Efeito do laser de baixa potência (660nm) na tendinite induzida por colagenase em tendão calcâneo de ratos

Texto

(1)UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO Programa de Pós-Graduação em Biofotônica Aplicada às Ciências da Saúde. Romildo Torres da Silva. EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA (660NM) NA TENDINITE INDUZIDA POR COLAGENASE EM TENDÃO CALCÂNEO DE RATOS. São Paulo, SP 2013.

(2) ROMILDO TORRES DA SILVA. EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA (660NM) NA TENDINITE INDUZIDA POR COLAGENASE EM TENDÃO CALCÂNEO DE RATOS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biofotônica Aplicada às Ciências da Saúde da Universidade Nove de Julho, para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Saúde Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Labat Marcos. São Paulo, SP 2013.

(3) Torres-silva, R. Efeito do laser de baixa potência (660nm) na tendinite induzida por colagenase em tendão calcâneo de ratos. / Romildo Torres da Silva 2013. 52 f.. Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE, São Paulo, 2013. Orientador (a): Prof. Dr. Rodrigo Labat Marcos. 1. Tendinite. 2. Inflamação aguda. 3. Tendão calcâneo. 4. Colagenase. I. Marcos, Rodrigues Labat. II. Titulo CDU 615.831.

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(5) Dedico este trabalho:. À minha esposa, Ana Maria Aos meus filhos Thiago, Reinaldo e Juliana As minhas netas Milena e Alice..

(6) AGRADECIMENTOS. A Deus, o nosso Grande Arquiteto do Universo, sem ele nada seria possível. A minha família, em especial ao meu grande amor minha esposa Ana Maria. Ao meu orientador Prof. Dr. Rodrigo Labat Marcos, pela orientação nos trabalhos desenvolvidos, dedicação apoio e amizade. Ao Prof. Dr. Rodrigo Álvaro Brandão Lopes Martins, pela confiança, oportunidade e pela amizade. A todos os amigos de sala, em especial a Ana, Manolo e Elis. A todos os Professores Doutores que contribuíram direta e indiretamente para a realização do trabalho.. MUITO OBRIGADO!!!!!!!!!.

(7) “O mundo de um cego é definido pelo limite de seu tato. O de um homem ignorante, pelos limites do seu conhecimento. Já o mundo de um grande homem é definido pelo tamanho do seu conhecimento.” (Autor desconhecido).

(8) RESUMO. TORRES-SILVA, R. Efeito do laser de baixa potência (660nm) na tendinite induzida por colagenase em tendão calcâneo de ratos. 52f . Dissertação (Mestrado em Biofotônica Aplicada a Ciências da Saúde) – Universidade UNINOVE, São Paulo, 2013.. Tendinopatias são distúrbios comuns com uma variedade de tratamentos e terapias e a Laserterapia aparece como uma alternativa no tratamento destas doenças. Nós investigamos os efeitos da irradiação laser no modelo de tendinite induzida por colagenase, em tendões calcâneo de ratos, verificando sua ação em importantes marcadores inflamatórios. Métodos: Foram utilizados ratos machos (Wistar) divididos em grupos: Controle (C), Tendinite Não Tratado (NT), Tratamento com Diclofenado de Sódio (D) ou Laser (1J) e (3J). A tendinite foi induzida por colagenase (100μg/tendão) sobre o tendão calcâneo que foi removido para análises. Foi verificado a expressão gênica de COX-2, TNF-α, IL-6 e IL-10 (RT-PCR). Resultados e discussão: A laserterapia (660nm, 100mW, 3J), utilizada no tratamento da tendinite induzida por colagenase em tendão calcâneo de ratos, foi eficaz na redução de importantes marcadores inflamatórios, tornando-se uma ferramenta promissora para o tratamento de lesões tendíneas.. Palavras-chave: Tendinite. Inflamação Aguda. Tendão calcâneo. Colagenase. Laser de baixa potência..

(9) ABSTRACT. TORRES-SILVA, R. Effect of the low level laser therapy (660nm) in the induced tendinitis by collagenase in aquilles tendon of rats. 52pg. Master in Applied Biophotonics the Health Sciences - UNINOVE, São Paulo , 2013.. Tendinopathy is a common disease with a variety of treatments and therapies. Laser therapy appears as a alternative treatment. We research the effects of the laser irradiation in tendinitis model induced by collagenase injection on Achilles tendon rats, verified its action in important inflammatory markers. Methods: The male rats (Wistar) were used and divided in groups: Saline (C), Tendinitis (NT) and tendinitis treated with Sodium diclofenac (D) or Laser (1J) and (3J). The tendinitis was induced by collagenase (100μg/tendon) on the Achilles tendon which was removed for analyzes. The gene expression for COX-2; TNF-α; il-6 and IL-10 (RT-PCR) was measured. Results and discussion: The Laser therapy (660nm, 100mW, 3J) used in the treatment of the tendinitis induced by collagenase in Achilles tendon in rats, was effective in the reduction of important inflammatory markers, becoming a promising tool for the treatment of tendon diseases.. Word-key: Tendinitis. Acute inflammation. Achilles tendon. Collagenase. Low Intensity laser therapy..

(10) SUMÁRIO. 1-. INTRODUÇÃO..............................................................................................11 1.1-. Tendão...............................................................................................12. 1.2-. Arquitetura interna dos tendões..........................................................13. 1.3-. Tecido colágeno.................................................................................14. 1.4-. Processo Inflamatório .......................................................................14. 1.5-. Inflamação do Tendão........................................................................15. 1.5.1 Cicloxigenase 2 (COX-2)...................................................................16 1.5.2 Interleucinas IL-6 e IL-10...................................................................17 1.5.3 Fator de necrose tumoral TNF-α........................................................18 1.6-. Tratamentos......................................................................................18. 1.7-. Laserterapia.......................................................................................19. 2-. OBJETIVOS..................................................................................................22. 3-. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................23. 4-. 3.1. Animais...............................................................................................23. 3.2. Grupos Experimentais........................................................................23. 3.3. Indução da tendinite............................................................................24. 3.4. Aplicação da Terapia com Laser de Baixa Potência (LBP)..............25. 3.5. Análises de expressão gênica por RT-PCR.....................................25. 3.6. Análise estatística...............................................................................26. RESULTADOS................................................................................................27 4.1. Artigo submetido para publicação.......................................................27. 5-. CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................43. 6-. REFERÊNCIAS…………………………….....…………………………….......…..44. 7-. ANEXO 1 (Aprovação do comitê de ética e pesquisa)....................................52.

(11) LISTA DE ABREVIAÇÕES AP – Fosfatase Alcalina ATP – Adenosina Trifosfato β-actina – Anticorpo Policlonal cDNA – DNA Complementar COX – Ciclo-Oxigenase DNAse – Enzima catalizadora do Ácido Desoxirribonucléico FP – Fibrinogênio Plasmático HILT - High Intensity Laser Treatment IL – Interleucina JMT – Junção Músculo-tendínea JOT – Junção Ósteo-tendínea LASER – Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation LBP – Laser de Baixa Potência LILT - Low Intensity Laser Treatment MMP – Metaloproteinase da Matriz mW – MiliWatt nm– Nanômetro PMNs – Polimorfonucleares RNA – Ácido Ribonucléico RNAm – Ácido Ribonucléico mensageiro RT PCR – reação de transcriptase reversa – reação em cadeia da polimerase TNF-α – Fator de Necrose Tumoral.

(12) LISTAS DE FIGURAS. Figura 1: Tendão Calcâneo..............................................................................pag 12 Figura 2: Arquitetura interna dos tendões.........................................................pag 13 Figura 3: Esquema de grupos experimentais...................................................pag 23 Figura 4: Seqüência de Primers..................................................................pag 25-26 Figura 5: Tabela dos resultados......................................................................pag 44.

(13) 11. 1 – INTRODUÇÃO. As doenças musculoesqueléticas entre elas a tendinite, em virtude da sua frequência, do custo do tratamento, da redução da funcionalidade laboral e do desencadeamento. de. co-morbidades,. necessitam. de. recursos. financeiros. consideráveis para o acompanhamento da saúde dos indivíduos vítimas destas patologias, principalmente nos casos em que a incapacidade no trabalho persiste além do tempo médio para o retorno às atividades laborativas (BERNARD B., 1997, ARVIDSSON S. et al., 2008). As tendinopatias são alterações na saúde do tendão, geralmente frequentes e difíceis de serem tratadas, incapacitando desde atletas profissionais e recreacionais até pessoas comuns em seu local de trabalho. A tendinite tem um alto impacto na qualidade de vida do indivíduo que requer freqüente atendimento médico mesmo nos casos simples, constituindo um desafio terapêutico nos casos crônicos (BARROS M. et al.; 2006; AITTOMAKI A. et al., 2006). Sua ocorrência é alta, especialmente quando consideramos o tendão calcâneo, o patelar e o do cotovelo, onde a cronificação da doença é comum (LANGBERG e KONGS-GAARD, 2008), sendo objeto de preocupação entre as classes de trabalhadores em diversas ocupações, pela redução da qualidade de vida e pelo alto custo ao sistema de saúde (LOISEL P., et al 2002). Quando a doença cronifica, ocorre um aumento considerável dos recursos despendidos pelo empregador, relacionados ao afastamento e a necessidade de relocação e qualificação de outro para o exercício desta função (NGUYEN et al 2007). Sua predominância foi relatada entre 2% dos trabalhadores ativos e 55% dos atletas (LIN et al, 2006). Nos Estados Unidos, foi observado um aumento de 39% dos gastos com indenizações e 62% com custos médicos no período de 1991 à 2001. No Brasil, acidentes de trabalho e doenças ocupacionais somaram 509.062 dias de trabalho perdidos em 2000, responsável por R$8.492.762,00 de gastos com benefícios concedidos pelo INSS, apenas no estado da Bahia (SANTANA et al., 2006). Porém, a etiologia das tendinopatias ainda não foi totalmente explicada (ALFREDSON e LORENTZON, 2000), mas sua ocorrência elevada faz destas doenças um grande problema sócio-econômico onde as intervenções médicas e terapias para a reabilitação são ainda limitadas (LANGBERG e KONGS-GAARD,.

(14) 12. 2008). Sua prevenção, a identificação das causas associadas e a promoção do retorno seguro às atividades laborativas, portanto, tornaram-se tema de estudos no campo da saúde pública (BARBE MF, 2006). 1.1 – Tendão. Tendões saudáveis apresentam coloração branca brilhante e textura fibroelástica, mostrando grande resistência a tensões mecânicas. Eles podem variar muito quanto à forma, e ainda quanto à maneira como estão ligados ao osso. Além disso, a junção miotendínea (JMT) também mostra variações anatômicas entre diferentes músculos.. Figura 1. Tendão calcâneo (Aquiles) de humano. (vista posterior). Fonte: Wikipédia.org.. Tendões são estruturas anatômicas interpostas entre músculos e ossos (figura 1), que transmitem a força gerada no músculo para o osso, tornando possível o movimento articular (JÓZSA e KANNUS, 1997; KHAN et. al., 1999). Os elementos básicos dos tendões são fibras de colágeno e matriz extracelular rica em proteoglicanas, formadas a partir de células denominadas tenócitos. O colágeno fornece a força tênsil ao tendão, enquanto a matriz fornece suporte estrutural para as fibras de colágeno e regula a transformação extracelular de pró-colágeno em.

(15) 13. colágeno maduro (ASTROM, 1997). Os tenoblastos, células achatadas e distribuídas entre as fibras de colágeno sintetizam tanto a matriz extracelular, quanto o prócolágeno. O colágeno é arranjado hierarquicamente em níveis de complexidade crescente, começando com protocolágeno, fibras, fascículos, bandas terciárias e finalmente o tendão propriamente dito (JÓZSA e KANNUS, 1997; ASTROM, 1997; KHAN et al., 1999). 1.2 – Arquitetura interna dos tendões. O tendão é completamente coberto pelo epitendão, uma camada fina de tecido conjuntivo contendo suprimentos nervosos, vasculares e linfáticos. O epitendão se estende profundamente no tendão, entre as bandas terciárias e o endotendão (figura 2). Mais superficialmente, o epitendão é envolvido pelo paratendão, um tecido conjuntivo areolar contendo basicamente fibrilas de colágeno (KVIST et al., 1985), algumas fibrilas elásticas e uma linha interna de células sinoviais (WILLIANS, 1986).. Figura 2. Organização hierárquica da estrutura do tendão (das fibrilas de colágeno até o tendão propriamente dito). Fonte: KASTELIC et al. (1978). 1.3 – Tecido Colágeno.

(16) 14. As fibras formadas por colágeno representam dois dos três principais tipos de fibras do tecido conjuntivo, as fibras colágenas e as reticulares. As fibras elásticas são formadas pela proteína elastina. O colágeno é a proteína mais abundante do organismo, representando cerca de 30% do peso seco e pode ser classificado nos seguintes grupos: (1) colágenos que formam longas fibrilas; (2) colágenos associados a fibrilas; (3) colágeno que forma rede e (4) colágeno de ancoragem. O colágeno que forma os tendões, ossos, dentina, derme e outros tecidos, está incluído no 1o Grupo. A síntese de colágeno foi primeiramente atribuída a uma variedade restrita de tipos celulares como fibroblastos, osteoblastos e condroblastos. Atualmente, existem evidências convincentes de que outros tipos celulares são capazes de sintetizar o colágeno (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). O colágeno é um dos principais componentes da matriz extracelular, responsável pela resistência à tração atuando também na estabilidade do tecido conjuntivo (MOALI C, 2012, WIDMER, C, et al. 2012 ). Esta integridade e. estabilidade do tecido são reguladas principalmente através de um equilíbrio entre produção, organização e degradação do colágeno (HULMES DJ 2002). O colágeno fibrilar mais abundante no tendão é primeiramente o colágeno do tipo I, seguido pelo colágeno tipo II e III, sintetizados a partir do pró colágeno (HULMES, 2008). 1.4 – Processo Inflamatório. A inflamação é uma resposta biológica complexa do tecido à estímulos nocivos como, células danificadas, ou irritantes (FERRERO- MILIANI L. et al., 2007) sendo um dos mecanismos de proteção do organismo com a função de neutralizar e remover este estímulos nocivos, promovendo o reparo. A inflamação aguda é um processo de curta duração, aparecendo geralmente dentro de alguns minutos ou horas (COTRAN et al., 1998). O mecanismo fisiopatológico da inflamação é explicado por um conjunto de reações locais e gerais do organismo, compondo uma série de fenômenos complexos que se associam e se complementam, formando uma reação em cascata, que envolve células inflamatórias, como: neutrófilos, linfócitos e monócitos/ macrófagos (TEDGUI e MALLAT, 2001)..

(17) 15. Durante a resposta inflamatória aguda, ao libertar mediadores inflamatórios responsáveis pelos sinais de inflamação, ocorre a vasodilatação e consequente aumento do fluxo sanguíneo, apresentando na área inflamada vermelhidão e aumento do calor. O aumento da permeabilidade dos vasos sanguíneos resulta em uma exsudação do plasma e proteínas de fluidos para os tecidos, se manifestando como inchaço. Alguns mediadores inflamatórios liberados durante este processo podem alterar determinadas moléculas dos vasos sanguíneos permitindo a migração de leucócitos, principalmente de neutrófilos provocando um infiltrado inflamatório. Os neutrófilos migram por quimiotaxia até o local da lesão (COTRAN et al., 1998). 1.5 – Inflamação do Tendão. Historicamente, tendões são conhecidos como partes vulneráveis do corpo humano. Hipócrates reportou que se o tendão de Aquiles (calcâneo) fosse lesado, poderia causar febre aguda, convulsões, inconsciência e finalmente a morte. Felizmente, lesões no calcâneo nos dias de hoje não estão associadas com morte, mas algumas vezes podem causar condições crônicas dolorosas e de difícil tratamento. No processo inflamatório crônico, ocorre o remodelamento da bainha tendínea e do tecido sinovial, aumentando a quantidade de células inflamatórias. Estas alterações no tecido tendíneo conduzem a um distúrbio com redução de sua funcionalidade. Outra complicação está no fato que os tendões usam suas extremidades para se ligarem em outras estruturas, como ossos e cartilagens e uma vez alterado, este processo inflamatório pode migrar para outros tecidos iniciando um quadro pré-artrítico. Esta pode ser a explicação sobre como os tendões são afetados pela inflamação crônica e como a tendinite pode influenciar no aparecimento e evolução de doenças inflamatórias nos ossos e cartilagens (HAYER et al., 2007). De maneira Geral, o tendão humano tem uma alta capacidade de suportar tensões. Medições diretas em calcâneos humanos registraram forças de até 9 kN (correspondente a 12,5 vezes o peso corporal) durante uma corrida em velocidade de 6 m/s. Entretanto, hoje sabemos que a força máxima suportada desse tendão é.

(18) 16. uma variável bastante individual, indicando também uma faixa ampla de suscetibilidade a sobrecargas. Existe um grande número de sugestões quanto aos fatores etiológicos da tendinite, mas são poucas as comprovações científicas. A causa determinante mais comum é o esforço exagerado de extensão sobre os tendões, ocorrendo distensão de suas fibras, que por não suportarem a tração mecânica, podem apresentar rupturas parciais desenvolvendo intensa e dolorosa reação inflamatória local (ALFREDSON e LORENTZON, 2000). Além da sobrecarga mecânica conhecida como o principal fator causador das tendinopatias, existem processos lesivos repentinos e o envelhecimento que também contribuem para a degeneração do tendão que pode ocorrer na ausência (tendinose) ou na presença (tendinite) de resposta inflamatória (SUN et al., 2008). 1.5.1 – Cicloxigenase 2 (COX-2). Após a lesão do tendão, o organismo inicia uma série de eventos para a promoção do reparo tecidual que pode ter como resultado a alteração do tecido e formação de cicatriz (LIN al, 2006). A cicatriz inicialmente fornece a continuidade física do tecido, porém pode provocar a formação de tecidos adjacentes indesejáveis, impedindo o mecanismo de deslizamento do tendão (BEREDJIKLIAN et al., 2003). Já a inflamação intensa, com grande migração leucocitária e formação de citocinas pró-inflamatórias à partir da Ciclo-oxigenase, promove a alteração do tecido, pelo aumento de fibroblastos e mudança da matriz extracelular (LIECHTY et al., 2000). A prostaglandina H2 sintase, também conhecida como cicloxigenase é uma enzima integral da membrana celular, participando da cascata inflamatória. Geralmente são constitutivas, porém a COX-2 pode ser induzida durante a resposta inflamatória, influenciando ainda a formação de mediadores inflamatórios tais como interleucinas, prostaglandinas e tromboxanos (KOMOTO J. et al 2006). Algumas destas citocinas, entre elas a IL-1, IL-6 e IL-12 e ainda o TNF-α são reprimidas drasticamente no final do processo inflamatório, durante o reparo tecidual (RANG and DALE, 2012). A expressão de COX-2 pode ser também aumentada após a indução do processo inflamatório em tendões calcâneos de ratos (MARCOS et al, 2011). Ao.

(19) 17. contrário, sua redução foi observada após terapias farmacológicas e não farmacológicas, como na utilização da laserterapia de baixa potência (WANG et al, 2003; XAVIER et al, 2010; MARCOS et al, 2011). 1.5.2 – Interleucinas IL-6 e IL-10. Uma maneira de reduzir o processo inflamatório no tecido lesionado seria controlar o processo de cicatrização pela modulação do processo inflamatório e dos níveis de citocinas anti e pró-inflamatórias envolvidas no reparo (RICCHETTI et al., 2008). Entre estas citocinas, as interleucinas teriam um papel importante na modulação da inflamação do tendão (LIN et al., 2006). A IL-6, é uma citocina com papel central na inflamação após processos lesivos (SKUTEK M, et al., 2001). No processo inflamatório agudo do tendão é observado um aumento expressivo de granulócitos e neutrófilos na bainha sinovial, geralmente ativados pelo aumento de IL1 e IL6. A presença destas duas citocinas esta diretamente relacionada a progressão da tendinite (HAYER et al., 2007). Outros estudos sugeriram que as citocinas inflamatórias pode desempenhar um papel durante a progressão das condições das tendinopatias, uma vez que também foram detectados no processo da dor e ruptura do tendão ([FU SC, et al., 2002, NAKAMA K, et al. , 2006). A IL-10 foi identificada inicialmente por MOSMANN et al. (1989), sendo reconhecida por sua atividade antiimunológica e antiinflamatória. Desde sua descrição, a lista de células produtoras de IL-10 se expandiu rapidamente assim como o número de células que são capazes de responder a essa citocina (MOSSER et al., 2008). A IL-10 também é conhecida por inibir a expressão de IL-6 e IL-8 e a migração de células inflamatórias no local da lesão incluindo macrófagos e monócitos (ALAM et al., 1994; RICCHETTI et al., 2008). Durante o processo inflamatório a interleucina IL-10 possui uma importante função biológica de inibir a maturação e a diferenciação de células dendrítica em monócitos e de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias exposição à IL-10 que pode ainda inibir a inflamação, aumentando os receptores antagonistas de IL-1 pelos macrófagos (MOSSER et al., 2008)..

(20) 18. 1.5.3 – Fator de necrose tumoral TNF-α O fator de necrose tumoral (TNF-α) é uma citocina pleitrópica, relacionada tanto na sobrevivência e proliferação celular como na morte celular no processo apoptótico. Esta citocina também é distribuída e expressa em tenócitos em condições inflamatórias onde a apoptose e a proliferação celular é acentuada (HOSAKA et al., 2005). O TNF-α é considerado uma citocina chave na origem de várias doenças osteomusculares, como Artrite Reumatóide, Osteoartrite e Tendinite (HAYER et al., 2007), porém, seu papel na doença do tendão ainda não foram bem determinada. Sabe-se que em tendões de equinos, o TNF-α pode apresentar ações antiapoptóticas e apoptóticas, controlando o número de células, sendo um fator importante no progresso de degeneração do tecido tendíneo (HOSAKA et al., 2005). Os tendões são bastante afetados pela inflamação também por estarem sujeitos a forças específicas e cargas mecânicas prolongadas (HAYER et al., 2007). Nestas condições patológicas, o tecido tendíneo pode apresentar aumento dos receptores de TNF-α (R1 e R2) (HOSAKA et al., 2005). Os níveis de TNF-α são aumentados nos tecidos músculo-tendíneos, em situações pós-traumáticas (ELSAID et al., 2008). As cirurgias de tendão, cartilagem e osso é outro fator que pode dar início a um processo inflamatório. Após uma lesão, sejam por um acidente ou por uma intervenção médica, os níveis de citocinas inflamatórias como TNF-α e IL são aumentados (AKESEN et al., 2009). 1.6 – Tratamentos. Condições inflamatórias de tendões estão associadas a uma ampla variedade de tratamentos propostos, algumas delas com poucas evidências científicas que apoiem seu uso (KVIST, 1994; KHAN et al., 1999; ALFREDSON e LORENTZON, 2000; ANDRES et al., 2008; BJORDAL et al., 2008). Os tratamentos da tendinite têm por finalidade a redução da inflamação, que se persistir, promove alterações nos feixes das fibras de colágeno e aumento da atividade de determinadas enzimas, prolongando-se assim as fases inflamatória e proliferativa, favorecendo a deposição excessiva de tecido cicatricial, alterando.

(21) 19. algumas características como a redução da resistência em comparação ao tendão original (FERNANDES et al., 2003). O tratamento mais comum é o conservador, recomendado pela maioria dos autores como estratégia inicial. Na maioria das vezes consiste em uma abordagem multi-orientada, incluindo modelos de reabilitação combinada como repouso, medicação a base de antiinflamatórios não esteroidais e corticóides, crioterapia, massagem, treinamento de força. A eficácia do tratamento aumenta com a determinação da fase em que o processo inflamatório no tendão se encontra. Na fase inicial do processo de reparação, podem ser instituídas práticas hidroterápicas frias, visando-se reduzir o metabolismo na região, e agentes antiinflamatórios esteroidais ou não-esteroidais (ALVES e MIKAIL, 2006). Os corticosteróides são bem absorvidos em qualquer sítio de administração, (tópica, oral, subcutânea, intramuscular, intralesional e intravenosa), porém podem provocar efeitos deletérios no uso intralesional (POOL et al., 1980). Os antiinflamatórios não esteroidais são as drogas utilizadas com mais freqüência, como parte do tratamento inicial, principalmente na redução da dor, embora seja comum encontrarmos amostras de tendões durante a tendinopatia, com ausência de células inflamatórias que justifique esta preferência (ALFREDSON et al., 2003; ANDRES et al., 2008). 1.7 – Laserterapia. Vários trabalhos foram publicados para melhorar o entendimento dos efeitos da terapia LASER no tratamento de doenças inflamatórias. Porém, apesar de todas as investigações realizadas e do importante uso clínico do laser de baixa potência, o conhecimento básico de seus mecanismos de ação ainda é muito deficiente. O termo Laser é um acrônimo para “Light Amplification by emission of radiation” (amplificação da luz pela emissão estimulada da radiação). Embora Albert Einstein originalmente tenha delineado os princípios subjacentes à geração deste tipo de luz no início deste século, foi somente em 1960 que Maiman produziu o primeiro feixe de luz de laser e baseado neste protótipo surgiu vários aparelhos. As características que diferem a luz laser de uma lâmpada são: monocromaticidade, colimação e coerência (SCHAWLOW,1995)..

(22) 20. A coerência é uma das propriedades da luz laser, como citada acima, mas ao penetrar no tecido, esta propriedade se perde nos primeiros extratos da pele. Isto ocorre devido à grande variedade de estruturas celulares que compõe a pele (Nomura et al, 1989). Segundo esses autores, apesar da perda da coerência no interior dos tecidos, a irradiação ainda é absorvida pelas células, gerando alterações no seu metabolismo tanto em tecidos superficiais como profundos (SVAASAND, 1990). Os lasers podem ser classificados em dois grandes grupos: os laseres cirúrgicos de alta intensidade (HILT – High -Intensity Laser Treatment) e laseres nãocirúrgicos de baixa intensidade (LILT – Low Intensity Laser Treatment). Em geral, quase todas as aplicações com HILT tomam por base os efeitos fototérmicos e fotoablativos do laser no tecido, sendo usados para cortar, destruir, soldar, remover tatuagens, entre outros efeitos. Em contraste, nas décadas de 60 e 70 os pesquisadores voltaram-se para as aplicações com LILT e essas se baseiam nas interações atérmicas da luz laser com o tecido, produzindo efeitos de Biomodulação (KARU, 1998; BASFORD,1995). A terapia com laser de baixa potência (LBP), incide sobre as reações atérmicas da luz com o tecido, ocasionando efeitos fotoquímicos (SCHAFFER et al., 2000; HONMURA et al.,1993), ou seja, radiações com baixa densidade de potência (DP) 0,01 w/cm2 à 1 w/cm2 e também baixa densidade de energia (DE), de 1 à 10J/cm2 (SCHINDL et al., 2000). Nesses limites se produz uma pequeno e não significante aumento de temperatura, o qual não ultrapassa 1 grau Celsius (KARU,1987). O Laser de baixa potência parece agir sobre organelas celulares (mitocôndrias e membranas), gerando aumento da síntese de ATP e modificando o transporte iônico. Dessa forma o laser, em curto prazo, acelera a glicólise e a oxidação fosforilativa e em longo prazo a transcrição e a replicação do DNA (KARU, 1987). Acredita-se que a ação do laser de baixa potência sobre o tecido está relacionada à possibilidade de inibição do aparecimento de fatores quimiotáticos nos estágios iniciais da inflamação; de interferir com o efeito dos mediadores químicos induzidos pela inflamação (CAMPANA et al., 1998; CAMPANA et al. ,1999); inibir a síntese das prostaglandinas (SATTAYUT et al., 1999; BJORDAL et al., 2006) além de inibir o esfíncter pré-capilar, através de mediadores químicos..

(23) 21. Estudos adicionais sobre o efeito antiinflamatório do laser de baixa potência ainda se fazem bastante necessários e seu mecanismo de ação deve ser investigado a fim de compreender suas ações nos diferentes modelos experimentais em que vem sendo utilizados. Campana et al. (1998) quantificaram o nível de fibrinogênio plasmático (FP) em modelo de lesão tecidual induzida por laparotomia e tratada com LBP e diclofenaco de sódio. Nesse modelo experimental os resultados mostraram que o nível de FP que se encontrava aumentado nos tecidos lesados retornaram a níveis normais após o tratamento com LBP sendo semelhante ao tratamento com diclofenaco de sódio. Esses resultados sugerem que a resposta inflamatória pode ser normalizada ou reduzida pela ação fotoquímica do LBP, sugerindo uma ação seletiva da COX-2, visto que a redução do FP obtida com LBP foi semelhante ao tratamento farmacológico. SATTAYUT et al. (1999), investigaram o efeito do laser As-Ga-Al (820nm) com densidade de energia de 4J/cm2 e 19J/cm2 na produção de PGE2 em culturas de células estimulada com IL-1 e observaram que a inibição da síntese de PGE 2 ocorreu com 19J/cm2, sugerindo ser este o mecanismo analgésico para as dores músculo - esqueléticas. O uso de lasers na prática clínica objetivando o efeito antiinflamatório em diferentes doenças baseia-se em um número já razoável de publicações de caráter científico. Nos últimos anos, inúmeros estudos em diferentes situações foram realizados, fazendo com que a terapia laser já seja considerada como alternativa terapêutica para várias doenças. (SALATE et al, 2005; FRIGO, 2009; CHOW, 2009; CRESSONI ET AL, 2010; TUMILTY et al, 2012; ALFREDO et al, 2012; ALVES et al, 2013; BJORDAL et al, 2013; MARCOS et al, 2013; CASALECHI et al, 2013. À partir destes trabalhos, foi possível entender parte do efeito da Terapia com Laser de Baixa Potência na reação inflamatória em cartilagem, na osteoartrite e tendinite, em ratos e humanos. No entanto, é importante ressaltar que pouco se conhece a respeito do mecanismo de ação dos laseres no processo inflamatório, onde os estudos experimentais assumem grande relevância..

(24) 22. 2 – OBJETIVOS. Estudar o efeito do laser de baixa potência 660nm, 100mW na inflamação aguda do tendão, investigando alterações da expressão de enzimas e mediadores inflamatórios como COX-2, IL-6, IL-10 e TNF-α..

(25) 23. 3 – MATERIAL E MÉTODOS 3.1 – Animais. Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 200 e 250g (+/- 90 dias de vida) com livre acesso a água e ração, provenientes Biotério do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura controlada e ciclo claro/escuro de 12 horas. 3.2 – Grupos Experimentais. Os animais foram divididos em diferentes grupos conforme o esquema abaixo:. Figura 3. Esquema dos grupos experimentais..

(26) 24. - Grupo 1: Controle (C) Tendões de animais que receberam injeção com solução salina 0,9% de NaCl (soro fisiológico estéril).. - Grupo 2: Tendinite não tratado (NT): Tendões de animais que receberam injeção com solução de colagenase.. - Grupo 3: Diclofenaco (D): Receberam injeções de Colagenase e foram tratados com Diclofenaco de Sódio (2,5mg/kg I.M., Voltaren, Novartis®) imediatamente após a indução.. - Grupos 4: Irradiado (1J): Receberam injeção de colagenase e os tendões foram irradiados, na região da injeção, num único ponto com Laser em 660nm na energia de 1J e 100mW.. - Grupos 5: Irradiado (3J): Receberam injeção de colagenase e os tendões foram irradiados, na região da injeção, num único ponto com Laser em 660nm na energia de 3J e 100mW. 3.3 – Indução da tendinite. Os animais foram anestesiados com injeção de cloridrato de ketamina (90mg/Kg) e cloridrato de Xilazina (10mg/Kg). Depois de anestesiados, os animais do grupo G2 ao G5 receberam 100 µl de injeção transcutânea de colagenase (1 mg/ml; Sigma Chemical Co, Cat. C-6885) na região posterior da pata direita do Tendão calcâneo. Animais do grupo controle receberam o mesmo volume de solução fisiológica (NaCl 0,9%). A seguir, os animais retornaram para as caixas de contenção separados em diferentes grupos experimentais. Após 2 horas da indução do processo inflamatório pela injeção de colagenase, os animais foram eutanasiados. A eutanásia foi realizada através de “overdose” injetável de anestésico cloridrato de ketamina (180mg/Kg) e cloridrato de Xilazina (20mg/Kg). O tecido tendíneo foi removido para posteriores análises..

(27) 25. 3.4 – Aplicação da Terapia com Laser de Baixa Potência (LBP). Os animais receberam o tratamento com laser de baixa potência 660nm em 100mW de potência (Thera Lase, DMC®), 1 hora após serem submetidos ao modelo de inflamação aguda pela injeção de colagenase, O tempo de Irradiação foi de 10 e 30 segundos, respectivamente para a energia de 1J e 3J. A aplicação do laser com um ponto por contato pontual, com diâmetro de 0,028 cm². 3.5 – Análises de expressão gênica por RT-PCR. Os tendões removidos foram imediatamente armazenados à -80 ºC para análise da expressão gênica dos compostos indicados na tabela abaixo, pela reação em cadeia da polimerase reversa (PCR) em tempo real. O RNA total das amostras foi extraído com o reagente Trizol (Gibco BRL, EUA), de acordo com instruções do fabricante. Após tratamento com DNAse, a síntese dos cDNAs foi feita pelo método da transcriptase reversa, empregando a enzima SuperScript (Invitrogen, 2μg de RNA total), na presença de mistura de primers randômicos e oligo dT. A análise das amostras em tempo real obedeceu um ciclo de desnaturação inicial (10min à 95 ºC) e quarenta ciclos de amplificação (30 seg de desnaturação à 95 ºC e 1min de anelamento e extensão à 60 ºC). As seqüências dos primers utilizados estão representadas na figura 4, conforme Wang et al. (2004). Os resultados da expressão gênica foram interpretados usando-se a fórmula 2-∆∆ Ct (Ct = número de ciclos necessários para atingir o limiar de fluorescência acima do valor de fundo - background) que relaciona a expressão do gene de interesse comparado àquela do gene controle B-actina.. PRIMER β-ACTINA. SEQUÊNCIA FOWARD: AAGATTTGGCACCACACTTTCTACA REVERSE: CGGTGAGCAGCACAGGGT. COX-2. FOWARD: AGATCAGAAGCGAGGACCTG REVERSE: CCATCCTGGAAAAGTCGAAG.

(28) 26. FOWARD: TGACCCAACCACAAATGC IL-6. REVERSE: CGAGCTCTGAAACAAAGGAT. IL-10. FOWARD: CATGGGTGTTGGGAAGAGAA REVERSE: GCTTTCGAGACTGGAAGTGG. TNF-α. FOWARD: GGTGATCGGTCCCAACAAGGA REVERSE: CACGCTGGCTCAGCCACT. Figura 4: Seqüência de Primers para análise da expressão de mRNA, pela técnica de RT-PCR em tempo real. 3.6 – Análise estatística. Os dados foram descritos em valores médios seguidos dos respectivos desvios padrão. Todos os resultados foram submetidos à análise estatística através do teste de ANOVA com post-hoc de Tukey-Kramer para múltiplas comparações. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos..

(29) 27. 4 RESULTADOS 4.1 – Artigo submetido para publicação..

(30) 28. The Low Level Laser Therapy (LLLT) Operating in 660 nm Reduce Gene Expression of Inflammatory Mediators in the Experimental Model of Collagenase-induced Rat Tendinitis. Torres-Silva, R1; Lopes-Martins R.A.B.2, Bjordal J.M.3, Frigo L4, Rahouadj R.5, Arnold G.6, Leal-Junior, E.C.P.1, Magdalou J.7, Pallota R.2, Marcos, R.L.1 1 - University of Nove de Julho, Biophotonics Applied to Health Sciences, São Paulo 01504-001, Brazil 2 - University of São Paulo (USP), Laboratory of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Institute of Biomedical Sciences (ICB), São Paulo 05508-900, Brazil 3 – University of Bergen, Department of Global Health, Norway 4 – Universidade Cruzeiro do Sul, Departamento de Ciências da Saúde – São Paulo 5 - Université de Lorraine (UL), Laboratoire d'Energétique et de Mécanique Théorique et Appliquée (LEMTA), UMR 7563 CNRS, F-54504 Vandœuvre-lèsNancy, France 6 - Université de Haute Alsace (UHA), Laboratoire Physique et Mécanique Textiles (LPMT), F-68093 Mulhouse, France e Université de Strasbourg (UdS), ICube, UMR 7357 CNRS, F-67411 Illkirch, France 7- Université de Lorraine (UL), Ingénierie Moléculaire, Physiopathologie Articulaire (IMoPA), UMR 7365 CNRS, Biopôle, F-54505 Vandœuvre-lès-Nancy, France. Correspondence Author Rodrigo Labat Marcos Programa de Pós-Graduação em Biofotônica Aplicada das Ciências da Saúde Universidade Nove de Julho Rua Vergueiro – 239-245 Email: rodrigolabat@yahoo.com.br. ABSTRACT.

(31) 29. Tendinopathy is a common disease with a variety of treatments and therapies. Laser therapy appears as an alternative treatment. Here we investigate the effects of laser irradiation in an experimental model of tendinitis induced by collagenase injection on rat calcaneous tendon, verifying its action in important inflammatory markers. Methods: Male Wistar rats were used and divided in five groups: Control Saline (C), non-treated tendinitis (NT) and tendinitis treated with sodium diclofenac (D) or Laser (1J) and (3J). The tendinitis was induced by collagenase (100μg/tendon) on the Achilles tendon which was removed for analyzes. The gene expression for COX-2; TNF-α; IL-6; IL-10; MMP-3, 9, 13 (RT-PCR) was measured. Results and discussion: The Laser irradiation (660nm, 100mW, 3J) used in the treatment of the tendinitis induced by collagenase in Achilles tendon in rats, was effective in the reduction of important inflammatory markers, becoming a promising tool for the treatment of tendon diseases. Keywords: Tendinitis. LLLT, Laser therapy, Tendinitis, inflammation, tendon, rats.. INTRODUCTION Tendinopathies are changes in the tendon health, which are frequent and difficult to treat, because of the high impact on quality of life of individuals that require frequent medical care even in simple cases, being a therapeutic challenge in chronic situations [1,2]. This fact results in a significant increase of resources expended by the employer relating to the sick leave and the need for relocation and qualifying new employees [3]. The high incidence tendon diseases make it a social problem which medical therapies and interventions for rehabilitation are limited [4]. Therefore, its prevention, the identification of associated causes and also the promotion of safe return for working activities became the subject of studies in public health [5]. Tendons are composed by tenocytes which are responsible for the synthesis of specific extracellular matrix and collagen, arranged in hierarchical levels, forming a complex anatomical structure transmitting the force generated from the muscle to the bone, making possible the joint movement [6,7]. The tendon tissue is covered by epitendon which provides a poor blood supply when compared to other tissues. This may compromise its repair process after a.

(32) 30. lesion due to the difficulty in removing metabolites or even the low bioavailability of drugs commonly used in conventional therapy [8,9]. The most abundant collagen found in tendon tissue is the type I collagen followed by type II and III. These proteins are organized in long fibrils conferring resistance to the tissue. A balance between production and degradation of collagen regulates the tissue integrity. Thus, changes in this balance can interfere directly in the mechanical properties of the tendon [10,11,12]. There are a number of etiologic factors that can be attributed as tendinitis inductors. The most common cause is the overexertion of tendons extension promoting distension of collagen fibers leading to partial ruptures, developing an intense and painful inflammatory reaction [13]. In this context, the most common treatment of the inflammatory reaction in tendon tissue are the NSAID’s. The use of NSAID’s still controversial in tendon diseases. However, an alternative to way to reduce the inflammatory process in tendon tissue could be controlling the wound healing process by modulating the inflammation and levels of anti- and proinflammatory cytokines involved in tissue repair [14]. The cyclooxygenase II, for example, is an integral enzyme that can be induced during this inflammatory process, influencing the formation of important inflammatory cytokines, including the interleukins (IL-1, IL-6, IL-10) and tumor necrosis factor (TNF - α). These cytokines have a major role in the modulation of tendon inflammation [15]. IL-6, for example, is a cytokine with a central role in inflammation after injurious processes [16]. In acute inflammation of tendon is commonly observed a significant increase of both granulocytes and neutrophil in synovial sheath, usually activated by increasing IL-1 and IL-6. The presence of these cytokines is directly related to progression of tendinitis in a painful process after tendon rupture [17,18,19]. In contrast, IL-10 is known for its anti-inflammatory activity. IL-10 inhibits both the expression of the interleukins (IL-6; IL-8) and the migration of inflammatory cells at the lesion site including macrophages and monocytes [14,20]. TNF-α is a pleitropic cytokine related to cell survival and proliferation but also to cell death in the apoptotic process expressed by tenocytes in inflammatory conditions [21]. TNF-α may be the key cytokine in the origin of several musculoskeletal diseases such as Rheumatoid Arthritis, Osteoarthritis and tendinitis [19], however, its role in tendon disease has not been well determined. It is known.

(33) 31. that its expression is increased in tendons in traumatic situations or after surgery, wherein there is a harmful process [21,22]. Thus, treatment of tendinitis aims to reduce inflammation, because its persistence promotes alterations in collagen and an increase in specific activity of certain enzymes fibers, extending the inflammatory and proliferative phases, favoring the excess deposition of scar tissue, altering some characteristics as strength reduction compared to the original tendon [23,24]. The most common treatment is still conservative and recommended by most authors as the initial strategy. The NSAIDs are the drugs most commonly used as part of initial treatment, especially in reducing pain [25,26]. However there are a few scientific evidences to support its use [7,8,13,26,27]. In recent years, several studies have been performed in different situations, leading laser therapy to be considered as a promising alternative therapy for a numerous diseases, acting in the early stages of inflammation by inhibiting the onset chemotactic factors through altering the presence of pro- and anti-inflammatory mediators, modulating the inflammation [28,29,30,31]. From these studies, it was possible to understand part of the effect of therapy using a Low Level Laser in inflammatory reaction of cartilage in osteoarthritis and tendinitis of both rats and humans [9,24,26,28,32,33,34] However, it is important to note that very few studies addresses the molecular effects in gene expression over the lasers action in the inflammatory process, specially in tendons. This work aims to study the effect of low level laser 660nm, 100mW in acute inflammation of tendon, investigating changes in the expression of enzymes and inflammatory mediators such as COX-2, IL-6, IL-10 and TNF-α.. MATERIALS AND METHODS: All of the experimental procedures were submitted and approved by the Ethical Committee of the University of Sao Paulo. Thirty male Wistar rats weighing 250 + 20 g were randomly divided and housed five per cage before the experimental procedure. Food and water were provided ad libitum throughout the experiment. Rats were anesthetized with xylazine and ketamine injection (90mg/Kg and 10mg/Kg, respectively) before collagenase injection. All the necessary preoperative procedures.

(34) 32. were performed in order to prevent discomfort and to avoid any infection. Skin was surgically prepared and collagenase was injected in right leg (100 µg/tendon) percutaneously into the Achilles tendon, approximately 2 mm proximal to the osteotendinous junction under anesthesia using a 30 G needle. The same volume of PBS without collagenase was injected using the same procedure in a control group (C). Thirty minutes after collagenase injection, one group (called D) was treated using sodium diclofenac (Voltaren injectable® – Novartis 2.5 mg/kg) injected in the gluteus muscle. Two other groups were treated by laser 1 h after collagenase injection. A single LLLT was performed with an infrared laser unit (Thera Lase, DMC, Brazil). The laser unit emitted a continuous optical radiation under a wavelength of 660 nm, with a power of 100 mW in a mean spot size area of 0.028 Cm2. Laser irradiation was performed in skin contact at the site of collagenase injection with doses of 1 J and 3 J, corresponding to irradiation times of 10 s and 30 s, respectively. The laser energy doses were chosen according to previous studies [29]. The two groups were called L1J and L3J, for 1 and 3 J respectively. The last group (called TEN) was not subjected to any treatment of tendinitis. Six animals of each group were sacrificed with an overdose of xylazine and ketamine injection (270mg/Kg and 30mg/Kg, respectively), 2 h after tendinitis induction for biochemical analysis. After the removal of skin and connective tissue, Achilles tendons were dissected, frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 °C for further analysis. - RNA isolation and Real Time PCR analysis: At the Achilles tendons were dissected, frozen in liquid nitrogen, and stored at −80°C. Total RNA was isolated in the Trizol reagent, according to the manufacturer’s instruction. DNase I was employed to digest DNA to obtain RNA purification and the integrity of RNA was verified by agarose gel electrophoresis. Total RNA (2 μg) was used for first-strand cDNA synthesis (reverse transcriptase [RT]) using SuperScript II. In addition, RNaseOUT was also added to protect the RNA during this process. Three pooled RNA aliquots were routinely sham reverse transcribed (i.e. RT omitted) to insure the absence of DNA contaminants. Diluted RT samples (1:10) were submitted to real-time PCR amplification using Platinum Sybr QPCR Supermix-UDG and specific oligonucleotides for COX-2 (forward: AGATCAGAAGCGAGGACCTG; reverse: CCATCCTGGAAAAGTCGAAG), IL-6 (forward: TGACCCAACCACAAATGC; reverse: CGAGCTCTGAAACAAAGGAT), IL-10. (forward:. GCTTTCGAGACTGGAAGTGG). CATGGGTGTTGGGAAGAGAA; and. TNF-α. reverse: (forward:.

(35) 33. GGTGATCGGTCCCAACAAGGA; reverse: CACGCTGGCTCAGCCACT). Beta-actin was used as an internal control (forward: AAGATTTGGCACCACACTTTCTACA; reverse: CGGTGAGCAGCACAGGGT). The conditions for PCR were as follows: 50°C—2 min; 95°C—2 min, followed by 30 cycles of 95°C—15 s; 60°C—1 min and 72°C—15 s. Ct values were recorded for each gene, and the results of genes of interest were normalized to results obtained with the internal control gene. ddCT were calculated and the results are expressed as fold increase. All oligonucleotides and reagents utilized in this protocol were purchased from Invitrogen Co. - Statistical analysis: Data are expressed as mean and standard error (±) of the mean (SEM) and were analyzed using Student's t-test to evaluate the statistical significance of the null hypothesis vs CTL and/or TEN. All data were statistically evaluated by analysis of variance (ANOVA), followed by the Tukey test. Values with P < 0.05 were considered to be statistically significant.. RESULTS The figure 01 shows in the Panel A the COX-2 gene expression, 2 hours after induction of tendinitis . We can observe that the tendinitis ( NT ) as well as the other 3 groups presented a significant increase in COX-2 gene expression when compared to the control group after tendinitis induction (P < 0.001). However, none of the groups were significantly inhibited by diclofenac or Laser treatments. In Panel B we can observe the IL6 gene expression at 2 hours after induction of tendinitis. We could observe that there was an increase in gene expression of IL-6 in tendinitis untreated group (NT), (p<0,05) compared with the control group (C). Tendinitis groups treated with sodium diclofenac (D) and irradiated (1J) failed to reduce the IL-6 expression, when compared with the control group. However, the group irradiated with the energy of 3 Joules (3J) presented a significant inhibition of IL6 gene expression when compared to non-treated group. The figure 01 panel C shows the IL-10 gene expression, 2 hours after induction of tendinitis in Achilles tendons of rats. We can observe the increase of IL10 expression in all groups where the tendinitis was induced compared to control.

(36) 34. group. The group treated with sodium diclofenac (D) and the irradiated group (1J) showed increased expression of the same gene, when compared with (NT). The figure 01 panel D shows the TNF-α gene expression, two hours after tendinitis induction. We can observe that the (NT) group showed a significant increase in TNF-α gene expression when compared to the control group (C). It was also observed that both groups diclofenac and Laser 1J failed to reduce the expression of TNF-α. Only the group treated with laser irradiation at the energy of 3J was able to significantly reduce the TNF-α expression when compared to NT group (p <0.02). A. B 1500. 15. *** *. ** 5. IL6 /  -actin. 1000. ** 500. 0. *. C. 3J. 1J. D. T. C. 3J. 1J. D. T N. C. 0. N. COX-2/ß-actin. *** ***. 10. D 40. 40. ###. TNF- /  -actin. ***. 10. 30 ## 20. 10. 3J. 1J. D. C. 3J. 1J. D. T N. C. T. 0. 0. N. IL10 /  -actin. 30. 20. ***. ###. Figure 1. Gene expression of COX-2 (1A), IL-6 (1B), IL10 (1C) and TNF-α (1D) in Achilles tendons, 2 hours after collagenase-induced tendinitis. The protocol was divised in 5 groups denominated: C – Control group, NT – Non-treated group, D – Sodium diclofenac group, 1J and 3J – irradiated groups using 1J and 3J energy respectively. The values are represented mean, error bars are SDs. n = 6 animals per group. *p < 0.05 vs Control and #p < 0.05 vs Non-treated group..

(37) 35. DISCUSSION Low level laser therapy has been studied since the 60s being considered as a therapeutic alternative with good perspectives for use specially in musculo-skeletal and inflammatory disorders. In our study, we investigated the effects of low level laser therapy on important inflammatory mediators, involved in acute inflammation of the tendon. Recent studies have focused on the discovery of new therapies able to promote cytokines inhibition, such as IL-1β, TNF-α as well as metalloproteinases in tendon diseases. Thus, tendinitis appears as the target of concern, both in the sports medicine and labor. Here we employed the nonsteroidal anti-inflammatory drug Sodium Diclofenac as a pharmacological reference therapy to be compared to Laser irradiation in tendon inflammation induced by collagenase. The experimental model used was the tendinitis induced in Achilles tendon of rats by collagenase injection. This experimental model of tendon inflammation is well known in the study of tendinitis in which edema and acute destruction of the extracellular matrix are similar to those found in natural tendon injury, being considered an excellent model that allows to investigate molecular and histological changes [35]. The development of inflammation during the injury is a beneficial event that aims to restore tissue homeostasis. In this process the formation of chemical mediators with pro-inflammatory or anti-inflammatory action are produced from cyclooxygenase pathways that also increase in inflammatory processes. In tendinitis model, due to low vascularity or to transitions between tendinitis and tendinosis periods, this tissue has not always inflammatory infiltrate. However, COX-2 increase was observed in both cases which indicates in some extent, a tissue degeneration as a result of the inflammatory process [36]. Previous study from our group was the first to determine the time course of COX-2 gene expression, and the peak time after 2 hours of tendinitis induction [29]. From these data, we choose the period of 2 hours, the same used previously, to.

(38) 36. study the effects of Laser irradiation, this time operating in 660nm, in the experimental model of collagenase-induced rat tendinitis. In the present study it was observed that COX-2 gene expression increased in non-treated group (NT). In the same way, non-treated group presented significant increases in the other pro-inflammatory citokines, IL-6 and TNF-. The treated group with sodium diclofenac (D) also presented increase in COX2 and TNF- expression, similar to NT group and more IL-6 expression compare to NT. On the other hand, the irradiated groups, especially 3J showed a slight decrease in COX-2, IL-6 and TNF-, compared to NT. Cyclooxygenase-2 increased can directly interfere in the formation of specific inflammatory mediators, such as interleukins and tumor necrosis factor, by changing the tissue repair process. TNF-α is another factor that can modulate this process. Their levels are generally increased in the presence of musculoskeletal diseases like tendinitis and could be important in degenerative process of the tissue by inducing an increase in inflammatory cells [19]. Thus, the increase of TNF-α gene expression after tendinitis induced may represent an increase in the inflammatory process triggering other important inflammatory mediators, such as matrix metalloproteinases [37]. Changes in tendon repair can lead to scar formation with different characteristics of the original tissue. The scar initially provides the physical continuity of the tissue, but the proliferation of adjacent tissue can be undesirable and hinder the sliding mechanism tendon [14]. One way to reduce these changes would be control the healing process, modulating the inflammation by cytokines levels, involved in the repair, such as IL-6 , IL-10 and TNF-α , observed in this work and associated with disease progression. IL-10 for instance, sharing functional activities such as suppression of proinflammatory events by inhibition of inflammatory cytokines such as IL-1, IL-6, TNF-α and also inhibit some MMPs that could hamper tissue repair [15]. In this work, the expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-) were increased not only in the NT group, but also in diclofenac group (D) and even in the irradiated group (1J). Only the irradiated group (3J) was able to reduce.

(39) 37. expression of these pro-inflammatory cytokines. On the other hand, the expression of antiinflammatory cytokines (IL-10) was increased in all groups where tendinitis was induced, probably a natural action of the body to reduce inflammation, but in the treated groups D, 1J and 3J, this increase was even higher. Thus, the relationship between the amounts of IL-6 and IL-10 show a positive anti-inflammatory response, mainly in the irradiated group 3J. These results together suggest that in the non-treated group (NT) the inflammation remained high and probably the highest level of tissue injury, on account of increase of TNF-α to be associated with increased of matrix metalloproteinase enzymes. Previous results demonstrated that treatment with sodium diclofenac reduces prostaglandin E2 synthesis and NK1 neuropeptides expression, receptors likely to pain. However, our results showed that sodium diclofenac treatment failed to reduce the expression of citokines (IL6 and TNF-α). Diclofenac treatment failure may be related to dose and administration in rats or specific tendon characteristics that is poorly vascularized. The sum of these factors is a strong indication that low level laser therapy in 660nm - 100mW and 3 Joules can be effective in reducing the acute inflammatory process induced by collagenase in Achilles tendons of rats. However, further analysis are needed to determine this laser modulation operating in 660 nm on matrix metalloproteinases in tendon tissues during the inflammatory process. The investigation of biochemical factors as protein expression of inflammatory mediators, enzyme dosage and morphological and functional factors such as histological and mechanical properties analyzes are important to understanding of this inflammatory event and the action mechanism involved at cellular and structural changes in tendinitis..

(40) 38. CONCLUSION We can conclude that the model of tendinitis by collagenase-induced in rats increased the expression of important inflammatory mediators. Treatment with sodium diclofenac was not effective in reducing inflammatory mediators. The low level laser therapy (660nm - 100mW) at 3 Joules of energy was effective in reducing the inflammation in this model.. REFERENCES. 1 BARROS M, CÉSAR CLG, CARANDINA L, TORRE GD. Desigualdades sociais na prevalência das doenças crônicas no Brasil, PNAD 2003. Cienc Saúde Coletiva. 11: 911-926. 2006. 2 AITTOMAKI A, LAHELMA E, RAHKONEN O, LEINO-ARJAS AMN, OLSEN J. The contribution of musculoskeletal disorders and physical workload to socioeconomic inequalities in health. Eur J Public Health 2006; 2: 145-150. 3 NGUYEN TH, RANDOLPH DC. Nonspecific low back pain and return to work. Am Fam Physician. 10: 1497-502. 2007. 4 Kjaer M, Langberg H, Bojsen-Møller J, Koskinen SO, Mackey A, Heinemeier K,Holm L, Skovgaard D, Døssing S, Hansen M,Hansen P, Haraldsson B, Carøe I,Magnusson. SP.. Novel. methods. for. tendon. investigations.. Disabil. Rehabil.2008;30(20-22):1514-22. 5 BARBE MF, BARR AE. Inflammation and the pathophysiology of work-related musculoskeletal disorders. Brain Behav Immun. 5: 423-429. 2006. 6 JÓZSA, L.; KANNUS, P. Histopathological findings in spontaneous tendon ruptures. Scand. J. Med. Sci. Sports, v. 7, n. 2, p. 113-118, 1997. 7 KHAN, K. M.; COOK, J. L.; BONAR, F.; HARCOUT, P.; ASTROM, M. (1999). Hystopathology of common tendinopathies. Update and implications for clinical management. Sports Med., v. 27, n. 6, p. 393-408, 1999..

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(42) 40. 17 FU SC, WANG W, PAU HM ET AL. Increased expression of transforming growth factor-beta1 in patellar tendinosis. Clin Orthop Relat Res. 400:174-83. 2002. 18 NAKAMA K, GOTOH M, YAMADA T et al. Interleukin-6-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 in ruptured rotator cuff tendon. 19 HAYER, S.; REDLICH, K.; KORB, A.; HERMANN, S.; SMOLEN, J.; SCHETT, G. Tenosynovitis and osteoclast formation as the initial preclinical changes in a murine model of inflammatory arthritis. Arthritis Rheum., v. 56, n.1, p. 79-88, 2007. 20 ALAM, R.; KUMAR, D.; ANDERSON-WALTERS, D.; FORSYTHE, P. A. Macrophage inflammatory protein-1 alpha and monocyte chemoattractant peptide-1 elicit immediate and late cutaneous reactions and activate murine mast cells in vivo. J. Immunol., v. 2, p. 1298-1303, 1994. 21 HOSAKA, Y.; KIRISAWA, R.; UEDA, H.; YAMAGUCHI, M.; TAKEHANA, K. Differences in tumor necrosis factor (TNF)alpha and TNF receptor-1-mediated intracellular signaling factors in normal, inflamed and scar-formed horse tendons. J. Vet. Med. Sci., v. 67, n. 10, p. 985-991, 2005. 22 AKESEN, B.; DEMIRAG, B.; BUDAK, F. Evaluation of intra-articular collagenase, TIMP-1, and TNF-αlpha levels before and after anterior cruciate ligament reconstruction. Acta Orthop. Traumatol. Turc., v. 43, n. 3, p. 214-218, 2009. 23 FERNANDES, M. A. L.; ALVES, G. E. S.; SOUZA, J. C. A. Efeito do ultra-som terapêutico em tendinite experimental de eqüinos: estudo clínico, ultra-sonográfico e histopatológico de dois protocolos. Arq. B. Med. Vet. Zoot., v. 55, n. 1, p. 27-34, 2003. 24 ALVES AC, ALBERTINI R, DOS SANTOS SA, LEAL-JUNIOR EC, SANTANA E, SERRA AJ, SILVA JA JR, DE CARVALHO PD. Effect of low-level laser therapy on metalloproteinase MMP-2 and MMP-9 production and percentage of collagen types I and III in a papain cartilage injury model. Lasers Med Sci. 29. 2013. 25 ALFREDSON, H.; OHBERG, L.; FORSGREN, S. Is vasculo-neural ingrowth the cause of pain in chronic Achilles tendinosis? An investigation using ultrasonography.

(43) 41. and colour Doppler, immunohistochemistry, and diagnostic injections. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc., v. 11, n. 5, p. 334-338, 2003. 26 ANDRES, B. M.; MURRELL, G. A. Treatment of tendinopathy: what works, what does not, and what is on the horizon. Clin. Orthop. Relat. Res., v. 466, n. 7, p. 15391554, 2008. 27 BJORDAL, J. M.; KLOVNING, A.; LOPES-MARTINS, R. A.; ROLAND, P. D.; JOENSEN, J.; SLØRDAL, L. Overviews and systematic reviews on low back pain. Ann. Intern. Med., v. 10 n. 148, p. 789-790, 2008. 28 BJORDAL JM, LOPES-MARTINS RA. Lack of adherence to the laser dosage recommendations from the World Association for Laser Therapy in Achilles study. Arch Phys Med Rehabil. 94(2), 408. 2013. 29 MARCOS RL, LEAL JUNIOR EC, et al. Infrared (810 nm) low-level laser therapy in rat achilles tendinitis: a consistent alternative to drugs. Photochem Photobiol. 87(6):1447-52. 2011. 30 ALFREDO PP, BJORDAL JM, DREYER SH, MENESES SR, ZAGUETTI G, OVANESSIAN V, FUKUDA TY, JUNIOR WS, LOPES MARTINS RÁ, CASAROTTO RA, MARQUES AP. Efficacy of low level laser therapy associated with exercises in knee osteoarthritis: a randomized double-blind study. Clin Rehabil. 26(6), 523-33. 2012. 31 DE ALMEIDA P, TOMAZONI SS, FRIGO L, DE CARVALHO PD, VANIN AA, SANTOS LA, ALBUQUERQUE-PONTES GM, DE MARCHI T, TAIROVA O, MARCOS RL, LOPES-MARTINS RA, LEAL-JUNIOR EC. What is the best treatment to decrease pro-inflammatory cytokine release in acute skeletal muscle injury induced by trauma in rats: low-level laser therapy, diclofenac, or cryotherapy? Lasers Med Sci. 30. 2013 32 FRIGO, L.; LUPPI, J. S.; FAVERO, G. M.; PENNA, S. C.; BJORDAL, J. M.; BENSADOUN, R. J.; LOPES-MARTINS, R. A. The effect of low-level laser irradiation (In-Ga-Al-AsP - 660 nm) on melanoma in vitro and in vivo. BMC Cancer, v. 20, n. 9, p. 404, 2009..

(44) 42. 33 CHOW, R. T.; JOHNSON, M. I.; LOPES-MARTINS, R. A.; BJORDAL, J. M. Efficacy of low-level laser therapy in the management of neck pain: a systematic review and meta-analysis of randomised placebo or active-treatment controlled trials. Lancet, v. 374, n. 9705, p. 1897-1908, 2009. 34 CASALECHI HL, DE FARIAS MARQUES AC, DA SILVA EA, AIMBIRE F, MARCOS RL, LOPES-MARTINS RA, DE CARVALHO PD, ALBERTINI R. Analysis of the effect of phototherapy in model with traumatic Achilles tendon injury in rats. Lasers Med Sci. Nov 2. 2013. 35 WARDEN, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br. J. Sports Med., v.41, n.4, p. 232-240, 2007. 36 QUEIROZ-JUNIOR, C. M.; PACHECO, C. M. F.; MALTOS, K. L. M.; CALIARI, M. V.; DUARTE, I. D. G; FRANCISCHI, J. N. Role of systemic and local administration of selective inhibitors of cyclo-oxygenase 1 and 2 in an experimental model of periodontal disease in rats. J. Periodontal Res., v. 44, n. 2, p. 153-160, 2009. 37 DEMOS, M.; JOOSTEN, L. A.; OPPERS-WALGREEN, B.; VAN SCHIE, J. T.; JAHR, H.; VAN OSCH, G. J.; VERHAAR, J. A. Tendon degeneration is not mediated by regulation of Toll-like receptors 2 and 4 in human tenocytes. J. Orthop. Res., v. 27 , p. 1043-1047, 2009..

(45) 43. 5 CONSIDERAÇÔES FINAIS. O modelo de tendinite induzida por colagenase em ratos aumentou a expressão de importantes mediadores inflamatórios relacionados também com a degradação de colágeno. O tratamento com diclofenaco de sódio não foi eficaz na redução de mediadores inflamatórios. O laser de baixa potência (660nm – 110mW) na energia de 3 Joules foi eficaz na redução do processo inflamatório neste modelo de tendinite.. Figura 5: Tabela dos resultados; os valores do grupo NT foram comparados com o grupo C, e os grupos tratados com D, 1J e 3J, com valores comparados com o grupo NT..

(46) 44. 6 REFERÊNCIAS. ALFREDO PP, BJORDAL JM, DREYER SH, MENESES SR, ZAGUETTI G, OVANESSIAN V, FUKUDA TY, JUNIOR WS, LOPES MARTINS RÁ, CASAROTTO RA, MARQUES AP. Efficacy of low level laser therapy associated with exercises in knee osteoarthritis: a randomized double-blind study. Clin Rehabil. 26(6), 523-33. 2012. ALFREDSON, H.; LORENTZON, R. Chronic Achilles tendinosis. Recommendations for treatment and prevention. Sports Med., v. 29, n. 2, p. 135-146, 2000. ALFREDSON, H.; OHBERG, L.; FORSGREN, S. Is vasculo-neural ingrowth the cause of pain in chronic Achilles tendinosis? An investigation using ultrasonography and colour Doppler, immunohistochemistry, and diagnostic injections. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc., v. 11, n. 5, p. 334-338, 2003. ALVES AC, ALBERTINI R, DOS SANTOS SA, LEAL-JUNIOR EC, SANTANA E, SERRA AJ, SILVA JA JR, DE CARVALHO PD. Effect of low-level laser therapy on metalloproteinase MMP-2 and MMP-9 production and percentage of collagen types I and III in a papain cartilage injury model. Lasers Med Sci. 29. 2013. ALAM, R.; KUMAR, D.; ANDERSON-WALTERS, D.; FORSYTHE, P. A. Macrophage inflammatory protein-1 alpha and monocyte chemoattractant peptide-1 elicit immediate and late cutaneous reactions and activate murine mast cells in vivo. J. Immunol., v. 2, p. 1298-1303, 1994. ANDRES, B. M.; MURRELL, G. A. Treatment of tendinopathy: what works, what does not, and what is on the horizon. Clin. Orthop. Relat. Res., v. 466, n. 7, p. 15391554, 2008. AITTOMAKI A, LAHELMA E, RAHKONEN O, LEINO-ARJAS AMN, OLSEN J. The contribution of musculoskeletal disorders and physical workload to socioeconomic inequalities in health. Eur J Public Health 2006; 2: 145-150. AKESEN, B.; DEMIRAG, B.; BUDAK, F. Evaluation of intra-articular collagenase, TIMP-1, and TNF-αlpha levels before and after anterior cruciate ligament reconstruction. Acta Orthop. Traumatol. Turc., v. 43, n. 3, p. 214-218, 2009. ARVIDSSON S, ARVIDSSON B, FRIDLUND B, BERGMAN S. Health predicting factors in a general population over an eight-year pe riod in subjects with and without chronic musculoskeletal pain. Health Qual Life Outcomes. 6: 98. 2008. ASTROM, M. On the Nat. and etiology of chronic achilles tendinopathy. Ph. D. Thesis - Lund University, 1997..