Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Tese
Novas abordagens para o desenvolvimento de uma
vacina contra a leptospirose
Amilton Clair Pinto Seixas Neto
Novas abordagens para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do Conhecimento: Vacinologia).
Orientador: Prof. Dr. Éverton Fagonde da Silva
Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
BANCA EXAMINADORA
Profª. Dra. Cláudia Pinho Hartleben (CDTec, UFPel)
Profª. Dra. Rita de Cássia dos Santos da Conceição (Fac. Veterinária, UFPel) Dr. Leonardo Garcia Monte (CDTec, UFPel)
Prof. Dr. Éverton Fagonde da Silva (Orientador, Fac.Veterinária, UFPel)
S462N SEIXAS NETO, AMILTON CLAIR PINTO
NOVAS ABORDAGENS PARA O DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA CONTRA A LEPTOSPIROSE / AMILTON CLAIR PINTO SEIXAS NETO. – 85F. : IL. – TESE
(DOUTORADO). PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS. CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO, 2014. – ORIENTADOR ÉVERTON
FAGONDE DA SILVA ; CO-ORIENTADOR ODIR ANTONIO DELLAGOSTIN.
1.BIOTECNOLOGIA. 2.LEPTOSPIRA INTERROGANS.
3.VACINOLOGIA REVERSA. 4.BOVINOS. 5.ANIMAIS. I.SILVA, ÉVERTON FAGONDE DA. II.DELLAGOSTIN, ODIR ANTONIO. III.TÍTULO.
CDD: 614.56
Para minha esposa e família com carinho e gratidão. Dedico.
A Deus em primeiro lugar, que sempre esteve ao meu lado.
A Universidade Federal de Pelotas, ao PPGB e ao CNPq, pela oportunidade de realização deste trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Éverton Fagonde da Silva, pela confiança, amizade, companheirismo e ensinamentos.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Odir Dellagostin, pela amizade, competência e suporte.
A minha esposa e amiga Ellen Souza, por todo amor e companheirismo nos momentos de conquistas e perdas, e por sempre me incentivar acreditando em meu potencial.
Aos meus pais pelo carinho e incentivo, aos meus tios, em especial a minha tia Fabiana Seixas e o tio Tiago Collares que me apoiaram em todas as etapas de minha formação sempre com palavras sábias.
Aos meus avós, pelo carinho, confiança, sabedoria em especial aos meus avós Amilton Seixas e Dalva Kommling. Ao meu sogro Vanderlei Souza e minha sogra Elgi Alice pelo apoio e amizade.
Aos meus amigos e colegas de laboratório de Vacinologia, Thais, Carol, Sergio, Charles, Jéssica,, Rodrigo ao André Alex, Samuel, Michel, Najara, e Karina, pelo suporte, apoio, incentivo e amizade.
Aos demais colegas do laboratório de Vacinologia (Laboratório 7), estagiários e amigos do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTec), pela amizade apoio e convívio agradável.
. À equipe do Biotério Central da UFPel por todo o auxílio durante os experimentos, especialmente ao pessoal da experimentação, Cristiano, Juliana, Fabiane, Patricia e Cristina por todo o suporte e amizade.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
“O êxito é fácil de se obter, o difícil é merecê-lo”.
Seixas Neto, Amilton. Novas abordagens para o desenvolvimento de uma vacina
contra a leptospirose. 2014. 85f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação
em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A leptospirose é uma zoonose que possui distribuição mundial, causando um importante impacto econômico no setor agropecuário. Atualmente, as vacinas empregadas para a prevenção da enfermidade são formuladas com culturas de leptospiras inteiras inativadas, as quais possuem sucesso limitado, já que induzem uma imunidade de curta duração e proteção sorovar-específica. Resultados preliminares revelaram que fragmentos recombinantes das proteínas Ligs (Leptospiral immunoglobulin-like) são antigênicas, imunogênicas e conferem proteção total ou parcial contra o desafio homólogo em hamsters. Dessa forma, fragmentos rLigs são candidatos potenciais para uma vacina de subunidade contra a leptospirose humana e animal. Assim sendo, a proposta deste projeto foi avaliar preparações vacinais com as proteínas recombinantes LigA625-1224aa (rLigANI), LigB131-649aa (rLigBRep), LigB625-1044aa (rLigB7-11) e LigA131-1224aa (rLigAFull) quando administradas com Hidróxido de Alumínio como adjuvante, individualmente ou combinadas, a fim de identificar quais formulações serão capazes de induzir uma resposta protetora contra o desafio homólogo. Hamsters machos e fêmeas foram imunizados com as preparações através da via intramuscular, nos dias 0 e 14, e o desafio homólogo foi realizado através da via intraperitoneal, no dia 28, utilizando Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. Após a expressão e purificação das quatro proteínas, obteve-se quatro lotes com pureza de 90%. Todas as quatro proteínas recombinantes apresentaram antigenicidade, reagindo contra soro de humanos e animal convalescentes de leptospirose. A imunização dos hamsters contendo as preparações com rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11 e rLigAFull conferiram proteções variáveis (0-100%) contra o desafio homólogo. Embora nenhuma preparação tenha induzido a uma proteção esterilizante, evidenciada através das técnicas de reisolamento e imunofluorescência, a associação entre rLigANI e rLigBRep foi capaz de conferir proteção significativa (p<0,05) em todos os experimentos. Em contrapartida, o fragmento inteiro de LigA, assim como rLigB7-11, não conferiram proteção. Nosso estudo propôs uma nova abordagem para o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a leptospirose. É o primeiro estudo que testou a proteína LigA recombinante em sua forma inteira. Além disso, foi possível obter a sua expressão na forma solúvel. Embora a proteína obtida tenha sido reconhecida por soros de humanos convalescentes in vitro, foi capaz de conferir apenas níveis de sobrevivência significativa (p<0,05) aos animais desafiados, mas não em relação à mortalidade. Por outro lado, a associação entre rLigBRep e rLigANI, outra abordagem inédita, demonstrou que mesmo testando-se em diferentes doses (40g ou 60g) de cada alvo, tanto a análise de mortalidade quanto a de sobrevivência revelou resultados significativos (p<0,01) em três dos cinco experimentos realizados. Os resultados obtidos em nosso estudo representam uma contribuição importante para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose.
Palavras-chave: Leptospira interrogans, Vacinologia Reversa, Bovinos; Animais
leptospirosis. 2014. 85f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Leptospirosis is a worldwide zoonosis, causing a major economic impact on the agricultural sector. Currently, the vaccines used to prevent disease in cattle are formulated with inactivated Leptospira whole-cell bacterins, which have limited success, since they induce an immunity of short duration and serovar-specific protection. Preliminary results from our group showed that recombinant fragments of Lig (leptospiral immunoglobulin-like) proteins are antigenic, immunogenic and confer full or partial protection against homologous challenge in hamster model. Thus, rLigs fragments are potential candidates for a subunit vaccine against human and animal leptospirosis. Therefore, the purpose of this study was to evaluate vaccine preparations with recombinant proteins LigA625-1224aa (rLigANI), LigB131-649aa (rLigBRep), LigB625-1044aa (rLigB7-11) and LigA131-1224aa (rLigAFull) when administered with Alum Hydroxide as adjuvant, either individually or combined, in order to identify formulations that are capable of inducing a protective response against homologous challenge. Male and female hamsters were immunized with the preparations by intramuscular injection on days 0 and 14, and the homologous challenge was performed using Leptospira interrogans serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130, by intraperitoneal injection on day 28. Following expression and purification of the four proteins were obtained four batches with a purity of 90%. All four recombinant proteins showed antigenicity, reacting against human sera with convalescent leptospirosis. Immunization of hamsters with preparations containing rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11, and rLigAFull conferred variable protection (0-100%) against homologous challenge. Although no preparation has induced a sterilizing protection, evidenced by the isolation and immunofluorescence techniques, the association between rLigANI and rLigBRep was able to confer significant protection (p <0.05) in all experiments. In contrast, the LigAFull as well as rLigB7-11, did not provide protection. Our study has proposed a new approach for the development of a recombinant vaccine against bovine leptospirosis. It is the first study that tested the rLigA in its entire form. Furthermore, it was possible to obtain expression in soluble form. Although the protein obtained has been recognized by sera from convalescent human in vitro, it was only capable of conferring significant levels of survival (p <0.05) to challenged animals but not in relation to mortality. Moreover, the association between rLigBRep and rLigANI, another novel approach, testing showed that even at different doses (40 g ou 60 g) of each target, both the analysis of the mortality and survival showed significant results (p <0.01) in three of the five experiments. The results obtained in our study represent an important contribution to the development of a vaccine against leptospirosis.
Keywords: Leptospira interrogans, Reverse Vacinology, Bovine; Domestic Animals
Figura 1. SDS-PAGE para a análise da pureza das proteínas recombinantes... 26
Figura 2. Antigenicidade das proteínas recombinantes... 26
Figura 3. Curvas de sobrevivência dos experimentos 1 e 2... 30
Figura 4. Curvas de sobrevivência dos experimentos 3, 4 e 5... 30
Figura 5. Avaliação da colonização renal, hepática e pulmonar através da técnica de imunofluorescência... 32
Tabela 1. Imunoproteção com machos e o desafio com 1000 leptospiras... 27
Tabela 2. Imunoproteção com machos e o desafio com 500 leptospiras... 27
Tabela 3. Imunoproteção com fêmeas e o desafio com 500 leptospiras... 28
Tabela 4. Imunoproteção com machos e o desafio com 500 leptospiras... 28
Tabela 5. Imunoproteção com machos e o desafio com 500 leptospiras... 28
Tabela 6. Avaliação da colonização renal, hepática e pulmonar através da análise microbiológica e imunofluorescência dos 5 experimentos... 31
E. coli -Escherichia Coli
ELISA - Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay LPS - Lipopolissacarídeo
MAT- Teste de aglutinação microscópica PCR – Reação em cadeia de polimerase BSA- Albumina sérica bovina
FITC- Fluorescein isothiocyanate OMP - Proteína de membrana externa
1INTRODUÇÃO GERAL………. 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA……… 16
2.1 A importância da leptospirose………. 16
2.2 Leptospirose bovina……….. 17
2.3 Vacinas para a leptospirose bovina……… 18
3 HIPÓTESE E OBJETIVOS……….. 21 3.1 Hipótese……….. 21 3.2 Objetivo Geral……… 21 3.3 Objetivos Específicos……… 21 4 CAPÍTULOS………... 22 4.1 Relatório de Atividades………. 22 4.1.1 Material e Métodos……….. 22
4.1.1.1 Cepas, cultivo e extração de DNA……… 22
4.1.1.2 Animais... 22
4.1.1.3 Expressão e padronização das proteínas rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11 e rLigAFull... 22
4.1.1.4 Formulação das proteínas com adjuvante Hidróxido de Alumínio e os grupos controles... 23
4.1.1.5 Ensaios de antigenicidade... 23
4.1.1.6 Ensaio de imunoproteção... 24
4.1.1.7 Avaliação microbiológica... 24
4.1.3 Discussão... 32
4.1.4 Conclusões... 35
5 CONCLUSÃO GERAL... 36
6 REFERÊNCIAS... 37
7 ANEXOS... 42
Anexo A – Artigo submetido para Brazilian Journal of Microbiology... 42
Anexo B – Manuscrito a ser submetido ao periódico PLOS ONE... 48
1 INTRODUÇÃO GERAL
A leptospirose, enfermidade causada por uma espiroqueta do gênero
Leptospira, tem sido reconhecida como um importante problema de saúde pública
no mundo inteiro, sendo considerada a zoonose geograficamente mais difundida no mundo (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010).
No Brasil, a leptospirose é uma doença endêmica com sério risco à saúde pública. A manutenção de leptospiras em regiões rurais e urbanas é favorecida pelo clima tropical associado a uma enorme população de roedores, acúmulo de lixo e crescimento desordenado dos centros urbanos com aumento das favelas e construções desordenadas nas periferias, com mínimo ou nenhum saneamento básico (KO; GOARANT; PICARDEAU, 2009).
Como consequência da leptospirose animal, a indústria agropecuária sofre grande impacto econômico, com graves prejuízos para os produtores rurais, devido principalmente as perdas por abortos, natimortos, infertilidade e redução na produção de leite (ADLER; DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010). Entretanto, ainda são escassos os dados oficiais referentes à ocorrência da enfermidade em animais no Brasil. Além do importante impacto econômico, a doença nos bovinos é considerada um fator de risco ocupacional para veterinários, magarefes e produtores rurais (FAINE et al., 1999; LEVETT, 2001). O controle da leptospirose depende principalmente de medidas sanitárias básicas e eficientes. No entanto, poucas medidas efetivas para prevenção da leptospirose têm sido implantadas (McBRIDE et al., 2009).
Na área veterinária as vacinas disponíveis comercialmente para o controle da leptospirose são baseadas na célula inteira inativada ou em preparados da membrana de leptospiras patogênicas. Estes tipos de vacinas conferem resposta protetora pela indução de anticorpos contra os lipopolissacarideos (LPS) destas bactérias (ADLER; DE LA PEÑA-MOCTEZUMA, 2010), podendo prevenir o desenvolvimento da doença, mas não a leptospirúria (MINKE et al., 2009). Nas imunizações a resposta gerada é predominantemente humoral e sorovar específica (COSSON et al. 2014). Assim, protegem somente contra infecções causados por sorovares homólogos ou antigenicamente relacionados.
As vacinas convencionais contra leptospirose para uso veterinário, possuem falhas ao induzir proteção cruzada contra a infecção. As vacinas baseadas na célula
inteira inativada (bacterinas) estimulam imunidade restrita (6 a 12 meses), havendo necessidade de repetir a vacinação para manutenção da imunidade (COSSON et al. 2014). Existe um grande número de sorovares patogênicos (superior a 260) o que impõe uma maior limitação para a produção de uma vacina com componentes multisorovar (CERQUEIRA et al., 2010 ).
A identificação de componentes imunogênicos com potencial para o desenvolvimento de vacinas recombinantes resultou na caracterização de proteínas de membrana externa (DELLAGOSTIN et al., 2011). Dados preliminares indicam que as proteínas Lig (Leptospiral immunoglobulin-Like) possuem um grande potencial para o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra leptospirose, pois são proteínas de membrana externa presentes em espécies de leptospiras patogênicas e a sua expressão ocorre somente durante a infecção (FIGUEIRA et al., 2011).
Neste contexto, a importância do desenvolvimento de uma vacina protetora contra a leptospirose bovina, que tenha amplo espectro e que confira imunidade de longa duração torna-se necessária. Dessa forma, utilizamos as proteínas recombinantes LigA625-1224aa (LigANI), LigB131-649aa (LigBRep), LigB625-1044aa (LigB7-11) e LigA131-1224aa (LigAFull), purificadas e formuladas, separadamente ou combinadas, com o adjuvante hidróxido de alumínio, a fim de identificar quais formulações induzem uma resposta protetora em hamster (Mesocricetus auratus), um modelo animal suscetível a leptospirose.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A importância da leptospirose
A leptospirose é uma doença infecciosa endêmica causada por espécies patogênicas de bactérias do gênero Leptospira. Ela afeta os humanos e animais e constitui um sério problema de saúde pública e veterinária. As condições precárias de saneamento básico, associadas à elevada intensidade das chuvas, principalmente em países tropicais, têm contribuído para o aumento da incidência da enfermidade tanto nos centros urbanos como no meio rural (KO, GOARANT e PICARDEAU, 2009).
Estima-se que a ocorrência da leptospirose seja de aproximadamente 500 mil novos casos por ano (HARTSKEERL et al., 2011; WHO, 2011). Porém, acredita-se que esse número seja subestimado em função da precariedade da vigilância sanitária em alguns países, dos sintomas pouco específicos e da limitação para o diagnóstico na fase inicial da doença (ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010).
No Brasil, assim como em outros países em desenvolvimento, a doença é amplamente negligenciada e a qualidade do diagnóstico e do controle varia de Estado para Estado. Nos últimos 15 anos, estados como o Piauí e Roraima relataram menos que 20 casos confirmados de leptospirose humana, enquanto Estados como São Paulo e Rio Grande do Sul chegam a relatar mais de mil em apenas um ano (BRASIL, 2012).
Na epidemiologia da leptospirose, a fonte de infecção mais comum no meio urbano é o rato de esgoto (Rattus norvegicus), o qual é considerado o principal reservatório do agente. O rato possui a urina alcalina, que é propícia à sobrevivência das leptospiras e uma leptospirúria de longa duração. É provável que todos os mamíferos e algumas espécies de roedores, marsupiais sejam os principais portadores e excretores de leptospiras. Entretanto, há relatos do isolamento do agente de anfíbios, répteis, aves, peixes e invertebrados em diversos locais do mundo (MONAHAN et al., 2009).
Fatores de virulência das leptospiras como as adesinas e hemolisinas têm sido estudados para um melhor entendimento dos mecanismos de ação dessas bactérias no hospedeiro, como também a resposta imune contra esses patógenos (CULLEN; HAAKE; ADLER, 2003; KLIMPEL; MATTHIAS; VINETZ, 2003;
VIRIYAKOSOL et al., 2006; VERMA et al., 2006). Um importante foco desse estudo inclui a identificação das proteínas da membrana externa (OMPs) envolvidas na patogênese da leptospirose (HAAKE, 2000). Devido a sua localização sobre a superfície celular, as OMPs leptospirais são relevantes para o entendimento das interações hospedeiro-patógeno. Uma família de proteínas com estrutura similar às adesinas bacterianas foi recentemente identificada e pode ter um papel importante na patogênese das leptospiras. Essas proteínas têm domínios repetidos em tandem semelhantes às imunoglobulinas e, por isso, foram denominadas Lig (leptospiral
immunoglobulin-like) (CULLEN; HAAKE; ADLER, 2003).
2.2 Leptospirose Bovina
A leptospirose animal no Brasil não é uma doença de notificação compulsória. Por esse motivo, a enfermidade não é submetida a um controle organizado por órgãos e entidades públicas ou privadas de sanidade animal, dificultando o verdadeiro conhecimento da extensão das infecções por Leptospira em qualquer região do país (ARAÚJO et al., 2005). Assim, dados oficiais referentes à ocorrência da leptospirose em bovinos no Brasil ainda são pouco disponíveis.
A leptospirose bovina resulta em graves prejuízos para os produtores rurais, e conseqüentemente, para a economia dos países acometidos. A doença que normalmente manifesta-se na forma crônica assintomática, apresenta elevados índices de abortos e animais natimortos, infertilidade de machos e fêmeas, e a redução na produção de leite (ELLIS, 1994). Estes problemas normalmente estão associados com o sorovar Hardjo que determina a síndrome da queda do leite ou
milk drop syndrome (ELLIS et al., 1976; HIGGINS et al., 1980; MARTINS et al.,
2011). Embora a taxa de mortalidade nesta espécie seja baixa (5%), a morbidade geralmente é alta de acordo com as apresentações clínicas (ELLIS et al., 1985).
Os bovinos são considerados reservatórios do agente e devido à proximidade com os humanos representam também uma fonte de infecção, sendo considerada como um fator de risco ocupacional para veterinários (LEVETT, 2001), magarefes (DORJEE et al., 2011) e produtores rurais (ADLER; de la PEÑA MOCTEZUMA, 2010). No final da década de 50, surgiram os primeiros trabalhos sobre a leptospirose bovina no Brasil, com a identificação da infecção pelo sorovar Pomona em um feto bovino (FREITAS, 1957). Este fato despertou interesse por
parte de pesquisadores brasileiros, e a pesquisa de anticorpos anti-Leptospira em rebanhos bovinos e o isolamento do agente passaram a ser realizados com maior interesse no Brasil (LILENBAUM, 1996). Embora os inúmeros trabalhos disponíveis publicados apresentem delineamentos experimentais, taxas de prevalência e incidência, períodos de execução e amostragem variáveis, todos convergem para que a leptospirose bovina no Brasil seja considerada uma enfermidade endêmica.
A prevalência sorológica em bovinos é estimada em torno de 35%, com mais de 80% das propriedades rurais apresentando casos da doença (LILENBAUM, DOS SANTOS, 1995; MARTINS et al., 2011). Esses dados da leptospirose em bovinos foram obtidos através de investigações sorológicas realizadas em várias regiões do país, com a utilização do teste de soroaglutinação microscópica (MAT), o qual é o teste padrão-ouro para o diagnóstico sorológico da leptospirose (WHO, 2003). Apesar de apresentar uma elevada sensibilidade e especificidade, o MAT é dependente do painel de antígenos empregado e dos critérios adotados para a interpretação dos exames (ADLER; de la PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Além disso, para a obtenção do máximo de confiabilidade e padronização do MAT, os laboratórios credenciados para sua execução são encorajados a solicitar periodicamente um painel de cepas aos laboratórios de referência nacionais e realizarem o teste internacional de proficiência, que é o controle de qualidade internacional do teste, o qual é organizado pela Sociedade Internacional de Leptospirose (ILS) (CHAPPEL et al., 2004; HARTSKEERL, 2005).
2.3 Vacinas para leptospirose bovina
A vacinação contra leptospirose bovina é realizada com bacterinas dos sorovares endêmicos para a espécie no mundo. Esta vacinação apresenta uma série de limitações, onde se destacam: reações adversas à vacina; proteção apenas contra os sorovares incluídos na vacinação; necessidade de estudos epidemiológicos continuados para conhecer todos os sorovares endêmicos e incluí-los na vacinação; resposta imune de curta duração, necessitando de múltiplas doses para manutenção da imunidade (DELLAGOSTIN et al., 2011). Além disso, a resposta imune protetora é pouco compreendida. Na maioria das espécies a vacinação parece induzir resposta humoral com predomínio de anticorpos protetores
anti-LPS. Em bovinos, bacterinas que induzem altos títulos de anticorpos anti-LPS não são protetoras, enquanto bacterinas que induzem potentes respostas celulares apresentam maior proteção (ZUERNER et al., 2011).
Apesar de estar associada com a redução dos casos e uma eficácia maior que 70%, as vacinas compostas por bacterinas estão associadas a efeitos colaterais, sistêmicos e locais, como dor, febre, e, ainda, pode estar relacionada com doenças autoimunes, como a uveíte (FAINE et al., 1999; SANCHES et al., 2000; KOIZUMI, WATANABE, 2005). Estes foram os motivos que levaram a China e o Japão a testar uma nova formulação para a vacina, passando a utilizar a membrana externa, a qual demonstrou menos efeitos colaterais e proteção quando comparado a bacterina (YAN et al., 2003; KOIZUMI, WATANABE, 2005). Entretanto, independente da formulação, a imunização ainda é sorovar-específico, oferecendo uma proteção de curta duração e frequentemente necessita de várias doses. Assim sendo, a procura por uma vacina que ofereça proteção com ausência de efeitos colaterais, efetiva contra a leptospirose aguda e crônica é altamente desejável (KO, GOARANT e PICARDEAU, 2009). Atualmente, o foco está nas vacinas recombinantes, sejam elas de subunidade ou DNA, vetorizadas ou não.
Devido a essas limitações, diversos estudos têm focado no desenvolvimento de vacinas recombinantes contra leptospirose. As proteínas LipL41 e OmpL1 demonstraram proteção parcial quando co-administradas em hamsters (HAAKE et al., 1999). A lipoproteína de membrana externa LipL32, a proteína mais abundante na superfície da bactéria, já foi apresentada ao sistema imune via adenovírus (BRANGER et al., 2001) e BCG recombinante (SEIXAS et al., 2007), e na forma de vacina de DNA (BRANGER et al., 2005) e vacina de subunidade (SEIXAS et al., 2007; GRASSMANN et al., 2012), porém todas as estratégias apresentaram baixa eficácia. O potencial imunoprotetor de formulações vacinais com as proteínas Ligs combinadas a diferentes adjuvantes também já foi avaliado, apresentando os resultados mais promissores encontrados até então (DELLAGOSTIN et al., 2011).
A proteína LigA conferiu proteção esterilizante quando fusionada à glutationa-S-transferase e administrada com hidróxido de alumínio, porém esta não foi significativa (PALANIAPPAN et al., 2006). A porção C-terminal desta proteína (LigAni) protegeu 67-100% dos hamsters de desafio letal com Leptospira
interrogans, utilizando adjuvante de Freund, porém não conferiu imunidade
protetor, mas novamente sem significância estatística (FAISAL et al., 2008). A lipoproteína LigB, foi avaliada para utilização no diagnóstico de leptospirose bovina por ELISA, no qual, 49% das amostras foram positivas, apresentando sensibilidade de 100% e especificidade de 97,1% (SANKAR et al., 2010). A imunização com vacina de DNA codificando LigBrep resultou na sobrevivência de 62,5% dos hamsters contra a infecção letal. A vacina induziu uma resposta de anticorpos IgG e, além disso, conferiu imunidade esterilizante em 80% dos animais sobreviventes (FORSTER et al., 2013).
As vacinas de subunidade possuem vantagens como a produção de poucos efeitos colaterais, porém, também estão tradicionalmente ligadas a uma baixa resposta imune. A fim de contornar este problema, adjuvantes moduladores de resposta imune são comumente empregados nas formulações vacinais de vacinas de subunidade (McKEE et al., 2010). O adjuvante mais utilizado atualmente e o único permitido para a vacinação humana são os sais minerais de alumínio, tais como o hidróxido. Apesar de ser considerado um adjuvante pouco potente, o alumínio induz majoritariamente uma resposta Th2 (anticorpos IgG1) (LIU, 2010) e não está relacionada a série de problemas encontrados nos adjuvantes oleosos.
Mais estudos necessitam ser realizados a fim de se conhecer a melhor formulação assim como as características imunes geradas por este tipo de vacina. Atualmente, muitos dos trabalhos sobre vacinas para leptospirose são feitos em
Mesocricetus auratus, tradicionalmente conhecido como hamster sírio capa dourada.
Embora as cepas patogênicas de Leptospira tenham a capacidade de infectar uma grande variedade de animais, o hamster sírio é o modelo animal suscetível à infecção e também por apresentar resultados com melhor reprodutibilidade (HAAKE, 2006). O curso da infecção é muito parecido com o verificado em humanos, o modelo sofre de infecção aguda, apresentando síndrome pulmonar hemorrágica associada à leptospirose, além de ser bem caracterizado para a doença e aceito por órgãos regulatórios para testes de vacinas comerciais (DELLAGOSTIN et al., 2011).
3 HIPÓTESE E OBJETIVOS
3.1 Hipótese
As proteínas recombinantes LigA625-1224aa (LigANI), LigB131-649aa (LigBRep), LigB625-1044aa (LigB7-11) e LigA131-1224aa (LigAFull), são capazes de conferir proteção homóloga em hamsters, quando formulados individualmente ou em associação ao adjuvante hidróxido de Alumínio.
3.2 Objetivo Geral
Avaliar quatro proteínas recombinantes [LigA625-1224aa (rLigANI), LigB131-649aa (rLigBRep), LigB625-1044aa (rLigB7-11) e LigA131-1224aa (rLigAFull)] de L.
interrogans sorovar Copenhageni Cepa Fiocruz L1-130, quanto a capacidade de
conferir proteção contra desafio homólogo em hamster.
3.3 Objetivos Específicos
Expressar e purificar as proteínas recombinantes selecionadas, avaliando o rendimento e pureza das proteínas recombinantes obtidas;
Avaliar a antigenicidade das proteínas recombinantes obtidas, utilizando soros positivos de humanos com leptospirose; previamente testados pela técnica de microaglutinação (MAT);
Formular as preparações com as proteínas recombinantes obtidas, individualmente e combinadas, usando hidróxido de alumínio como adjuvante;
Vacinar e realizar o desafio homólogo com Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130, em hamster um modelo animal suscetível para a leptospirose;
4 CAPÍTULOS
4.1 Relatório de Atividades
4.1.1 Material e Métodos
4.1.1.1 Cepas, cultivo e extração de DNA
Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 foi cultivada
em meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (Difco, USA) enriquecido com 10% de suplemento comercial (Difco, USA). As transformações em Escherichia
Coli (E. coli) foram feitas nas cepas TOP10F ou BL21(DE3), cultivadas e o DNA foi
extraído seguindo procedimentos padrões (Sambrook, 2001).
4.1.1.2 Animais.
Hamsters (Mesocricetus auratus) com 4 semanas de idade foram utilizados para um total de 5 experimentos, totalizando 98 machos e 20 fêmeas. Todos os animais foram pesados no inicio do experimento e mantidos em caixas com as dimensões de 49x34x16cm, totalizando uma área >300cm2 por animal (cinco animais por caixa), conforme recomendado para hamsters adultos mantidos em grupos (SILVA et al., 2007). Após o desafio, os animais foram alojados em estantes ventiladas com umidade e temperatura controladas e programa de luz conforme recomendado para a espécie. Alimento e água foram fornecidos em regime Ad
libitum. Os animais foram alocados no Biotério Central da UFPel.
4.1.1.3 Expressão e padronização das proteínas rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11 e rLigAFull
Com o intuito de melhorar o rendimento das proteínas recombinantes e, consequentemente, determinar as melhores condições de cultivo, o crescimento das cepas de E. coli foi realizado em biorreator Biopod f800 (Fogale Nanotech), com capacidade de até 80mL e BioFlo®(New Brunswick) no Laboratório de Tecnologia Recombinante (LATER) em BioManguinhos (Fiocruz-RJ). Os cultivos celulares
crescidos no biorreator foram lisados e as proteínas recombinantes LigANI, LigBRep, LigB7-11 e LigAFull individualmente expressas foram purificadas no equipamento AKTA Purifier 10 (GE Healthcare) por HPLC (High Performance Liquid
Chromatography), através do método de purificação por afinidade usando colunas
modelo Histrap HP (GE Healthcare). As proteínas purificadas foram dessalinizadas e aplicadas em coluna de troca iônica a fim de aumentar o grau de homogeneidade e reduzir a quantidade de LPS nas amostras. Em seguida, as proteínas foram submetidas a protocolos de avaliação de rendimento, pureza, antigenicidade e manutenção da estrutura secundária, através da técnica de dicroísmo circular.
4.1.1.4 Formulação das proteínas com adjuvante Hidróxido de Alumínio e os grupos controles.
As proteínas recombinantes foram quantificadas utilizando um método colorimétrico (BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific). A seguir, as proteínas foram formuladas em adjuvante na proporção de 200μg de proteína para 2mg de hidróxido de alumínio (1:10 de Alhydrogel, Brenntag Biosector) e estocadas até o momento da inoculação dos animais. Todas as proteínas foram identificadas e os lotes foram catalogados para controle, como segue: LigBRep lote 138/11-075/11, LigAFull lote 137/11-074/11, LigANI lote 127/10-073/11, LigBRep+LigANI lote 076/11 e LigB7-11 sem o lote especificado. Todas as preparações tiveram a concentração ajustada para 200g/mL. Os animais do grupo controle negativo de todos os experimentos receberam uma dose com volume final de 250µL de uma preparação de PBS com Hidróxido de alumínio (2 µg/mL). Os animais do controle positivo foram imunizados com bacterina comercial (Leptofem 5, Pfizer) na quantidade de 108 leptospiras por dose, de acordo com o fabricante.
4.1.1.5 Ensaios de antigenicidade.
A avaliação da antigenicidade das proteínas recombinantes LigANI, LigBRep, LigB7-11 e LigAfull foi realizada pelo Laboratório de Tecnologia Recombinante (LATER),BioManguinhos (Fiocruz-RJ), por immunoblotting utilizando soros de humanos convalescentes da leptospirose. A eletroforese das proteínas foi realizada em gel de SDS-PAGE unidimensional por 2h, 120V, e as proteínas foram
transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado em PBS, incubadas durante 10 h com anticorpos primários, lavadas com PBS e incubadas por 1h com anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina. NBT / BCIP (Nitroazul de tetrazolio/ 5-bromo-4-cloro-3-indolil phosphate, Promega) foi usado para coloração dos poços e identificação visual das bandas de antígenos.
4.1.1.6 Ensaio de imunoproteção
Para os cinco ensaios de imunoproteção 118 hamsters foram divididos em grupos de cinco a oito animais, inoculados com cada uma das vacinas, individualmente ou em associação, conforme o protocolo programado. Os animais foram desafiados com a cepa de L. interrogans sorovar Copenhageni (desafio homólogo) com a dose variando de 500 a 1000 leptospiras. A eficácia de cada uma das preparações vacinais foi determinada pelo número de animais sobreviventes ao desafio, quando comparado ao grupo controle. Ao final de todos os experimentos, os animais foram eutanasiados com o aprofundamento da anestesia com Barbitúrico Tiopental (150 mg/Kg) através da via intraperitoneal, com a posterior necropsia para a avaliação macroscópica dos órgãos, coletando rins, fígados e pulmões para as análises histopatológicas e microbiológicas.
4.1.1.7 Avaliação microbiológica
Ao final de cada procedimento de eutanásia realizados em uma cabine de fluxo laminar, os rins foram coletados para cultivo. Para isso, fragmentos de 2-3 cm3 do tecido renal foram removidos assepticamente e colocados dentro de uma seringa de 5 mL estéril para a realização do macerado renal, por pressão, diretamente dentro do tubo com 5 mL de meio de cultura (EMJH) líquido. Após, o tubo contendo o macerado renal foi homogeneizado gentilmente e deixado por 1 a 2 horas em repouso no escuro para a formação do sedimento. Decorrido esse período, foi realizado um repique de 0,5 mL do líquido próximo da superfície para um tubo com 5 mL de meio de cultura semi-sólido. Os tubos foram incubados em estufa bacteriológica a 30ºC e verificados semanalmente, macro e microscopicamente, durante sete semanas.
4.1.1.8 Imunofluorescência
Para a realização da técnica de imunofluorescência (Chagas-Junior et al., 2009) foram coletados fragmentos de rim, fígado e pulmão de todos os animais. Os órgãos foram cortados ao meio e pressionados sobre as lâminas preparadas com poli-L-lisina e fixadas com acetona. Após, foram hidratadas três vezes e bloqueadas com solução de BSA 0,4% por 40 min. Após lavagem, as lâminas foram cobertas com anticorpo anti-Leptospira inteira, produzido em coelhos e incubadas durante 1h. Lavaram-se as lâminas e adicionou-se anti-coelho conjugado a FITC (Sigma). Após novo período de incubação, as lâminas foram lavadas e montadas para a leitura em microscópio de fluorescência.
4.1.1.9 Análise estatística.
Utilizou-se Fischer’s test para a avaliação da mortalidade, disponível no programa Epiinfo 3.53. O programa Prisma 4.3 foi utilizado para a construção dos gráficos e a análise estatística pelo Logrank Test, para a avaliação da sobrevivência.
4.1.2 Resultados
A expressão e purificação das quatro proteínas foram realizadas com sucesso. A utilização do biorreator e do sistema de purificação AKTA prime favoreceu a obtenção de quatro lotes com pureza de 90% verificado através de eletroforese com gel unidirecional (Figura 1).
Todas as quatro proteínas recombinantes foram consideradas antigênicas reagindo contra soro de humanos convalescentes de leptospirose, fornecidos pelo Laboratório de Patologia e Biologia Molecular (LPBM) da Fiocruz/Bahia (Figura 2).
Figura.1. SDS-PAGE para a análise da pureza das proteínas recombinantes. Na coluna 1- Marcador (Magic Mark), coluna 2- LigB-7-11, coluna 3- LigANI, coluna 4- LigBRep, coluna 5- LigAFull.
Após os ensaios de antigenicidade, uma parte do lote de proteínas produzida foi estocada e a outra parte foi encaminhada para o processo de adsorção em Hidróxido de Alumínio. Todos esses procedimentos foram realizados no LATER/Bio-Manguinhos pela equipe do Dr. Marco Alberto Medeiros e as preparações vacinais foram encaminhadas para o Laboratório de Vacinologia (Lab. 7/Biotecnologia) para a realização os experimentos de imunoproteção.
Figura 2. Antigenicidade das proteínas recombinantes utilizadas no estudo com pool de soros de pacientes humanos convalescentes. Coluna 1- LigB-7-11 (33,4KDa), coluna2 - LigANi (62KDa), coluna 3- LigBRep(58KDa), e coluna 4- LigAfull (114KDa).
A imunização dos hamsters contendo as preparações com rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11 e rLigAFull conferiram proteções variáveis (0-100%) contra o desafio homólogo com dose letal conforme as tabelas 1, 2, 3, 4, e 5.
114 kDa 60 kDa 30 kDa 114 kDa 60 kDa 30 kDa 1 2 3 4 1 2 3 4 5
Tabela 1. Imunoproteção com hamsters machos e o desafio com 1000 leptospiras
G N Dose 1 Dose 2 S/T Dias para óbito Fisher Test Logrank
Test 1 8 Alum Alum 0/8 10,10,10,10,10, 10,11,12 - - 2 8 Bacterina Bacterina 8/8 - p<0,01 p<0,01 3 6 LigAFull (40g) LigAFull (40g) 1/6 12,14,14,17,20 NS p<0,01 4 6 LigANI (40g) LigANI (40g) 5/6 14 p<0,01 p<0,01 5 6 LigBrep (40g) LigBrep (40g) 2/6 11,12,13,14 NS p<0,01 6 6 LigANI (40g)+ LigBrep (40g) LigANI (40g)+ LigBrep (40g) 4/6 13,16 p=0,014 p<0,01 Total 40
G= grupo; N= número de animais; S/T = sobreviventes pelo total; NS = não significativo
Quanto aos controles, nenhum animal sobreviveu no grupo controle negativo (adjuvante Hidróxido de alumínio) tanto no desafio com 500 quanto no desafio com 1000 leptospiras por mL (Tabelas 1, 2, 3, 4 e 5), enquanto que os animais vacinados com a bacterina comercial sobreviveram 100% (Tabela 1 e 5).
Tabela 2. Ensaio de imunoproteção com hamsters machos e o desafio com 500 leptospiras
G N Dose 1 Dose 2 S/T Dias para óbito Fisher Test Logrank
Test 1 5 Alum Alum 0/5 10,10,11,12,15 - - 2 5 LigAFull (40g) LigAFull (40g) 1/5 13,13,15,16 NS p<0,03 3 5 LigANI (40g) LigANI (40g) 1/5 12,13,14,15 NS p<0,12 4 5 LigANI (40g)+ LigBrep (40g) LigANI (40g)+ LigBrep (40g) 5/5 0 p<0,01 p<0,01 total 20
G= grupo; N= número de animais; S/T = sobreviventes pelo total; NS = não significativo
Ao realizarmos a análise da mortalidade usando o Fisher’s test, comparando-se cada uma das preparações vacinais com o grupo controle negativo, a proteção conferida com significância estatística (p<0,05) foi observada nos grupos de hamsters machos vacinados com rLigANI (40ug) e rLigANI (40ug) + rLigBRep(40ug) desafiados com 1000 leptospiras (Tabela 1), e no grupo de hamsters machos vacinados com rLigANI(40ug) + rLigBRep(40ug), desafiados com 500 leptospiras (Tabela 2 e 4).
Tabela 3. Imunoproteção com hamsters fêmeas e o desafio com 500 leptospiras
G N Dose 1 Dose 2 S/T Dias para óbito Fisher Test Logrank Test 1 5 Alum Alum 0/5 9,9,10,10,16 - - 2 5 LigANI (60g) + LigBrep (60g) LigANI(60g) + LigBrep (60g) 5/5 0 p<0,01 p<0,01 3 5 LigANI (60g) LigANI (60g) 5/5 0 p<0,01 p<0,01 4 5 LigBRep (60g) LigBRep (60g) 5/5 0 p<0,01 p<0,01 total 20
G= grupo; N= número de animais; S/T = sobreviventes pelo total; NS = não significativo
Também foi observado proteção significativa nos grupos de hamsters fêmeas vacinados com rLigANI (60g), rLigBRep (60g) e rLigANI(60g) + rLigBRep(60g), desafiados com 500 leptospiras (Tabela 3).
Tabela 4. Imunoproteção com hamsters machos e o desafio com 500 leptospiras
G N Dose 1 Dose 2 S/T Dias para
óbito Fisher Test
Logrank Test 1 5 Alum Alum 0/5 9,9,13,16,17 - - 2 5 LigB 7-11 (30g) LigB 7-11 (30g) 0/5 9,10,10,10,13 NS NS 3 5 LigANI (40g)+ LigBrep (40g) LigANI (40g)+ LigBrep (40g) 4/5 11 p=0,04 p<0,01 4 5 LigANI (40g) LigANI (40g) 2/5 11,11,15 NS NS Total 20
G= grupo; N= número de animais; S/T = sobreviventes pelo total; NS = não significativo
Tabela 5. Imunoproteção com hamsters machos e o desafio com 500 leptospiras
G N Dose 1 Dose 2 S/T Dias para
óbito Fisher Test
Logrank Test 1 6 Alum Alum 0/6 9,9,9,9,10,12 - - 2 6 LigANI (40g) LigANI (40g) 4/6 9,11 NS p<0,01 3 6 Bacterina Bacterina 6/6 0 p<0,01 p<0,01 Total 18
G= grupo; N= número de animais; S/T = sobreviventes pelo total; NS = não significativo
Na análise de sobrevivência através do Logrank test, todos os grupos vacinais conferiram proteção com significância estatística aos animais (p<0,05), quando
comparados com o grupo controle, em todos os experimentos, com exceção do experimento 4 onde as preparações com rLigB7-11 e rLigANI não conferiram proteção significativa (Figuras 3 e 4).
Experimento 1 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Alum Bacterina comercial rLigAFull rLigANI rLigBRep rLigANI + rLigBRep Dias % S o b re v iv ê n c ia Experimento 2 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Alum rLigAFull rLigANI rLigANI + rLigBRep Dias % S o b re v iv ê n c ia
Figura 3. Sobrevivência de hamsters machos ao desafio com 1000 leptospiras no experimento 1 e com 500 leptospiras no experimento 2.
Experimento 3 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Alum rLigANI + rLigBRep rLigANI rLigBRep Dias % S o b re v iv ê n c ia Experimento 4 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Alum LigB7-11 rLigANI + rLigBRep rLigANI Dias % S o b re v iv ê n c ia Experimento 5 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Alum rLigANI Bacterina Comercial Dias % S o b re v iv ê n c ia
Figura 4. Sobrevivência de hamsters fêmeas (experimento 3) e machos (experimentos 4 e 5) ao desafio com 500 leptospiras.
Para os animais imunizados com a bacterina comercial não houve presença de leptospiras nos três órgãos avaliados, bem como para os animais sobreviventes
dos experimentos do grupo 4 do experimento 3 imunizados com LigBRep (6g), no grupo 4 do experimento 4 LigANI (4g) (Tabela 6).
Tabela 6. Avaliação da colonização renal, hepática e pulmonar através da analise microbiológica e imunofluorescência dos 5 experimentos.
Exp. Grupo Vacinas (Positivos/total) (Positivos/total)
Rim Fígado Pulmão
1 1 Alum 7/8 - - - 1 2 Bacterina 2/8 - - - 1 3 LigAFull (40g) 2/6 - - - 1 4 LigANI (40g) 1/6 - - - 1 5 LigBrep (40g) 2/6 - - - 1 6 LigANI (40g)+ LigBrep (40g) 0/6 - - - 2 1 Alum 4/5 - - - 2 2 LigAFull (40g) 2/5 - - - 2 3 LigANI (40g) 2/5 - - - 2 4 LigANI (40g)+ LigBrep (40g) 0/5 - - - 3 1 Alum 2/3 2/3 2/3 3/3 3 2 LigANI (60g) + LigBrep (60g) 0/5 1/5 3/5 4/5 3 3 LigANI (60g) 0/5 4/5 1/5 2/5 3 4 LigBRep (60g) 1/5 0/5 1/5 0/5 4 1 Alum 1/1 1/1 1/1 1/1 4 2 LigB 7-11 (30g) 4/5 3/5 2/5 2/5 4 3 LigANI (40g)+ LigBrep (40g) 1/5 4/5 5/5 3/5 4 4 LigANI (40g) 3/5 3/4 1/4 0/4 5 1 Alum 3/3 2/2 2/2 2/2 5 2 LigANI (40g) 3/6 4/6 4/6 4/6 5 3 Bacterina - 0/3 0/3 0/3
Nos experimentos 1 e 2 não foi realizada a coleta dos órgãos para a análise histopatológica e microbiológica. Nos experimentos 3, 4, 5 foi realizada a técnica de imunofluorescência onde foram evidenciados animais positivos nos três órgãos (Rim, fígado e o pulmão), avaliados pela técnica (Figura 5).
A
B
C
D
E
F
Figura 5. Avaliação da colonização renal, hepática e pulmonar através da técnica de imunofluorescência, onde (A) tecido renal, (B) hepático e (C) pulmonar de animais positivos, e (D) renal, (E) hepático e (F) pulmonar de animais negativos (não desafiados).
4.1.3 Discussão
Os prejuízos econômicos e sociais causados pela leptospirose justificam o emprego de novas estratégias e tecnologias para o desenvolvimento de vacinas mais eficazes contra a enfermidade em populações humanas e animais em locais de risco (KO; GOARANT; PICARDEAU, 2009). O desenvolvimento de vacinas contra a leptospirose bovina, que sejam seguras e capazes de gerar proteção cruzada contra diferentes sorovares da bactéria, ainda representa um grande desafio (ADLER, DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Na área animal, a vacinação é empregada desde a década de 50 (FAINE et al., 1999). Porém, novas estratégias têm sido utilizadas buscando a diminuição da disseminação das leptospiras patogênicas entre os rebanhos, devido às grandes perdas econômicas causadas pelas infecções. Assim,
a prioridade está sendo no desenvolvimento de vacinas que gerem uma resposta imune efetiva e inibam a eliminação de leptospiras através da urina (DELLAGOSTIN et al., 2011).
Proteínas de membrana externa e lipoproteínas expostas à superfície celular são apontadas como potenciais alvos vacinais, devido a sua localização na superfície da célula e a sua participação na interação com o hospedeiro (DELLAGOSTIN et al., 2011; HAAKE, 2000). As Ligs são proteínas da membrana externa e expostas à superfície de leptospiras virulentas e, por conseguinte, são considerados candidatos potenciais para vacina recombinante contra a leptospirose. Estudos anteriores examinaram a capacidade das proteínas Lig conferirem imunoproteção, mas as conclusões foram limitadas devido, principalmente, pelo modelo animal utilizado e pela baixa virulência das cepas para o desafio (Kozumi et al 2004). Embora o estudo realizado por Palaniappan et al (2004) tenha utilizado o modelo animal hamsters, um modelo aceito para o estudo de vacinas para leptospirose, a imunoproteção conferida por LigA não demonstrou uma diferença significativa(P>0,05), na sobrevida entre o grupo vacinal e o grupo controle, devido a alta sobrevivência dos animais do grupo controle.
Em nosso estudo a imunização do hamsters machos e fêmeas contendo as preparações vacinais com rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11 e rLigAFull, conferiram proteções variáveis (0-100%) contra o desafio homólogo com dose letal de 500 ou 1000 leptospiras. Embora a dose letal 50% para a cepa Fiocruz L1-130 tenha sido descrita como sendo menor do que 100 leptospiras (SILVA et al., 2008), tanto para machos quanto para fêmeas, nosso estudo oportunizou o uso de doses 5 e 10 vezes maiores no desafio. No entanto, quase a totalidade de animais apresentaram leptospiras no isolamento e na técnica de imunofluorescência. Este resultado é semelhante ao obtido por Silva et al (2007), porém, aquele estudo utilizou adjuvante oleoso. Assim, nosso estudo ao utilizar preparações com Hidróxido de alumínio evidenciou o grande potencial para o uso, também, na espécie humana em futuros ensaios e abordagens.
Haake (2006) descreveu o animal de laboratório hamster (Mesocricetus
auratus) como modelo animal preferencial para a leptospirose devido a sua
suscetibilidade a infecção e a reprodutibilidade dos experimentos. Entretanto, nenhuma menção é destinada a diferença entre sexos quanto a suscetibilidade para
a enfermidade. Silva et al (2007) mostraram que fêmeas são mais resistentes do que machos quando são desafiados com a mesma quantidade de leptospiras. Além disso, uma maior gravidade de manifestações clínicas e patológicas foram evidenciadas quando o modelo utilizado era o macho. Em humanos, tal fato também já foi mencionado, evidenciado um maior número de casos em homens do que em mulheres (FAINE et al., 2000). No entanto, esse fato pode ser contestado, no que se refere ao risco de exposição ocupacional entre os dois sexos, no qual homens executariam um maior número de atividades de risco do que mulheres. Em nosso estudo, utilizamos fêmeas em apenas um experimento (nº3), no qual todos os animais desafiados com 500 leptospiras sobreviveram até o final do experimento, excetuando-se o grupo controle negativo. Interessantemente, em nenhum outro experimento os alvos vacinais tiveram esse mesmo desempenho (todos 100%). Além disso, quando analisamos os parâmetros secundários de infecção entre os experimentos, esse fato também foi observado. Por outro lado, quando analisamos apenas os experimentos com machos, nosso estudo mostra que mesmo não havendo proteção de 100% dos animais dos grupos vacinais em todos os experimentos, podem ser evidenciados parâmetros de mortalidade e de sobrevivência estatisticamente diferentes (p<0,05) em relação ao grupo controle negativo.
Nosso estudo propôs uma nova abordagem para o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a leptospirose bovina. É o primeiro estudo que testou a proteína LigA recombinante em sua forma inteira, exceto o lipobox. Além disso, foi possível obter a sua expressão na forma solúvel. Embora a proteína obtida tenha sido reconhecida por soros de humanos convalescentes in vitro, foi capaz de conferir apenas níveis de sobrevivência significativa (p<0,05) aos animais desafiados, mas não em relação a mortalidade. Por outro lado, a associação entre rLigBRep e rLigANI, outra abordagem inédita, demonstrou que mesmo testando-se em diferentes doses (40 g ou 60 g) de cada alvo, tanto a análise de mortalidade quanto a de sobrevivência revelou resultados altamente significativos (p<0,01) em três dos cinco experimentos realizados.
4.1.4 Conclusões
A expressão e a purificação das proteínas recombinantes LigANI, LigBRep, LigB7-11 e LigAFull é possível utilizando a metodologia empregada. Os Quatro lotes estão disponíveis com rendimento e pureza de >90%.
A avaliação das formulações vacinais LigANI, LigBRep e LigAFull com Hidróxido de alumínio revelou que individualmente elas protegem os hamsters do desafio letal, porém em graus variáveis de proteção (0 a 100%).
LigAFull não protege os hamsters da leptospirose letal, porém confere sobrevida aos animais imunizados.
A formulação com LigB7-11 não protege e nem confere sobrevida aos animais imunizados;
A associação entre LigANI e LigBRep confere proteção significativa (p>0,05) ao desafio letal. Dessa forma, recomenda-se que essa formulação seja utilizada em ensaios de imunogenicidade e imunoproteção heterólogo.
5 CONCLUSÃO GERAL
Os resultados obtidos em nosso estudo representam uma contribuição importante para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose devido ao grande potencial de uso das preparações testadas, as quais motivam a continuidade e futuros ensaios.
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7 ANEXOS
Anexo A – Artigo submetido para Brazilian Journal of Microbiology
First Latin American Leptospira interrogans serovar Djasiman isolate from a
human case
Amilton Clair Pinto Seixas Neto1, Samuel Rodrigues Félix2, Sandra Denize Jouglard1, Karina Colonetti1, Flávia Aleixo Vasconcellos3, Claudiomar Soares Brod2, Odir Antônio Dellagostin1, Éverton Fagonde da Silva2*
1
Centro de Desenvolvimento Tecnológico; Universidade Federal de Pelotas, Brazil. 2
Faculdade de Veterinária; Universidade Federal de Pelotas, Brazil. 3
Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos; Universidade Federal de Pelotas, Brazil.
*
Corresponding author: Faculdade de Veterinária/UFPel, Campus Universitário Capão do Leão, prédio 1, CEP: 96010-900. Pelotas, RS, Brazil. Phone: +55 53 32757644. Fax: +55 53 32757551. E-mail: efsilva@ufpel.edu.br
Abstract
This brief report describes a human leptospirosis case, followed by the isolation of a
Leptospira interrogans serovar Djasiman previously unknown to cause human
disease in the Americas. Much more than this, the report shows how poor control measures expose the populations of underdeveloped and developing countries to the disease.
Key-words: Leptospirosis; Public Health; Veterinary Medicine; Tropical Neglected Disease
Text
Leptospirosis is a major public health issue in many countries, especially in Latin America and in South-East Asia (Picardeau, 2013). Brazil and most Latin American countries are suffering the consequences of demographic transformations due to uncontrolled growth of urban centers. Urban slums are sites of poor sanitation that favor the transmission of leptospirosis among humans (Riley et al., 2007).
We have recently reported the isolation and virulence characterization of strains obtained from humans and animals, representative of important species and serogroups for public health and veterinary medicine (Silva et al., 2009; Diniz et al., 2011). Herein, we report the isolation of Leptospira interrogans serovar Djasiman from a case of human leptospirosis. The isolate was obtained from a 24-year-old man, admitted to the Hospital Santa Casa de Misericórdia, Pelotas, RS, Brazil, with a history of fever, diarrhea, myalgia, severe headache and nausea. Prior to the onset of symptoms, he had had contact with stray dogs and rodents. A blood sample was
