CARACTERIZAÇÃO ISOENZIMÁTICA DE BACTÉRIAS ISOLADAS DA TORTA DE FILTRO BACTERIAL ISOENZYMATIC CHARACTERIZATION ISOLATED FROM FILTER CAKE

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Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v.7, 2015. Número especial.

CARACTERIZAÇÃO ISOENZIMÁTICA DE BACTÉRIAS ISOLADAS DA TORTA DE FILTRO

BACTERIAL ISOENZYMATIC CHARACTERIZATION ISOLATED FROM FILTER CAKE

Gabriela Cabral Fernandes⁽¹⁾ João Carlos Campanharo⁽²⁾ Jackson Antônio Marcondes de Souza⁽³⁾ Eliana Gertrudes de Macedo Lemos⁽⁴⁾

Resumo

O objetivo desse trabalho foi testar a eficiência da isoenzima α-esterase na caracterização de isolados bacterianos da torta de filtro (TF), um resíduo composto da mistura de bagaço moído e lodo de decantação proveniente do processo de clarificação do açúcar. Inicialmente foi produzida uma suspensão do composto coletado com água destilada estéril, que posterior agitação e diluições seriadas foram transferidas para placas com meio de cultura para desenvolvimento bacteriano. Após, serem feitas extrações isoenzimática das amostras, essas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida, gerando perfis de bandas os quais mostraram que a maior parte dos isolados possui padrão polimórfico para a enzima α- esterase, assim, essa pode ser considerada um bom marcador bioquímico para a caracterização de bactérias da torta de filtro.

Palavras-chave: Marcador bioquímico. α-esterase. Cana-de-açúcar.

Abstract

The aim of this study was to test the efficiency of α-esterase isozyme characterization of bacterial isolates the filter cake (TF), a compound residue of ground bagasse mixture and decanting sludge from the clarification of the sugar process. A suspension of the compound collected with sterile distilled water to further stirring and serial dilutions were transferred to plates with culture medium for bacterial development was initially produced. After, being made isozyme extractions of the samples, these were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, generating profiles bands which showed that the majority of the isolates have polymorphic pattern for the α-esterase enzyme, so this may be considered a good biochemical marker for the characterization of bacteria from the filter cake.

Keywords: Biochemical marker. α-esterase. Sugar cane.

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1Mestra em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) pela Unesp/FCAV. ²Doutor em Microbiologia Agropecuária pela Unesp/FCAV. ³Professor Assistente Doutor na Unesp/FCAV. ⁴Profesora titular na Unesp/FCAV. E-mail contato:

gfernandes1403@gmail.com

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1 Introdução

Na safra 2013/14 de cana-de-açúcar, foram moídas 658,8 milhões de toneladas de cana, sendo 360,9 milhões para etanol e 297,9 milhões para produção de açúcar (CONAB, 2014). No processo de moagem, para cada tonelada de cana moída são gerados 30 kg de torta de filtro, um subproduto utilizado no solo para cultivo tanto para fornecer nutrientes, uma vez que é rico em fósforo, quanto para corrigir a acidez do solo (NARDIN, 2007).

Mesmo com a adição desse e outros compostos, uma microbiota ativa traz inúmeros benefícios às plantas, uma vez que as bactérias são altamente versáteis e ublíquas; além de auxiliarem devido à capacidade de conversão de nitrogênio; solubilização de fosfato inorgânico e promoção do crescimento vegetal. Sendo assim, recorrer a uma técnica que estime a diversidade da microbiota presente na torta de filtro que será incorporada ao solo, torna-se importante.

Várias são as enzimas utilizadas para caracterização e identificação de diversas espécies, tais como: esterases, superóxido dismutase, álcool desidrogenase, glicose - 6 - fosfato desidrogenase, entre outras. As funções de cada enzima variam, sendo as esterases enzimas capazes de hidrolisar ligações do tipo éster de uma grande variedade de substratos, estas são classificadas em α-esterases, β-esterases e Ϲ-esterases (BASTOS, 2001). De maneira simplificada, as isoenzimas podem ser consideradas variações de uma dada enzima dentro de um organismo, que apresentam uma mesma especificidade de substrato. Assim sendo, a variação específica em número, composição e atividade das isoenzimas em cada sistema enzimático, permite a diferenciação entre variedades (LARSEN, 1969).

Diante disso, o presente estudo avaliou a eficiência do sistema isoenzimático α- esterase, na caracterização de isolados bacterianos da torta de filtro.

2 Material e Métodos

A coleta da torta de filtro foi realizada em três pontos diferentes na Usina Santa Fé S/A, no município de Nova Europa-SP. As amostras foram coletadas, identificadas, acondicionadas em caixa térmica contendo gelo seco e encaminhadas ao Departamento de Tecnologia, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Câmpus de Jaboticabal-SP, onde foram realizadas as análises. Inicialmente foi produzida uma suspensão de 10 g do composto em 90 mL de água destilada estéril que permaneceu sob agitação a 160 rpm, a 28°C, durante 1h. Em seguida, 1,0 mL desta mistura foi transferido para tubos estéreis,contendo 9,0 mL de solução salina (NaCl – 0,85%) e cicloheximida [300 µg/mL]

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(PANTHIER et al., 1979) agitados nas mesmas condições anteriores. Após agitação, foi realizada diluição seriada das células contidas na suspensão, transferindo-se 100 µL de cada diluição para placas de Petri, contendo meio sólido DYGS (RODRIGUEZ NETO et al., 1986), que ficaram inoculadas em estufa tipo “BOD”, a 30°C, por 48 h. Após purificação, as colônias individuais foram suspensas em caldo nutriente contendo 20% de glicerol e armazenadas em ultrafreezer à -80°C.

Para a extração de isoenzimas, os isolados foram cultivados em 50 mL de meio DYGS e a isoenzima α-esterase, foi extraída para avaliação (BERINGER, 1974) . Para a eletroforese, os géis de separação a 10% e de concentração a 5% foram preparados de acordo com Laemmli (1970) e montados entre duas placas de vidro de 173 x 163 mm com 1,0 mm de espessura. Utilizou-se a eletroforese vertical onde as cubas continham o seguinte tampão de eletrodo: (0,19M glicina; 0,025M Tris; 0,0035M de dodecil sulfato de sódio; pH 8,3). O sistema foi submetido a uma corrente elétrica inicial, constante de 20 mA, até que o corante

“de front” atingisse o separador. A corrente elétrica foi então elevada para 25 mA, permanecendo constante até o final da corrida. No gel foram aplicados 50 mg de isoenzima referente a cada isolado, que foram previamente determinadas pelo método de LOWRY modificado (HARTREE, 1972). A revelação das bandas das isoenzimas α-esterase nos géis foi realizada segundo as metodologias descritas por Pasteur et al. (1988) e Cardy e Beversdorf (1984). Em 100 ml de tampão fosfato pH 6,2 acrescentou-se 100 mg de fast-blue RR e 60 mg de α-naftil acetato dissolvido em 500 uL de acetona. A avaliação dos isolados foi feita através da análise visual dos zimogramas obtidos após a eletroforese. Os parâmetros utilizados na diferenciação basearam-se na intensidade e na ausência ou presença das bandas isoenzimáticas.

3 Resultados e Discussão

O meio DYGS por ser um meio rico e de rápido crescimento, mostrou-se eficaz para o desenvolvimento de isolados bacterianos da torta de filtro.

A presença da enzima foi caracterizada pela presença ou ausência de bandas no gel. A caracterização isoenzimática desses isolados bacterianos possibilitou avaliar a similaridade entre eles, que se mostrou abundante no composto estudado.

Foi observado que o processo de isolamento das bactérias da torta de filtro foi eficiente. O número total de bactérias obtidas pela metodologia adotada foi de 55 isolados, dos quais 46 apresentaram padrão de bandas para a isoenzima α-esterase (Figura 1). A partir

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da análise no perfil de bandas, foi possível observar que 16 isolados apresentaram alto grau de semelhança, podendo assim serem considerados da mesma estirpe.

Figura 1- Sistema isoenzimático α-esterase em gel de poliacrilamida. Gel A: Isolados JAB- 01 ao JAB-20. Gel B: Isolados JAB-21 ao JAB-38. Gel C: Isolados JAB-39 ao JAB- 55. Mostrando as diferenças, semelhanças e ausências nos padrões de bandas.

4 Conclusão

A maior parte dos isolados possui padrão polimórfico para a enzima α-esterase, assim, essa pode ser considerada um bom marcador bioquímico para a caracterização de bactérias da torta de filtro.

Referências

BASTOS, V.L.F. Enzimas do Metabolismo de Xenobióticos em Piaractus mesopotamicus (Pacu). Dissertação de doutorado. UERJ, 2001.

BERINGER, J.E.R. Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. Journal of General Microbiology, v. 84, p, 188-198, 1974.

CARDY, B.J.; BEVERSDORF, W,D. Identification of soybean cultivars using isoenzyme electrophoresis. Seed Science and Technology, Zürich, v.12, p.943-954, 1984.

CONAB. Cana-de-açúcar tem fechamento da safra 2013/14 e primeira estimativa da 2014/15. Disponível em: < http://www.conab.gov.br/imprensa-noticia.php?id=33407>.

Acessado em 04 de junho de 2015.

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LARSEN, A.L. Isoenzimes and varietal identification. Seed World, Nosthwest Highway, v.25, p.5-6, 1969.

NARDIN, R. R. Filter cake applied in argissolo and agronomic effects in two varieties of sugar-cane at two times of harvest. 39 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Produção Agrícola) – Pós-Graduação – IAC, 2007.

PANTHIER, J.J.; DIEM, H.G.; DOMMERGUES, Y. Rapid method to enumerate and isolate soil actinomycetes antagonistic towards rhizobia. Soil Biology and Biochemistry, v. 11, p.

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