Controle de Qualidade das Folhas de Ginkgo biloba L.
Comercializadas para Decocção e Infusão
Romanita C. Moschen1*, Christiane C. Pereira1, Jairo P. Oliveira2, Adilson R. Prado3,4
1Departamento de Farmácia – UNESC, Colatina-ES.
2Departamento de Morfologia - CCS / UFES, Vitória - ES 3Pós-graduação em Engenharia Elétrica - Labtel - UFES 4Instituto Federal do Espírito Santo - IFES, Serra – ES
*romanitacm@hotmail.com
Resumo
As plantas medicinais são amplamente conhecidas e utilizadas em todo o mundo. Ao contrário do que se pensa e por ter um conhecimento empírico muito difundido, os produtos de origem vegetal podem sim trazer prejuízos à saúde se usados indiscriminadamente. Desta forma, surge o controle de qualidade que busca a segurança e a garantia da eficácia desses medicamentos. O controle de qualidade de fitoterápicos foi desenvolvido neste trabalho utilizando-se três amostras de folhas secas de Ginkgo biloba L. adquiridas no comércio de Colatina e Vitória – ES. Foram realizados testes de Cromatografia em Camada Delgada (CCD), para verificar a autenticidade e a eficiência das substâncias nelas contidas, e, por se tratar de um método confiável e preciso, pôde auxiliar na confirmação de substâncias que estão presentes nesta planta em comparação com o descrito na literatura. Foi realizada também a análise macroscópica da amostra, o que mostrou não haverem outros componentes senão as folhas de Ginkgo. Testes para o teor de umidade e de cinzas totais mostraram que as amostras encontravam- se dentro da conformidade exigida pela Organização Mundial da Saúde (OMS), e os testes microbiológicos constataram a ausência de microrganismos patogênicos e presença de microrganismos viáveis, porém dentro dos limites aceitáveis pela legislação vigente.
Palavras-chave: Fitoterápicos, controle de qualidade, Ginkgo biloba L.
Introdução
O Ginkgo biloba é um dos mais famosos fitoterápicos do mercado mundial, seu processo de produção é extremamente complexo e custoso, o que torna este extrato alvo comum de adulteração. Os extratos de Ginkgo biloba foram introduzidos na medicina em 1965, através das pesquisas do médico-farmacêutico alemão Willmar Schwabe. Há uma quantidade enorme de fontes bibliográficas que descrevem a investigação científica relacionada com o efeito do Ginkgo biloba e foram documentadas várias atividades farmacológicas do extrato de suas folhas e/ou de seus componentes, que incluem seu efeito sobre a conduta, o aprendizado, a memória, a atividade cardiovascular, e seu efeito sobre a circulação sanguínea e sua atividade antioxidante.1
Os efeitos farmacológicos do extrato do Ginkgo biloba e seus componentes são amplamente descritos, dados estes que comprovam evidências e apóiam o uso clínico moderno do extrato padronizado da folha de Ginkgo biloba.
Os princípios ativos mais importantes do extrato de Ginkgo biloba incluem os glicosídeos de flavonóides e as lactonas terpênicas. Foi descrito que ele realiza uma atividade polivalente, é provável que a atividade combinada de vários de seus componentes seja responsável por seu efeito.1 Desde a aplicação de compressas das folhas, a ingestão de chás, tinturas, extratos espessos e secos, até a incorporação de produtos otimizados na obtenção de formas farmacêuticas sólidas, esse vegetal é um dos exemplos mais consistentes do aprimoramento do conceito de produto fitoterápico e de estratégia terapêutica.2
Na comercialização de plantas medicinais, como é o caso do Ginkgo biloba, o conhecimento popular pode gerar erros na identificação da planta e, ainda, não se pode descartar a possibilidade de adulterações, interações de plantas
Copyright © Todos os direitos reservados Revisado em Agosto 2013
Aceito em Outubro 2013
com medicamentos alopáticos e reações alérgicas e tóxicas. Para a garantia da qualidade do produto final, é essencial que se faça análise e controle de matéria- prima, embalagem e formulação farmacêutica, além de estudos de estabilidade.3,4
Comerciantes e usuários de plantas divulgam seus usos medicinais muitas vezes sem nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas. Às vezes o uso medicinal destas plantas é bem diferente do uso popular.3 A qualidade dos produtos à base de plantas medicinais, comercializados no Brasil, é cada vez mais preocupante. Pesquisas científicas têm apontado a presença de diversas irregularidades que comprometem a eficácia do princípio ativo e põem em risco a saúde do consumidor. Uma das justificativas seria a de as indústrias responsáveis pela fabricação desses produtos serem basicamente constituídas por empresas de pequeno porte que funcionam de modo precário.5
Assim como os medicamentos sintéticos, a qualidade da matéria prima vegetal é de extrema importância para a qualidade do produto final. No caso dos fitoterápicos, os insumos vegetais são geralmente de fácil análise, mas os extratos e formas farmacêuticas derivadas requerem análises mais apuradas, pois devem garantir que a ação biológica e a segurança na utilização sejam constantes e devem ter sua autenticidade comprovada através da análise de sua composição química, aspectos botânicos, fitoquímicos, farmacológicos e toxicológicos.6,7
O controle de qualidade na manipulação do fitoterápico assegura que os produtos manipulados estejam de acordo com as boas práticas de manipulação, tendo em vista o aumento da procura e consumo dessa espécie de medicamento. Fraudes e adulterações de produtos vegetais são frequentes e ocorrem por diversos fatores, como por exemplo, a falta de conhecimento dos produtores, distribuidores e deficiência na fiscalização.
A finalidade desse estudo foi avaliar se a matéria-prima vegetal encontrada em farmácias, lojas de produtos naturais e mercados atendem às especificações de qualidade descritos na literatura e demonstrar a importância deste controle.
Material e Métodos
A escolha do material vegetal utilizado neste trabalho se deu por uma pesquisa qualitativa e quantitativa através de um questionário, que foi respondido pelos farmacêuticos das farmácias de manipulação de Colatina- ES. Com esse questionário, foi levantado os fitoterápicos mais comercializados nas farmácias de manipulação na cidade de Colatina e Vitória-ES. Através do resultado do questionário, adquiriram-se amostras de 3 (três)
Colatina-ES, conforme pode ser observado na figura 1.
Em seguida, foram realizados testes de cromatografia em camada delgada (CCD) com o objetivo de identificação de constituintes químicos, teor de umidade e teor de cinzas, detecção de falsificação e adulteração, além de testes microbiológicos. Também foi feita uma análise das informações contidas nas embalagens para verificação se estavam de acordo com a Portaria nº 6/MS/SNVS, de 31 de janeiro de 1995,8 quanto às informações contidas na rotulagem, embalagem e bulas.
Figura 1. Folhas secas de Ginkgo biloba L. na forma em que são comercializadas.
Para a preparação da amostra a ser analisada, reduziu-se o material vegetal em partículas de tamanho homogêneo através de trituração. Para a obtenção do extrato foi utilizada a amostra vegetal obtida como descrito anteriormente. A preparação das amostras para a CCD consistiu na pesagem de 1,0 g destas amostras A, B e C, adicionou-se 10 ml de metanol e a mistura foi deixada sob refluxo em Soxlet por 30 minutos a 65°C.
Obteve-se um líquido claro que foi evaporado em banho- maria a 60°C até secura e depois resuspendido em 2 ml de metanol, utilizando-se, então, 10µL deste material final para aplicação na CCD.9
Na CCD, a fase estacionária consistiu em placa de vidro 10x10 cm com uma camada de 25 mm de sílica gel 60 com indicador fluorescente UV254 da marca alemã Macherey-Nagel. Foram preparadas três placas para a analise dos extratos, sendo usado três fases móveis diferentes para a detecção dos vários flavonoides que são encontrados no Ginkgo biloba L., sendo para cada placa as seguintes fases móveis: Placa 1: a primeira mistura composta de acetato de etila/ácido acético glacial/ácido fórmico/água (100:11:11:26); Placa 2: a segunda mistura composta por clorofórmio/acetona/
ácido fórmico (75:16,5:8,5); Placa 3: a terceira mistura composta de tolueno/acetona (70:30). Em três cubas de vidro previamente saturadas com as misturas citadas anteriormente, foi feita a corrida para glicosídeos flavonoides e visualizou-se sob luz UV de 365nm.9
A análise de perda por secagem consistiu na pesagem de 1,0 g de cada uma das amostras pulverizadas em uma
estufa a 100-105 °C por 2h. A pesagem foi realizada e então, o material foi novamente colocado em estufa, sendo feitas mais duas pesagens, somando-se 3h e 4h a partir do início do procedimento. É interessante ressaltar que tal procedimento foi realizado em triplicata.10
A determinação do teor de cinzas consistiu no aquecimento ao rubro de um cadinho de porcelana durante 30 minutos em forno mufla. Esfriou-se em dessecador e pesou-se. Acrescentou-se ao cadinho 1,0 g da amostra pulverizada e foi feito seu espalhamento uniformemente no fundo do mesmo (procedimento realizado em triplicata).
Secou-se em estufa durante 1h a 100-105 ± 5 °C e após este procedimento levou-se ao forno mufla aumentando a temperatura gradativamente, sendo 30 minutos em 200 °C, 60 minutos a 400 °C e 90 minutos a 600 ± 25 °C. O material foi esfriado em dessecador e pesado. O procedimento foi repetido a 600 ± 25 °C até massa constante, deixando-se esfriar em dessecador a cada incineração.10
Para a pesquisa de bactérias aeróbias, foi utilizado o meio de cultura Agar Contagem de Placas (Agar métodos padrão), que é um meio de cultura ótimo para crescimento de Escherichia coli, Lactobacillus casei, Staphylococcus aureus entre outros, mas infelizmente não inibe o crescimento de fungos e leveduras. Por esse motivo, foi realizado o método de semeadura por profundidade, para tentar diminuir o crescimento destes microrganismos e confirmar se a contagem feita havia sido somente de bactérias ou se possivelmente havia fungos.
Resultados e Discussão
Na cromatografia em camada delgada (CCD) foram detectadas nitidamente em todas as amostras manchas reveladas em fonte luminosa UV de 365 nm e foram calculados seus respectivos Rf’s (coeficiente de retenção) para a identificação das mesmas. O agente revelador utilizado foi o cloreto de alumínio a 1% em etanol que é um agente revelador para flavonóides em geral. Isso ajudou a destacar as manchas encontradas nas amostras que foram corridas com três tipos de fases móveis diferentes, o que indicou a presença dos vários flavonóides que a literatura descreve conter no Ginkgo biloba L., conforme mostrado na figura 2 abaixo.
De acordo com Hildebert,9 uma mancha amarelo-laranja com Rf superior a 0,75 indica presença de agliconas flavonol e biflavonóides.9 Os Rf’s das manchas reveladas para a placa 1 podem ser observados na Tabela 1.
Figura 2. Revelação em lâmpada de UV a 365 nm das Placas:
(A) Placa 1, (B) Placa 2 e (C) Placa 3, em todos os casos contendo as amostras de estrato rotuladas por A, B e C.
A Tabelas 2 e 3 a seguir mostram os dados obtidos para as demais placas, é interessante ressaltar que para as outras placas foram calculados diferentes valores de Rf, já que o processo de eluição com as outras misturas foram mais eficientes. Desse modo é possível verificar uma considerável variação de cores ao logo de todo caminho da fase móvel.
Tabela 1. Cálculos dos Rf’s das manchas reveladas na placa 1.
Amostra A (Rf) Amostra B (Rf) Amostra C (Rf) Cálculo Resul-tado Cálculo Resulta-do Cálculo Resul-
tado 5,5/6,7 0,8 5,5/6,7 0,8 5,45/6,7 0,8
A tabelas 2 e 3 a seguir mostram os dados obtidos para as demais placas, é interessante ressaltar que para as outras placas foram calculados diferentes valores de Rf, já que o processo de eluição com as outras misturas foram mais eficientes. Desse modo é possível verificar uma considerável variação de cores ao logo de todo caminho da fase móvel.
Tabela 2. Cálculos dos Rf’s das manchas reveladas na placa 2.
Amostra A (Rf) Amostra B (Rf) Amostra C (Rf)
Cálculo Resulta-do Cálculo Resulta-do Cálculo Resulta-do
1/6,8 0,14 1/6,8 0,14 1/6,8 0,14
1,3/6,8 0,19 1,3/6,8 0,19 1,3/6,8 0,19 2,5/6,8 0,36 2,4/6,8 0,35 2/6,8 0,29 3,4/6,8 0,5 3,3/6,8 0,48 2,5/6,8 0,36 4/6,8 0,58 3,8/6,8 0,55 3,9/6,8 0,57 4,4/6,8 0,64 4,2/6,8 0,61 4,1/6,8 0,60 5,2/6,8 0,76 5/6,8 0,73 4,6/6,8 0,67 5,8/6,8 0,85 5,7/6,8 0,83 5,4/6,8 0,79 6,1/6,8 0,98 6,1/6,8 0,98 5,9/6,8 0,86
- - - - 6,2/6,8 0,91
Através dos Rf’s calculados, constatou-se a presença de várias substâncias, de acordo com Hildebert (1996). Estes autores afirmam que os Rf’s entre 0,25 e 0,4, com manchas nas cores amarelo- verde/laranja, indicam presença de rutina, quercetina, kaempferol e isorhamnetin-3-O-(2”-6”-di-O- -L-rhamnopyranosyl)- -D-glucopyanoside. Os Rf’s de 0,45 a 0,49, apresentando cores verde-amarelo, indicam narcissin, isorhamntin-rutinoside. Rf’s na faixa de 0,5, com coloração azul claro fluorescente, indicam ácido 6-hydroxikynurenic kaempferol, quercentina- 3-O-(6”’-trans-p- coumaroyl-4”-glucosyl)- rhamnoside.
Os Rf’s de 0,6, de cor laranja-amarelo, indicam quercitrina e os Rf’s acima de 0,6 e até 0,75, na cor verde-amarelo, indicam isoquercitrina e astragalin, dihydrokaempeferol-7-O-glucoseide. Já os Rf’s de 0,75 ou maiores, de coloração amarela-laranja, indicam preseça de agliconas flavonol e biflavonóides.9
Tabela 3. Cálculos dos Rf’s das manchas reveladas em luz UV na placa 3.
Amostra A (Rf) Amostra B (Rf) Amostra C (Rf)
Cálculo Resul-tado Cálculo Resul-tado Cálculo Resul-tado 0,5/7,1 0,07 0,4/7,1 0,05 0,5/7,1 0,06 0,9/7,1 0,12 0,7/7,1 0,09 0,8/7,1 0,10 1,2/7,1 0,16 1,1/7,1 0,15 1,1/7,1 0,15 1,6/7,1 0,22 1,5/7,1 0,21 1,5/7,1 0,20 2,1/7,1 0,29 1,9/7,1 0,26 1,9/7,1 0,26 2,6/7,1 0,36 2,5/7,1 0,34 2,4/7,1 0,33 3,5/7,1 0,49 3,3/7,1 0,46 3,3/7,1 0,46 3,8/7,1 0,53 3,6/7,1 0,51 3,7/7,1 0,51 4,6/7,1 0,65 4,7/7,1 0,66 4,6/7,1 0,64 5,6/7,1 0,78 5,6/7,1 0,78 5,6/7,1 0,78 6,5/7,1 0,91 6,5/7,1 0,91 6,4/7,1 0,90
Não se quantifica compostos químicos pelo método de CCD e, em se tratando de matéria-prima em forma de folhas, possivelmente cada amostra apresentaria valores diferentes, pois somente o extrato seco padronizado EGb 761 contém uma quantidade conhecida de princípio ativo, que a RDC 89/2004 diz que deve conter no mínimo 24% de ginkgoflavonóides e 6% de terpenóides 11.
Em estudo feito por Bara,12 foi pesquisado o teor do princípio ativo contido no extrato seco de várias matérias- primas vegetais e foi encontrada uma amostra de Ginkgo biloba que possuía um teor de princípio ativo muito abaixo, o que levou à dedução de que a amostra se tratava do pó da planta e não do extrato. Isso mostrou a importância do uso do extrato seco padronizado para que se tenha um resultado eficiente e confiável, pois em outra forma como, por exemplo, o pó das folhas desta planta poderia conter ácido ginkgólico e por se tratar de uma substância alergênica não tem o uso recomendado. Nos extratos secos, sua concentração deve ser menor que 5 ppm.
Para a análise de perda por secagem, todas as amostras mostraram-se dentro do ideal aceito que é de até 11%
de umidade pela recomendação da OMS, sendo que a amostra A apresentou uma média de 6,43%, a amostra B de 5,82% e a amostra C de 6,02%. Em material vegetal, o baixo teor de umidade é importante, por se tratarem de amostras de folhas secas que não passaram por nenhum processo senão a secagem. A diminuição da atividade de água diminui também a possibilidade do crescimento de microrganismos e a deterioração a amostra.10
No ensaio para determinar o teor de cinzas, todas as amostras apresentaram resultados satisfatórios dentro do exigido pela OMS para folhas secas de Ginkgo biloba L. de
no máximo 11%. A amostra A apresentou uma média de 9,22%, a amostra B de 10,97% e a amostra C de 10,76%.
Este ensaio se fez importante pois através dele, seria possível detectar contaminantes inorgânicos não voláteis como pedras, cimento, pedaços de cerâmica e areia que é o mais comum entre outros se estivessem presentes 10.
Na análise microbiológica, a monografia da OMS informa os limites aceitos para os microrganismos pesquisados na folha do Ginkgo biloba L. e foram obtidos os seguintes resultados, conforme pode ser observado na Tabela 4.
Tabela 4. Resultados das análises microbiológicas.8
Microrga-
nismos *Limites
aceitáveis Resultado
Amostra A Resultado
Amostra B Resultado Amostra C Bactérias
aeróbias <107 UFC/g 15x10-3
UFC/g 3x10-2
UFC/g 7x10-3 UFC/g Fungos <105 UFC/g <105 UFC/g Ausente <105 UFC/g
Escherichia coli <102 UFC/g Ausente Ausente Ausente
Salmonella Ausência Ausente Ausente Ausente
A Tabela 4 apresenta os resultados das análises microbiológicas das amostras A, B e C de Ginkgo biloba L. e, como pode ser observado, todas as amostras encontraram-se dentro da quantidade de colônias aceitas.
A amostra B trazia em sua embalagem a informação de
“produto esterilizado” e provavelmente por esse motivo o crescimento de microrganismo foi praticamente nulo.
Estudos microbiológicos de fitoterápicos presentes na literatura demonstram que a quantidade de microrganismos encontrados nestes produtos raramente ultrapassa os valores aceitos de contaminação, o que está de acordo com os resultados encontrados no presente estudo. Isso foi demonstrado nos estudos de Andrade,13 em que foram feitas análises de matérias- primas e formulações farmacêuticas magistrais que incluíam o Ginkgo biloba na forma de extrato seco, cápsulas e folhas secas para chás. Porém, não se pode descartar a possibilidade deste tipo de contaminação, por se tratarem de materiais vegetais e seu cultivo, coleta e manipulação nem sempre serem feitos de forma higiênica, motivo pelo qual é necessário que seja efetuado o controle microbiológico destes produtos.
Vários estudos pesquisam a qualidade e quantidade dos flavonóides encontrados no Ginkgo biloba L., mostrando a importância deste componente para a ação terapêutica desta planta, porém fica claro que o extrato seco deve ser a matéria-prima utilizada nas formulações deste fitoterápico.
O grande problema de se consumir produtos como os chás das folhas dos vegetais é que não se sabe a quantidade do princípio ativo presente no produto, o que gera a possibilidade de ocorrência de reações adversas, como intoxicações, ou, ainda, o produto pode não apresentar o resultado esperado. O ideal é que os pacientes consumam
atenda adequadamente o seu consumidor não gerando riscos para sua saúde e, ao mesmo tempo, trazendo benefícios para o mesmo, de acordo com as normas disponíveis na literatura. Isso se aplica aos fitoterápicos, sendo essas análises de extrema importância para a garantia de que um produto bom e eficiente seja colocado no mercado. Dessa forma, observou-se através dos testes realizados neste trabalho que as três amostras de Ginkgo biloba L. analizadas encontravam-se dentro dos limites esperados para os testes quantitativos. No caso da cromatografia em camada delgada, apesar de o método ser qualitativo, se mostrou importante por apresentar resultados que indicaram a presença dos flavonóides característicos do Ginkgo biloba L., de acordo com as descrições das literaturas pesquisadas.
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