Revista de Biologia e Ciências da Terra
ISSN: 1519-5228
revbiocieter@yahoo.com.br Universidade Estadual da Paraíba Brasil
de Almeida, Jorge Xavier; de Melo e Medeiros, Filipe Patrício; Marques de Melo, Anaxímenes José;
Cavalcanti da Silva, José; Pires Dantas, José
Avaliação do efeito mutagênico da palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill) através do Teste de Micronúcleos em medula óssea de ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) IN VIVO
Revista de Biologia e Ciências da Terra, vol. 5, núm. 2, segundo semestre, 2005, p. 0 Universidade Estadual da Paraíba
Paraíba, Brasil
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REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 Volume 5 - Número 2 - 2º Semestre 2005
Avaliação do efeito mutagênico da palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill) através do Teste de Micronúcleos em medula óssea de
ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) IN VIVO.
Jorge Xavier de Almeida Neto1, Filipe Patrício de Melo e Medeiros1, Anaxímenes José Marques de Melo1, José Cavalcanti da Silva2, José Pires Dantas3
RESUMO
As mutações no DNA, têm provocado muitas doenças, dentre as quais inclui-se o câncer.
Estas alterações no DNA são induzidas por vários fatores, entre elas por substâncias contidas em vegetais. A palma forrageira (Opuntia ficus-indica) é uma planta muito utilizada no nordeste brasileiro, inclusive para alimentação humana. Devido a enorme importância, pretendeu-se avaliar o efeito mutagênico da palma forrageira (Opuntia ficus-indica) através do teste de micronúcleos em ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) in vivo.
Determinaram-se 4 grupos experimentais as quais foram administrados: ciclofosfamida (controle positivo), soro fisiológico (controle negativo), palma forrageira (Opuntia ficus-indica) e a palma forrageira (Opuntia ficus-indica) com a ciclofosfamida. Utilizaram-se 6 ratos (Rattus novergicus), 3 de cada sexo, por grupo. Depois de 24 horas, extraiu-se a medula óssea que, após a centrifugação, foram feitos esfregaços e corados para a leitura de eritrócitos policromáticos (PCE) e contagem de micronúcleos (MN) ao microscópio. Os dados foram analisados pelo teste do qui-quadrado. Apenas a ciclofosfamida teve efeito mutagênico com uma freqüência de média = 7,6 MNs/1000 PCEs. Com a palma forrageira (Opuntia fícus- indica Mill.) essa freqüência variou entre 1,5 e 3 MNs/1000 PCEs, que é considerado freqüência normal. Portanto, a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) não tem efeito mutagênico, sendo também antimutagênica.
Palavras-chave: teste de micronúcleos, palma forrageira, mutações, Opuntia, antimutagênico
ABSTRACT
The mutations of DNA, they have been provoking a lot of diseases, among which the cancer is included. These alterations in DNA are induced by several factors, among them for substances contained in vegetables. The palm forage-producing (Opuntia ficus-indica) it is a plant very used in the Brazilian northeast, besides with for human. Due to his importance, it intended to evaluate the effect mutagenic of the palm forage-producing (Opuntia ficus-indica) through the micronucleus test in mice (Rattus novergicus, lineage Wistar) alive in. They were determined 4 experimental groups which were administered: cyclophosphamide (it controls positive), physiologic serum (it controls negative), palm forage-producing (Opuntia ficus- indica) and the palm forage-producing (Opuntia ficus-indica) with the cyclophosphamide. 6 mice were used (Rattus novergicus), 3 of each sex, for group. After 24 hours, the bone marrow was extracted that, after the centrifugalization, they were made smears and red-faced
for the reading of erythrocyte polychromatic (PCE) and micronucleus counting (MN) to the microscope. The data were analyzed by the test of the qui-square. Just the cyclophosphamide had effect mutagenic with an average frequency = 7,6 MNs/1000 PCEs.
With the palm forage-producing (Opuntia fícus-indica) that frequency varied among 1,5 and 3 MNs/1000 PCEs, that normal frequency is considered. Therefore, the palm forage-producing (Opuntia fícus-indica) he doesn't have effect mutagenic being also antimutagenic.
Key words: micronucleus test, palm forage-producing, mutations, Opuntia, antimutagenic.
1 - INTRODUÇÃO
A mutação é uma alteração súbita e herdável na estrutura do material genético e como tal, é uma fonte extremamente importante de variabilidade genética nas populações de seres vivos(BURNS e BOTTINO, 1991). Entretanto, a curto prazo e do ponto de vista de um único organismo, a alteração genética é quase sempre prejudicial, especialmente em organismos multicelulares, nos quais a alteração genética está mais inclinada a perturbar o desenvolvimento e a fisiologia extremamente complexos e, finamente, sintonizados, de um organismo (ALBERTS et al, 2002).
A preservação do meio ambiente e a prevenção dos efeitos danosos causados pelo seu uso não apropriado, são preocupações cada vez maiores no mundo atual. A utilização cada vez mais acentuada de produtos como fármacos, agroquímicos, cosméticos, corantes e muitos outros, tem demonstrado aumento nas taxas de mutagênese ambiental (RIBEIRO et al, 2003). Tais agentes mutagênicos invadem a célula e se dirigem ao núcleo causando alterações no material genético podendo desregular o ciclo celular, fazendo com que a célula se reproduza descontroladamente invadindo tecidos adjacentes, dando início à formação de tumores.
Conhecer os componentes físicos, químicos e biológicos que causam alterações gênicas, é necessário para melhor preservar a saúde humana.
O teste do micronúcleo é o ensaio, in vivo, mais amplamente utilizado para a detecção de agentes clastogênicos (que quebram cromossomos) e aneugênicos (que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal), internacionalmente aceito como parte da bateria de testes recomendada para a avaliação do potencial mutagênico e para o registro de novos produtos químicos que entram anualmente no mercado mundial. Este teste foi desenvolvido de inicio, em eritrócitos de medula óssea de camundongos mas é também realizado em ratos. (TAKAHASHI et al, 2004)
Alguns vegetais contêm substâncias que acarretam a ocorrência de mutações. Por isso, há necessidade de estudá-las, fazendo-se testes que detectem o efeito mutagênico como o teste de micronúcleos.
A palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill) é um vegetal muito utilizado no nordeste brasileiro, principalmente como alimento para bovinos. Originado no continente americano, a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill), da família das cactáceas, se adapta muito bem as regiões semi-áridas do Brasil, sobretudo por ser muito resistente a longos períodos de estiagem, característica bastante seletiva.
Atualmente, este vegetal se presta às mais diversas utilidades, por ser amplamente difundido, de fácil plantio, altamente resistente à seca. A palma forrageira (Opuntia fícus- indica Mill) é uma das principais culturas da região Nordeste do Brasil e seu principal uso se restringe: ao alimento humano, alimento animal, à energia, medicina, cosmético, agronômico e outros, como: adesivos e colas, fibras para artesanato, papel, corantes, mucilagem para a indústria alimentícia, antiaspirantes e ornamental. (SEBRAE, 2001).
Devido à sua grande importância, pretendeu-se com este trabalho avaliar o efeito mutagênico da palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) através do teste de micronúcleos em ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) in vivo.
2 - METODOLOGIA 2.1 Local
Este trabalho foi desenvolvido no Biotério do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS), localizado na Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG).
2.2 Animais Utilizados no Experimento
Os animais utilizados provinham do Biotério da Faculdade de Medicina da UFCG, onde os ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) são mantidos em gaiolas de 20x30cm, em boas condições de temperatura, ou seja, de 20 a 25°C, e alimentados com ração específica.
2.3 Grupos Experimentais
Determinaram-se 4 grupos experimentais (T1, T2, T3, T4), com seis animais, três machos e três fêmeas em cada grupo, representados por:
• T1:50mg/kg de Ciclofosfamida (controle positivo) injetado intraperitonialmente
• T2: Soro fisiológico (controle negativo) injetado via intraperitonialmente, na mesma quantidade da ciclofosfamida
• T3: Tratamento com a palma forrageira (Opuntia ficus-indica, Mill), colocados 50g na dieta dos animais e analisado 24 horas depois.
• T4: Tratamento com a palma forrageira (Opuntia fícus-indica, Mill), colocados 50g na alimentação, e a Ciclofosfamida, na dosagem de 50mg/kg, analisado após 24 horas.
Os animais dos grupos T3 e T4 foram colocados individualmente em gaiolas menores, para se administrar os 50g, em cada gaiola, da palma forrageira. Antes e depois das 24 horas, o vegetal foi pesado para que se obtivesse a média da quantidade ingerida pelos ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar).
Figura 2: Grupos T3 e T4 inseridos individualmente em gaiolas menores.
Foto: Almeida Neto, 2004.
2.4 Aplicação do teste de micronúcleos
Para o teste de micronúcleos utilizaram-se os seguintes procedimentos:
2.4.1 Preparação Direta da Medula Óssea
Os ratos receberam os respectivos tratamentos, de acordo com o grupo, sendo sacrificados, após 24 horas, com a inalação de éter sulfúrico.
Em todos os animais as preparações para o estudo da freqüência de micronúcleos em células de medula óssea obedeceram a alguns critérios recomendados por Ribeiro et al (2003):
• Após o sacrifício do animal corta-se a pele que cobre a perna e retira-se o fêmur;
• A extremidade final proximal do fêmur é cortada para expor o canal da medula;
• A agulha de uma seringa de 1ml, previamente preenchida com soro fetal bovino, é inserida firmemente na abertura do fêmur, injetando-se o soro, de modo a empurrar a medula para dentro de um tubo de seringa, previamente marcado com o código do animal;
• A suspensão foi centrifugada, por 5 minutos, a 1000rpm, e o sobrenatante foi descartado com o auxilio da pipeta de Pasteur, e com esse material foram feitos os esfregaços.
3.4.2 Preparação dos Esfregaços
Os esfregaços foram preparados adicionando-se uma gota da suspensão na lâmina (previamente marcada com o código do animal) e com o auxílio de outra
lâmina inclinada num ângulo de 45°, de acordo com a metodologia utilizada por Ribeiro et al (2003).
Utilizaram-se efetivamente duas lâminas limpas para realização de cada esfregaço e se fizeram dois esfregaços por animal. Depois de secadas a temperatura ambiente, as preparações foram fixadas em Metanol P. A., durante 10 minutos e novamente deixadas para secar ao ar.
3.4.3 Coloração das Lâminas
A coloração das lâminas foi feita com o corante Giemsa diluído em solução tampão fosfato com PH 6,8, na proporção de 1:10, durante 15 minutos. Após a coloração, as lâminas foram lavadas com água destilada para remoção do excesso de corante e deixadas secar ao ar.
De acordo com Ribeiro et al (2003), a coloração serve para diferenciar eritrócito policromático (PCE) de eritrócito normocromático (NCE). Eritrócitos policromáticos (PCE) ou jovens se coram de azul claro e eritrócitos normocromáticos se coram de vermelho-telha.
Figura 3: Diferença na coloração de PCE e NCE: (a) eritrócito policromático micronucleado (PCEMN); (b) eritrócito policromático; (c) eritrócito normocromatico. (Foto retirada do livro Mutagênese Ambiental, 2003)
3.4.4 Leitura das Lâminas
Para a leitura das lâminas realizaram-se os seguintes procedimentos:
• Utilização de microscópio óptico com objetiva de aumento de 100 vezes;
• Contagem e análise de 1000 eritrócitos policromáticos (PCE) e apenas a contagem de eritrócitos normocromáticos (NCE) em 200 PCEs para cada esfregaço;
• A leitura do campo laminar foi feita em ziguezague.
Rabello-Gay et al (1991) apud Silva et al (2003) consideram uma freqüência normal de três eritrócitos micronucleados em 1000 PCEs, portanto, considerou- se a freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMN) e, ainda, como a freqüência de células micronucleadas entre os NCEs não aumenta da
mesma forma que nos PCEs, tendo este comportamento não se faz necessário analisar NCEs micronucleados (RIBEIRO et al, 2003).
3.4.5 Análise dos dados
As lâminas de todos os animais (grupos tratados, controle positivo e controle negativo), foram analisadas pelo mesmo observador, em teste cego (sem manipulação de dados), de modo a eliminar erros de análise, como recomendam Ribeiro et al (2003).
A análise dos dados foi feita através do teste de χ2 (Qui-quadrado), indicado para casos em que um grande número de unidades amostrais deve ser considerado e a ocorrência das anomalias procuradas constituem um evento raro. Na Citogenética, uma anomalia cromossômica é um evento raro vista que, há necessidade de um grande número de espaços amostrais para que um número de ocorrência de eventos observados seja considerado significante (SILVA et al, 2003).
Segundo Pereira (1991) apud Silva et al (2003), o teste do χ2 é definido pela fórmula:
χ2= (FO – FE)2 FE Donde:
FO: Freqüência do evento observado experimentalmente;
FE: Freqüência esperada do evento.
A Freqüência Observada (FO) foi obtida somando-se a quantidade de micronúcleos no tratamento. A Freqüência Esperada (FE) é adquirida adicionando-se a freqüência de micronúcleos de dois grupos e dividindo por 2 (quantidade de tratamentos). Daí por diante, seguiu-se a realização dos cálculos na fórmula do χ2.
O Qui-quadrado (χ2) é um teste estatístico muito utilizado em trabalhos de Citogenética, pois possibilita a comparação da freqüência de dados que, neste trabalho, está relacionada com a freqüência de micronúcleos.
Na análise do Qui-quadrado comparou-se os dados dos grupos tratados com a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) e com o Soro Fisiológico (controle negativo) para avaliar se há ação mutagênica de T3, entretanto, foram comparadas também os dados de grupos tratados com a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) e Ciclofosfamida com a Ciclofosfamida (controle positivo), para verificar se há ação antimutagênica de T4.
Após 24 horas a palma forrageia foi retirada e pesada por gaiola.
4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
A média da quantidade do vegetal ingerido por animal foi de: o grupo T3 = 24,16g/animal e o tratamento T4 = 17,5g/animal.
Tendo em vista a freqüência normal de 3 micronúcleos para 1000 PCEs, como retratam Rabello-Gay et al (1991) apud Silva et al (2003), observou-se:
Tabela 3. Resultados obtidos com o Controle Positivo – Ciclofosfamida (T1) Rato Sexo Valor
médio (MNs)
PCE PCEMN NCE para 200
PCEs 1A
1B
Masculino 5.5 1000 5
6
61 104 2A
2B
Masculino 6.5 1000 7 6
93 70 3A
3B Masculino 5.5 1000 5
6 67
92 4A
4B
Feminino 9.5 1000 12 7
97 73 5A
5B
Feminino 9 1000 10
8
87 98 6A
6B Feminino 10 1000 10
10 71
104 PCE (eritrócitos policromáticos), PCEMN (eritrócitos policromáticos micronucleados),
NCE (eritrócitos normocromáticos)
No tratamento com a Ciclofosfamida observou-se uma média de 7,6 micronúcleos em cada 1000 PCEs. Este tratamento usado como Controle Positivo teve ação no material genético do animal, fazendo com que ocorresse dano ao cromossomo e ele quebrasse ou fosse desviado completamente do seu caminho normal, que seria ir para dentro do núcleo durante a divisão celular. É através destes meios que o micronúcleo é formado.
Devido à média da freqüência de micronúcleos, de 7,6/1000 PCEs, e se comparando a freqüência normal de 3/1000, conclui-se que houve atividade mutagênica.
Foram contados, em média, 84,75 eritrócitos normocromáticos (NCEs) em cada 200 eritrócitos policromáticos.
Tabela 4. Resultados obtidos com o Controle Negativo – Soro Fisiológico (T2) Rato Sexo Valor
médio (MNs)
PCE PCEMN NCE para 200
PCEs 1A
1B
Masculino 2,5 1000 3
2
135 130
2A Masculino 2 1000 3 126
2B 1 139 3A
3B Masculino 3 1000 3
3 63
131 4A
4B
Feminino 2,5 1000 2 3
99 142 5A
5B Feminino 2 1000 2
2 116
180 6A
6B Feminino 2 1000 3
1 93
99
No tratamento com o Soro Fisiológico (controle negativo) constatou-se uma média de 2,3 micronúcleos em cada 1000 PCEs, significando que a substância obedeça as condições normais e, portanto, não apresenta atividade mutagênica. E serve como base controle para o experimento, além de uma média de 121,08 NCEs para cada 200 PCEs contados.
Tabela 5. Resultados obtidos com a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) (T3) Rato Sexo Valor
médio (MNs)
PCE PCEMN NCE para 200
PCEs 1A
1B
Masculino 2 1000 2
2
119 110 2A
2B
Masculino 2 1000 2
2
100 69 3A
3B Masculino 3 1000 3
3 197
100 4A
4B
Feminino 1.5 1000 2 1
86 92 5A
5B
Feminino 1.5 1000 2 1
117 72 6A
6B Feminino 2.5 1000 2
3 84
148
O tratamento com a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) apresenta uma média de 2,1 micronúcleos em 1000 PCEs. Obteve-se média de 107.6 NCEs em 200 PCEs contados.
Portanto, considerando a freqüência normal de 3 micronúcleos estabelecida por Rabello-Gay et al (1991) apud Silva et al (2003), nota-se que houve uma ausência de atividade mutagênica com os animais tratados com a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.).
Tabela 6. Resultados obtidos com a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) e a Ciclofosfamida (T4).
Rato Sexo Valor médio (MNs)
PCE PCEMN NCE para 200
PCEs 1A
1B
Masculino 1,5 1000 2
1
95 108 2A
2B Masculino 2 1000 1
3 83
82
3A Masculino 1,5 1000 2 105
3B 1 28 4A
4B Feminino 1,5 1000 1
2 100
97 5A
5B
Feminino 1,5 1000 2 1
87 103 6A
6B Feminino 2,5 1000 3
2 73
86
Aqui obteve-se média de 1,75 micronúcleo para cada 1000 PCEs observados. E uma média de 87,25 NCEs/200 PCEs.
Levando-se em conta a freqüência normal de micronúcleos, tem-se que, quando colocada com a Ciclofosfamida, a palma forrageira inibiu consideravelmente a ação mutagênica desta substância.
A aplicação do χ2 para este trabalho considera o grau de liberdade igual a 1, com probabilidade de 5%. O resultado é tido como significativo quando o valor do χ2 é superior a 3,84 e não-significativo quando inferior.
Tabela 7. Amostra dos resultados do Teste do Qui-quadrado (χ2).
Tratamentos FO FE FO - FE (FO - FE)2 (FO - FE)2 /FE χ2
T3 25 26,5 -1,5 2,25 0,08 0,16
T2 28 26,5 1,5 2,25 0,08
T4 21 55,5 -34,5 1.190,25 21,44 *42,88
T1 90 55,5 34,5 1.190,25 21,44
FO: Freqüência do evento observado experimentalmente; FE: Freqüência esperada do evento.
Com esses cálculos, pode-se observar:
T3 e T2: O resultado do χ2= 0,16, mostra que o grupo tratado com a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.), não teve ação significativa e, portanto, este tratamento não exerceu efeito mutagênico no local (medula óssea) analisado, já que a freqüência de PCEMN não mostrou aumento elevado, sendo considerado normal.
T4 e T 1: O resultado significativo do χ2 = 42,88 confirma que a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) inibiu a ação mutagênica da Ciclofosfamida, ou seja, ela é antimutagênica.
O grupo tratado por T4 não indicou aumento elevado na freqüência de PCEMN, portanto, é considerado normal.
4 - CONCLUSÃO
O teste de micronúcleos em medula óssea de ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) tratados com as substâncias: Ciclofosfamida, Soro Fisiológico e palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.), permitiu concluir-se:
• A palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) não tem efeito mutagênico, devido à freqüência de PCEMN esta abaixo de 3 micronúcleos/1000 PCEs, considerado normal, e comprovado através da análise do Qui-quadrado (χ2).
• A palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) ministrada junto com a ciclofosfamida inibe a ação mutagênica desta substância em ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar), ou seja, tem efeito antimutagênico.
5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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BURNS, G. W., e BOTTINO, P. J. Genética. Editora Guanabara Koogan. 6ª edição. Rio de Janeiro (RJ): 1991.
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Campina Grande (PB): 2003.
TAKAHASHI, C. S., et al Teste do micronúcleo em eritrócito de medula óssea de camundongo. Disponível na Internet: http://www.sbmcta.org.br/index.php?arq=doc01. Acesso em 10 de outubro de 2004.
[1] Biólogos pela Universidade Estadual da Paraíba. Email: jorgebiologia@bol.com.br [2] Professor Mestre do Departamento de Biologia da Universidade Estadual da Paraíba.
[3] Professor Doutor do Departamento de Química da Universidade Estadual da Paraíba.
