM HOSPITAL DE
REFERÊNCIA PARA TRATAMENTO DE TUBERCULOSE ... 41
9 CONCLUSÕES ... 58
10 CONSIDERAÇOES FINAIS ... 58
REFERÊNCIAS ... 59
APÊNDICES ... 67
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO .. 67
APÊNDICE B – FICHA DE COLETA DE DADOS ... 69
ANEXO ... 71
ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DO HOSPITAL OTÁVIO DE FREITAS ... 71
1 APRESENTAÇÃO
São escassos os dados sobre tuberculose multirresistente (TB-MDR), no grupo dos 22 países responsáveis por 80% dos casos de tuberculose (TB) no mundo, no qual o Brasil ocupa a 19ª posição (SUCHINDRAN; BROUWER; VAN RIE, 2009).
Aproximadamente 500.000 casos de TB-MDR surgem, a cada ano no mundo, e entre 5% a 7% deles tornam-se tuberculose super-resistente (TB-XDR) (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010). No Brasil, em 2007, entre os pacientes com risco de albergarem cepas de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) resistentes (em falência de esquema, em recidiva ou no retorno após abandono), testes de sensibilidade aos fármacos foram realizados em apenas 30,7% dos casos. Notificaram-se nesse ano 372 casos de TB-MDR, sendo que 7,8% eram coinfectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) (KRITSKI, 2010). E, aproximadamente 96% dos casos de resistência notificados são adquiridos, sendo que mais da metade tem histórico de três ou mais tratamentos prévios para TB (BRASIL, 2011).
Estimou-se, no Brasil, no ano de 2008, que de todos os casos novos de tuberculose, 0,9% (0,6% a 1,4%) evoluíram para TB-MDR, assim como 5,4% (4,1% a 7,2%) dos casos de pacientes submetidos novamente a tratamento de TB (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2011). Na realidade, há poucos dados consolidados sobre a prevalência de multirresistência nacionalmente. Os dados do II Inquérito Nacional de Resistência aos Fármacos antiTB (2007-2008) mostraram aumento da resistência primária à isoniazida (H) de 4,4 para 6,0% e à rifampicina (R) de 1,1% para 1,4%, entre os anos 1997 (período do I Inquérito Nacional de Resistência) e 2007, no Brasil (CONDE et al., 2009).
A pirazinamida (Z) é uma droga de primeira linha, utilizada no tratamento da TB, tanto em pacientes recém-diagnosticados como no tratamento da TB-MDR. É responsável pela morte dos bacilos persistentes durante a fase inicial do tratamento, e, em sinergismo com a rifampicina, auxilia no encurtamento do tratamento de nove para seis meses (SHI; ITAGAKI; SUGAWARA, 2007; ZHANG; MITCHISON, 2003). Apesar disso, testes de sensibilidade à Z não são realizados, rotineiramente, em muitos países, devido às dificuldades técnicas e custo. Assim, a prevalência de resistência a Z é globalmente desconhecida (LOUW et al., 2006).
Pesquisa realizada na África do Sul demonstrou que 68/127 (53,5%) dos isolados de Mtb resistentes às drogas em pacientes previamente tratados também foram resistentes a Z, e 1/47 (2,1%) isolado de Mtb foi resistente apenas à Z, sugerindo monorresistência. E um total de 62/68 (91%) dos isolados resistentes a Z também foram resistentes a H e a R. Observou-se que a resistência a Z é comum entre cepas isoladas de Mtb, no sul da África, em isolados clínicos de pacientes resistentes a outros medicamentos contra a tuberculose (LOUW et al., 2006).
No Brasil, muitos estudos sobre a resistência às drogas antituberculose não relatam a realização de testes de sensibilidade a Z (BRITO et al., 2010; MARQUES et al., 2010; AGUIAR et al., 2009; MENDES et al., 2007). Além disso, em Pernambuco, por exemplo, não há sequer pesquisas recentes sobre a resistência às drogas antituberculose em geral. Este trabalho pretende preencher essa lacuna relatando a frequência de resistência primária e adquirida às drogas antituberculose, inclusive à Z, em linhagens de Mtb isoladas de pacientes com tuberculose pulmonar atendidos em hospital de referência em Pernambuco.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 O agente etiológico da tuberculose
O Mtb é o agente mais importante da doença humana causada pelo complexo M. tuberculosis. Este complexo engloba, ainda, o M. bovis (bacilo da tuberculose bovina e responsável pela tuberculose transmitida pelo leite não pasteurizado), M. caprae (relacionado ao M. bovis), M. africanum (isolado de casos na África Ocidental, Central e Oriental), M. microti (bacilo do “rato calunga”, um microrganismo menos virulento e raramente encontrado), M. pinnipedii (bacilo que infecta focas e leões-marinhos no hemisfério sul e, recentemente, seres humanos) e M. canetti (isolado raro de casos da África Oriental, que produz colônias lisas incomuns em meio sólido) (RAVIGLIONE, BRIEN, 2008). No entanto, a espécie mais importante é o Mtb, isolada e identificada por Robert Koch em 1882 (ALMEIDA, 2009).
As infecções por outras espécies de micobactérias também devem ser consideradas. Segundo a Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS) e a Organização Mundial de Saúde (OMS), 7000 casos novos de tuberculose humana causada pelo M. bovis são notificados na América do Sul a cada ano. A diferenciação entre o Mtb e M. bovis é particularmente importante, uma vez que este último é naturalmente resistente a Z (PINTO JÚNIOR et al., 2007).
Morfologicamente, são bacilos retos ou ligeiramente curvos, com dimensões que variam de 0,2µ a 0,6µ por 1µ e 10µ, não formam cápsula, são imóveis e apresentam um tempo de geração de aproximadamente dezoito horas (ALMEIDA, 2009).
O Mtb é transmitido principalmente por via aérea, mais comumente através da tosse de um doente com tuberculose pulmonar bacilífero, facilitada pela aglomeração humana, ambientes pouco arejados e maior tempo de contato com o doente bacilífero (FIÚZA DE MELO et al., 2006). A transmissão se inicia pelo paciente portador de tuberculose pulmonar, com a eliminação de partículas pequenas, com tamanho de 2µ a 10µ, contendo o Mtb, chamadas de fomites,
partículas núcleo ou gotículas núcleo de Wels, que são capazes de alcançar os alvéolos pulmonares dos comunicantes (RAVIGLIONE, BRIEN, 2008).
2.2 Fatores associados à tuberculose pulmonar
A TB é uma doença infecto-contagiosa que apresenta características sociais e demográficas. Está frequentemente associada à exclusão social, renda familiar baixa, educação precária, habitação ruim / inexistente, famílias numerosas, adensamentos comunitários, desnutrição, dificuldades de acesso aos serviços básicos de saúde, alcoolismo e também a doenças associadas, como a coinfecção pelo HIV (VIEIRA; RIBEIRO, 2008).
O alcoolismo crônico, em razão de estar associado à diminuição da imunidade e a desnutrição, é considerado importante fator de risco para o desenvolvimento da TB, fato mostrado quando percebemos maior incidência e tratamentos prolongados da doença entre esses pacientes (BRASIL, 2002). Estudo realizado em Carapicuíba – São Paulo observou que o alcoolismo foi a comorbidade de maior prevalência em pacientes com TB, além de estar significativamente associada ao abandono do tratamento, também foi apontado na literatura como importante fator de risco para mau prognóstico e desfecho desfavorável do tratamento da TB (VIEIRA; RIBEIRO, 2008).
Também já foi demonstrada a associação entre tabagismo e TB, bem como o aumento da infecção, da morbidade e da mortalidade da TB nos pacientes fumantes ativos ou passivos. O tabagismo parece estar associado à demora na conversão da baciloscopia do escarro e à maior taxa de recidiva da doença (BRASIL, 2011; CONDE et al., 2009).
A interação entre a infecção pelo HIV e o Mtb, evidenciada com a pandemia da aids, favoreceu o recrudescimento da tuberculose nos países desenvolvidos, outrora sob controle. Agravou ainda o difícil panorama desta enfermidade, com substancial aumento do número de casos novos nos países em desenvolvimento (GOPI et al., 2007).
A TB é uma das infecções oportunistas mais comuns nos pacientes com aids, particularmente nos países onde a mesma é endêmica, como o Brasil. O risco anual
de progressão para tuberculose-doença entre os pacientes coinfectados varia entre 5 e 15%, dependendo do grau de imunodepressão, contra 0,5% e 1% nos não coinfectados (MELO; AFIUNE; HIJAR, 2005). Embora sejam menos infectantes que os pacientes com baciloscopia positiva, estes pacientes, em geral, são mais imunocomprometidos, apresentam mais reações adversas aos medicamentos e têm maiores taxas de mortalidade agravadas pelo diagnóstico tardio dessas formas (BRASIL, 2011; JAMALL; MOHERDAUILL, 2007)
Entretanto, outras causas de imunossupressão, por doenças ou fármacos, também têm sido reconhecidas como fatores predisponentes para o desenvolvimento de TB. Pacientes com diabetes mellitus, insuficiência renal crônica ou neoplasias e pacientes em uso de medicamentos imunossupressores têm demonstrado incidências elevadas da doença. O uso de imunossupressores em diversas situações clínicas é cada vez mais frequente elevando o número de casos nesse contexto. Vale salientar que a TB em pacientes imunocomprometidos não portadores de HIV pode ser tão grave quanto nos pacientes HIV positivos (SILVA et al., 2010).
A TB apresenta uma marcante suscetibilidade na população geriátrica, tanto no que diz respeito a novas infecções quanto à reativação de doença, ambas relacionadas à diminuição da imunidade celular, afetada pelo processo de envelhecimento imunológico.Por ter sua transmissão preferencial ligada à via aérea, a doença encontra no idoso um sistema respiratório senescente, com redução de seus mecanismos de defesa, o que aumenta ainda mais o risco de infecção e de adoecimento a partir de reativação de focos latentes (CAVANCANTI, 2006).
2.2 O diagnóstico bacteriológico de tuberculose pulmonar
O diagnóstico da TB pulmonar permite que ocorra menores taxas de morbimortalidade e de sequelas entre os portadores de doença ativa, além de interromper a cadeia de transmissão, contribuindo para a prevenção de novos casos (PALACI; MELLO, 2011). O laboratório de bacteriologia desempenha um papel importante no diagnóstico preciso da TB, enquanto os exames clínicos e
radiológicos auxiliam de modo indireto no diagnóstico (NOGUEIRA; ABRAÃO; MALUCELLI, 2004).
A pesquisa do bacilo álcool-ácido resistente (BAAR), pelo método de coloração Ziehl-Nielsen (ZN) é a técnica mais utilizada para o diagnóstico da doença e é considerada um exame simples, econômico que permite a identificação da fonte de infecção, o doente bacilífero. Esse procedimento é realizado como triagem para o diagnóstico da TB, sendo importante no programa de controle desta doença (BRASIL, 2011; CONDE et al., 2009; BRASIL, 2005). Entretanto, a baciloscopia possui baixa sensibilidade, 60% a 70%, sendo necessários 5.000 a 10.000 bacilos por ml de escarro para possibilitar o diagnóstico. Logo, podem ocorrer resultados falsos negativos em doentes paucibacilares, como apresentarem resultados falsos positivos ao demonstrar bacilos mortos (KRITSKI et al., 2007).
Por outro lado, a cultura é mais sensível e o crescimento ocorre com 10 a 100 bacilos por ml de escarro (BRASIL, 2005). Em geral, a sensibilidade da cultura é de 70% para pacientes sem a doença cavitária, podendo aumentar para 96% em pacientes com lesão cavitária. Em pacientes com baciloscopia negativa, a sensibilidade da cultura varia de 80 a 85%, com especificidade de aproximadamente 98% (PALACI; MELLO, 2011).
Os métodos clássicos para cultura de microbactérias utilizam a semeadura da amostra em meios de cultura sólidos. Os meios de cultura mais comumente utilizados são os sólidos a base de ovo, Lowenstein-Jensen (LJ) e Ogawa-Kudoh. Têm a vantagem de serem os de menor custo e de apresentarem um índice de contaminação menor. A desvantagem do meio sólido é o tempo de detecção do crescimento bacteriano que varia de 14 a 30 dias, podendo se estender por ate oito semanas (BRASIL, 2011). Também pode ser realizada por métodos bacteriológicos automatizados, tais como os dos sistemas BACTEC MGIT 960® e MB/BactT® e tem como principal vantagem a redução do tempo de detecção para 7 a 15 dias, na dependência da carga bacilar inicial da amostra. Contudo, apresenta um custo financeiro superior aos métodos convencionais (PALACI; MELLO, 2011).
As III Diretrizes em Tuberculose da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia indicam que todo sintomático respiratório com radiografia de tórax sugestiva de TB tenha cultura para micobactérias com teste de identificação e teste de sensibilidade (TS), realizados em, pelo menos, uma amostra de escarro, sempre que possível (CONDE et al., 2009). Testes de sensibilidade são de extrema
importância para estabelecer diagnóstico e tratamento precoce de multirresistência na tentativa de diminuir a disseminação da doença (CAMPANERUT et al., 2011). No entanto, destaca-se a dificuldade de se detectar a resistência inicial a drogas, devido à não realização de TS a drogas até mesmo para casos suspeitos (VIEIRA et al., 2007).
Os métodos padronizados e validados para investigar a sensibilidade de Mtb aos medicamentos antiTB de primeira linha são os métodos das proporções, das concentrações absolutas e da razão de resistência, que utilizam meios sólidos; e o BACTEC MGIT 960® e o BacT/ALERT eD®, que utilizam meios líquidos. Os meios sólidos (LJ e Ogawa-Kudoh) ou de ágar (Middlebrook 7H10 e o 7H11) representam menor custo, mas, além do tempo para confirmação do diagnóstico de TB, demandam mais de quatro semanas para fornecer os resultados dos testes de sensibilidade (PALACI; MELLO, 2011).
2.3 A história do tratamento quimioterápico da tuberculose
Nos anos sessenta, a Comissão Técnica da Comissão Nacional Contra a Tuberculose (CNCT), baseando-se em experiência própria e atendendo a recomendações internacionais, com o intuito de evitar o desenvolvimento da resistência bacteriana e melhorar a eficiência terapêutica, adotou um esquema de tratamento, à época chamado de “standard” ou de primeira linha. Inicialmente, o esquema era tríplice, envolvendo estreptomicina (S), ácido p-amino salicílico (PAS) e H, durante o primeiro trimestre, seguido de nove meses de PAS e H e mais um ano de apenas H (HIJJARL et al., 2007). O longo tempo de quimioterapia ocasionava uma baixa adesão e muitos pacientes abandonavam o tratamento ou o faziam irregularmente, propiciando o aparecimento da resistência bacteriana. Em 1966, a CNCT diminuiu o período de tratamento para um ano: três meses de S, PAS e H, seguidos de nove meses de PAS e H. Alternativamente, se indicavam três meses de S, PAS e H, três meses de S e H e, no último semestre, apenas H. Este esquema de um ano era preferencial para os pacientes virgens de tratamento (BRASIL, 1966).
Naquela época, a resistência do Mtb às drogas de primeira linha era um problema no Sanatório Octávio de Freitas (hoje chamado de Hospital Geral Otávio
de Freitas - HGOF). O Hospital dispunha de dois pavilhões, K e L, ocupados, exclusivamente, por pacientes resistentes às drogas antiTB. Tais pacientes constituíam sério desafio sanitário e se evitava a alta hospitalar por receio de se disseminar Mtb resistente. Resolveu-se, então, instituir-se um esquema terapêutico de reserva, incluindo: cicloserina, etionamida (Et) e morfazinamida, esta última um derivado da Z. A morfazinamida foi preferida por sua alegada menor toxicidade e maior atividade in vitro. Teoricamente, este dado é questionável, posto que a atividade antimicobacteriana da morfazinamida deve-se à Z, que é liberada juntamente com a morfolina e aldeído fórmico (ZIERSK, 1963; BONATI; BERTONI, 1962).
Todavia, em trabalho publicado em 1969, Rizzo e colaboradores justificaram a ótima tolerância de seus pacientes ao tratamento, devido ao emprego da morfazinamida em lugar da Z. Outros estudos, entretanto, realizados em animais, demostraram que a morfazinamida é mais tóxica e muito menos ativa que a Z (ZITOKOVÁ et al., 1983). Hoje, a morfazinamida é considerada inferior a Z e, portanto, é dispensável nos esquemas de tratamento da tuberculose (ZHANG; MITCHISON, 2003). Apesar de tais assertivas, são surpreendentes os bons resultados obtidos na década de sessenta por Rizzo e colaboradores (1969). Observou-se notável adesão dos pacientes ao tratamento, embora este incluísse, ao lado da morfazinamida, a etionamida, droga reconhecidamente também hepatotóxica (KUNTZ; LIHER; PFINGST, 1968). Além disso, houve a negativação do escarro à cultura da quase totalidade dos pacientes tratados.
É provável, entretanto, que a excepcional adesão ao tratamento, observada no HGOF, tenha decorrido mais do preparo psicológico realizado pelo Serviço Social daquele Hospital que à menor toxidez da morfazinamida. Àquela época, o HGOF dispunha de excelente Serviço Social que realizava primoroso trabalho de convencimento, ajudando os pacientes a suportar os efeitos colaterais de quimioterapia tão prolongada (RIZZO; MAGALHÃES; MOURA, 1969).
Diferentemente do que ocorre em outras infecções, a relação parasita-hospedeiro na tuberculose possui características peculiares. Assim, o Mtb, além de apresentar prolongado tempo de geração, tem a notável capacidade de permanecer em estado de dormência nas secreções caseosas e no interior dos granulomas, achados histopatológicos patognomônicos das micobacterioses. Esse conhecimento, de importante implicação terapêutica, deveu-se ao desenvolvimento
de um modelo de tuberculose experimental em camundongos, pelos pesquisadores da Universidade Cornell, nos Estados Unidos, conhecido como Modelo Cornell da tuberculose dormente ou persistente (McDERMOTT; TOMPSETT, 1954; McCUNE; TOMPSETT, 1956; McCUNE; TOMPSETT; McDERMOTT, 1956).
No estado de inatividade metabólica, dormência, o Mtb não se replica, tornando-se, portanto, tolerante à ação da maioria dos tuberculostáticos, que somente exercem sua ação antibacteriana quando o microorganismo está em multiplicação ativa. Daí, o objetivo de se manterem os esquemas terapêuticos por períodos prolongados é a expectativa de as drogas estarem presentes no organismo, na eventualidade de uma volta do Mtb à atividade metabólica original, tornando-o mais uma vez susceptível à ação das drogas antimicrobianas. A inclusão da Z nos esquemas terapêuticos veio contornar esse problema, haja vista que esse fármaco atua, preferencialmente, na população bacteriana dormente (HU; COATES; MITCHISON, 2006; HEIFETS; LINDHOLM-LEVY, 1992) e tem efeito esterilizante máximo nos primeiros dois meses de terapia, quando o local do processo inflamatório apresenta um pH ácido (ZHANG; MITCHISON, 2003). Além disso, pacientes tratados com esquemas contendo Z têm uma menor taxa de recaída bacteriológica (HONG KONG CHEST SERVICE, 1982).
Assim, a Z, além de essencial nos tratamentos de resgate de pacientes com resistência, passou a ser usada também como um tuberculostático de vanguarda, ao lado de H, R e E, no tratamento de casos recém-diagnosticados de tuberculose. (MUTHURAJ et al., 2010; CONNOLLY; EDELSTEIN; RAMAKRISHNAN, 2007; BARCO et al., 2006).
Por outra parte, a Z é limitada quanto à prevenção da resistência às drogas (MITCHISON, 1985), sendo comum a resistência a Z em pacientes infectados com TB-MDR (LOUW et al., 2006). Portanto, o conhecimento do estado de susceptibilidade a Z de cepas MDR ou XDR, de pacientes já expostos aquele fármaco, é fundamental na prescrição de um tratamento de resgate racional (DORMANDY et al., 2007).
Portanto, o tratamento quimioterápico da tuberculose baseia-se em três características inerentes ao Mtb: aerobiose estrita, multiplicação lenta e alta proporção de mutantes resistentes. De acordo com a lesão e localização no hospedeiro, o bacilo se comporta de maneira diferente, dependendo da disponibilidade de oxigênio. Durante a localização intracelular (macrófago), o
crescimento da micobactéria é lento pela baixa oferta de oxigênio, ação enzimática celular e o pH ácido. Os medicamentos que melhor atuam nesta fase são: R, Z e etambutol (E) (FIÚZA DE MELO et al., 2006). Quando a lesão é caseosa (fechada), o crescimento é intermitente, devido ao pH neutro ou ácido e à presença de necrose tecidual, que produz acúmulo de gás carbônico e ácido lático. A droga mais eficaz e rápida é a R, sendo a atuação da H mais lenta e demorada (BRASIL, 2007).
Atualmente, o esquema de tratamento utilizado no Brasil é composto, nos primeiros dois meses, por quatro comprimidos diários de Coxcip 4®. Cada comprimido contém em dose fixa combinada: R (150 mg), H (75 mg), Z (400 mg) e E (275 mg); e, nos quatro últimos meses, por 2 comprimidos diários de R (300 mg) e H (200 mg). Este esquema é indicado para adultos com peso de 50 quilos ou mais, não previamente tratados e todos os casos de recidiva e retorno após abandono (BRASIL, 2011; CONDE et al., 2009).
2.4 A resistência aos fármacos antituberculose
M. tuberculosis pode apresentar resistência natural aos fármacos contra a
tuberculose, antes mesmo de ser exposto a esses medicamentos. Tal fato se dá em decorrência de mutações genéticas, no processo de multiplicação do bacilo naturalmente (SATO, 2003).
A resistência primária é definida como a resistência a um ou mais fármacos, em pacientes com tuberculose pulmonar, que nunca tenham entrado em contato com as drogas do esquema, ou seja, contaminados por bacilos previamente resistentes (BRASIL, 2011;VARELDZIS et al., 1994; MELO; AFIUNE, 1993).
A resistência adquirida ou secundária é a que se verifica em pacientes com tuberculose inicialmente sensível, que se torna resistente após a exposição aos medicamentos. Tal fato pode ocorrer por tratamentos irregulares, interrompidos antes da eliminação dos bacilos, administração de doses inadequadas ou pela falha na prescrição de medicamento (BRASIL, 2011; VARELDZIS et al., 1994).
A TB-MDR é causada por cepas do Mtb resistentes, pelo menos, a R e H. (CONDE et al., 2009; DYE, 2009; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008). Já a TB-XDR é a resistência a R e H acrescida à resistência a uma fluorquinolona e a um
injetável de segunda linha (amicacina, canamicina ou capreomicina) ( BRASIL, 2011; CONDE et al., 2009; DYE, 2009; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008).
É importante ressaltar que alguns fatores podem aumentar a suspeita de algum grau de resistência do bacilo, como: monoterapia, devido à oferta irregular de drogas, prescrição médica inadequada e, principalmente, a fraca adesão do paciente ao tratamento. Além desses, também influem o tratamento prévio para tuberculose ativa, falha da resposta a tratamento empírico, desde que a adesão ao tratamento tenha sido comprovada (LONG et al., 2009; ZHANG; YEW, 2009).
Outros fatores também podem estar relacionados ao maior risco de indivíduos albergarem cepas de Mtb resistentes são os portadores de comorbidades, falha ou recidiva da infecção em pacientes HIV-positivos, moradores de rua e pacientes atendidos em hospitais/ emergências, delegacias ou prisões que não disponham de medidas efetivas de controle de infecção (KRITSKI, 2010).
A subsequente transmissão de cepas de Mtb resistentes do paciente do índice para os outros agrava o problema. O fenótipo MDR / XDR é causado pelo acúmulo sequencial de mutações em genes envolvidos na resistência individual a drogas (LONG et al., 2009; ZHANG; YEW, 2009). Kritisk e colaboradores (1996) realizaram um estudo na cidade do Rio de Janeiro, avaliando a incidência e os fatores de risco entre comunicantes de TB-MDR. Os autores encontraram que, entre os comunicantes que adquiriram a doença, 46% apresentaram o mesmo perfil de resistência daqueles que, provavelmente, os contaminaram, demonstrando ser este um problema preocupante em saúde pública.
A maioria dos casos de multirresistência no mundo é adquirida por tratamentos irregulares e abandono. No Brasil, aproximadamente 96% dos casos de resistência notificados são adquiridos, sendo que mais da metade tem histórico de três ou mais tratamentos prévios para TB (BRASIL, 2009).
Até março de 2011, um total de 69 países, em todo o mundo, declarou ter identificado, pelo menos, um caso de tuberculose com TB-XDR. Pesquisa na China revelou proporção de TB-MDR de 5,7% em novos casos TB e 25,6% nos casos tratados anteriormente. Inquéritos em Botsuana e na Suazilândia revelaram TB-MDR em casos novos de 2,5% e 7,7%, respectivamente, sugerindo que a proporção de TB-MDR tem aumentado nos últimos 15 anos. Novos dados da África do Sul indicam que a TB-MDR é um problema crescente nesta sub-região, provavelmente, associado com a epidemia de HIV (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2011).
Mundialmente, apenas cerca de 30.000 casos de TB-MDR foram notificados à OMS em 2009, na maior parte dos países europeus e da África do Sul. Isto representa 12% do número estimado de casos de TB entre todos os TB-MDR pulmonar notificados em 2009. Aumento substancial no número de pacientes diagnosticados com TB-MDR é esperado nos três países onde o número estimado de casos é maior: China, Índia e Federação Russa (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010).
Estudo multicêntrico, coordenado pelo Ministério da Saúde, realizado em unidades de atendimento primário, entre 1995 e 1996, demonstrou uma taxa de resistência inicial de 8,5% e de resistência adquirida de 21,8%. A resistência inicial à rifampicina e à isoniazida associadas ocorreu em 0,8% dos casos investigados, e a resistência adquirida a estas drogas foi de 9,2%. Neste estudo, não foi realizada sorologia anti-HIV dos pacientes investigados, e não foram incluídos pacientes atendidos em unidades hospitalares (DALCOMO; ANDRADE; PICON, 2007; NATAL et al., 2002).
Inquérito de resistência aos fármacos antiTB, envolvendo 595 pacientes atendidos em seis hospitais no Rio de Janeiro, entre 2004 e 2006, observou-se uma elevada prevalência de TB multirresistente primária (3,9%), entre 433 pacientes sem histórico de tratamentos anteriores. Em relação a cada droga, houve resistência de 75/595 (12,8%) à H, 50/595 (8,4%) à R, 39/595 (7,0%) à S e 18/595 (3,2%) ao E. (BRITO, 2008).
Estudo realizado no Mato Grosso do Sul demonstrou resistência primária de 3,4% à S, 2,9% à H, 1,7% ao E e ausência de resistência a R. Em relação a resistência adquirida, a mesma pesquisa observou taxas de 7,2% à H, 3,6% à S, 2,2% à R e 1,4% ao E. A resistência combinada foi de 3,7% à H, 3,4% à S, 1,7% ao E e 0,4% à R (MARQUES et al., 2010).
Nos últimos anos, o Brasil e o mundo vêm ampliando os esforços para o controle da tuberculose, que continua sendo um importante e grave problema de saúde pública, essencialmente devido a epidemia da aids, crises econômicas sucessivas, crescimento da população marginalizada urbana e rural, aumento das migrações, falta de sistemas públicos de saúde eficazes e deficit nos programas de controle dessa enfermidade. (LIMA et al., 2008). Notificaram-se em 2009, 75.040 casos novos e de recaídas; destes, 64% tinham escarro positivo. O número absoluto
de casos confirmados de TB-MDR, em 2009, foi de 449 casos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010).
Em Pernambuco, ocorrem aproximadamente 4.230 casos novos de tuberculose ao ano. O estado detém classificação nacional preocupante: 4º lugar nacional em taxa de doença, 2º lugar geral em mortalidade e 1º lugar em número de casos no Nordeste, sendo o Recife a capital brasileira com maior taxa de incidência (48,2%). Em 2009, a taxa de abandono foi de 8,3% (PERNAMBUCO, 2011)
2.5 Resistência e testes de sensibilidade à pirazinamida
A pirazinamida é um derivado do ácido nicotínico, com estrutura similar a da H, mas sem resistência cruzada com a mesma. Essa droga tem sido droga importante de primeira linha. É bem absorvida após a administração via oral e distribui-se amplamente em todo o organismo, atingindo a concentração máxima plasmática em duas horas. É bactericida e tem potente ação esterilizante, principalmente em meio ácido no interior dos macrófagos e em áreas de inflamação aguda (ARBEX et al., 2010; ZHANG et al., 2003).
O conhecimento disponível sobre o mecanismo de ação da Z é inferior ao dos outros agentes antimicobacterianos (CAMPOS, 1999). O Mtb somente quebra a molécula da Z através de sua enzima pirazinamidase-nicotinamidase (PZase), produzindo ácido pirazinoico, a forma ativa da droga, em pH ácido (ZHANG; YEW, 2009; McDERMOTT; TOMPSETT, 1954). Há uma relação direta entre o pH e a concentração inibitória mínima da droga (CIM). Assim, por exemplo, ao pH 5,5 a CIM da Z é em torno de 50 µg / ml. Quando o pH do meio é elevado para 5,8 e 6,1 a CIM aumenta, respectivamente, para 100 e 200 µg / ml. Logo, ocorre um conflito, principalmente, porque um pH mais baixo reduz o crescimento de micobactérias (ARAGÓN et al., 2007). O problema é agravado quando se tenta corrigi-lo pelo aumento do tamanho do inóculo, uma vez que é bem conhecido que um tamanho de inoculo grande reduz a atividade da Z, um efeito que é muito maior do que com outras drogas, ocasionando muitos resultados de falsa resistência. Portanto, os testes de sensibilidade “in house” para a Z fornecem resultados inconsistentes (ZHANG; MITCHISON, 2003; ZHANG et al., 2003)..
A pirazinamida é ativa apenas contra os organismos do complexo Mtb (M. tuberculosis, M. africanum e M. microti), mas não contra o M. bovis, devido às mutações características do gene pncA (ZHANG; YEW, 2009; ROSSETI et al., 2002). Ela tem atividade altamente específica contra Mtb, não exercendo qualquer efeito sobre as outras micobactérias (SILVA, 2011; ZHANG et al., 2003). Cepas do M. bovis, incluindo o bacilo Calmette-Guérin (BCG), são naturalmente resistentes a Z e inativos a enzima pirazinamidase-nicotinamidase (PZase); estes fatores são comumente utilizados para distinguir M. bovis do M. tuberculosis. A resistência natural a Z do M. bovis e BCG é devida a um simples ponto de mutação de “C” para “G”, na posição 169 nucleotídeo do gene pncA, comparado com a sequência pncA do Mtb (ZHANG; YEW, 2009).
A maioria (72-97%) das cepas de Mtb resistentes a Z tem mutação no gene pncA (ZHANG; YEW, 2009; JURÉEN et al., 2008; LOUW et al., 2006; ZHANG; MITCHISON 2003; ROSSETI et al., 2002). Segundo Silva (2011), a atividade defeituosa da pirazinamidase, devido a mutações no pncA, é a principal causa de resistência a Z. Qualquer mutação pontual, perda, inserção ou substituição de nucleotídeos, na cadeia constituinte de seu DNA, incapacita a síntese da PZase (BUTLER; KILBURN, 1983). Outros estudos confirmaram este achado (JURÉEN et al., 2008; LOUW et al., 2006; PORTUGAL et al., 2004). Estas mutações são altamente diversificadas e dispersas ao longo do gene, que é exclusivo para resistência a Z. Apesar disso, há algum grau de concentração em três regiões do pncA, 3-17, 61-85 e 132-142 ( ZHANG; YEW, 2009).
Um achado interessante em Quebec, Canadá, é que muitos isolados clínicos são PZA-monorresistante e todos eles partilham a mesma perfil de mutação pncA. Esse estudo demonstrou que 53 de 57 isolados clínicos de Mtb resistentes a Z apresentavam mutações no gene pncA, indicando que a mutação pncA é o principal mecanismo de resistência à Z em Mtb (CHENG et al., 2000).
Também há estudos demonstrando a ausência na correlação de mutações do gene pncA de isolados de Mtb resistentes a Z, indicando a possibilidade de, pelo menos, um mecanismo adicional mediador de resistência. Relatou-se, anteriormente, a possibilidade da resistência a Z ser adquirida a partir de mutações existentes no alvo do ácido pirazinoico na micobactéria (ROSSETI et al., 2002). Maphele e colaboradores, em 2008, sugeriu a participação de outras regiões
genômicas de Mtb em conferir a resistência a Z: defeitos na absorção da Z no organismo e efluxo ativo do ácido pirazinoico bactericida do organismo.
Muitas vezes, problemas são enfrentados em relação ao teste de sensibilidade a Z. Tais dificuldades estimularam o desenvolvimento de métodos comerciais automatizados. Entre estes, os mais usados são: Bactec 460, MGIT 960 (Becton-Dikinson), BacT ALERT 3D “system” (Bio-Merieux, Durham, NC.). Esses testes têm a desvantagem de serem dispendiosos e têm prazos de validade curtos, impedindo o seu uso em laboratórios clínicos, cuja demanda de testes de sensibilidade para o Mtb é escassa, especialmente naqueles localizados em regiões em desenvolvimento (BRASIL, 2005).
A utilização de métodos moleculares, como é possível com outros tuberculostáticos, é dificultada porque as mutações que levam à Z resistência, que ocorrem no gene pncA, estão dispersas em vários sítios da cadeia de DNA do gene , o que obrigaria o emprego de grande número de sondas se o eventual desenvolvimento de reação em cadeia polimerase (PCR) fosse tentado. Isso obriga a realização do sequenciamento total do gene. O método de sequenciamento, embora útil em trabalhos de pesquisa, é impraticável de ser usado na rotina de laboratórios clínicos (ZHANG; MITCHISON, 2003).
Em decorrência de tais dificuldades, a solução mais prática e mais barata de se reconhecer em laboratório clínico a sensibilidade ou resistência do Mtb à Z é determinar sua capacidade de produzir ou não PZase. O teste da produção de PZase foi, pioneiramente, desenvolvido por Wayne, 1974, com finalidade taxonômica. Todas as espécies componentes do complexo Mtb, exceto o M. bovis, produzem a enzima (KONNO; NAGAYAMA; OKA, 1959). Quando usado como teste de sensibilidade, apenas as linhagens de Mtb sensíveis a Z são capazes de produzir a enzima. Como referido acima, qualquer mutação no gene pncA elimina, na grande maioria dos casos, a capacidade de produção da PZase (ZHANG; MITCHISON, 2003). A maioria das cepas de tuberculose resistentes a Z perderam sua atividade pirazinamidase, dando assim um resultado negativo no ensaio de Wayne (SYRE; OVEREAS; GREWAL, 2010). Todavia, em raros casos, a resistência do Mtb a Z não pode ser explicada por mutações no gene pncA; talvez um outro gene, ainda não reconhecido, possa estar envolvido na resistência (SINGH et al., 2007).
Em pesquisa realizada por Rodrigues e colaboradores (2005), a atividade PZase foi medida em todos os isolados de Mtb. Trinta e nove (97,5%) dos 40
isolados resistentes a Z apresentaram inatividade da PZase, confirmando os testes de sensibilidade, e um isolado mostrou atividade da PZase, mas nenhuma mutação no gene pncA. Neste estudo, descreveu-se a grande diversidade do gene pncA Z em cepas de Mtb resistentes do Brasil. Encontraram-se, também, cepas que não apresentaram uma mutação genética, mas foram pncA PZase negativo, sugerindo a participação de outras regiões genômicas de M. tuberculosis na resistência a Z. Além disso, este estudo revelou doze novas mutações no gene pncA do Mtb que, possivelmente, estão envolvidas na resistência a Z.
Juréen e colaboradores, em 2008, avaliaram o papel das mutações do gene pncA como marcador para detecção de resistência a Z em Mtb. Observou-se resistência à Z em 34/72 dos isolados clínicos, e para as 34 cepas fenotipicamente resistentes a Z, detectou-se mutações do gene pncA em 32 casos, resultando para o teste rápido molecular sensibilidade de 94,1%.
Entretanto, o ensaio PZase ainda é útil para a triagem de isolados de Mtb resistentes a Z e poderia ser usada como um método alternativo, especialmente em países de baixa renda, onde o teste foi altamente sensível (JONMALUNG et al., 2010).
Singh e colaboradores (2007) avaliaram na Índia a susceptibilidade de Mtb a Z através da comparação dos resultados do BacT/ALERT 3D sistema PZA com o método das proporções (LJ) e o ensaio enzimático para PZase. A sensibilidade do ensaio PZase foi de 29/35 (82,85%). A grande utilidade do teste PZase consiste na sua elevada especificidade, como observado nesse estudo 71/72(98,6%). Esse estudo concluiu que considerando a exigencia de tempos para o método proporcional LJ, bem como a incapacidade de alguns isolados de crescer em meio acidificado, o ensaio Pzase, apesar de ser relativamente menos sensível, parece ser um método útil de triagem para testes de susceptibilidade a Z.
Outro estudo evidenciou que, comparado com BACTEC, a sensibilidade, a especificidade do ensaio PZase foi de 83,33% e 100% respectivamente. O método BACTEC radiométrica é um método comumente usado para TS para Z nos países desenvolvidos. No entanto, o ensaio de pirazinamidase pode ser usado como uma alternativa para BACTEC especialmente nas áreas onde não está disponível (KRISHNAMURTHY et al., 2004)
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Determinar a frequência de resistência primária e adquirida à pirazinamida e as outras drogas antiTB de primeira linha, em amostras de escarro positivas para o M. tuberculosis, provenientes de pacientes com tuberculose pulmonar atendidos no Hospital Geral Otávio de Freitas no período de abril a novembro de 2011.
3.2 Específicos
- Verificar a frequência de resistência primária à pirazinamida, realizada em culturas positivas para M. tuberculosis, provenientes de pacientes virgens de tratamento.
- Verificar a frequência de resistência adquirida à pirazinamida, realizada em culturas positivas para M. tuberculosis, provenientes de pacientes com história de tratamento prévio para tuberculose e suspeitos de multirresistência.
- Descrever a susceptibilidade das cepas de M. tuberculosis, provenientes de pacientes virgens de tratamento, com história de tratamento prévio para tuberculose e suspeitos de multirresistência à rifampicina, isoniazida, etambutol e estreptomicina.
- Descrever a atividade da enzima pirazinamidase, nas cepas de M. tuberculosis, provenientes de pacientes virgens de tratamento, com história de tratamento prévio para tuberculose e suspeitos de multirresistência.
-Descrever os fatores de risco para o desenvolvimento de resistência a pirazinamida descritos na literatura (uso prévio de pirazinamida, abandono de tratamento anterior, irregularidade do uso de tratamento anterior).
-Descrever as comorbidades presentes na população do estudo.
4 MÉTODOS
4.1 Desenho do estudo
Estudo prospectivo, descritivo, tipo série de casos, que avaliou a sensibilidade do Mycobacterium tuberculosis frente à pirazinamida, isolado a partir de culturas de escarro em pacientes com tuberculose pulmonar. Foi realizada análise de dados preenchidos em questionário próprio (APÊNDICE B), em pacientes atendidos no Ambulatório, Emergência ou na Enfermaria de Tisiologia do HGOF, no período de abril a novembro de 2011.
4.2 Local do estudo
O HGOF, nomeado inicialmente de Sanatório de Sancho, no bairro de Tejipió, zona oeste do Recife, começou a ser construído ainda na década de 40, mas só foi fundado em 1956. É referência para tratamento de doenças respiratórias, em especial tuberculose, da Secretaria de Saúde do Estado de Pernambuco e presta atendimento ambulatorial, internamento e emergência.
A Enfermaria de Tisiologia do HGOF dispõe de onze leitos para pacientes portadores de tuberculose multidroga resistente e quarenta leitos para os de tuberculose e é referência na rede pública para seguimento desses pacientes. Ainda hoje possui ambulatório de acompanhamento de pacientes multidroga resistente e tem caráter científico, educacional e assistencial.
A análise microbiológica das amostras clínicas utilizadas neste estudo foi realizada no Laboratório Marcelo Magalhães, empresa da rede privada, localizada na cidade do Recife, que realiza cerca de 15.000 exames na área de bacteriologia e biologia molecular e apresenta certificado da Control Lab, da Sociedade Brasileira de Análise Clínica.
4.3 População do estudo
A população do estudo foi constituída por pacientes com tuberculose
pulmonar, atendidos no Ambulatório, Emergência ou Enfermaria de Tisiologia do HGOF, durante o período da coleta no ano de 2011.
Foram incluídos no estudo dois grupos de pacientes. O primeiro constituído por indivíduos recém-diagnosticados, virgens de tratamento (grupo VT), atendidos na emergência, no ambulatório ou internados na enfermaria de tisiologia deste hospital. O segundo grupo foi de pacientes previamente tratados com drogas antituberculose de primeira linha, alguns submetidos a mais de um curso de tratamento e outros internados, fazendo tratamento com drogas de reserva, em retratamento (grupo RT).
4.3.1 Tipo de amostragem
A amostra foi do tipo conveniência, segundo a demanda do HGOF.
4.3.2 Critérios de elegibilidade
- Ter idade igual ou superior a 18 anos, independentemente do gênero;
- Apresentar cultura positiva para Mycobacterirum tuberculosis, isolada no escarro durante o período do estudo do HGOF;
- Estar internado na Enfermaria de Tisiologia ou ter sido atendido no Ambulatório, Enfermaria ou Emergência do HGOF no período do estudo.
4.3.2.2 Critérios de exclusão
- Constatação de contaminação do material de cultura; - Identificação de micobactéria não tuberculosa;
- Ausência de dados no prontuário e/ou impossibilidade de contato com o paciente, não permitindo o preenchimento mínimo de dados de identificação, clínicos e /ou epidemiológicos.
4.4 Definição e categorização das variáveis
- Diagnóstico de tuberculose: quadro clínico suspeito, no momento da coleta do material que resultou em cultura com identificação de Mycobacterium tuberculosis.
- Caso novo ou virgem de tratamento: nunca recebeu tratamento anterior para tuberculose.
- Recidiva de tuberculose: caso de diagnóstico atual de tuberculose bacteriologicamente positiva, com história de tuberculose anterior curada com medicamentos antituberculose.
- Abandono de tratamento: caso de interrupção de tratamento para tuberculose por período igual ou superior a trinta dias.
- Tuberculose multirresistente: cepas de M. tuberculosis resistentes à rifampicina e à isoniazida.
- Tuberculose com resistência extensiva: cepas de M. tuberculosis resistentes à rifampicina, isoniazida e a uma fluorquinolona, associada à resistência a um dos três fármacos injetáveis de segunda linha (amicacina, canamicina, capreomicina).
- Gênero: categorizado em:
1) masculino 2) feminino
- Idade: definida como intervalo de tempo entre a data do nascimento e a da coleta das amostras clínicas. Será categorizada em 3 grupos:
1) 18 – 39 anos 3)>= 60 anos
2) 40 – 59 anos
- Comorbidades: categorizadas em 6 grupos:
1) Alcoolismo: o ato de ingerir bebida alcoólica, categorizada em sim ou não. 2) Diabetes: categorizada em sim ou não
3) Sorologia para HIV: categorizada em positivo, negativo ou não realizado
4)Tabagismo: hábito de fumar à época da aplicação do questionário ou já ter fumado antes, categorizada em sim ou não
5) Uso de drogas ilícitas: categorizada em sim ou não 6) Não referida
- Tratamento anterior TB: caracterizado em 5 grupos: 1) Uso prévio pirazinamida: categorizado em sim ou não
2) Abandono de tratamento anterior: interrupção de tratamento para TB por período igual ou superior a 30 dias, categorizado em sim ou não
3) Irregularidade de tratamento anterior, categorizado em sim ou não 4) Alta por cura
4.5 Plano de coleta de dados
Os pacientes com tuberculose pulmonar atendidos no HGOF, no período de abril a novembro de 2011, e que foram elegíveis para o estudo, segundo os critérios de inclusão e de exclusão, foram encaminhados pelos residentes de pneumologia e pela pesquisadora responsável pelo estudo, que também é médica pneumologista.
O atendimento desses pacientes foi realizado pela pesquisadora responsável pelo estudo, em uma das salas de atendimento médico do HGOF. Os pacientes foram então convidados a participar da pesquisa. Os objetivos, riscos e benefícios do estudo foram informados aos pacientes com 18 anos ou mais, enfatizando seu direito de participar ou não da pesquisa. Aos que concordaram em participar do estudo, foi solicitada a assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido (APÊNDICE A). Esse termo documento foi então entregue aos pacientes com 18 anos ou mais para assinatura em duas vias, ficando uma com o pesquisador e outra com o paciente ou seu responsável legal.
Na ocasião do atendimento, os seguintes dados foram coletados de cada paciente participante do estudo, para preenchimento da ficha de coleta de dados (APÊNDICE B): nome, idade, gênero, telefones de contato, município onde reside, tipo de moradia, hospitalização, comorbidades associadas, sinais e sintomas, tratamento anterior para tuberculose (quantos e quais drogas utilizadas), medicações em uso. Foram solicitados, ainda, os exames laboratoriais: exame direto em amostra de escarro e cultura de escarro, nos quais serão realizados os métodos convencionais para identificação direta e cultura para Mtb; exame radiológico de tórax e sorologia para HIV.
4.6 Coleta e transporte das amostras
Após a coleta dos dados dos pacientes, foi feita a coleta de amostra do escarro, em recipiente estéril, de preferência em jejum, antes da escovação dos dentes. O material foi coletado em recipientes de propiletileno estéreis e foi enviado após coleta, o mais rapidamente possível, ao laboratório, em caixas de isopor
contendo gelo para evitar crescimento bacteriano excessivo, o que prejudicaria a avaliação do bacilo álcool-ácido resistente (BAAR). Os espécimes aquosos não purulentos ou mucóides foram descartados e, eventualmente, substituídos por outros adequados.
4.7 Análise do material coletado
4.7.1 Digestão e descontaminação do escarro
No laboratório foi, inicialmente, preparada uma lâmina direta do escarro e corado com azul de metileno, com a finalidade de verificar se o espécime é adequado, isto é, se apresenta uma superioridade igual ou maior que 75% de células polimorfonucleares (leucócitos) em relação a células epiteliais pavimentosas. Os espécimes que não preencheram esse requisito foram descartados da pesquisa.
Os espécimes foram descontaminados, obedecendo-se às recomendações publicadas no Manual of Clinical Microbiology 9ª edição, utilizado o método N-acetil cisteína hidróxido de sódio (NALC-NaOH).
Aproximadamente 2 a 4 ml do escarro foram transferidos para tubo de polipropileno graduado de 50 ml e adicionada, cuidadosamente, igual quantidade da solução NALC-OHNa. O tubo foi fechado e agitado em “shaker” durante 15 minutos. Adicionou-se a solução tampão e centrifugou-se a 3000 X g por 15 a 20 minutos. Foi decantado o líquido sobrenadante em reservatório contendo desinfetante. O sedimento obtido foi utilizado para o preparo de estiramentos em lâmina para a pesquisa direta de BAAR, cultura e testes moleculares.
O sedimento (1µl) obtido após a descontaminação foi utilizado para o preparo de estiramentos em lâmina de microscopia, secos ao ar, fixados em metanol por cinco minutos e submetidos à coloração de Ziehl-Neelsen (LIMA et al., 2008).
Para realizar o procedimento, a lâmina foi coberta totalmente com a fucsina e aquecida até a emissão de vapores. Completou-se a cobertura da lâmina com fucsina e, se necessário, repetir-se-ia o aquecimento por mais duas vezes.
4.7.3 Cultura do escarro para micobactérias
Para o cultivo de micobactérias foram utilizados o meio sólido de Lowenstein-Jensen (LJ) (Difco etc) e o meio líquido 7H9 Middlebrook, enriquecido com albumina bovina, glicose, catalase e ácido oleico (OADC; Becton-Dickinson Co. MD – USA), econtendo uma mistura de antibióticos, polimixina B, anfotericina B, ácido nalidíxico, trimetoprim e azlocilina (PANTA; Becton-Dickinson). Esses meios de cultivo foram preparados como prescrito pelos fabricantes.
Os tubos contendo os meios foram inoculados com aproximadamente 20 uL do sedimento descontaminado, usando-se para isso uma alça de nicrome. Os meios de cultivo foram colocados em estufa a 37º C e exames para detectar a presença de crescimento bacteriano foram realizados após 7 dias de incubação, com o objetivo de detectar eventual micobactéria de crescimento rápido e, em seguida, após 30 e 60 dias, antes de descartadas como negativas (LEMAITRE et al., 2004).
Na identificação das culturas empregou-se a PCR em tempo real, ensaio in house. A plataforma utilizada foi a TaqMan com o desenho dos iniciadores e sondas desenvolvidos e validados anteriormente (LEMAITRE et al., 2004).
Todas as culturas positivas foram submetidas a teste de sensibilidade. Utilizou-se o método das proporções, opção indireta, de Canetti (CANETTI et al., 1963). Foi investigada em todas as amostras a sensibilidade a rifampicina, pirazinamida, isoniazida, etambutol e estreptomicina. As drogas foram adicionadas ao meio de Lowenstein-Jensen, nas seguintes concentrações: estreptomicina 4 µg / ml, isoniazida 0,2 µg / ml, rifampicina 40 µg / ml e etambutol 4 µg / ml. Os meios de Lowenstein-Jensen com e sem drogas foram coagulados a 80ºC, durante 45 minutos. Os testes de sensibilidade à pirazinamida, 200 ug / ml, foram realizados em meio 7H9 OADC com o pH ajustado para 5,9.
Transferiu-se com alça de nicrome pequena porção (1µl) da cultura bacteriana do meio de Lowenstein-Jensen para 1 ml de salina, em tubo de hemólise esterilizado e, em seguida, agitou-se fortemente em “shaker”. Deixou-se em repouso por 1 minuto para sedimentação de eventuais aglomerados e foi transferido o sobrenadante, turvação equivalente a 0,5 da escala de Mc Farland, para outro tubo de hemólise. Os meios de cultivo com e sem drogas foram inoculados usando-se alça de nicrome de 10 µL.
Como controle para avaliação da proporção de colônias resistentes, o inóculo bacteriano, diluído 1:100, também foi inoculado em meios sem droga. A cultura foi considerada resistente, quando a quantidade de colônias observadas nos meios contendo droga fosse igual ou superior à observada no meio controle inoculado com a suspensão bacteriana diluída 1:100.
4.7.5 Teste da pirazinamidase
Para a preparação do meio de cultura colocou-se o balão em forno de micro-ondas para dissolver os ingredientes: meio líquido 7H9 de Middlebrook , glicerol, agarose ,pirazinamida (Sigma & Adrich etc ) e água destilada. Foi distribuído o meio à razão de 2 ml, em tubos de vidro 100 / 10 mm e em autoclave a 120°C, durante 20 minutos. O meio foi solidificado, deixando-se os tubos na posição vertical.
O teste da PZase foi realizado pelo método de Singh e colaboradores ( 2007), uma modificação do método clássico desenvolvido, pioneiramente, por Wayne (1974). Estudo preliminar, realizado neste laboratório, demonstrou que o método modificado (SINGH et al., 2007) é mais sensível e de avaliação mais consistente que o método original (WAYNE et al., 1974).
Na realização do teste, aproximadamente, 10 mg de culturas jovens, 21 a 30 dias, cultivadas em meio de Lowenstein-Jensen, foram dissolvidas em 25 µL de salina, previamente adicionados à superfície do meio. O meio foi escarificado com a alça usada na transferência do inóculo, de modo que parte da cultura se situe ligeiramente abaixo da superfície do meio. Para cada caso, dois tubos foram inoculados e incubados a 37 °C.
Após quatro dias, adicionaram-se a um dos tubos 500 µL de uma solução de sulfato de ferro e amônio a 1%, preparada imediatamente antes do uso. Qualquer mudança de tonalidade para a cor rosa ou castanho foi considerada como reação positiva. Se este tubo testou negativo, sua duplicata foi reincubada e nova avaliação realizada ao décimo dia. Todas as culturas PZase negativas foram submetidas a uma PCR em tempo real (PINSKY; BANAEI, 2008), visando-se à deleção da sequência genômica RD4, para afastar a possibilidade de se tratar de uma cepa de M. bovis, microorganismo intrinsecamente resistente à pirazinamida.
4.7.6 Controles
Culturas de M. tuberculosis H37Rv e de M. bovis BCG foram utilizadas, respectivamente, como controles positivos e negativos da reação.
