UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS FACULDADE DE VETERINÁRIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA – CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL
“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PARVOVÍRUS ASSOCIADOS AOS CASOS DE GASTRENTERITE EM FILHOTES DE CÃES E GATOS NO ESTADO
DO RIO DE JANEIRO”
TATIANA XAVIER DE CASTRO
Orientadoras: Norma Vollmer Labarthe Rita de Cássia N.C.Garcia
TATIANA XAVIER DE CASTRO
“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PARVOVÍRUS ASSOCIADOS AOS CASOS DE GASTRENTERITE EM FILHOTES DE CÃES E GATOS NO ESTADO
DO RIO DE JANEIRO”
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito para a obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Cirurgia e Clínica Médica Veterinária, Sub- Área: Clínica Veterinária.
Orientadoras: Norma Vollmer Labarthe Rita de Cássia N.C.Garcia
TATIANA XAVIER DE CASTRO
“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PARVOVÍRUS ASSOCIADOS AOS CASOS DE GASTRENTERITE EM FILHOTES DE CÃES E GATOS NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO”
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito para a obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Cirurgia e Clínica Médica Veterinária, Sub- Área: Clínica Veterinária. BANCA EXAMINADORA
Dra Norma Vollmer Labarthe (UFF) – Orientadora
Dra Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia (UFF) – Orientadora
Dr. Aloysio de Mello F. Cerqueira (UFF)
Dr. Marcelo de Lima (UFF)
Dr. José Paulo Gagliardi Leite (FIOCRUZ)
Dr. Jonimar Pereira Paiva (Universidade Castelo Branco)
Dra Flavya Mendes-de-Almeida (UFF - Suplente Interna)
Dr. Eduardo de Mello Volotão (FIOCRUZ - Suplente Externo)
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO – PROPP
Este trabalho foi realizado no Departamento de Microbiologia e Parasitologia do Instituto Biomédico – UFF, em cooperação com o Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental, Instituto Oswaldo Cruz (IOC) por Tatiana Xavier de Castro, sob orientação da Dra. Norma Vollmer Labarthe e Dra.Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia.
C355 Castro, Tatiana Xavier de
Caracterização molecular dos parvovírus associados aos casos de gastrenterite em filhotes de cães e gatos no Estado do Rio de Janeiro/ Tatiana Xavier de Castro; orientadora Norma Vollmer Labarthe. – 2010.
124 f.
Dissertação (Mestrado em Cirurgia e Clínica Médica Veterinária)- Universidade Federal
Fluminense,2010. Orientadora: Norma Vollmer Labarthe
1.Parvovírus canino. 2.Gastroenterite
3.Diagnóstico. 4. Vírus da panleucopenia felina. I. Título.
CDD 636.08960194
Aos meus pais e irmã, pelo apoio incondicional
durante esta etapa da minha vida.
AGRADECIMENTOS
A Deus pela força de superar todos os obstáculos e continuar sempre buscando meus objetivos.
À minha família por todo o amor, carinho e compreensão ao longo desta etapa da minha vida.
À Profa Dra Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia pelo apoio e presença marcante nestes 11 anos de convivência.
À Dra Norma Labarthe pelo apoio e orientação não somente neste projeto, mas ao longo de todo o meu desenvolvimento profissional.
Ao Dr. José Paulo Gagliardi Leite pela oportunidade oferecida de desenvolver a etapa determinante deste projeto no Instituto Oswaldo Cruz.
Aos colegas do laboratório de Virologia da Universidade Federal Fluminense por todos os bons momentos compartilhados no laboratório.
Aos colegas do laboratório de Virologia Comparada e Ambiental do Instituto Oswaldo Cruz pela paciência e boa vontade em transmitir os ensinamentos que permitiram a realização deste projeto.
À todos os médicos veterinários que gentilmente nos enviaram amostras fecais de casos de gastrenterite, possibilitando a realização deste estudo.
Ao Curso de Pós-Graduação em Cirurgia e Clínica Médica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária, por esta oportunidade de crescimento profissional e pessoal.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo auxílio financeiro durante a elaboração do projeto.
“Ora Lege Lege Lege Relege Labora et
Invenies".
"Reza, lê, lê, lê, relê, trabalha e
encontrarás"
Gaston Bachelard
,
livro mudo da
alquimia, 1677.
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA, f. VI
AGRADECIMENTOS f. VII
EPÍGRAFE f.VIII
SUMÁRIO, f. XI
LISTA DE FIGURAS, f. XII
LISTA DE QUADROS, f. XIII
LISTA DE TABELAS, f. XIV
LISTA DE APÊNDICE, f. XV
LISTA DE ANEXOS, f.XVI
RESUMO, f. XVII ABSTRACT, f. XIX 1 INTRODUÇÃO, f.20 2 HIPÓTESE, f. 24 3 OBJETIVOS, f.25 3.1- OBJETIVO GERAL, f.25 3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS, f.25 4 REVISÃO DA LITERATURA, f.26 4.1.–CLASSIFICAÇÃO, f.26 4.2–MORFOLOGIA DO VÍRUS,f.26 4.3–REPLICAÇÃO DO VÍRUS,f.28
4.4–EVOLUÇÃO DO VÍRUS E SURGIMENTO DOS TIPOS ANTIGÊNICOS,f.30
4.6–TRANSMISSÃO, PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS,f.40 4.7–IMUNIDADE E PROFILAXIA, f. 43 4.8-DIAGNÓSTICO LABORATORIAL f. 45 5-MATERIAL E MÉTODOS, f.49 5.1- AMOSTRAS CLÍNICAS, f.49 5.2- REAGENTES E SOLUÇÕES, f.50 5.2.1-TAMPÃO TRIS-CA++0,01M PH7,2, f.50
5.2.2-TAMPÃO SALINA-BORATO (BABS) PH9.0, f.50
5.2.3-TAMPÃO VAD PH6.0, f.51 5.2.4-CAOLIM 25%, f.51 5.2.5-TAMPÃO L2 PH6,4, f.51 5.2.6-TAMPÃO TRIS-HCL 0,1M PH6,4, f.52 5.2.7-TAMPÃO NAOH10N, f.52 5.2.8-SÍLICA, f.52 5.2.9-ETANOL 70%, f.53 5.2.10-EDTA0,5M PH8,8, f.53
5.2.11-TAMPÃO TRIS-BORO-EDTA(TBE)10X PH8,4, f.53
5.2.12-AGAROSE A 1,5%, f.54
5.2.13-SOLUÇÃO DE BROMETO DE ETÍDIO, f.54
5.2.14-TAMPÃO CORANTE AZUL DE BROMOFENOL , f.54
5.3- INICIADORES DE CADEIA UTILIZADOS NA PCR PARA CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA, F.55
5.4 - MÉTODOS, f.56
5.4.2-REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO E INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO (HA/HI), f.56
5.4.3-REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) PARA A DETECÇÃO DO GENOMA DO PARVOVÍRUS CANINO. f.57
5.4.3.1.-EXTRAÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO. f.57
5.4.3.2-REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR).f.58
5.4.4- SEQUENCIAMENTO PARCIAL DO GENE QUE CODIFICA PARA A PROTEÍNA DE CAPSÍDEO VP2 DOS PARVOVÍRUS CANINO E FELINO.f.59
5.4.5-ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS AMOSTRAS DOS PARVOVÍRUS CANINO E FELINO. f.61
6-RESULTADOS. f.63
6.1-TRIAGEM DE AMOSTRAS CPV POSITIVAS PARA SEQUENCIAMENTO. f.63
6.2- CARACTERIZAÇÃO DOS TIPOS DE CPV EM AMOSTRAS FECAIS DE CÃES NÃO VACINADOS COM GASTRENTERITE,f.65
6.3-MONITORAMENTO DOS TIPOS DE PARVOVIRUS CANINO (CPV) EM FILHOTES DE CÃES VACINADOS COM GASTRENTERITE NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO.f.70
6.4 -CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PARVOVÍRUS EM AMOSTRAS DE FELINOS DOMÉSTICOS NO
ESTADO DO RIO DE JANEIRO E COMPARAÇÃO COM OS TIPOS DE CPV DE AMOSTRAS CANINAS. f.77
7-DISCUSSÃO. f.81
8-CONCLUSÕES.f.89
9-OBRAS CITADAS. f.90
10- APÊNDICES. f.104
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Fotomicrografia eletrônica de partículas de parvovírus canino (CPV) em amostra fecal de um cão com gastrenterite (WILLI, 1998); B- Modelo da partícula viral; C- Modelo dinâmico da montagem do capsídeo icosaédrico do CPV (www. people.brandeis.edu). f.27
Figura 2 Etapas da expressão gênica e replicação dos parvovírus autônomos (MORAES & COSTA, 2007). f.29
Figura 3 Organização genômica e mapa de transcrição do parvovírus canino (REED;JONES; MILLER, 1988) f.30
Figura 4 Representação do capsídeo viral com os AA que alteraram durante a evolução do CPV. Resíduos que variaram entre FPV e CPV estão em azul, resíduos que variaram entre CPV-2 e CPV-2a estão em verde e em amarelo os resíduos que ainda continuam variando (PARRISH & KAWAOKA, 2005). f.32
Figura 5 Análise genética e os hospedeiros do vírus da panleucopenia felina (FPLV) e parvovirus canino (CPV) desde a sua origem no final da década de 70, até os dias atuais (HOELZER& PARRISH, 2010). f.34
Figura 6 Relação filogenética entre os parvovírus de carnívoros, baseada no gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2. FPLV (vírus da panleucopenia felina); BFPV (parvovírus da raposa azul); RPV (parvovírus do racoon) (HOELZER& PARRISH, 2010). f.39
Figura 7 Fluxograma da patogenia da infecção pelo parvovírus canino (CPV) (MACARTNEY; MCCANDLISH; THOMPSON, 1984; POLLOCK; COYNE, 1993; SMITH-CARR et al., 1997). f.41
Figura 8 Localização da seqüência dos iniciadores de cadeia utilizados neste estudo f.55
Figura 9 Fluxograma de detecção, caracterização e análise de homologia de nt e AA das amostras de parvovírus canino e felino utilizadas neste estudo. f.43
Figura 10 Comparação entre as sequências nucleotídicas dos isolados de CPV-2c detectados na
América do Sul. Em destaque as mutações pontuais detectadas nos diferentes isolados. f.68
Figura 11 Dendograma construído a partir da análise de um fragmento (563 pb) do gene que codifica
para a proteína de capsideo VP2 das amostras de CPV de cães não vacinados e amostras de CPV no GenBank. A barra na parte inferior da figura é proporcional à distância genética. f.69
Figura 12 Sequências nucleotídicas da amostra caracterizada como CPV-2b selvagem (RJ901/08) e
4494, presente na cepa vacinal. f.74
Figura 13 Dendograma elaborado a partir das análise de um fragmento (563 pb) do gene que codifica
para a proteína de capsideo VP2 de 37 cães vacinados, quatro vacinas para CPV e amostras padrão e recombinantes de CPV obtidas no GenBank. A barra na parte inferior da Figura é proporcional à distância genética. f. 76
Figura 14 Dendograma elaborado a partir das análise de um fragmento (1171 pb) do gene que
codifica para a proteína de capsideo VP2 das seis amostras felinas deste estudo junto com as amostras caninas e isolados felinos e caninos obtidos no Genbank. Em destaque as amostras caninas que apresentaram mutações de AA importantes na determinação do espectro de hospedeiro dos parvovirus. A barra na parte inferior da Figura é proporcional à distância genética. f. 80
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Principais mutações descritas no genoma do parvovírus canino (CPV) durante sua
evolução (TRUYEN et al., 1998; BUONAVOGLIA et al., 2001; MOON et al., 2008; HOELZER& PARRISH, 2010). f.38
Quadro 2 Descrição dos iniciadores utilizados na reação em cadeia pela polimerase (PCR) neste
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Distribuição das 69 amostras fecais caninas positivas por HA/HI e PCR analisadas neste
estudo conforme o sexo, faixa etária, raça, condição vacinal dos cães e tipo de CPV (CPV-2a, 2b e 2c) caracterizado na amostra fecal. f.64
Tabela 2 Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos encontradas no produto amplificado de 563
bp de VP2 nas 32 amostras de parvovirus canino de cães não vacinados apresentando gastrenterite e isolados obtidos no GenBank. f.66
Tabela 3 Idade e condição vacinal dos cães e tipo de parvovírus canino detectado nas 37
amostras fecais coletadas de cães vacinados no Rio de Janeiro no período de 1995-2009. f.70
Tabela 4 Caracterização genômica dos parvovirus caninos detectados nas 37 amostras de cães
vacinados e nas quatro amostras de vacinas a partir da análise da sequência parcial do gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2. f. 72
Tabela 5 Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos encontradas no fragmento de 1171 pb do
gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 em seis amostras felinas e quatro amostras caninas coletadas em 2004-2005. f. 78
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice 1 Ficha de identificação do animal. f. 105 Apêndice 2 Tabela de aminoácidos. f.106
Apêndice 3 Aprovação do COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL (PRÓ-REITORIA DE
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1 Número de acesso do GenBank das amostras de parvovírus canino (CPV) e felino
(FPLV) caracterizadas neste estudo. f.109
Anexo 2 Distribuição cronológica dos tipos de CPV no Brasil de 1980 a 2009. A tabela oi
formulada tendo como base o estudo atual e estudos anteriores (PEREIRA et al., 2007; STRECK et al., 2009). A linha contínua indica predominância do tipo. A linha tracejada indica uma menor circulação do tipo. f.110
Anexo 3 Carta de aceite e trabalho submetido para publicação no periódico Brazilian Journal of
Mirobiology: “Partial VP2 sequencing of canine parvovirus (CPV) strains circulating in the State of Rio de Janeiro, Brazil: detection of the new variant CPV-2c”. f.111
Anexo 4 Carta de aceite e trabalho submetido para publicação no periódico Research in
Veterinary Science: “Monitoring of canine parvovirus (CPV) strains detected in vaccinated puppies in Brazil”.f. 118
Anexo 5 Carta de submissão e trabalho “First Characterization of parvovirus strains from domestic cats in Brazil.” para publicação no periódico Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. f. 124
RESUMO
A infecção pelo Parvovírus Canino (CPV) é a principal causa de gastrenterite viral em filhotes de cães e novos tipos antigênicos vem sendo descritos substituindo os tipos antigos destes vírus. A circulação do CPV e do vírus da Panleucopenia Felina (FPLV) em cães e gatos no Estado do Rio de Janeiro, bem como a descrição de casos de gastrenterite em felinos associados aos novos tipo de CPV torna necessária uma avaliação contínua das amostras de parvovírus (FPLV e CPV) circulantes nestas espécies. Portanto, este trabalho teve como objetivo realizar a caracterização molecular dos parvovírus detectados em amostras fecais de cães e gatos com até um ano de idade com gastrenterite no Estado do Rio de Janeiro no período de 1995-2009. Após confirmação laboratorial da infecção pelo parvovírus por hemaglutinação/ inibição da hemaglutinação (HA/HI), 69 amostras fecais de cães foram submetidas à reação em cadeia pela polimerase (PCR) e sequenciamento parcial do gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 para caracterização dos tipos de CPV. Seis amostras fecais de felinos domésticos, também foram submetidas ao sequenciamento parcial da mesma região para caracterização dos parvovírus associadas à infecção nesta espécie. A análise de dois aminoácidos (AA) 426 e 555 do CPV em 32 amostras fecais de cães não vacinados coletadas no período de 1995-2009 demonstrou uma substituição do tipo CPV-2a pelo tipo 2b e a primeira descrição do tipo CPV-2c na população canina no Rio de Janeiro. Para monitoramento dos tipos de CPV em 37 cães vacinados, a análise dos AA 297, 300, 305, 426 e 555 permitiu a caracterização dos tipos CPV-2a em 23 amostras e CPV-2b em 14 amostras. Mutações sinônimas foram detectadas nos AA 440 e 574. As mutações detectadas nos tipos estudados aparentemente não afetaram os AA relacionados a antigenicidade do vírus e não parecem comprometer a capacidade global das vacinas em proteger os filhotes contra os tipos em circulação. Os parvovírus detectados em seis amostras felinas foram caracterizadas com FPLV por sequenciamento, porém a detecção de mutações não-sinônimas em resíduos importantes para a determinação do espectro de hospederio em duas amostras felinas e uma canina indica que os CPV e FPLV estão sujeitos a importantes eventos evolutivos e enfatizam a importância do monitoramento contínuo e da caracterização molecular desse parvovírus de maneira a permitir a identificação de possíveis mudanças genéticas e antigênicas que possam interferir na eficácia das vacinas para CPV. Estes resultados também reforçam a idéia de que somente o sequenciamento oferece ampla informação sobre a caracterização e análise filogenética dos parvovírus em circulação na população canina e felina.
Palavras–chave: Parvovírus Canino (CPV); Vírus da Panleucopenia felina
ABSTRACT
Canine Parvovirus (CPV) infection is the major cause of viral enteritis in puppies and new antigenic types have been described in substitution of the old types of these viruses. The aim of this study was to realize the genomic analysis of CPV strains in enteritis puppies in the State of Rio de Janeiro. The circulation of CPV and FPLV in dogs and cats in Rio de Janeiro, and the description of cases of enteritis in cats associated with the new types of CPV requires a continuous evaluation of parvovirus (FPLV and CPV) circulating in these species. Therefore, the aim of this study was to perform the molecular characterization of parvovirus detected in fecal samples of dogs and cats up to one year of age with enteritis in the State of Rio de Janeiro. After laboratory confirmation of CPV infection by hemagglutination/ hemagglutination inhibition tests (HA/HI), 69 fecal samples from dogs with one year of age were submitted to polymerase chain reaction (PCR) and partial sequencing of the gene coding for VP2 capsid protein for characterization of the types of CPV in clinical samples. Six fecal samples from domestic cats up to six months old were also subjected to partial sequencing of the same region for characterization of parvovirus infection associated with this species. The analysis of two amino acids (AA) 426 and 555 of CPV in 32 fecal samples collected from unvaccinated puppies collected during 1995-2009 showed a progressive replacement of CPV type-2a by the 2b type and the first description of CPV-2c in the canine population in Rio de Janeiro. In order to investigate CPV types in 37 puppies with parvoviral infection despite vaccination, the analysis of residues 297, 300, 305, 426 e 555 allowed the characterization of CPV-2a in 23 samples and CPV-2b in another 14. Synonymous substitutions in the AA 440 and 574 were detected. All CPV-2a showed a non-synonymous mutation in residue 297 (SerAla). The mutations detected in CPV strains collected from vaccinated puppies apparently did not affect the amino acid residues related to antigenicity of CPV, and did not compromise the overall ability of current vaccines in protect puppies against the circulating types. The parvovirus strains detected in six cat samples were confirmed by sequencing as FPLV but the detection of non-synonymous mutations in feline and canine parvovirus strains indicate that CPV and FPLV are subject to important evolutionary events and emphasize the importance of continuous surveillance and genetic characterization of these parvovirus in order to detect possible genetic and antigenic changes with potential effect on CPV vaccine effectiveness. These results also reinforce that only sequence analysis provides full information for characterization and phylogenetic analysis of parvovirus circulating in dog and cat population.
Key-words: Canine Parvovirus (CPV); Feline Panleukopenia Virus (FPLV);
1- INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, a emergência de novos vírus deixou de ser um tema apenas do meio científico e acadêmico e passou a ser discutido também pela população leiga mundial. Um dos mecanismos responsáveis pelo aparecimento de uma virose emergente resulta da capacidade de determinados vírus em ampliar seu espectro de hospedeiros (transposição da barreira de espécie), adquirindo a habilidade de se replicar e disseminar eficientemente em outras espécies de hospedeiro (PARRISH& KAWAOKA, 2005).
Entre os vírus com genoma DNA de fita simples, os parvovírus de carnívoros constituem-se em importante modelo para explicar como múltiplas mudanças de aminoácidos na proteína de capsídeo podem contribuir para a emergência de um novo patógeno (PARRISH & KAWAOKA, 2005). O parvovírus canino (CPV) é um exemplo de sucesso na transposição da barreira de hospedeiro (PARRISH & KAWAOKA, 2005; HOELZER; PARRISH, 2010), já que é considerado uma variante do vírus da panleucopenia felina (FPLV) que adquiriu a capacidade de replicação em cães após a passagem em um hospedeiro carnívoro selvagem (HORIUCHI et al., 1998; TRUYEN et al., 1998; STEINEL et al., 2001; IKEDA et al., 2002).
Desde 1920, o FPLV já era conhecido como agente de doença em gatos domésticos (Felis catus) (VERGE; CHRISTOFORI, 1928). Após o aparecimento do CPV em 1978, a doença entérica associada a infecção pelo CPV em cães foi considerada patologicamente semelhante a doença causadas pela vírus da panleucopenia felina vírus (FPLV) em gatos e anticorpos policlonais e estudos de “in vivo” proteção cruzada logo mostrou que o CPV e FPV estavam estreitamente relacionados antigenicamente (PARRISH, 1999). Neste período, PARRISH et al.
(1985) observaram que as amostras de CPV que circularam nos Estados Unidos da América (EUA) entre 1978 a 1980 eram de um único tipo, atualmente denominadas de “tipo antigo” ou CPV-2. Um novo tipo, CPV-2a, rapidamente substituiu o tipo “antigo” em circulação e passou a prevalecer na população canina logo após 1980. A partir de 1984 um novo tipo CPV-2b surgiu (PARRISH, 1988; PARRISH, 1995-a) e estes tipos 2a e 2b co-existiram em várias populações no mundo em diferentes proporções não sendo observada vantagem evolutiva de um tipo em relação ao outro (STEINEL et al., 1998).
Em 2001, um terceiro tipo de CPV (CPV-2c) foi descrito na Itália (BUONAVOGLIA et al., 2001) e já existem relatos da circulação deste tipo na população canina em diferentes países, incluindo na América do Sul (DECARO et al., 2006, 2007; HONG et al., 2007; MEERS et al., 2007; PÉREZ et al., 2007; VIEIRA et al., 2008; CALDERON et al., 2009). Na Itália, o tipo 2c está substituindo o tipo 2b na população canina e tal disseminação sugere que esse tipo apresenta uma vantagem evolutiva, em comparação com os demais (DECARO et al., 2006-b, 2007-a).
A manifestação clínica da infecção pelo CPV e a intensidade dos sinais clínicos podem variar, mas a gravidade do quadro clínico (vômito, anorexia, apatia, diarréia hemorrágica líquida) faz com que o proprietário do filhote procure o atendimento de um médico veterinário (CASTRO et al., 2007, DESARIO et al., 2005; MOON et al., 2007).
Os estudos que investigaram o potencial patogênico do CPV-2c apresentaram resultados discordantes. Enquanto os primeiros relatos sugeríam uma baixa patogenicidade, nos casos mais recentes tem-se observado sinais clínicos mais graves (DECARO et al., 2006; KAPIL et al., 2008; DECARO et al., 2009). Portanto, a circulação de novos tipos de CPV, bem como a descrição de uma diversidade de sinais clínicos relacionados à infecção pelos diferentes tipos (CASTRO et al., 2007; MOON et al., 2007; PÉREZ et al., 2007), torna necessário não somente o diagnóstico laboratorial da infecção por CPV, mas também o estudo dos sinais clínicos associados a infecção pelos novos tipos.
Desde os primeiros surtos de enterite por CPV, houve uma evolução gradual na profilaxia da parvovirose canina, e atualmente vacinas de vírus vivo modificado
ou “Modified Live Virus“ (MLV), constituídas de CPV-2 (tipo antigo) ou CPV-2b são amplamente utilizadas em vários países, inclusive no Brasil. A detecção de CPV em animais vacinados através das metodologias usadas na rotina como a reação de hemaglutinação (HA) e o ensaio imunoenzimático (EIA) é um complicador no diagnóstico, pois o vírus vacinal é eliminado nas fezes de 3 a 9 dias pós vacinação e pode ser detectado por estas técnicas, que não distinguem o CPV vacinal do selvagem (DECARO et al., 2006-a).
Além disso, com a emergência do novo tipo 2c em vários países, alguns trabalhos sugerem que as vacinas disponíveis não conferiam proteção à infecção por este tipo, uma vez que surtos de enterite em filhotes vacinados foram associados à presença do CPV-2c (DECARO et al., 2006-b, 2008-a). Portanto, o monitoramento das amostras de CPV circulantes, principalmente naqueles casos em que os animais apresentam enterite por CPV apesar da vacinação, é essencial para a avaliação da eficácia das vacinas frente ao desafio com os novos tipos do vírus.
Estudos realizados após 1996 têm demonstrado que vários de surtos panleucopenia felinanão não foram associados ao FPLV e sim aos novos tipos de CPV em circulação (CPV-2a 2b e 2c) (TRUYEN et al., 1996; NAKAMURA; SAKAMOTO; IKEDA, 2001; GAMOH et al., 2003-b; DECARO et al., 2010). Estes estudos sugerem que, embora o CPV-2 tenha perdido a capacidade de se replicar em células de origem felina, os novos tipos de CPV voltaram a causar doença em gatos domésticos, com sinais clínicos semelhantes aos causados pelo FPLV. Entretanto, o potencial patogênico do CPV nestes hospedeiros não está claro (NAKAMURA; SAKAMOTO;IKEDA, 2001; GAMOH et al., 2003-b).
Em estudos conduzidos por um período de 15 anos (1995 a 2009), o CPV foi associado a 32 a 55% dos casos de diarréia em filhotes de cães com até 6 meses de idade no Estado do Rio de Janeiro (CASTRO et al., 2007; SILVA, 2010). Da mesma forma, um estudo realizado em 2006 com 159 amostras fecais de felinos domésticos confirmou a circulação do FPLV associado a casos de enterite nesta mesma região (MIRANDA, 2006).
A co-circulação do FPLV e CPV na população canina e felina neste Estado, bem como a recente descrição de casos graves de enterite em felinos domésticos
associados ao tipo novo CPV-2c na Itália (DECARO et al., 2010) torna necessária uma avaliação contínua das amostras de parvovírus (FPLV e CPV) circulantes na população felina para determinação do padrão de evolução destes parvovírus no Rio de Janeiro e da sua importância epidemiológica.
Neste estudo os parvovírus detectados em amostras fecais coletadas de filhotes de cães com enterite no período de 15 anos (1995-2009) e de gatos domésticos foram caracterizados através do sequenciamento parcial da proteína de capsídeo VP2 evidenciando a circulação dos novos tipos CPV-2a e 2b e a primeira descrição do novo tipo 2c na população canina do Estado do Rio de Janeiro.
As amostras obtidas de cães que apresentaram enterite por CPV apesar da vacinação também foram caracterizadas em busca de alterações no gene que codifica para a proteína VP2 que pudessem resultar em alterações antigênicas capazes de interferir na eficácia das vacinas constituídas pelos tipo antigo (CPV-2). Os tipos de CPV caracterizados nas amostras fecais de cães vacinados e não vacinados foram relacionados aos sinais clínicos apresentados pelos cães, buscando a associação entre o tipo de CPV e a gravidade do quadro clínico.
Seis amostras felinas coletadas em 2004 foram estudadas juntamente com quatro amostras caninas coletadas no mesmo ano em busca de CPV associado a infecção em gatos, bem como possíveis mutações nos parvovírus detectados em felinos.
2- HIPÓTESE
As mudanças de nucleotídeos (nt) e aminoácidos (AA) observadas na
proteína de capsídeo VP2 do parvovírus canino (CPV) favorecem o surgimento de novos tipos de CPV no Estado do Rio de Janeiro.
A ocorrência de mutações em AA importantes na deteminação do espectro de hospedeiro no CPV faz com que o CPV readquira a capacidade de se replicar em felinos.
3- OBJETIVOS
3.1- Objetivo Geral:
Realizar a caracterização molecular dos parvovírus detectados em amostras fecais de filhotes de cães e gatos (até um ano de idade) portadores de gastrenterite no Estado do Rio de Janeiro.
3.2- Objetivos específicos:
Realizar o diagnóstico laboratorial dos casos de gastrenterite associados ao parvovírus canino.
Caracterizar através do sequenciamento parcial da proteína de capsídeo VP2, os tipos de parvovírus canino associados a casos de gastrenterite em amostras fecais de filhotes de cães no Estado do Rio de Janeiro no período de 1995 a 2009.
Caracterizar os tipos de parvovírus canino detectados em amostras fecais de filhotes de cães vacinados apresentando sinais clínicos de gastrenterite no Estado do Rio de Janeiro no mesmo período.
Realizar a caracterização molecular das amostras de parvovírus detectadas em felinos domésticos no Estado do Rio de Janeiro.
4- REVISÃO DA LITERATURA
4.1– Classificação
Os parvovírus patogênicos de animais estão classificados na família Parvoviridae, sub-família Parvovirinae, gênero Parvovirus, sendo que o vírus da panleucopenia felina (FPLV), vírus da enterite do mink (MEV) e parvovírus canino (CPV), juntamente com o parvovírus da raposa azul (blue fox parvovirus-BFPLV), raccoon parvovirus (RPV) e raccoon dog parvovirus (RDPV) formam o Subgrupo dos Parvovírus Felinos (VAN REGENMORTEL et al., 2000; MORAES & COSTA, 2007).
4.2 – Morfologia do vírus
As partículas de CPV quando visualizadas pela microscopia eletrônica (ME) são esféricas, não envelopadas, com diâmetro variando de 18 a 26 nm e capsídeo de simetria icosaédrica (Figura 1). A massa molecular da partícula viral completa é de 5,0 a 6,2 X 106 daltons e a densidade do vírion em gradiente de cloreto de césio é de 1,39 a 1,42 g/cm3 (SIEGL , 1984).
O capsídeo é constituído pelas proteínas VP1 (84 kDa) e VP2 (67 kDa), sendo 5-6 cópias de VP1 e 54–55 cópias de VP2. A VP1 é muito semelhante à VP2, com a adição de 154 aminoácidos na região amino terminal. Nas partículas infecciosas de CPV, a clivagem de 15-20 aminoácidos na região amino terminal de VP2 gera a proteína VP3 de 63 kDa (PARADISE; RHODE; SINGER, 1982; TSAO; CHAPMAN; AGBANDJE, 1991). Esta clivagem parece ser essencial à infectividade do vírus porque expõe sequências ricas em Glicina, importantes na interação com a membrana celular (WU & ROSSMAN, 1993). A proteína VP2 além de ser o sítio de ligação ao receptor, confere ao vírus a propriedade
hemaglutinante e contém os epítopos responsáveis pela indução de anticorpos neutralizantes (LOPEZ DE TURIZO et al., 1991).
O genoma viral consiste de um único filamento de ácido desoxiribonucleico (DNA), linear e de aproximadamente 5.150 nucleotídeos (nt), contendo nas extremidades 3’ e 5’ sequências palindrômicas de aproximadamente 150 nt (REED;JONES;MILLER,1988).
A B C
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de partículas de parvovírus canino (CPV) em amostra fecal de um cão com gastrenterite (WILLI, 1998); B- Modelo da partícula viral; C- Modelo dinâmico da montagem do capsídeo icosaédrico do CPV (www. people.brandeis.edu).
Como consequência de sua estrutura simples, os parvovírus são resistentes à inativação, sendo estáveis a variações de pH (3,0-9,0), a temperatura de 56oC/ 60 minutos e ao tratamento com solventes orgânicos (SIEGL, 1984). GORDON & ANGRICK (1986) demonstraram que o CPV pode manter-se infeccioso por até cinco meses no ambiente. Os parvovírus são sensíveis à formalina (0,2%), hipoclorito de sódio (1:30) e radiação ultravioleta (SIEGL, 1984).
4.3 – Replicação viral
A infecção pelos CPV e FPLV está associada à habilidade do capsídeo viral adsorver-se ao receptor de transferrina (Tf), uma glicoproteína de superfície celular expressa na maioria das células do organismo, responsável pelo transporte de ferro para o interior da célula (HUEFFER& PARRISH, 2003; PARRISH & KAWAOKA, 2005).
Em células com intensa atividade mitótica tais como da cripta do epitélio intestinal e do tecido hematopoético, estes receptores podem ser encontrados em níveis elevados, representando os principais alvos do CPV e FPLV nos animais. Após a ligação destes vírus ao receptor de Tf ocorre a formação de um complexo (vírus-receptor) que é rapidamente transportado para um sistema endossomal no interior da célula. Os tipos novos de CPV são capazes de se ligarem tanto ao receptor de Tf canino como felino, enquanto o FPLV liga-se apenas a receptores de Tf felinos. Por essa razão o FPLV não é capaz de infectar cães e de se replicar em cultura de células caninas (HUEFFER& PARRISH, 2003; PARRISH& KAWAOKA, 2005).
O genoma dos parvovírus não codifica a enzima necessária para a etapa inicial da replicação do DNA, a DNA polimerase, que é responsável pela síntese da fita de DNA complementar ao DNA viral fita simples. Como a DNA polimerase celular é somente expressa durante a mitose, a primeira e crucial etapa da replicação viral, portanto, requer a divisão celular (fase S tardia ou G2 do ciclo mitótico). Em animais jovens o tecido linfóide e particularmente o epitélio do intestino delgado apresentam intensa proliferação celular (STEINEL et al., 2001).
A replicação do genoma dos parvovírus ocorre no núcleo da célula infectada, onde as sequências palindrômicas terminais dobram sobre si mesmas, formando uma estrutura semelhante a um grampo (“hairpin”), que atuam como iniciadores para a DNA polimerase celular. Nestas regiões de DNA de fita dupla tem início a replicação com a formação de uma fita complementar. A replicação continua com a formação de intermediários de dupla fita que, posteriormente, são enzimaticamente clivados gerando DNA de fita simples. A fita negativa por
convenção, dá origem a duas fitas positivas e duas fitas negativas (YOUNG, 1988) (Figura 2).
Figura 2. Etapas da expressão gênica e replicação dos parvovírus autônomos (MORAES; COSTA, 2007).
O genoma dos parvovírus canino e felino contém dois promotores (P4 e P38), que dirigem a síntese das proteínas não estruturais (NS1 e NS2) e estruturais (VP1 e VP2), respectivamente (REED; JONES; MILLER, 1988). Dois ácidos ribonucleicos (RNAm) transcritos a partir da extremidade 3` do genoma codificam a síntese das proteínas NS1 e NS2, importantes para a replicação do DNA viral. Dois outros RNAm transcritos a partir da extremidade 5´ do genoma dirigem a síntese das proteínas estruturais. Estas proteínas são codificadas por sequências de leitura aberta (ORF) que se sobrepõem: nucleotídeo (nt) 2285-4786 para VP1 e nt 2786-4786 para VP2 (REED;JONES;MILLER,1988; AGBANDJE; PARRISH; ROSSMANN, 1995) (Figura 3).
Figura 3. Organização genômica e mapa de transcrição do parvovírus canino (REED;JONES;MILLER, 1988)
A síntese das proteínas estruturais ocorre no citoplasma da célula, porém a montagem de novas partículas virais acontece no núcleo e a liberação por lise celular. A replicação viral em cultura de células pode ser observada pela presença de corpúsculos de inclusão intranucleares corados pelo método de May Grunwald Giemsa (APPEL; SCOTT; CARMICHAEL,1979).
Alguns aspectos do processo de replicação do vírus, incluindo a ausência de algumas subunidades da DNA polimerase da célula hospedeira, a rápida replicação do genoma e a natureza fita simples do genoma viral resultam em uma baixa fidelidade de replicação dos parvovírus caninos, facilitando o aparecimento de mutações (HOELZER; SHACKELTON; PARRISH, 2008; HOELZER & PARRISH, 2010).
4.4- Evolução do vírus e surgimento dos tipos antigênicos
O CPV é um exemplo de sucesso na transposição da barreira de hospedeiro (PARRISH & KAWAOKA, 2005), já que é considerado uma variante do FPLV
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 VP1 VP2 P4 P38 3’ 5’ NS-1 NS-2 VP-1 VP-2 mRNA 4.9Kb 3.3Kb 3.0Kb 3.0Kb
(HORIUCHI et al., 1998; TRUYEN et al., 1998; STEINEL et al., 2001; IKEDA et al., 2002). O CPV e FPLV são geneticamente idênticos em 98% do seu genoma e diferem em cerca de 8-10 aminoácidos (PARRISH, 1988; 1990; 1995).
Durante os anos de 1978 e 1979, surtos de uma doença fatal em cães, caracterizada por causar miocardite em animais entre 3 e 16 semanas de idade ou gastrenterite hemorrágica em animais mais velhos, foram descritos na América do Norte, Europa e Austrália. Os vírus isolados dos casos de miocardite neonatal causaram gastrenterite em cães após infecções experimentais, indicando que as duas síndromes eram causadas pelo mesmo tipo de vírus (ROBINSON; WILCOX; FLOWER,1980; PARRISH et al.,1995). Em 1980, esta doença já tinha uma distribuição mundial (SIEGL, 1984; APPEL & PARRISH, 1987).
Os sinais clínicos e patológicos da gastrenterite em cães eram similares aos observados na infecção pelo FPLV em gatos e do vírus da enterite do Vison (Mink enteritis vírus ou MEV). Poucos meses após a descrição da doença, partículas semelhante aos parvovírus foram observadas por ME em amostras fecais de cães com as formas miocárdica e entérica da doença, respectivamente. Naquela época, o novo vírus foi denominado parvovírus canino tipo 2 (CPV-2) a fim de diferenciá-lo do vírus mínimo do cão (CPV-1), descrito anteriormente (BINN et al., 1970).
A hipótese mais aceita é que o CPV tenha surgido de uma mutação do FPLV ou de outro parvovírus estritamente relacionado após a passagem em um hospedeiro carnívoro, tal como sub-espécies de Neovison vison (Schreber,1777), (visons e doninhas), Alopex lagopus (Linnaeus, 1758) (raposas do Ártico) ou Vulpes lagopus (Huxley,1880) (raposas vermelha) (HORIUCHI et al., 1998; TRUYEN et al., 1998; IKEDA et al., 2002).
No Brasil, os primeiros casos de gastrenterite hemorrágica foram observados em São Paulo em 1979, mas a disseminação do vírus na população canina ocorreu a partir de 1980 (ANGELO et al., 1980; HAGIWARA et al., 1980).
Quanto as mudanças no espectro de hospedeiro de felinos para caninos, mudanças nos AA nas posições 80 (Lys→Arg), 93 (Lys→Asn), 103 (Val→Ala), 323 (Asp→Asn), 564 (Asn→Ser) e 568 (Ala→Gly) de VP2 conferiram ao CPV a capacidade de se ligar ao receptor de Tf canino e com isso replicar e infectar
células caninas, mas o vírus perdeu a capacidade de infectar células felinas (PARRISH et al., 1991; TRUYEN; PARRISH, 1992; CHANG; SGRO; PARRISH, 1992; AGBANDJE; PARRISH; ROSSMANN, 1995; HUEFFER; PARRISH, 2003; PARRISH; KAWAOKA, 2005) (Figura 4).
Logo após o aparecimento do CPV em 1978, PARRISH et al. (1985) observaram que as amostras que circularam nos Estados Unidos da América (EUA) entre 1978 e 1980 eram de um único tipo (denominadas de “tipo antigo” ou CPV-2). Entretanto, as amostras obtidas após 1980 podiam ser distinguidas das anteriores pela reatividade com anticorpos monoclonais e diferenças no perfil genômico após digeridas com endonucleases de restrição. Este novo tipo (CPV-2a) rapidamente substituiu o tipo “antigo” em circulação e passou a prevalecer na população canina (Figura 4).
Figura 4. Representação do capsídeo viral com os aminoácidos (AA) que alteraram durante a evolução do do parvovírus canino (CPV). AA que variaram entre o vírus da panleucopenia felina (FPLV) e CPV estão em azul, AA que variaram entre CPV-2 e CPV-2a estão em verde e em amarelo os AA que continuam variando (PARRISH& KAWAOKA, 2005)
A partir de 1984 um novo tipo surgiu (CPV-2b) (PARRISH, 1988; 1995). Substituições nos AA 87 (Met→Leu), 300 (Gly→Ala), 305 (Tyr→Asp) e 555 (Val→Ile) ocorreram na evolução do parvovírus canino tipo antigo (CPV-2) para o tipo novo (CPV-2a), e 426 (Asn→Asp) e 555 (Ile →Val) na emergência do tipo 2b a partir do 2a (TRUYEN, 1999).
Estes novos tipos (CPV-2a e CPV-2b) tem sido detectados em vários países (PARRISH et al., 1995). A co-existência destes tipos em várias populações no mundo em diferentes proporções mostra que não houve uma vantagem evolutiva de um tipo em relação ao outro (STEINEL et al., 1998). Além disso, estes novos tipos extenderam o espectro de hospedeiro do CPV que adquiriu também a capacidade de infectar a espécie felina (PARKER & PARRISH, 1997) (Figura 5).
Desde o final da década de 1980, os tipos novos de CPV (2a e 2b) têm sido isolados de felinos domésticos e selvagens no Japão, Alemanha, EUA, Taiwan, Vietnã e Itália, demonstrando que estes têm a capacidade de se replicar em tecidos felinos, ao contrário do tipo antigo que não era capaz de se replicar nestes tecidos (MOCHIZUKI et al.,1993; MOCHIZUKI et al., 1996; TRUYEN et al., 1996-a; TRUYEN; PLATZER; PARRISH, 1996; IKEDA et al., 1999; IKEDA et al., 2000; STEINEL et al., 2000; GAMOH et al., 2003; BATINALLI et al., 2006; DECARO et al., 2010).
A primeira descrição de um parvovírus canino infectando gatos ocorreu em 1996 (TRUYEN et al., 1996-b) e atualmente 5% dos parvovírus isolados de gatos com gastrenterite detectados na Alemanha e EUA e 3% dos isolados no Japão foram form caracterizados como tipos 2a ou 2b (TRUYEN et al., 1996-b; TRUYEN; PLATZER; PARRISH,1996; GAMOH et al., 2003).
Em 2001, mais um tipo de CPV (CPV-2c) foi relatado na Itália e já existem trabalhos descrevendo sua circulação na população canina da Espanha, Reino Unido, Vietnã, Austrália, Tunísia, Índia e América do Sul. (MARTELLA et al., 2004; DECARO et al., 2006-b; MEERS et al., 2007; PERES et al., 2007; TOUIHRI et al., 2009; CALDERON et al., 2009; NANDI et al., 2010).
O CPV-2c apresenta uma mudança de AA na posição 426 (Asp→Glu) da proteína de capsídeo VP2, região importante para o estabelecimento das
propriedades antigênicas do CPV (BUONAVOGLIA et al., 2001). Na Itália, o tipo 2c está substituindo o tipo 2b na população canina e tal disseminação sugere que a mudança de AA na posição 426 tenha dado ao vírus uma maior adaptação ao hospedeiro canino, em comparação com as outros tipos (DECARO et al., 2006-b, 2007-a; DECARO et al., 2009-a). Este tipo 2c também já foi associado à infecção em felinos, que desenvolveram quadro clínico grave de gastrenterite e panleucopenia (DECARO et al., 2010) (Figura 5).
Figura 5. Análise genética e hospedeiros do vírus da panleucopenia felina (FPLV) e parvovirus canino (CPV) desde a sua origem no final da década de 70, até os dias atuais (HOELZER& PARRISH, 2010).
A infecção por CPV-2c já foi descrita na Argentina (CALDERON et al., 2009) e no Uruguai (PÉREZ et al., 2007) em cães com gastrenterite hemorrágica e foi detectada em casos de gastrenterite em filhotes de cães no Rio Grande do Sul, (STRECK et al., 2009). Até o momento, infecções relacionadas ao tipo CPV-2c ainda não foram descritas no Estado do Rio de Janeiro.
Várias mudanças continuam ocorrendo nas amostras de CPV-2a e 2b que circulam na população canina em todo o mundo desde a década de 1980, embora nem todas estejam associadas à variações antigênicas (TRUYEN et al., 2000; BATILLANI et al., 2001; MARTELLA et al., 2004; PARRISH & KAWAOKA, 2005; WANG et al., 2005; BUONAVOGLIA, C. 2006; DECARO et al., 2007).
Casos de co-infecção por diferentes tipos de parvovírus em um mesmo hospedeiro também foram anteriormente descritos. URL et al. (2003) detectatam pela PCR o tipo antigo CPV-2 e FPLV simultaneamente em uma amostra de tecido nervoso de um felino apresentando hipoplasia cerebelar e panleucopenia. Em 2006, em Portugal, os tipos novos CPV-2b e 2c foram detectados em uma amostra fecal de um cão com gastrenterite não vacinado (VIEIRA et al., 2008-b) e na Itália, BATINALLI et al. (2007) detectaram em duas amostras fecais de filhotes (um cão e um gato) com sinais clínicos de gastrenterite a presença simultânea dos tipos CPV-2a e 2c.
4.5 - Análise de homologia de nt e AA dos parvovírus caninos (CPV).
Por técnicas de mapeamento de nucleotídeo e sequênciamento, o acúmulo de mutações pontuais tem sido observado em isolados de CPV desde a década de 1980. Algumas destas mutações podem ser silenciosas, não provocando mudança na sequência de AA (mutações sinônimas) ou podem levar a alteração do AA (mutações não-sinônimas) (PARRISH et al.,1991; BATINALLI et al., 2002).
Após 1990, os novos tipos em circulação (CPV-2a e 2b) passaram a apresentar uma mutação no gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 (AA 297 Ser→Ala). Esta mutação representou uma vantagem evolutiva, e se fez presente em mais de 90% dos isolados de CPV até o ano de 2000 (TRUYEN, 1999; HOELZER; PARRISH, 2010). Estas variantes (297 Ser→Ala) foram
inicialmente denominadas de “Novo CPV-2a” e “Novo CPV-2b” , entretanto esta nova nomenclatura não é adotada por todos os autores.
Uma outra variante de CPV-2a, apresentando uma alteração no gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 na posição 4449 (AA 555 Ile→Val) foi descrita em 2001 (BUONAVOGLIA et al., 2001; DESARIO et al., 2005; MEERS et al., 2007), e também substituiu o tipo anterior CPV-2a (AA 555 Ile) em circulação (DECARO et al., 2009-a). O resíduo 555 se localiza em um sítio antigênico da proteína de capsídeo VP2, e esta mudança Ile→Val 555 representa uma reversão à sequência original do vírus (CPV-2) (Quadro 1). (BUONAVOGLIA et al., 2001; MARTELLA et al., 2005-a).
As diferentes mutações que ocorreram no genoma do CPV de 1978 até hoje estão descritas no Quadro 1.
O acúmulo de mutações também permite o agrupamento das amostras em diferentes grupos. Os isolados de CPV são normalmente divididos em dois grupos maiores, sendo o primeiro composto pelo tipo CPV-2 e o segundo, claramente distinto, contendo outros isolados CPV-like que se originaram de um ancestral comum CPV-2a (HOELZER;PARRISH, 2010) (Figura 6).
Algumas características do genoma viral dos parvovírus como tamanho e tipo do genoma viral (único filamento de DNA), ocorrência de metilação em algumas regiões do genoma (DUFFY; SHACKLETON; HOLMES, 2008; HOELZER; SHACKELTON; PARRISH, 2008), a co-circulação de diferentes tipos de parvovírus em uma mesma população canina e felina (STEINEL et al., 1998; HOELZER; PARRISH, 2010) e a co-infecção de diferentes tipos em um mesmo indivíduo (BATINALLI et al., 2007; VIEIRA et al., 2008-b) são fatores que podem favorecer o aparecimento de mutações.
Estudos demostram que o CPV apresenta taxas de mutação dos genes que codificam para as proteínas de capsídeo VP1/ VP2 de 2x 10-4 e 8x10-5 substituições/ sítio/ ano respectivamente (HOELZER; PARRISH, 2010), valores comparáveis aos observados em vírus de genoma RNA e valores superiores ao FPLV (PARRISH; KAWAOKA, 2005; DUFFY,S.; SHACKLETON, A.; HOLMES,E. 2008).
Um estudo realizado com isolados brasileiros de CPV-2a e 2b apresentou valores ainda maiores, de 2,4x 104 substituições/ sítio/ ano para os genes que codificam para as proteínas de capsídeo VP1 e VP2 (PEREIRA; LEAL; DURIGON, 2007).
Para outras proteínas não estruturais (NS1 e NS2) as taxas de mutações do CPV e FPLV são idênticas (7,9 x 10-5 substituições/ sítio/ ano), sugerindo que os genes que codificam para estas proteínas estão sujeitos a uma menor pressão seletiva (SHACKELTON et al., 2005).
Quadro 1. Principais mutações descritas no genoma do parvovírus canino (CPV) durante sua evolução (TRUYEN et al., 1998; BUONAVOGLIA et al., 2001; MOON et al., 2008; HOELZER; PARRISH, 2010).
Aminoácido e tipo de substituição
Nome do vírus mutante Ano da primeira descrição
Importância e prevalência relativa na população
80 Arg→ Lys FPLV para CPV-2 1978 Mudança de espectro de hospedeiro de felinos para caninos.
Habilidade de se replicar somente em cães.
Alterações na ligação com o receptor celular de transferrina (TRUYEN et al., 1998; HOELZER; PARRISH, 2010) 93 Lys→Asn 103 Val→ Ala 323 Asp→ Asn 564 Asn→Ser 568 Ala→ Gly
87 Met→ Leu CPV-2 para CPV-2a 1979 100% a partir de 1980. Novo tipo antigênico
Habilidade de se replicar em felinos (TRUYEN et al., 1998; HOELZER; PARRISH, 2010)
101 Ile →Thr 300 Ala →Gly
305 Asp →Tyr
426 Asn →Asp CPV-2a para CPV-2b 1984 30 a 80% entre 1984 e 2005 Novo tipo antigênico
Habilidade de se replicar em felinos. (TRUYEN et al., 1998; HOELZER; PARRISH, 2010)
297 Ser →Ala CPV-2a e 2b 1990 Superior a 90% até 2000
(TRUYEN et al., 1998; HOELZER; PARRISH, 2010)
555 Ile → Val CPV-2a e 2b 2001 Reversão à sequência original do vírus (CPV-2)
Prevalência não estimada (BUONAVOGLIA et al., 2001; HOELZER; PARRISH, 2010)
426 Asp →Glu CPV-2c 2001 Prevalência não estimada
Novo tipo antigênico.
Habilidade de se replicar em felinos. (BUONAVOGLIA et al., 2001; HOELZER; PARRISH, 2010)
440 Thr→Ala CPV-2a 2008 Associado à sinais clínicos mais
graves.Prevalência não estimada (MOON et al., 2008)
Figura 6. Relação filogenética entre os parvovírus de carnívoros, baseada no gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2. FPLV (vírus da panleucopenia felina); BFPLV (parvovírus da raposa azul); RPV (parvovírus do racoon) (HOELZER; PARRISH, 2010).
4.6 – Transmissão, patogenia e manifestações clínicas
Estudos de infecção experimental em filhotes de cães demostraram que a infecção natural ocorre pela via oral, com replicação inicial do vírus nos tecidos linfóides da orofaringe dois dias após a infecção (PI). A seguir, uma intensa viremia é observada 3-5 dias PI, disseminando o vírus para outros tecidos: medula óssea, tecido linfóide e intestino delgado (MACARTNEY; MCCANDLISH; THOMPSON, 1984). Embora geralmente se manifeste como uma doença entérica, a infecção pelo CPV é uma enfermidade com disseminação sistêmica, com as manifestações clínicas surgindo 5 dias PI (POLLOCK; CARMICHAEL, 1990; POLLOCK; COYNE, 1993).
No trato intestinal, a replicação viral nas células do epitélio germinativo das criptas do intestino delgado resulta em morte celular, levando à destruição do epitélio e, consequentemente, achatamento das vilosidades intestinais. Quando ocorre a atrofia das vilosidades, o intestino delgado perde a capacidade de absorção, pois o epitélio germinativo responsável por substituir o epitélio maduro foi destruído. Devido à reposição celular, que ocorre de 1-3 dias, esta perda normalmente é limitada (POLLOCK; COYNE, 1993) (Figura 7).
Figura 7. Fluxograma da patogenia da infecção pelo parvovírus canino (CPV) (MACARTNEY; MCCANDLISH; THOMPSON, 1984; POLLOCK; COYNE, 1993; SMITH-CARR et al., 1997).
O vírus pode ser detectado nas fezes a partir do 3o e 4o dias pós infecção (PI), antes do aparecimento dos sinais clínicos. A maior concentração do vírus nas fezes é observada entre o 4o e 6o dias PI (APPEL; PARRISH, 1987; POLLOCK; COYNE, 1993). A transmissão fecal-oral ocorre quando animais infectados liberam partículas virais nas fezes que permanecem no ambiente por longos períodos e que contaminam animais saudáveis pela ingestão de água ou alimentos contaminados (MURPHY et al., 1999).
Pela necessidade de células em atividade mitótica para a replicação, o CPV apresenta tropismo por tecidos de animais jovens ou recém-nascidos, ou tecidos de animais adultos com intensa proliferação (TSAO; CHAPMAN; AGBANDJE, 1991). Os tipos de CPV-2a, 2b e 2c apresentam patogenia e distribuição tecidual semelhante, sugerindo um mesmo comportamento biológico desses tipos no hospedeiro (DECARO et al., 2007).
Os filhotes de cães entre seis semanas e seis meses de vida são os mais
Transmissão oral
Replicação viral em nódulos linfáticos (orofaringe) 1-2 dias pós infecção (PI)
Viremia 3-5 dias PI 6-10 dias PI Linfonodos e Medula óssea Intestino
Necrose de Células Linfóides e Linfopenia
Necrose do epitélio germinativo e diarréia
suscetíveis e a forma clínica predominante da infecção pelo CPV é a gastrenterite, que se caracteriza pela eliminação de fezes de consistência diminuída com ou sem melena. A diarréia hemorrágica em filhotes de cães pode ser considerada um indicativo da infecção por CPV (CARMICHAEL; BINN, 1981; PARRISH, 1995-b; GUILFORD; STROMBECK, 1996; McCAW; HOSKINS, 1998). Em estudo anterior realizado em nosso laboratório, foram observados os sinais clássicos em 70% dos animais infectados por CPV. Os demais animais apresentaram sinais entéricos de gravidade variada (CASTRO et al., 2007).
Os primeiros sinais clínicos geralmente são inespecíficos, observados entre o 4º e 5º dias PI e incluem anorexia, apatia e febre (MCARTNEY et al., 1984; MARTIN et al., 2002; PRITTIE, 2004). Vômito e diarréia ocorrem após 24 a 48 horas e levam a desidratação rapidamente, além de serem associados com a rápida destruição de células em mitose do intestino e medula óssea (SHERDING, 1989; POLLOCK; COYNE, 1993).
A leucopenia, que ocorre comumente nas infecções pelo CPV tem sua intensidade associada à gravidade dos sintomas clínicos, o que costuma ocorrer entre o 5° e o 8° dias da infecção. Observa-se uma redução de moderada a acentuada nesses tipos celulares em decorrência da destruição das células precurssoras na medula óssea e em outros órgãos e tecidos com função linfoproliferativa como timo, linfonodos e baço (GODDARD et al., 2008).
Quando a infecção pelo CPV evolui favoravelmente, a recuperação hematológica ocorre entre 1 a 6 dias após o início do tratamento quando observa-se frequentemente leucocitoobserva-se reativa (LATIMER, 1995). Após o período das manifestações clínicas, que geralmente dura de seis a sete dias, o animal recupera o seu estado geral.
Os sinais clínicos observados após a infecção pelo FPLV estão associados a duas síndromes típicas. Quando o FPLV infectava fetos ou felinos recém-natos ocorria hipoplasia cerebelar, com manifestação clínica de ataxia (JOHNSON; MARGOLIS; KILHAM, 1967; KILHAM; MARGOLIS; COLBY,1971). Contudo, quando a infecção ocorria em filhotes com mais de 15 dias de idade, a doença
caracterizava-se por anorexia, febre, vômito, diarréia hemorrágica e leucopenia (JOHNSON; MARGOLIS; KILHAM,1967; CARPENTER, 1971).
Apesar dos tipos CPV-2a e CPV-2b terem sido isolados de gatos com sintomatologia clínica compatível com parvovirose, a patogenicidade destes vírus em felinos domésticos ainda é discutida (MOCHIZUKI et al., 1993; MOCHIZUKI et al., 1996). Enquanto alguns estudos de infecção experimental demonstraram que CPV-2a e 2b eram capazes de infectar felinos mas não causavam manifestações clínicas claras, apenas uma leucopenia transitória (CHALMERS et al. 1999; SAKAMOTO; ISHIGURO; MOCHIZUKI, 1999); outros observaram óbito em 2/3 animais inoculados com uma amostra de CPV-2b isolada de um gato com infecção pelo parvovírus (GAMOH et al., 2003).
Da mesma forma, DECARO et al. (2010) foram capazes de detectar CPV-2c em uma amostra fecal de um filhote de gato que veio a óbito após um quadro grave de gastrenterite hemorrágica. Por esta razão, a circulação dos novos tipos de CPV em felinos domésticos, principalmente associada a doença clínica deve ser monitorada.
4.7 – Imunidade e profilaxia
Vacinas contra FPLV estão disponíveis no mercado desde a década de 1950 e devido a similaridade antigênica entre o CPV-2 e o FPLV, vacinas com FPLV inativado chegaram a ser utilizadas em cães no início da década de 80. A primeira vacina contra CPV (CPV-2) foi disponibilizada no mercado em 1979, aproximadamente um ano após a emergência deste agente na população canina (HOELZER; PARRISH, 2010) e ficou comprovado que a vacina inativada constituída por CPV apresentou melhores resultados que a vacina produzida com FPLV (MOORE, 1983; BURTONBOY et al., 1991).
No fim da década de 1980, uma vacina atenuada foi desenvolvida com o tipo CPV-2a e permaneceu no mercado por 10 anos, Durante este período, nenhuma vantagem imunológica foi observada com o uso da vacina constituída
por este tipo em relação a vacina constituída pelo tipo antigo (CPV-2) (LARSON; SHULTZ, 2008).
A presença de anticorpos maternos é considerada a causa mais comum de falha vacinal em filhotes de cães e gatos (SCHULTZ, 2009). Vários estudos mostraram que títulos de anticorpos séricos > 80 pela reação de inibição da hemaglutinação (HI) são considerados protetores e títulos > 10 já interferem na imunização com vacinas inativadas para CPV-2 (POLLOCK; COYNE, 1993). Os filhotes que nascem de cadelas com baixos títulos de anticorpos podem tornar-se suscetíveis ao vírus selvagem após quatro a seis semanas de vida, enquanto filhotes de cadelas com altos títulos de anticorpos podem permanecer imunes à infecção por até 12-20 semanas após o nascimento (MURPHY et al., 1999). Este intervalo pode durar algumas semanas, durante as quais os cães não respondem a imunização ativa mas estão vulneráveis a infecção (BUONAVOGLIA et al., 1992; LARSON; SHULTZ,1997).
Na tentativa de reduzir este período de suscetibilidade, quatro anos após o surgimento do CPV-2, vacinas constituídas pelo vírus atenuado (MLV ou Modified Live Virus) foram elaboradas a partir de amostras isoladas no início da década de 80. Na década de 1990, vacinas constituídas por vírus modificado e com alto título (107 TCID50/dose) e baixa passagem (HTLP) foram desenvolvidas com o
mesmo objetivo (BURTONBOY et al., 1991; BUONOVOGLIA et al., 1992).
A primeira vacina constituída pelo tipo CPV-2b foi desenvolvida no final da década de 90. Sabe-se que os CPV-2a e 2b podem ser eliminados nas fezes a títulos muito superiores que o CPV-2 (CARMICHAEL, 1994), provavelmente como uma conseqüência da adaptação dos tipos de CPV ao hospedeiro canino o que explicaria porque a tipo 2b foi mais eficiente em superar o bloqueio dos anticorpos maternos (DECARO et al., 2005-a).
Atualmente, vacinas constituídas pelo tipo antigo do vírus (CPV-2) ou pelo tipo CPV-2b estão disponíveis no mercado para a prevenção da parvovirose canina. Não existem até o momento vacinas licenciadas constituídas pelos tipos 2a ou 2c (LARSON; SHULTZ, 2008).
Em 2006, um surto de gastrenterite em filhotes nascidos de cadelas imunizadas com o tipo CPV-2 foi associado à presença do CPV-2c (DECARO et al., 2006-b). Em 2007, um novo surto por CPV-2c com alta mortalidade foi relatado por DECARO et al. (2008-a) desta vez acometendo adultos jovens (com idade de seis meses a dois anos), que haviam recebido múltiplas doses de vacina MLV constituída pelo tipo antigo CPV-2. Na mesma época, estudos baseados em infecção experimental demostraram que as vacinas constituídas por CPV-2 e 2b protegeram os filhotes frente ao desafio com o tipo 2c (LARSON; SHULTZ, 2008; SPILBEY et al., 2008). Um estudo realizado por SCHULTZ et al. (2010) também demonstrou que a vacinação com os tipos CPV-2 e 2b conferem proteção contra os tipos novos circulantes (CPV-2a, 2b e 2c).
4.8 – Diagnóstico Laboratorial
De modo a confirmar o diagnóstico clínico destes animais e acompanhar a circulação dos tipos de CPV, faz-se necessário a realização do diagnóstico laboratorial. Este consiste principalmente na detecção direta do vírus a partir de amostras fecais coletadas dos casos agudos da infecção, pois nesta fase, a quantidade de vírus eliminada pelo animal doente pode alcançar até 109 TCID50/g
de fezes (POLLOCK; COYNE, 1993).
Os métodos utilizados para o diagnóstico são: a) observação das partículas virais pela ME, b) reação de HA seguida pela reação de HI c) ensaios imunoenzimáticos (EIE), d) isolamento em cultura de células e e)PCR (TERRAMOTO et al., 1984; APPEL; PARRISH, 1987; DURIGON et al., 1987; MOCHIZUKI; HASHIMOTO; ISHIDA, 1993; MOCHIZUKI, 2006; DECARO et. al., 2009-b; SCHIMITZ et al., 2009).
Devido a propriedade de aglutinar hemácias de suínos e macaco Rhesus (Macaca mulatta), o teste de HA é um dos mais utilizados rotineiramente para o diagnóstico rápido da parvovirose canina. Entretanto o resultado positivo pelo HA deve ser confirmado pelo HI, com um soro imune específico. Ainda, a reação de
HI com anticorpos monoclonais permite a diferenciação antigênica das amostras de CPV (CARMICHAEL; JOUBERT; POLLOCK, 1980; DURIGON et al., 1987).
O diagnóstico também pode ser realizado através do isolamento viral em cultura de células, tanto de origem canina (Madin-Darby canine kidney - MDCK) quanto felina (Crandell feline kidney – CRFK) (CARMICHAEL; JOUBERT; POLLOCK, 1980; MOCHIZUKI et al., 1984; DURIGON et al., 1987). Atualmente, testes comerciais baseados em EIE e imunocromatográficos estão disponíveis no mercado para a rápida detecção do CPV nas fezes, o que facilita o diagnóstico em clínicas e hospitais veterinários (DESARIO et al., 2005; DECARO et al.,2009-b; SCHIMITZ et al., 2009).
Técnicas baseadas na amplificação do genoma viral mostraram ser altamente sensíveis e a PCR além de permitir a detecção do genoma do CPV em amostras de fezes, possibilita a distinção entre o tipo antigo (CPV-2) presente em algumas vacinas e os novos tipos (CPV-2a, 2b e 2c) em circulação (SENDA et al., 1995; PEREIRA et al., 2000; BUONAVOGLIA et al., 2001; COSTA et al., 2005; DESARIO et al., 2005; PEREIRA; LEAL; DURIGON, 2007). Metodologias de PCR quantitativa também tem sido utilizada no diagnóstico, para a detecção, tipagem e quantificação de DNA do CPV em fezes de cães com diarréia. Estas metodologias possibiltam determinar o número de cópias do genoma viral durante o período de eliminação do vírus nas fezes, o que é importante para a avaliação da eficácia de vacinas (DECARO et al., 2006-a; 2007-a).
Os primeiros estudos realizados para diferenciação dos tipos de CPV circulantes em CPV-2, CPV-2a e CPV-2b, utilizavam anticorpos monoclonais e mapeamento com enzimas de restrição (PARRISH et al., 1985; 1988). A análise das mudanças de nucleotídeos responsáveis pelas substituições de aminoácidos na proteína VP2 do capsídeo viral (PARRISH et al.,1988) permitiu a elaboração de pares de iniciadores específicos para tipagem das amostras de CPV através da PCR (P2For/P2Rev e P2abFor/P2abRev) que foram então utilizados para a distinção entre o tipo antigo (CPV-2) e novos de CPV (2a e 2b) (MOCHIZUKI et al., 1993; SENDA et al., 1995; COSTA et al., 2005).
Posteriormente, PEREIRA et al. (2000) desenharam um novo par de iniciadores para a tipagem do CPV-2b, baseado nas duas mudanças pontuais do genoma viral que correspondem aos AA 426 e 555 e que permitem a diferenciação dos tipos 2a e 2b. A PCR com estes pares de iniciadores (P2abFor/P2abRev e P2bFor/P2bRev) foi amplamente utilizada no laboratório de virologia (Universidade Federal Fluminense) e por outros grupos de pesquisa para tipagem molecular das amostras de CPV em circulação até a implementação do sequenciamento genômico (BUONAVOGLIA et al 2001; COSTA et al., 2005; PÉREZ et al.,2007; CALDERON et al., 2009).
BUONAVOGLIA et al. (2001) detectaram por sequenciamento uma mutação no AA426 (Asp-Glu) em duas amostras fecais de cães com gastrenterite por CPV. Estas amostras foram inicialmente tipadas como 2b pela reação com anticorpos monoclonais e PCR, mas apresentavam um perfil atípico após digestão do produto de PCR com enzimas de restrição. Este mutante, detectado na Itália, foi denominado de CPV-2c (426-Glu) e já se disseminou na população canina em vários países (MARTELLA et al., 2004; DECARO et al., 2006-b; MEERS et al., 2007; PÉRES et al., 2007; TOUIHRI et al., 2009; CALDERON et al., 2009; NANDI et al., 2010).
A caracterização molecular dos CPV por de técnicas de sequenciamento foi então difundida e estudos que compararam a tipagem pela PCR convencional e a caracterização por sequenciamento demonstraram que a PCR não foi capaz de identificar a mutação no resíduo 426 que caracteriza o novo tipo 2c (BUONAVOGLIA et al., 2001) e as amostras 2c foram erroneamente tipadas como CPV-2b por esta metodologia (DESARIO et al., 2005; MEERS et al., 2007).
Através do sequenciamento, BUONAVOGLIA et al. (2001) detectaram pela primeira vez uma variante do tipo CPV-2a (555 Ile→Val). Estudos retrospectivos em diferentes países evidenciaram que esta variante CPV-2a (555 -Val) já circulava na população canina desde o início da década de 1990 (TRUYEN, 1999; DESARIO et al., 2005; MEERS et al., 2007; HOELZER; PARRISH, 2010) e que esta variante também era amplificada pelo par de iniciadores P2b, o qual se pensava ser específico para o CPV-2b.
Com a descrição do CPV-2c e da variante CPV-2a (555 Val) ficou claro que somente o sequenciamento do gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 permitiria a identificação dos tipos de CPV em circulação (DESARIO et al., 2005; MEERS et al., 2007).
O sequênciamento genômico é considerado o método mais fidedigno para a caracterização das amostras de parvovírus canino e felino e se baseia na determinação da seqüência de nucleotídeos do gene que codifica para as proteínas de capsídeo VP2 permitindo definir com precisão o tipo de parvovírus presente na amostra e a análise da relação de homologia de nt e AA do recente isolado com as amostras de parvovírus disponíveis em bancos de dados (GenBank) (IKEDA et al., 2000; STEINEL et al., 2000; BATTILANI et al., 2002; NAKAMURA et al., 2004; SHACKELTON et al., 2005; WANG et al., 2005; DECARO et al., 2008-b; DECARO et al., 2009-a; DECARO et al., 2010)
Para a diferenciação dos tipos novos de CPV (2a, 2b e 2c), a análise da região do genoma que codifica para a proteína de capsídeo VP2, contendo os AA 426 e 555 vem sendo amplamente utilizada (BUONAVOGLIA et al., 2001; PÉRES et al., 2007; VIEIRA et al., 2008-a; CALDERON et al., 2009). Uma vez que o tipo antigo do vírus (CPV-2) ainda é amplamente utilizado na preparação de vacinas atenuadas, a análise de outros AA informativos (297, 300 e 305) da proteína VP2 pode ser necessária para a determinação do tipo do vírus.
