UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

A INFLUÊNCIA DO CICLO ESTRAL NO COMPORTAMENTO DAS

LINHAGENS DE RATOS CONGÊNICA SLA16 E ISOGÊNICA SHR

Juliana Gonçalves Taniguchi

Botucatu - SP

2013

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

A INFLUÊNCIA DO CICLO ESTRAL NO COMPORTAMENTO DAS

LINHAGENS DE RATOS CONGÊNICA SLA16 E ISOGÊNICA SHR

Graduando: Juliana Gonçalves Taniguchi

Supervisor: Prof. Dr. Danillo Pinhal

Monografia apresentada ao Instituto

de Biociências, Câmpus de Botucatu,

UNESP, para obtenção do título de

Bacharel em Ciências Biomédicas

Botucatu - SP

2013

iii

Dedico este trabalho a meu pai,

que constantemente deu apoio em todas

minhas decisões e ao meu namorado, que

sempre quando quis desistir, dava-me

forças para continuar, sendo uma pessoa

muito especial na minha vida.

iv Agradeço:

À Deus, por todo conforto e suporte a mim fornecido.

À minha falecida avó (Angelina) pelo carinho e compreensão. Você sempre estará viva em minha memória.

À minha avó (Mutsumi) por não se importar em fazer de seu apartamento um “albergue” de estudantes sempre quando tínhamos eventos na cidade.

A meus sogros que me aguentaram por mais de um ano convivendo na casa deles e por fazerem vários favores para mim levando documentos para a graduação, buscando certificados, etc.

À minha cunhada querida, na qual descobri uma amiga muito louca para todas as horas. Ao meu orientador Prof. Dr. Geison Izídio, por toda paciência, compreensão, auxílio, incentivo, amizade e apoio. Obrigada por me dar a chance de realizar o TCC no laboratório e me acolher como IC, mesmo sendo de outra universidade.

À minha ex-orientadora, Prof. Dra. Luciana Fleuri, pela oportunidade inicial, por acreditar em mim e por ser essa pessoa tão gentil e meiga que é.

Ao meu supervisor Prof. Dr. Danillo Pinhal, por me aguentar com todos e-mails com dúvidas e perguntas.

Aos mestrandos do Laboratório de Genética do Comportamento: Elisa, Fernanda, Lucia e Fernando por me ajudarem nos experimentos e na hora de fazer a análise estatística.

À Thalita e Paula do Laboratório de Genética do Comportamento por ajudarem nos dias dos testes comportamentais, pelas fofocas e conversas enquanto esperávamos o tempo do teste e pela amizade.

Ao técnico do biotério (Júnior) por montar os aparatos comportamentais nos dias dos testes, pela paciência e ajuda.

Ao Laboratório de Genética do Comportamento, ao Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina pela estrutura cedida para realização deste trabalho.

v

“Great spirits have always encountered opposition from mediocre minds.

The mediocre mind is incapable of understanding the man who refuses to bow

blindly to conventional prejudices and chooses instead to express his opinions

courageously and honestly.”

vi RESUMO

Diversos estudos utilizam somente ratos machos em seus experimentos, mesmo com toda a evidência da existência de diferenças entre os sexos, não somente no comportamento reprodutivo, mas também no desenvolvimento de doenças. Essa ausência de ratas fêmeas nos estudos é em parte devido ao ciclo estral. Sabe-se que este dura cerca de 4-5 dias e é composto por 4 fases, sendo elas: proestro, estro, metaestro e diestro.

Ramos et al. (1999) identificaram e mapearam um QTL em uma população F2 proveniente do intercruzamento das linhagens de ratos SHR (ratos espontaneamente hipertensivos) e Lewis (LEW) e encontraram, no cromossomo 4, o primeiro QTL relacionado à ansiedade em ratos do mundo. Após vários retrocruzamentos entre as linhagens SHR e LEW, foi desenvolvida a linhagem congênica SLA16, para refinar o estudo desse QTL.

Esse QTL corresponde a uma grande região genômica, cerca de 75 milhões de pares de bases (Mb), e foi primeiramente chamado de Ofil1 (open field inner locomotion 1). Atualmente ele é chamado de Anxrr16 (anxiety-related response region 16) segundo o rat

genome database (RGD).

Izídio et al. (2011) sugeriram que a variação natural nos níveis hormonais presente ao longo do ciclo estral das ratas fêmeas poderia influenciar os efeitos deste locus sobre o comportamento. Ou seja, fêmeas em DP (diestro-proestro) apresentam o QTL na mesma região genômica que os machos, enquanto que fêmeas em EM (estro-metaestro) não o apresentam.

Foram avaliados os efeitos do ciclo estral da linhagem SLA16 e no seu controle isogênico SHR nos testes do campo aberto (CA); labirinto em cruz elevado (LCE) e caixa branca/preta.

No teste do CA, a linhagem SLA16 teve maior locomoção central (F=5,0; p<0,05) e periférica (F=12,6; p<0,01) em comparação a linhagem controle SHR. No teste do LCE, a linhagem SLA16 teve maior número de entradas (F=9,5; p<0,01) e tempo nos braços abertos (F=10,3; p<0,01) em comparação a linhagem controle SHR. Por fim, no teste da CBP, a linhagem SLA16 teve maior tempo (F=6,1; p<0,05) e locomoção no compartimento branco (F=8,4; p<0,01) em comparação a linhagem controle SHR. Nenhum efeito significativo do ciclo estral foi encontrado nestes testes comportamentais.

As linhagens diferiram para diversos comportamentos relacionados à emocionalidade, demonstrando que a linhagem SLA16 é ainda menos ansiosa que os ratos SHR e confirmando os efeitos do locus Anxrr16 sobre a emocionalidade. As pequenas variações relativas as fases

vii do ciclo estral não parecem ser um fator determinante no comportamento das fêmeas destas linhagens nestes aparatos, entretanto o estudo ainda necessita de um aumento de número experimental para melhor verificar este ponto.

Palavras-chave: Ansiedade. Emocionalidade. Genética do Comportamento. Linhagem Congênica SLA16. LEW. SHR. Anxrr16. Ciclo estral.

viii ABSTRACT

Several studies use only male rats in their experiments, even with all the evidence of differences between the sexes, not only in the reproductive behavior but also in the development of diseases. This absence of studies using female rats is due in part to the estrous cycle. It is known that one estrous cycle lasts four to 5 days and consists of four phases: proestrus, estrus, metestrus and diestrus.

Ramos et al. (1999) identified and mapped a QTL in an F2 population derived from interbreeding of strains of SHR (spontaneously hypertensive rats) and Lewis (LEW) rats and found, on chromosome 4, the first QTL of the world related to anxiety in rats. After several backcrosses between SHR and LEW strains, it was developed a congenic strain called SLA16, to refine the study of this QTL.

This QTL corresponds to a large genomic region, approximately 75 million basepairs (Mb), and was first called Ofil1 (inner open field locomotion 1). Currently it is called Anxrr16 (anxiety-related response region 16) according to the rat genome database (RGD).

Izidio et al. (2011) suggested that the natural fluctuation of the hormones in the estrous cycle of female rats could influence the effects of this locus on behavior. That is, females in DP (diestrus-proestrus) present the QTL in the same genomic region that males, while females in EM (estrus-metestrus) do not present it.

The effects of the estrous cycle in the SLA16 strain and its isogenic control SHR were analyzed on the elevated plus maze (EPM), black and white box and on the open field test (OF).

In the open field test, the SLA16 strain had higher central locomotion (F=5.0, p <0.05) and peripheral locomotion (F=12.6, p <0.01) compared to the SHR strain. In the elevated plus maze test, the SLA16 strain had the higher number of entries (F=9.5, p <0.01) and time spent in the open arms (F=10.3, p <0.01) compared to the SHR strain. Finally, in the black and white box test, the SLA16 lineage spent more time (F=6.1, p <0.05) and had higher locomotion in the white compartment (F=8.4, p <0.01) compared to the SHR. No significant effect of estrous cycle was found in these behavioral tests.

The lineages differed in a series of behaviors related to emotionality, demonstrating that the SLA16 lineage is even less anxious than the SHR and confirming the effects of locus Anxrr16 in emotionality. Small variations on the phases of the estrous cycle does not seem to be a determining factor in the behavior of females rats of these strains in these apparatus, however, the study needs an increase of experimental number to better verify this point.

ix Keywords: Anxiety. Emotionality. Behavior genetics. Congenic strain SLA16. LEW. SHR. Anxrr16. Estrous cycle.

x SUMÁRIO DEDICATÓRIA ... iii AGRADECIMENTOS ... iv EPÍGRAFE ... v RESUMO... vi ABSTRACT ... viii 1. REVISÃO DA LITERATURA………1

1.1 As linhagens SHR e LEWIS como modelos genéticos para o estudo da ansiedade ... 1

1.2 Análise de loci para características quantitativas (QTL) ... 1

1.3 Linhagem congênica SLA16 ... 2

1.4 Ciclo estral ... 3 2. OBJETIVOS ... 6 2.1 Objetivo Geral ... 6 2.2 Objetivos específicos ... 6 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 7 3.1. Animais ... 7

3.2 Determinação da fase do ciclo estral ... 7

3.3 Testes comportamentais ... 7

3.3.1 Campo aberto (CA) ... 8

3.3.2 Labirinto em cruz elevado (LCE) ... 8

3.3.3 Caixa branca e preta (CBP) ... 8

3.4 Análise estatística ... 9

4. RESULTADOS ... 10

5. CONCLUSÕES ... 13

1   1. REVISÃO DA LITERATURA

1.1 As linhagens SHR e LEWIS como modelos genéticos para o estudo da ansiedade As linhagens SHR (do inglês, ratos espontaneamente hipertensos) e Lewis (LEW) constituem um importante modelo genético para o estudo da emocionalidade. Eles mostram diferenças nas respostas a estímulos estressantes nos testes comportamentais do campo aberto, do labirinto em cruz elevado e da caixa branca/preta, mas não em relação a sua atividade locomotora. A linhagem SHR aproxima-se mais das áreas consideradas “aversivas” dos testes, enquanto a linhagem Lewis demonstra um comportamento mais “ansioso”, ficando menos tempo nas áreas aversivas [1,2]. Estas duas linhagens são ditas isogênicas, pois cada indivíduo dentro da linhagem apresenta uma alta homologia genética em relação aos seus pares, devido ao alto grau de cruzamentos consanguíneos ao longo de dezenas de gerações.

Esse comportamento contrastante foi atribuído a fatores genéticos através de um estudo feito com o intercruzamento das duas linhagens nascidos, criados e testados simultaneamente, sob as mesmas condições ambientais e sem influência dos pais ou dos avós nos comportamentos avaliados [3].

Como este comportamento contrastante entre as duas linhagens, em relação à ansiedade é robusto e apresenta fatores genéticos evidentes, os pesquisadores poderiam tentar buscar as bases genéticas que os influenciam utilizando algumas técnicas já disponíveis na literatura.

1.2 Análise de loci para características quantitativas (QTL)

Muitos estudos vêm demonstrando que a análise de loci para características quantitativas (QTL) é uma estratégia útil para mapear regiões genômicas que contribuem para o desenvolvimento de traços comportamentais, ou seja, é uma técnica utilizada para encontrar variações fenotípicas que são contínuas. Mapear um QTL significa identificar regiões genômicas que contribuem para determinados efeitos fenotípicos e estimar seus efeitos genéticos [4].

Ramos et al. (1999) identificaram e mapearam um QTL em uma população F2 proveniente do intercruzamento das linhagens de ratos SHR e Lewis (LEW fêmea x SHR macho e SHR fêmea x LEW macho) e encontraram, no cromossomo 4, o primeiro QTL relacionado à ansiedade em ratos do mundo. Essa região influenciava a locomoção no centro

2   do campo aberto, que é considerada uma região aversiva, mas essa influência ocorria somente nas ratas fêmeas com avós LEW.

Esse QTL corresponde a uma grande região genômica, cerca de 75 milhões de pares de bases (Mb), e foi primeiramente chamado de Ofil1 (open field inner locomotion 1). Atualmente ele é chamado de Anxrr16 (anxiety-related response region 16) segundo o rat

genome database (RGD).

Foi também observado por Ramos et al. (1999) que os animais da geração F2 que possuíam dois alelos da linhagem LEW (que é considerada mais “ansiosa”) no locus Anxrr16 apresentaram escores de locomoção central maiores do que ratos homozigotos para o alelo SHR, se mostrando ainda menos ansiosos do que a linhagem parental, o que não era o esperado [5].

Izídio et al. (2011) constataram, posteriormente que o locus Anxrr16 não influenciava somente ratas fêmeas, mas machos também. Além disso, os autores sugeriram que a variação natural nos níveis hormonais presente ao longo do ciclo estral das fêmeas poderia influenciar os efeitos deste locus sobre o comportamento. Ou seja, fêmeas em DP (diestro-proestro) apresentam o QTL na mesma região genômica que os machos, enquanto que fêmeas em EM (estro-metaestro) não o apresentam [6].

1.3 Linhagem congênica SLA16

Como os QTL são técnicas que nos permitem alcançar regiões candidatas, porém não o (s) gene (s) envolvido (s) com o comportamento em questão, após a identificação de um QTL faz-se, normalmente, o uso de algumas estratégias de refinamento. Dentre elas, a produção de linhagens congênicas é uma escolha interessante para comprovar e refinar mapas de QTLs.

Nestas linhagens a região de um QTL, previamente identificado, chamada locus diferencial, é inteiramente transferida do genoma de uma das linhagens parentais (doadora) para outra (receptora), através de vários retrocruzamentos e seleção com marcadores moleculares. Sabendo-se isso, pode-se realizar comparações entre os dois grupos de animais praticamente idênticos genotipicamente, exceto pela região do locus diferencial, atribuindo-se a essa região as diferenças fenotípicas encontradas [7].

Muitos estudos já foram feitos utilizando linhagens congênicas, como o uso destas para compreensão da diabetes tipo 2 [8], para melhor identificar QTLs para hemostase e

3   trombose [9], na identificação de genes específicos que atuam na obesidade [10], no alcoolismo [11,12], entre outros.

No caso da linhagem congênica SLA16, a linhagem LEW foi a doadora e a SHR, a receptora. Segundo Medeiros et al. (2013) a construção da linhagem congênica SLA16 teve início com um cruzamento entre fêmeas da linhagem LEW (doadora) e machos da linhagem SHR (receptora), originando a geração híbrida N1. Os animais da geração N1, heterozigotos em todo o genoma, foram retrocruzados com a linhagem parental SHR, originando a geração N2. Para acompanhar molecularmente a transferência do locus Anxrr16, todas as gerações a partir da N2 foram genotipadas para três marcadores moleculares do tipo microssatélite. Esses marcadores, localizados na região do QTL Anxrr16, já eram conhecidamente polimórficos entre as linhagens parentais. Aqueles indivíduos da N2, heterozigotos nesses microssatélites, foram então retrocruzados com a linhagem SHR, dando origem à geração N3, que também foi genotipada, selecionada e novamente retrocruzada com a linhagem SHR. Esse processo foi continuamente repetido até a obtenção da geração N10.

Nesta última, os animais heterozigotos para os marcadores do locus Anxrr16 foram intercruzados, gerando cerca de ¼ dos animais homozigotos com alelos da linhagem SHR, ½ heterozigotos e ¼ homozigotos com alelos da linhagem LEW nesse locus, sendo esses últimos os constituintes da primeira geração (N10F1) de animais da linhagem congênica SLA16.

Esta linhagem congênica esta agora pronta para o uso e caracterização comportamental em nosso laboratório. Nós acreditamos que ela seja um passo chave na identificação do (s) gene (s) localizados na região genômica do locus Anxrr16, que tem influencia na ansiedade/emocionalidade destes animais. Entretanto, existem diversas dúvidas a respeito do comportamento destes animais, principalmente em pontos relacionados aos comportamentos exibidos pelas fêmeas. Cabe também ressaltar que a linhagem controle será a SHR (receptora), com a qual a linhagem SLA16 compartilha o mesmo material genético, exceto na região do locus diferencial (Anxrr16).

1.4 Ciclo estral

Ainda hoje, muitos estudos utilizam somente ratos machos em seus experimentos, mesmo com toda a evidência clínica e pré-clínica da existência de diferenças entre os sexos, não somente no comportamento reprodutivo, mas também no desenvolvimento de doenças.

4   Por exemplo, sabe-se que o Alzheimer se desenvolve antes em mulheres e tem seus sintomas mais agravados nestas [13]; na esquizofrenia mulheres têm mais alucinações ou sintomas psicóticos do que homens [14]; mulheres são duas vezes mais afetadas pela depressão do que homens [15]; e em oito subtipos de transtornos de ansiedade mulheres são 2,25 vezes mais diagnosticadas com algum destes transtornos do que homens [15].

Simpson et al. (2012) fizeram uma pesquisa no PubMed e dos 443 artigos publicados entre 2010 a outubro de 2011, 17% utilizaram ratas fêmeas, 11% utilizaram ratos machos e fêmeas, enquanto a maior parte, 72%, utilizaram somente ratos machos. Cinco respeitadas revistas científicas foram incluídas nesta pesquisa: Behavioural Brain Research, Behavioural

Pharmacology, Pharmacology, Biochemistry and Behaviour, Physiology and Behaviour e Psychopharmacology.

A ausência de ratas fêmeas nos estudos é em parte devido ao ciclo estral. Sabe-se que este dura cerca de 4-5 dias e é composto por 4 fases, sendo elas: proestro, estro, metaestro e diestro; a progesterona aumenta acentuadamente começando cedo no período pós-ovulatório (metaestro) no primeiro dia e cai acentuadamente no segundo dia (diestro). Durante o proestro, o nível de estrogênio aumenta visivelmente seguido por um aumento de secreção de progesterona: esse aumento hormonal desencadeia a ovulação. Os hormônios voltam ao seus níveis basais quando acontece a ovulação (estro) no quarto dia, seguido por um pico temporário de estradiol na noite do estro [16] (fig.1).

5   Figura- 1 Esquema demonstrando o ciclo estral das ratas e as flutuações dos hormônios progesterona e estrogênio durante os quatro dias de ciclo [16].

Acredita-se que o ciclo estral interfere nos resultados de diversos testes comportamentais por aumentar a variabilidade dos resultados e pela necessidade de aumentar o número de ratos testados [15]. Dessa forma, chegamos a um impasse: (a) a óbvia necessidade de utilizarmos ratas fêmeas nos testes comportamentais devido à existência de diferenças comportamentais, fisiológicas ou neurobiológicas entre os sexos, por causa dos hormônios sexuais, que aumentam a quantidade de ratos necessários para os experimentos e (b) a não utilização das ratas por conta destes mesmos hormônios sexuais, que complicam a análise de resultados e dificultam a produção de medicamentos mais específicos, ou mesmo a compreensão da etiologia destes transtornos em mulheres.

Ao longo da introdução deste trabalho nós acreditamos ter ressaltado que: a) temos uma região genômica de grande importância na busca de genes candidatos para a ansiedade (Anxrr16); b) desenvolvemos uma linhagem, que necessita agora ser avaliada comportamentalmente, para melhor compreender os efeitos desta região genômica sobre a ansiedade; e c) temos a necessidade de avaliar as fêmeas e os fatores ligados ao ciclo estral nestes animais.

Assim, nossas hipóteses neste trabalho, são que as fêmeas da linhagem SLA16 serão ainda menos “ansiosas” que as fêmeas SHR, devido aos efeitos do locus Anxrr16, e que fatores ligados ao ciclo estral influenciarão o comportamento das fêmeas das duas linhagens nos testes comportamentais aos quais elas serão submetidas.

6   2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

O objetivo geral deste trabalho será avaliar o comportamento de fêmeas das linhagens SLA16 (congênica) e SHR (isogênica), considerando os fatores ligados ao ciclo estral destes animais, em diferentes aparatos comportamentais de ansiedade.

2.2 Objetivos específicos

- Avaliar o comportamento das fêmeas da linhagem SLA16 nos testes do campo aberto (CA), labirinto em cruz elevado (LCE) e caixa branca e preta (CBP).

- Avaliar o comportamento das fêmeas da linhagem SHR nos testes do campo aberto (CA), labirinto em cruz elevado (LCE) e caixa branca e preta (CBP).

- Avaliar a influência das diferentes fases do ciclo estral nas linhagens SLA16 e seu controle isogênico SHR nos testes comportamentais do campo aberto (CA), labirinto em cruz elevado (LCE) e caixa branca e preta (CBP).

7   3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

No presente estudo foram analisadas 49 ratas de 8 a 10 semanas de idade de ambas as linhagens, sendo 23 da linhagem controle isogênica SHR e 26 da linhagem congênica SLA16. Os animais foram separados em grupos de 4 ou 5 em gaiolas de polipropileno (41x34x16 cm) com etiquetas de identificação contendo data de nascimento, data do desmame e nome da linhagem. Tinham livre acesso a água e comida e permaneceram em um ambiente com temperatura de 21o C±1°C com um ciclo de 12 horas claro/escuro.

As ratas eram transportadas deste ambiente para uma outra sala onde era efetuado o teste comportamental e depois feita a coleta do esfregaço vaginal (PP00656 (CEUA/UFSC)).

3.2 Determinação da fase do ciclo estral

As ratas tiveram seu ciclo estral acompanhado por 4 dias previamente aos testes comportamentais para verificar se eram estes regulares, ou seja se a fêmea passava por todas as fases do ciclo. Basicamente, os animais foram imobilizados e, usando-se uma pipeta plástica, introduziu-se, superficialmente, na cavidade vaginal da rata cerca de 0,2mL de solução salina 0,9%. Após a lavagem da cavidade vaginal, com a solução salina, o fluído foi retirado e colocado em lâmina de microscópio limpa. Os esfregaços foram avaliados a fresco, com coloração de azul de metileno, e conduzidos sob aumento de 10X e 40X, para observação das características celulares, de acordo com o ciclo ovariano. Em caso de dúvida o processo era repetido. As análises foram feitas diariamente as 13:30h.

Além disso, ao final de cada teste comportamental nós também repetimos o processo para determinar em qual fase do ciclo a rata estava durante o período em que foi testada.

3.3 Testes comportamentais

Os animais passaram pelos testes comportamentais do campo aberto, do labirinto em cruz elevado e da caixa banca e preta por três dias seguidos, realizando somente um teste por dia e seguindo esta ordem.

As ratas permaneciam 5 minutos em cada aparato e logo após o término do teste tinham o esfregaço vaginal retirado para determinar a fase do ciclo estral.

8   3.3.1 Campo aberto (CA)

É um aparato feito de madeira como já descrito anteriormente [17], quadrado, medindo 100 x 100 cm. O chão é branco dividido em 25 quadrados de 20 x 20 cm e as paredes, também brancas, tem 40 cm de altura.

A sala de teste comportamental tinha uma luminosidade baixa, medindo 10 lux no centro do aparato. Cada rato foi colocado no centro do campo aberto e as variáveis medidas foram gravadas por uma câmera posicionada acima do campo aberto por 5 minutos: locomoção na periferia (quadrados adjacentes às paredes), locomoção central e tempo no centro.

Após cada animal ser testado, o aparato era limpo com esponja embebida em álcool 10% e seco com papel toalha. O comportamento de cada animal foi gravado por uma câmera de vídeo posicionada acima do aparato, o que permitia o esclarecimento de qualquer dúvida posterior. Além disto, o monitoramento instantâneo possibilitava a retirada das medidas por um observador treinado localizado em uma sala adjacente, através de um circuito fechado de TV. Os métodos de limpeza e gravação foram os mesmos para todos os outros testes comportamentais.

3.3.2 Labirinto em cruz elevado (LCE)

Como já descrito anteriormente [18], este aparato é feito de perspex (um tipo de plástico), com 4 braços em formato de cruz medindo 45 cm de comprimento e 10 cm de largura cada um. Dois braços opostos são fechados com paredes medindo 50 cm de altura e os outros dois são abertos. Há uma plataforma central medindo 10 x 10 cm que dá acesso a qualquer um dos 4 braços. O labirinto fica a 66 cm do chão e é da cor preta.

A iluminação no dia do teste na plataforma central era de 7,4 lux. Cada rato era colocado nesta plataforma e tinha seu comportamento gravado por 5 minutos com uma câmera posicionada acima do labirinto. As variáveis analisadas foram: tempo nos braços fechados, tempo nos braços abertos, número de entradas nos braços abertos e número de entradas nos braços fechados. Estas medidas só foram consideradas quando a rata passava com as 4 patas da plataforma para cada braço.

3.3.3 Caixa branca e preta (CBP)

Este aparato, como já foi descrito [19], também é feito de perspex e é dividido em dois compartimentos: um pintado de branco iluminado por uma lâmpada branca incandescente de

9   60W e outro pintado de preto, iluminado por uma lâmpada vermelha incandescente. Em ambos, a lâmpada fica a 37 cm acima do chão. Entre eles existe uma pequena abertura de 7 x 7 cm. Cada rata foi posicionada no compartimento branco e por 5 minutos tiveram seu comportamento filmado e as seguintes variáveis foram analisadas: tempo no compartimento branco, tempo no compartimento preto e número de transições.

3.4 Análise estatística

A análise estatística foi realizada através da ANOVA (Análise de Variância) de duas vias (sendo os fatores principais a linhagem e a fase do ciclo estral) com teste post-hoc de Duncan sendo utilizado quando necessário. Os dados foram considerados significativos quando o valor de p foi menor que 0,05 (p<0,05). O programa de computador utilizado para fazer essas análises estatísticas foi o Statistica 7.0.

10   4. RESULTADOS

Considerando-se as hipóteses de que: (a) as ratas da linhagem SLA16 seriam ainda menos ansiosas do que as ratas SHR devido à presença do locus Anxrr16; e de que (b) o ciclo estral das ratas influenciaria nos resultados dos testes comportamentais, nós obtivemos os resultados descritos abaixo em cada teste comportamental.

No teste do campo aberto, a linhagem SLA16 teve maior locomoção central (F=5,0; p<0,05) (fig. 2) e periférica (F=12,6; p<0,01) em comparação com a linhagem controle SHR. No teste do labirinto em cruz elevado, a linhagem SLA16 teve maior número de entradas (F=9,5; p<0,01) (fig. 3) e tempo nos braços abertos (F=10,3; p<0,01) (fig. 4) em comparação com a linhagem controle SHR. Por fim, no teste da caixa branca e preta, a linhagem SLA16 teve maior tempo (F=6,1; p<0,05) (fig. 5) e locomoção no compartimento branco (F=8,4; p<0,01) em comparação com a linhagem SHR controle.

Não houve nenhum efeito significativo do ciclo estral nestes testes comportamentais.

Figura – 2 A figura mostra a locomoção central das ratas no campo aberto separadas por linhagem (SHR e SLA16) e fase do ciclo estral. *p<0,05.

Campo Aberto

Proestro

Estro

Metaestro

Diestro

SHR

SLA16

Nº

d

e

q

u

a

d

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d

o

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c

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n

tr

a

is

11   Figura – 3 A figura mostra o número de entradas nos braços abertos das ratas no labirinto em cruz elevado separadas por linhagem (SHR e SLA16) e fase do ciclo estral. *p<0,01.

Figura 4 – A figura mostra o tempo nos braços abertos das ratas no labirinto em cruz elevado separadas por linhagem (SHR e SLA16) e fase do ciclo estral. **p<0,01.

LCE

Proestro

Estro

Metaestro

Diestro

SHR

SLA16

Nº

e

n

tr

a

d

a

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o

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LCE 2

Proestro

Estro

Metaestro

Diestro

SHR

SLA16

Te

m

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o

no

s

br

a

ç

os

a

be

rt

o

s

(

s

)

12   Figura – 5 A figura mostra o tempo passado no compartimento claro das ratas na caixa branca e preta separadas por linhagem (SHR e SLA16) e fase do ciclo estral. *p<0,05.

CBP

Proestro

Estro

Metaestro

Diestro

SHR

SLA16

13   5. CONCLUSÕES

Neste estudo da influência do ciclo estral nas linhagens de ratos congênica SLA16 e seu controle isogênico SHR, as linhagens diferiram para diversos comportamentos relacionados à emocionalidade, demonstrando que a linhagem SLA16 é ainda menos ansiosa que a SHR confirmando, assim, os efeitos do locus Anxrr16 sobre a emocionalidade e também a nossa hipótese inicial.

As pequenas variações relativas às fases do ciclo estral não parecem ser um fator determinante no comportamento das fêmeas destas linhagens nestes aparatos, o que refutou a segunda hipótese deste estudo. Porém, devido à pequena variação comportamental observada entre as fases, nós sugerimos que um aumento do número experimental poderá, futuramente, revelar algum efeito significativo sobre o comportamento destas linhagens.

A maior limitação deste estudo foi a quantidade de animais utilizados, pois apesar dos mesmos serem suficientes para uma análise estatística criteriosa, o número de animais dentro de cada linhagem e fase ainda não é o ideal em alguns casos. O principal fator que contribui para este fato foi a diminuição da capacidade reprodutiva dos animais no período e o tempo de espera necessário até os animais atingirem a maturidade reprodutiva para que pudessem ser realizados os experimentos.

14   6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Ramos A, Berton O, Mormède P, Chaouloff F. A multiple-test study of anxiety-related behaviours in six inbred rat strains. Behav Brain Res 1997;85:57-69.

[2] Ramos A, Kangerski A L, Basso P F, Santos J E S, Assreuy J, Vendruscolo L F, Takahashi R N. Evaluation of Lewis and SHR rat strains as a genetic model for the study of anxiety and pain. Behav Brain Res 2002;129:113-123

[3] Ramos A, Mellerin Y, Mormède P, Chaouloff F. A genetic and multifactorial analysis of anxiety-related behaviours in Lew and SHR intercrosses. Behav Brain Res 1998;96:195-205. [4] Yalcin B, Flint J, Mott R. Using Progenitor Strain Information to Identify Quantitative Trait Nucleotides in Outbred Mice. Genetics 2005;171(2):673-81.

[5] Ramos A, Moisan M-P, Chaouloff F, Mormède C and Mormède P. Identification of female-specific QTLs affecting an emotionality-related behaviour in rats. Mol Psychiatry 1999;4:453-462.

[6] Izídio G S, Oliveira L C, Oliveira L F G, Pereira E, Wehrmeister T D, Ramos A. The influence of sex and estrous cycle on QTL for emotionality and ethanol consumption. Mamm Genome 2011;22:329-340.

[7] Ledesma A M R, Desai A N, Bolivar V J, Symula D J, Flaherty L. Two new behavioral QTLs, Emo4 and Rev1, map to mouse Chromossome 1: congenic strains and candidate gene identification studies. Mamm Studies 2006 Feb;17(2):111-8.

[8] Hashimoto H. Study on establishment of congenic strains and screening of characteristics in IRS-2 deficient mice to support translational research on type 2 diabetes. Exp Animal 2011;60(1):21-32.

[9] Hoover-Plow J, Sa Q, Huang M, Grondolsky J. Genetic dissection of quantitative trait loci for hemostasis and thrombosis on mouse chromossomes 11 and 5 using congenic and subcongenic strains. PLoS One 2013 Oct;17:8(10)

[10] Stewart T P, Mao X, Aggad M N, Uffort D, Dillon K D, Saxton A M, Kim J H.   Subcongenic  analysis  of  tabw2  obesity  QTL  on  mouse  chromossome  6.  BMC  Genet  2012   Oct;1:13-­‐81.  

[11]  Crabbe  J  C,  Philips  T  J,  Belknap  J  K.    The  complexity  of  alcohol  drinking:  studies  in   rodent  genetic  models.  Behav  Genet  2010;40(6):737-­‐50.  

15   [12]  Ehringer  M  A,  Thompson  J,  Conroy  O,  Yang  F,  Hink  R,  Bennett  B,  Johnson  T  E,  Sikela   J  M.    Fine  mapping  of  polymorphic  alcohol-­‐related  quantitative  trait  loci  candidate  genes   using   interval-­‐specific   congenic   recombinant   mice.   Alcohol   Clin   Exp   Res.   2002;26(11):1603-­‐8.  

[13]   Barnes   L   L,   Wilson   R   S,   Bienias   J   L,   Schneider   J   A,   Evans   D   A,   Bennett   D   A.   Sex   differences   in   the   clinical   manifestations   of   Alzheimer   disease   pathology.   Arch   Gen   Psychiatry.  2005;62:685-­‐91.  

[14]  Lindamer  L  A,  Lohr  J  B,  Haris  M  J,  McAdams  L  A,  Jeste  D  V.  Gender-­‐related  clinical   diferences  in  older  patients  with  schizophrenia.  J  Clin  Psychiatry.  1999;60(1):61-­‐7.   [15]  Horst  J  P,  Kloet  E  R,  Schachinger  H,  Oitzl  M  S.  Relevance  of  stress  and  female  sex   hormones  for  emotion  and  cognition.  Cell  Mol  Neurobiol.  2012;32(5):725-­‐35.

[16]  Simpson  J,  Kelly  J  P.  An  investigationof  whether  thare  are  sex  diferences  in  certain   behavioural  and  neurochemical  parameters  in  the  rat.  Behav  Brain  Research.  2012;289-­‐ 300.  

[17] Ramos A, Mellerin Y, Mormède P, Chaouloff F. A genetic and multifactorial analysis of anxiety-related behaviours in Lewis and SHR intercrosses. Behav Brain Res 1998;96:195-205.

[18] Ramos A, Berton O, Mormède P, Chaouloff F. A multiple-test study of anxiety –related behaviours in six inbreed rat strains. Behav Brain Res 1997;85:57-69.

[19] Chaouloff F, Castanon N, Mormède P. Paradoxal diferences in animal models of anxiety among the Roman rat lines. Neurosci Lett 1994;182:217-21.