Lívia Mara Vitorino da Silva
Caracterização Epidemiológica e Molecular de Staphylococcus Coagulase Negativa Resistentes aos Beta-Lactâmicos Isolados de Leite de Vacas com Mastite Subclínica
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Produção Animal do Instituto de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Produção Animal.
Área de Concentração: Produção animal. Orientador: Prof (a) Anna Christina de Almeida Co-orientador (es): Prof (a) Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira Xavier
Prof. Mauro Aparecido de Sousa Xavier
MONTES CLAROS 2018
ELABORADA PELA BIBLIOTECA UNIVERSITÁRIA DO ICA/UFMG Josiel Machado Santos / CRB-6/2577
S586c 2018
Da Silva, Lívia Mara Vitorino.
Caracterização Epidemiológica e Molecular de Staphylococcus Coagulase Negativa Resistentes aos Beta-Lactâmicos Isolados de Leite de Vacas com Mastite Subclínica / Lívia Mara Vitorino da Silva. Montes Claros, 2018.
48 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Área de concentração em Produção Animal, Universidade Federal de Minas Gerais / Instituto de Ciências Agrárias.
Orientador(a): Profa Anna Christina de Almeida
Banca examinadora: Profa Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira Xavier, Dra Carolina Magalhães Caires Carvalho, Prof Mauro Aparecido de Sousa Xavier, Prof Otaviano Souza Pires Neto
Inclui referências: f. 24-28, 50-54.
1. Laticínios -- microbiologia. 2. Epidemiologia veterinária. 3. Mastite. 4. Antibióticos beta lactâmicos. 5. Infecções estafilococicas. I. Almeida, Anna Christina (Orientador). II. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Agrárias. III. Titulo.
Lívia Mara Vitorino da Silva
Caracterização Epidemiológica e Molecular de Cepas de Staphylococcus Coagulase Negativa Resistentes aos Beta-Lactâmicos Isolados em Leite Bovino do Norte de Minas Gerais
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Produção Animal do Instituto de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Produção Animal.
Área de Concentração: Produção animal.
Linha de Pesquisa: Manejo sanitário da produção animal sustentável
Orientador: Prof (a) Anna Christina de Almeida Instituto de Ciências Agrárias da UFMG
Aprovado pela banca examinadora constituída pelos professores:
Dra. Carolina Magalhães Caires Carvalho (UFMG)
Prof. Otaviano Souza Pires Neto (FUNORTE)
Profa. Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira Xavier (Unimontes) - Coorientador
Prof. Mauro Aparecido de Sousa Xavier (Unimontes)
Coorientador
________________________________________________________
Orientadora Prof (a) Anna Christina de Almeida (UFMG)
Dedico este trabalho a minha mãe Zenilda, meus irmãos e aos meus sobrinhos.
Agradecimento
Agradeço primeiramente à Deus, por sempre está presente na minha essência, principalmente nos momentos de fraqueza e por ter me guiado por estes anos, comprovando que o conhecimento é a melhor arma para combater uma mente que por muitas vezes foi desviada pelo comodismo.
A minha amada mãe Zenilda, por sempre me apoiar e mesmo nas cobranças, nunca deixou de acreditar no meu potencial e sempre me demonstrando firmeza para concluir os meus objetivos, deixando que as influências negativas mesmo que aparentemente agradáveis não exercesse o papel mais primordial na minha vida.
Aos meus irmãos, Leandro e Lyza por sempre me incentivarem, pelos melhores conselhos e pelo carinho que só os irmãos sabem transmitir, os meus sobrinhos Thales e Lara, pelas brincadeiras, risadas e doçura.
Os meus amigos de Belo Horizonte, Julien, Mariana, Gina que estão comigo a muitos anos e nunca deixou a amizade cair no ostracismo, tornando minhas vindas a BH neste período de estudos em encontros maravilhosos e inesquecíveis.
Aos amigos que conquistei em Montes Claros, como o Rody, que desde a minha chegada a cidade firmamos uma amizade. Foi através do seu projeto que cresci como profissional e nas nossas conversas, a todo momento disse que seria capaz, devo essa conquista a você.
O Idael, que desde o primeiro dia de aula foi meu amigo e desde então me ajudou em todos os sentidos e que mesmo distante, nossa amizade permanece forte. Obrigada por tudo e sempre poderá contar comigo onde quer que estejamos. Torço muito pelo seu sucesso e sei que ele virá, pois, é merecedor.
A minha Professora e orientadora Anna Christina, que desde 2014 me orientou com dedicação exclusiva, estimulando em todos os momentos, desde o resumo simples até o mestrado. Obrigada pelos conselhos, pelo companheirismo, profissionalismo e pela seriedade.
Aos meus co-orientadores e Professores Alessandra e Mauro, que sempre se disponibilizaram para que este trabalho se realizasse. Obrigada pelas aulas de Biologia Molecular que é o ponto mais importante para o compreendimento desta pesquisa, pela disponibilidade de trabalharmos no Laboratório de Microbiologia da Unimontes e pelo encorajamento.
A equipe do Laboratório de Sanidade Animal do Centro de Pesquisas Agrárias, que me ajudaram desde de 2016 pela concretização da minha formação.
Aos colegas do grupo SANILEITE, pelas viagens, parceria e profissionalismo dos meninos da extensão, Paulo Henrique, Lucas e Flávio, obrigada pela dedicação em levar os trabalhos para vários locais de Minas Gerais e demais estados.
Os meus colegas de sala em especial Stephanie, Gabriel e Luís, pela companhia, conversas engraçadas e pela amizade.
A CAPES pelo apoio através da bolsa, que proporcionou minha estádia em Montes Claros e auxílio no experimento.
E por fim, a UFMG campus Montes Claros por ter me acolhido e principalmente a todos os Professores que lecionaram me tornando uma profissional em Zootecnia.
‘’Amor de mãe é a mais elevada forma de altruísmo’’. Machado de Assis
RESUMO
O grupo de Staphylococcus coagulase negativo tornou-se um dos principais agentes patogênicos causadores de mastite subclínica em bovinos leiteiros. Objetivou-se identificar espécies de Staphylococcus coagulase negativo isolados de leite contaminado por mastite subclínica pela técnica MALDI-TOF MS, avaliar a resistência a antimicrobianos beta lactâmicos e rastrear a presença dos genes blaOXA-23 e blaKPC pela reação de polimerase em cadeia (PCR). Cento e onze isolados identificados como cocos Gram positivos provenientes da bacterioteca da UFMG foram analisadas neste estudo. Os isolados foram submetidos a análise para identificação através MALDI-TOF MS. As cepas identificadas foram avaliadas quanto a suscepitibilidade aos antibióticos cefoxitina (30µg), oxacilina (1µg), vancomicina (30µg), meropenem (10µg), imepenem (10µg) e subactam-ampicilina (10µg) pela técnica de difusão de disco e calculou-se o índice de multirresistência das espécies. Cepas resistentes fenotipicamente ao antimicrobiano meropenem, foram analisados genotipicamente quanto a presença dos genes de resistência blaOXA-23 e blaKPC. Através de teste Qui quadrado avaliou- se a frequência de espécies do grupo Staphylococcus coagulase negativo, de resistência aos beta-lactâmicos, bem como o índice de multirresistência. Através da técnica MALDI-TOF MS o gênero mais encontrado com 56,8% e o grupo Staphylococcus coagulase negativo apresentou frequência de 27%. As espécies Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus chromogenes obtiveram maior prevalência nos rebanhos com 35,8% respectivamente. Em Janaúba a propriedade Nova Prima, o valor médio do índice de multirresistência encontrado foi de 0,6, as demais propriedades e munícipios foram de 0,5. Nos rebanhos de bovinos leiteiros a resistência antimicrobiana foi para as bases cefoxitina (100%), oxacilina (100%), meropenem (100%) e vancominicina (100%). Os genes de resistência blaOXA-23 e blaKPC não foram rastreados nas espécies Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus auriculares e Staphylococcus haemolyticus. Outros mecanismos de resistência estão presentes nas cepas causando ineficiência no tratamento antimicrobiano nos rebanhos, comprometendo o bem-estar dos animais e saúde pública.
Palavras-chaves: genes de resistência. multirresistência antimicrobiana. produtos de origem animal.
ABSTRACT
The coagulase-negative Staphylococcus group has become one of the main pathogens causing subclinical mastitis in dairy cattle. The objective of this study was to identify species of coagulase negative Staphylococcus isolated from milk contaminated by subclinical mastitis using the MALDI-TOF MS technique, to evaluate the resistance to beta lactam antimicrobials and to trace the presence of blaOXA-23 and blaKPC genes by polymerase chain reaction (PCR). One hundred and eleven isolates identified as Gram-positive cocci from the UFMG library were analyzed in this study. The isolates were submitted to analysis for identification through MALDI-TOF MS. The strains identified were evaluated for susceptibility to antibiotics cefoxitin (30 μg), oxacillin (1 μg), vancomycin (30 μg), meropenem (10 μg), imepenem (10 μg) and subactam-ampicillin (10 μg) the species multiresistance index was used. Strains phenotypically resistant to the antimicrobial meropenem were analyzed genotypically for the presence of the resistance genes blaOXA-23 and blaKPC. The frequency of species of the coagulase-negative Staphylococcus coagulase group, resistance to beta-lactams, as well as the multidrug resistance index were evaluated by Chi-square test. Using the MALDI-TOF MS technique, the most common genotype was 56.8% and the coagulase-negative Staphylococcus group had a frequency of 27%. The species Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus chromogenes had a higher prevalence in the herds with 35.8%, respectively. In Janaúba Nova Prima property, the mean value of the multiresistance index found was 0.6, the other properties and municipalities were 0.5. Cefoxitin (100%), oxacillin (100%), meropenem (100%) and vancomycin (100%) were the antimicrobial resistance in the herds of dairy cattle. The blaOXA-23 and blaKPC resistance genes were not screened in the species Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus auriculares and Staphylococcus haemolyticus. Other mechanisms of resistance are present in the strains causing inefficiency in the antimicrobial treatment in the herds, compromising the well-being of the animals and public health.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES- ARTIGO
Quadro 1- Sequência dos oligonucleotídeos, genes alvo, tamanhos dos fragmentos amplificados (amplicons em pares de bases- pb) e referências que foram utilizados nas análises moleculares ... 36
Quadro 2- Caracterização fenotípica de resistência a antibióticos, bioquímica,coloração de Gram, análise de perfil proteômico e genômico de dezessete cepas Staphylococcus cogulase negativa isolados de leite de vacas com mastite subclínica em rebanhos do Norte de Minas Gerais... 38
Gráfico 1- Frequência de espécies de Staphylococcus spp multirresistentes identificados pelo MALDI- TOF MS em vacas com mastite subclínica ... 39
Gráfico 2- Frequência de espécies de SCN em cada propriedade do Norte de Minas Gerais... 41
Gráfico 3- Frequência de SCN em cada município do Norte de Minas Gerais... 41
Figura 1- Resultado da Extração do DNA em cepas de
SCN... 47
Figura 2- Análise de PCR com os iniciadores do gene 16S rDNA bacteriano universal... 47
LISTA DE ILUSTRAÇÕES- REVISÃO
Figura 1- Staphylococcus spp pela coloração de Gram visualizado em microscopia óptica... 17
Figura 2- Princípios da tecnologia de espectrometria de massas por ionização/dessorção de matriz assistida por laser por tempo de voo (MALDI-TOF MS)...23
LISTA DE TABELAS- ARTIGO
Tabela 1- Perfil de resistência e multirresistência das espécies do grupo de Staphylococcus coagulase negativo frente ao beta lactâmicos isolados de leite bovino nos municípios de propriedades do Norte de Minas Gerais...43
LISTA DE TABELAS- REVISÃO
Tabela 1- Espécies de SCN isolados de bovinos leiteiros com mastite clínica e subclínica... 18
Tabela 2- Multirresistência de espécies de Staphylococcus coagulase negativo ao beta lactâmicos em rebanhos de bovinos leiteiros e ambiente de produção animal... 20
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 14 2 OBJETIVOS... 15 2.1 Objetivo Geral... 15 2.2 Objetivos Especifícos... 15 3 REVISÃO DE LITERATURA... 16 3.1 Mastite subclínica... 16
3.1.2 Staphylococcus coagulase negativo... 17
3.1.3 Resistência aos antimicrobianos beta lactâmicos no grupo de Staphylococcus coagulase negativo em animais de produção e humanos... 19
3.1.4 Staphylococcus coagulase negativo resistentes aos carbapenêmicos... 21
3.1.5 MALDI-TOF MS... 22
3.4 REFERÊNCIAS... 24
4 ARTIGO... 29
4.1 Artigo1- Caracterização genotípica de espécies de Staphylococcus coagulase negativos provenientes de leite bovino encontrados em propriedades e municípios do Norte de Minas Gerais... 29
1 INTRODUÇÃO
Staphylococcus é um grupo heterogêneo composto por 52 espécies e 28 subespécies descritas (http://www.bacterio.net/staphylococcus.html).Aheterogeneidade evidente no gênero Staphylococcus levou a uma classificação baseada em procedimentos de diagnóstico com a caracteristica de produção de coagulase, facilitando a abordagem clínica ao diferenciar entre espécies patogênicas S. aureus e um grupo denominado Staphylococcus coagulase negativa (SCN) (BECKER, et al. 2014).
O grupo SCN, até o final da década de 80 era considerado um agente oportunista, de menor impacto. BECKER, et al. (2014) e VANDERHAEGHEN et al., (2015) apresentam um compilado de dados publicados com abordagem de aspectos epidemiológicos e taxonômicos evidenciando a importância do grupo como patógeno para saúde humana e animal.
A variedade de espécies desse grupo dificulta a identificação por técnicas microbiológicas convencionais, que envolvem etapas onerosas e tempo considerado longo para a confirmação dos resultados. A técnica MALDI -TOF MS, desenvolvida no final dos anos oitenta, tem sido empregado por obter níveis elevados de confiabilidade e agilidade na identificação de microrganismos, (BIER et al., 2017 e CROXATTO; PROD’HOM; GREUB, 2012), incluindo a identificação de SCN em leite mastítico (HUBER et al., 2011; TOMAZI et al., 2014; NYMAN et al., 2017).
Outro agravante observado nas infecçãoes por SCN é a multirresistência aos antimicrobianos, em especial ao grupo do beta lactâmicos, largamente utilizados no tratamento de infecções da glândula mamária em animais de produção (IBRAHIM et al., 2015) e como patógeno nosocomial, restringindo a cura de patologias no âmbito hospitalar (HASHMI et al., 2016; e WOERTHER et al., 2018).
Métodos terapêuticos, realizados com antibioticoterapia, colaboraram com redução de doenças na área da veterinária e humana, no entanto, a multirresistência das bactérias levaram a proposição de novas moléculas como os carbapenêmicos que já estão apresentando multirresistência e comprometendo o tratamento das infecções (PAPHITOU, 2013 e WOERTHER et al., 2018).
Mediante a presença de Staphylococcus coagulase negativo em leite de vacas com mastite subclínica, objetivou se identificar as espécies prevalentes utilizando a técnica MALDI-TOF MS, avaliar a resistência fenotípica aos beta-lactâmicos e averiguar a presença os genes blaOXA-23 e blaKPC, que codificam resistência aos carbapenêmicos em leite de vacas com mastite subclínica.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Caracterizar a participação de Staphylococcus coagulase negativo na etiologia da mastite bovina subclínica, a resistência fenotípica aos antimicrobianos beta-lactâmicos e verificar a presença de genes relacionados com a resistência aos carbapenêmicos.
2.2 Objetivos Específicos
- Identificar espécies Staphlylococcus coagulase negativo presentes em rebanhos com mastite subclinica pela técnica de MALDI-TOF MS.
- Caracterizar fenotipicamente a resistência dos isolados a antimicrobianos do grupo beta- lactâmico.
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Mastite subclínica
A mastite é uma doença que acomete os animais leiteiros, principalmente os bovinos e economicamente causa muitos prejuízos aos produtores de leite. A inflamação da glândula mamária resulta em redução da produção de leite, perdas na quantidade e qualidade do leite, abate prematuro, custos no tratamento e na mão de obra (KRISHNAMOORTHY et al., 2017; HOGEVEN et al., 2011).
Estes danos dependem da gravidade da inflamação e ela pode ser classificada em forma subclínica, clínica e crônica, e o seu grau é dependente da natureza do patógeno causador, da idade, raça, saúde imunológica e o estado de lactação do animal. Dentre estas citadas, a mastite subclínica é a mais difícil e acometidas nos rebanhos leiteiros, pois é devido à ausência de qualquer indício visível, no momento da ordenha, como grumos no leite causando altos custos no tratamento (BANSAL e GUPTA, 2009).
Com isso, a mastite subclínica é 15 a 40 vezes mais prevalente que a mastite clínica. É importante enfatizar que os efeitos que os animais afetados por este tipo de inflamação, continuam sendo uma fonte contínua de infecção para as vacas sadias no momento da ordenha (FAO, 2014).
O processo de infecção da glândula mamária é iniciado quando microrganismos patogênicos invadem o esfíncter do teto e multiplicam-se no interior dos tecidos mamários. Após a invasão ocorre uma intensa migração de leucócitos do sangue para o leite, com o objetivo de eliminar o agente infeccioso e alterações da permeabilidade vascular e outros sinais da inflamação (SANTOS; FONSECA, 2007).
Desse modo, a maior parte dos casos de mastite subclínica em bovinos é de etiologia bacteriana e são causadas por cinco bactérias em sua maioria, cujo as espécies mais isoladas são a Escherichia coli, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgolatiae e Streptococcus agalacitae. (BRADLEY, 2002; VERMA et al., 2018).
Além destas bactérias, outros agentes infecciosos como Staphylococcus coagulase negativo estão comumente isolados em amostras de leite bovino (IBRAHIM et al., 2015; MAHATO et al., 2017).
Em várias pesquisas realizadas em diversos países, inclusive o Brasil, a mastite subclínica é a mais prevalente em rebanhos leiteiros. Em estudo realizado por Dieser et al., (2014) 2296 vacas leiteiras em 51 rebanhos, 54% dos animais foram diagnosticados com mastite subclínica.
17
Do mesmo modo, 387 vacas leiteiras no Noroeste da Polônia, foram diagnosticadas com mastite subclínica, totalizando 36,7% do rebanho avaliado (SZATACHARÍSKA et al., 2016).
E no Brasil, a prevalência de mastite subclínica foram avaliadas em diferentes regiões, no Sudeste a inflamação da glândula mamária na forma subclínica variou de 10 a 48,64% e no Nordeste de 14,49% a 30,7% (COSTA et al., 2012; RIBEIRO et al., 2009; NEVES et al., 2010; BIANCHINI et al., 2010).
3.1.2 Staphylococcus coagulase negativo
Os estafilococos são bactérias Gram positivas, esféricas, que formam agrupamentos irregulares como cachos de uva (Figura 1) no qual, o gênero Staphylococcus spp tem alta prevalência em casos de mastite clínica e subclínica em bovinos, sendo o grupo de Staphylococcus coagulase negativo (SCN) microrganismos comensais (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012; ISAAC et al., 2017).
Figura 1- Staphylococcus spp pela coloração de Gram visualizado em microscopia óptica
Fonte: autora (2018)
O gênero Staphylococcus spp consiste em 52 espécies, destes, 38 foram classificados como coagulase negativo, responsáveis por diversas infecções e intoxicações em seres humanos e animais (BECKER; HEILMANN; PETERS, 2014; DIEDRICH et al., 2013).
Nos rebanhos bovinos leiteiros de vários países, incluindo o Brasil, foram isoladas várias espécies do grupo de Staphylococcus coagulase negativo (Tabela 1).
Tabela 1- Espécies de SCN isolados de leite de vacas com mastite clínica e subclínica Espécies de SCN Referências
Staphylococcus xylosus Harrison et al., 2013 e Mello et al., 2017
Staphylococcus saprophyticus Mello et al., 2017 e Srednik et al., 2017
Staphylococcus epidermidis Sampimon et al., 2011 e Mello et al., 2017
Staphylococcus chromogenes
Staphylococcus haemolyticus Mello et al., 2017
Staphylococcus simulans
Staphylococcus warneri
Fonte adaptada pela autora (2018)
Além da ocorrência em bovinos, estudos relatam a contaminação por SCN em derivados lácteos e produtos cárneos, além de infecções intramamárias em rebanhos caprinos e ovinos (BECKER; HEILMANN; PETERS, 2014; CHAJE-CKAWIERZCHOWSKA, 2015; FIJALKOWKI; PLEITER; KARAKULSKA, 2016; IBRAHIM et al., 2015), além dos já citados em bovinos.
Em seres humanos, SCN são encontrados na microbiota normal da pele, entretanto, esse grupo está cada vez mais relacionado com infecções graves como bacteremia, endocardite, implantações de próteses e cateteres intravasculares (TUFARIELLO e LOWY, 2017; ZHU et al., 2012).
Isso significa que, a maioria dos casos de infecções hospitalares e os encontrados em isolados de pacientes com diversas doenças infecciosas são: Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus lugdumensis, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus sciuri (HASHMI et al., 2016; HITZENBCHER et al., 2016; MARÍN et al., 2017).
19
Além destas citadas, outras espécies de Staphylococcus coagulase negativo foram isolados de amostras clínicas humanas como, Staphylococcus jettensis, Saphylococcus massilensis, Staphylococcus petrasii e Staphylococcus pettenkoferi (DE BEL et al., 2013; AL MASSALMA; RAOULT; ROUX, 2010; PANTŮČEK et al., 2013; TRÜLZSCH et al., 2007).
3.1.3 Resistência aos antimicrobianos beta lactâmicos no grupo de Staphylococcus coagulase negativo em animais de produção e humanos
Antimicrobianos são largamente utilizados como promotores de crescimento e no combate a infecções intramamárias, causadas por microrganismos patogênicos, principalmente por Staphylococcus spp, que possuí versatilidade no desenvolvimento de resistência aos antimicrobianos (KESERU et al., 2013; LANDERS et al., 2013).
Métodos terapêuticos, realizados com uso dos antibióticos, colaborou para a transformação da prática médica e veterinária de um diagnóstico e resolução eficaz na cura de diversas enfermidades. Porém, poucos anos após o advento dos antimicrobianos, a resistência reduziu drasticamente a eficiência desta abordagem de terapia (PAPHITOU, 2013).
Diante deste problema, os beta lactâmicos se tornaram de certa maneira ineficazes no tratamento de infecções da glândula mamária ocasionadas por bactérias estafilocócicas em bovinos leiteiros, devido ao uso imprudente desta classe de antibióticos, colocando o Brasil como um dos três países com maior utilização de antimicrobianos na produção animal (PRIBUL et al., 2011; VAN BOECKEL et al., 2015).
Com isso, estudos foram realizados com espécies do grupo de Staphyococcus coagulase negativo para ratificar a multirresistência em rebanhos leiteiros e propriedades rurais em diversos países (Tabela 2)
em rebanhos leiteiros e ambiente de produção animal.
*Frequencia de resistência apresentada na sequência citada para as bases utilizadas.
**Antibióticos: PEN (penicilina); TET (tetraciclina); OXA (oxacilina); TMP-SMX (trimethoprim-sulfamethoxalaze); GENT (gentamicina); FUS (ácido - fúsidico); CLI (clindamicina); ERI (eritromicina). Sequen
Fonte adaptada pela autora (2018)
Staphylococcus coagulase negativos, são considerados patógenos emergentes e oportunistas, sendo os derivados lácteos os principais alvos de contaminação e intoxicações alimentares causando riscos aos consumidores, devido à alta prevalência no leite bovino (IBRAHIM et al., 2015; TREMBLAY et al., 2013; CHAJE CKAWIERZCHOWSKA, 2015).
Na área da saúde humana espécies de Staphylococcus coagulase negativo, possuí potencial de proliferar em biomateriais e o uso contínuo de antibióticos em centros cirúrgicos e pós-operatórios, tornou esses microrganismos multirresistentes. A vancomicina por exemplo, é um antimicrobiano beta lactâmico, que após trinta anos foram isolados os primeiros casos clínicos com suscetibilidade reduzida, como foi descrito em cepas de Staphylococcus epidermidis (CANDIDO; BERNARDI, 2016; HASHMI et al., 2016; PIETTE, 2009; SUJATHA; PRAHARAJ, 2012).
Espécies
de SCN
Frequência de resistência (%)
Bases antimicrobianas Referências País
S.lugdumensis S.hominis S.epidermidis S.xylosus S.intermedius 100 100 66,6 42,8 27,2
TET El-Razik et al., 2017 Egito
S.epidermiis S. chromogenes S. haemolyticus S. simulans 74,1; 27; 17; 11; 36 14; 19; 5 24; 10 15; 2; 6
PEN; OXA; ERI; TMP-SMX; TET
PEN; OXA; TMP-SMX PEN; OXA OXA; GENT; TMP-SMX
Taponen et al., 2016 Finlândia
S. sciuri 98; 85; 50; 75; 99; 76
FUS; TET; ERI; CLI; OXA; PEN
Schoenfelder et al.,
2017 Alemanha
21
Além dos centros cirúrgicos e pós-operatórios, a multirresistência antimicrobiana das espécies de SCN estão presentes nas infecções perioprotéticas, que são complicações raras em cirurgia de prótese e as espécies, cujo apresentaram maior de resistência aos antibióticos beta lactâmicos avaliados em 19-40% das infecções foram a penicilina, eritromicina, gentamicina e ofloxacina (LOURTET-HASCOËT et al., 2018).
3.1.4 Staphylococcus coagulase negativo resistentes aos carbapenêmicos
Outra categoria de antibióticos classificados como beta lactâmicos, são os carbapenêmicos, agentes terapêuticos para infecções graves. Porém, a incidência de multirresistência dos microrganismos patogênicos a esses antimicrobianos está em ascensão devido aos mecanismos que as bactérias desenvolveram e disseminam em ambientes hospitalares, restringindo o tratamento eficiente ocasionando pandemias no mundo inteiro (VERWASET, 2000 e WOERTHER et al., 2018). A utilização dos carbapenêmicos e a consequente seleção de bactérias produtoras de carbapenemases, limita a ação terapêutica disponível para o tratamento de infecções.
Três grandes grupos de carbapenemases são conhecidos por inativar o grupo dos carbapenêmicos, sendo o grupo classe A (tipos; IIM; SME-; GES- e KPC), classe B ou metallo- β- lactamase (tipos; IMP; VIM; SPM e NDM) e classe D oxacilinases (tipo OXA-, principalmente a OXA-48 e OXA-23) (AVLAMI et al., 2010 e PEIRANO et al., 2009).
Esta resistência aos carbapenêmicos, envolve múltiplos mecanismos, incluindo alterações na permeabilidade da membrana externa mediada pela perda de porinas, aumento da regulação dos sistemas de fluxo juntamente com hiperprodução de β-lactamases AmpC ou β-lactamase de espectro estendido. As β-lactamases de KPC, são capazes de hidrolisar além dos carbapenêmicos, as cefalosporinas, cefamicinas, monobactâmicos e ácido clavulânico (CHEN et al., 2014).
Outras enzimas são referidas como OXA’s (oxacilinases) devido à sua capacidade de hidrolisar a isoxazolilpenicilina- oxacilina mais rapidamente que a benzilpenicilina. Com isso, seis grupos de carbapenemases OXA foram representadas por: OXA-51; OXA-23, OXA-40/124; OXA-58; OXA-143 e OXA-48 (NOWAK e PALUCHOWSKA, 2016).
Diante da resistência aos carbapenêmicos, é necessário atentar-se ao uso contínuo desta classe de antimicrobianos, pois, pesquisas relatam a presença destes genes de tolerância aos carbapenêmicos em produtos de origem animal. Ainda que não existam legislações que estabeleçam estudos ou limite de resíduos destes antibióticos em alimentos (MICHAEL et al., 2015 e MORISSON; RUBIN, 2015), e também foram isolados de diferentes tecidos de cães e gatos portadores de conjuntivite, resistência ao carbapnêmico meropenem na espécie de Staphylococcus intermedius (FERREIRA et al., 1999).
nosocomiais e comunitários a presença do gene OXA-48 em animais produtores de alimentos, sugere que estes possam disseminar em reservatórios de leite cru e possibilitar a transmissão da resistência aos seres humanos via alimentação ou mesmo durante o manejo (CECCARELLI et al., 2017; KHALIFA et al., 2017; LÜBBERT et al., 2017; MAIRI et al., 2017).
3.1.5 MALDI-TOF MS
A espectrometria de massa é uma técnica analítica, no qual compostos são ionizados em moléculas carregadas. Embora a espectrometria de massa (MS) tenha sido descoberta nos primeiros anos do século XX, seu escopo estava limitado às ciências químicas (SINGHAL et al., 2015).
A utilização da MS iniciou se nos anos 70 para identificação de microrganismos, mas o grande impulso para a evolução da tecnológica foi dado por Tanaka e seus colaboradores no final da década de oitenta. Estes pesquisadores conseguiram ionizar grandes moléculas por laser, utilizando uma matriz composta por partículas de cobalto e glicerol. No entanto, a princípio não foi possível ionizar moléculas não voláteis ou de grande peso molecular (ANHALT; FENSELAU, 1975 e TANAKA et al., 1988).
O princípio geral do MALDI TOF é simples, os íons de diferentes massas e cargas sujeitos a um movimento de campo elétrico e a distância percorrida em um determinado tempo é uma função da relação massa-carga (m/z). O termo MALDI deriva se da língua inglesa: Mass Assited Laser Desorption/Ionization, ou seja, dessorção/ionização por laser assistido por matriz. Os equipamentos de MS apresentaram variados analisadores que separam os íons de diferentes pesos/massas. Entre analisadores/separadores de íons, há aqueles que diferenciam pesos/massas pelo tempo de voo destas moléculas em tubo de vácuo (TOF: time of ligth) (CARBONNELLE; NASSIF, 2011).
Os íons assim formados, geralmente de carga 1+, no caso de MALDI, será acionado sob ação de um campo elétrico e o analisador irá separá-los de acordo com a relação m/z. Eles então passam por um número de grades de extração antes de chegar ao “tubo de voo” no final do qual é detector. Com isso, para alcançar o detector é calculado a massa de cada partícula e a soma dos íons analisados formarão um espectro característico da amostra (CARBONNELLE; NASSIF, 2011).
23
Figura 2- Princípios da tecnologia de espectrometria de massas por ionização/dessorção de matriz assistida por laser por tempo de voo (MALDI-TOF MS)
Fonte: Croxatto, Prod’Hom e Greub (2012).
A tecnologia MALDI-TOF MS, quando comparado a outras técnicas laboratoriais para identificação de microrganismos, a principal vantagem desta técnica proteômica é a agilidade para obtenção dos resultados. Entre o preparo do depósito e a leitura final, um resultado isolado pode ser obtido em menos de trinta minutos (CROXATTO; PROD’HOM; GREUB, 2012).
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4 ARTIGO
4.1. Caracterização epidemiológica e genotípica de espécies de Staphylococcus coagulase negativos isolados de leite bovino resistentes a beta lactâmicos
Este artigo foi elaborado conforme as normas da Revista Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
Caracterização epidemiológica e genotípica de espécies de Staphylococcus coagulase negativos isolados de leite bovino resistentes a beta lactâmicos
Epidemiological and genotypic characterization of beta lactam-resistant isolates of Staphylococcus coagulase negative isolates of bovine milk
L.M.V, Silva1*, A.C, Almeida1, A.R.E.O, Xavier2, S.F, Gonçalves1, G.A.A.D, Souza1, D.A, Sanglard1, L, Cardoso2, M.A.S, Xavier2
1Universidade Federal de Minas Gerais, Montes Claros, MG, Brasil 2Universidade Estadual de Montes Claros, Montes Claros, MG, Brasil
*Autor para correspondência- lviavitorino@yahoo.com.br
RESUMO
Cento e onze isolados cocos Gram positivos, de seis propriedades leiteiras do Norte de Minas Gerais, foram identificados pela técnica proteômica. As espécies de Staphylococcus coagulase negativo foram submetidas ao teste de difusão de disco com antibióticos convencionais beta-lactâmicos. Cepas resistentes ao meropenem foram rastreados os genes blaOXA-23 e blaKPC por meio da PCR. Através de teste Qui quadrado avaliou- se as espécies de Staphylococcus coagulase negativo, quanto a resistência e o índice de multirresistência. Pelo MALDI-TOF MS o gênero mais encontrado com 56,8% foi o Staphylococcus spp, o grupo SCN apresentou frequência de 27%. As espécies Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus chromogenes obtiveram maior prevalência nos rebanhos com 35,8% respectivamente. Em Janaúba a propriedade Nova Prima, o valor médio do índice de multirresistência encontrado foi de 0,6, as demais propriedades e munícipios foram de 0,5. Nos rebanhos de bovinos leiteiros a resistência antimicrobiana foi para as bases cefoxitina (100%), oxacilina (100%), meropenem (100%) e vancominicina (100%). Os genes de resistência blaOXA-23 e blaKPC não foram rastreados nas espécies Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus auriculares e Staphylococcus haemolyticus. Outros mecanismos de resistência estão presentes
nas cepas causando ineficiência no tratamento antimicrobiano nos rebanhos, comprometendo o bem-estar dos animais e saúde pública.
Palavras chave: genes de resistência; multirresistência antimicrobiana; produtos de origem animal
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ABSTRACT
One hundred eleven Gram positive cocci from six dairy farms in the north of Minas Gerais were identified by the proteomic technique. Staphylococcus coagulase negative species were submitted to the disc diffusion test with conventional beta-lactam antibiotics. Strains resistant to meropenem were screened for the blaOXA-23 and blaKPC genes by PCR. Staphylococcus coagulase-negative species were evaluated by Chi-square test for resistance and multidrug resistance index. For MALDI-TOF MS the most common genus with 56.8% was Staphylococcus spp, the SCN group had a frequency of 27%. The species Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus chromogenes had a higher prevalence in the herds with 35.8%, respectively. In
Janaúba Nova Prima property, the mean value of the multiresistance index found was 0.6, the other properties and municipalities were 0.5. Cefoxitin (100%), oxacillin (100%), meropenem (100%) and vancomycin (100%) were the antimicrobial resistance in the herds of dairy cattle. The blaOXA-23 and blaKPC resistance genes were not screened in the species Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus auriculares and Staphylococcus haemolyticus. Other mechanisms of resistance are present in the strains causing inefficiency in
the antimicrobial treatment in the herds, compromising the well-being of the animals and public health.
INTRODUÇÃO
A frequência de isolamento do grupo de Staphylococcus coagulase negativo (SCN) no final da década de 80 era considerado um agente oportunista de menor impacto, porém tem se tornado comum em vários países como causadores de mastite em bovinos leiteiros, principalmente em vacas jovens (Becker et al., 2014 Pyörälä e Taponem, 2009; Vanderhaeghen et al., 2015).
Neste grupo estão incluídos uma variedade de espécies, o que dificulta a identificação por métodos microbiológicos convencionais (Bier et al., 2017), que interfere nos estudos epidemiológicos e patogênicos de mastite causadas por Staphylococcus coagulase negativo.
Associado à participação de SCN na patogenia das mastites, com alta prevalência a identificação de cepas multirresistentes capazes de veicular genes a outras bactérias, incluindo S. aureus, desperta para a necessidade de maior conhecimento sobre a real participação deste grupo em saúde humana e animal (Isaac et al., 2017).
Com isso, novos genes são descritos como codificadores de resistência a outros grupos de beta lactâmicos como carbapenêmicos como os genes blaOXA-23. Microrganismos contendo o gene bla KPC possuí frequentemente vários genes que codificam resistência a outros agentes antimicrobianos, como aminoglicosídeos, quinolonas, triemetropim, sulfonamidas e tetraciclinas (Chen et al., 2014; Nowak e Paluchowska, 2016).
Objetivou-se identificar as espécies prevalentes de SCN em leite de vacas com mastite subclínica; averiguar a resistência aos betas lactâmicos e a presença de genes blaOXA-23 e blaKPC, relacionados com a resistência aos carbapenêmicos.
33
MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi conduzido segundo critérios aprovados pela Câmara de Ética e Experimentação Animal (CEUA) com o protocolo n⸰ 145/2013 da Universidade Federal de Minas Gerais.
Isolados bacterianos
Cento e onze cepas identificadas como cocos Gram positivos provenientes da bacterioteca do Laboratório de Sanidade Animal- CPCA- UFMG foram utilizadas para esta pesquisa. Estes foram provenientes de leite de vacas com mastite subclínica em seis propriedades do Norte de Minas Gerais conforme descrito em estudos relatados por Xavier et al. (2017).
As cepas estavam armazenadas sobre congelamento em meio BHI contendo 20% de glicerol e armazenados em alíquotas em freezer à - 20ºC (Teixeira et al., 2014) e foram ativadas em caldo BHI e incubadas por 24h a 37ºC por três vezes consecutivos.
Para confirmação da pureza das culturas, as colônias foram analisadas microbiologicamente quanto à morfologia de colônias ao Agar sangue (Oxoid) suplementado com 5% de sangue de ovino desfibrinado e coloração de Gram de acordo com Quinn et al., (2005) e Koneman; Allen; Janda, (2001). Aquelas colônias que apresentarem morfologia microscópica de cocos Gram-positivos, em culturas puras, foram selecionados, repicadas em ágar TSA (Oxoid) e enviadas para a análise MALDI-TOF MS.
Análise proteômica através da técnica MALDI TOF MS
Cento e onze cepas identificadas presuntivamente como cocos Gram positivos, conservadas em refrigeração foram ativadas em cultivo em BHI e repicadas em placas contendo ágar TSA (Oxoid) e colônias frescas, puras e isoladas foram encaminhados para a realização das análises proteômicas ao laboratório AQUACEN/RENAQUA da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais.
A análise por MALDI TOF MS foi realizada em conformidade com Assis et al., (2017) utilizando o aparelho Microflex TM MALDI TOF MS da Bruker Daltonics. Uma única colônia fresca foi colocada usando um palito de madeira estéril e colocada em uma placa de aço de 96 poços.
constituída por uma solução saturada de α- aciano- 4- hidroxicinâmico (HCCA) Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha, foram aplicados no local e deixados a temperatura ambiente. Antes das medições, a calibração foi procedida por um padrão de teste bacteriano (E. colli DH5 alpha; Bruker Daltonics).
Os critérios de escore de identificação em tempo real foram aqueles recomendados pelo fabricante: escore ≥ 2,000 indica identificação a nível de espécie, escore ≥ 1,700 e ≤ 2000 indica identificação a nível de gênero e ≤ 1700 indica identificação não confiável.
Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos
As cepas identificadas como Staphylococcus coagulase negativo pelo MALDI-TOF MS foram analisados quanto a resistência a beta lactâmicos, pela técnica de difusão em discos conforme Wayne (2016), utilizando os seguintes antibióticos: cefoxitina (30µg) (Laborclin), oxacilina (1µg) (Cecon), vancomicina (30µg) (Laborclin),, meropenem (10µg) (Cecon), imepenem (10µg) (Cecon) e sulbactam ampicilina (10µg) (Laborclin),.
O índice de múltipla resistência antimicrobiana (MAR) dos microrganismos foi determinado pela relação entre o número de antimicrobianos que a amostra é resistente e o número total de antimicrobianos testados. Índice MAR acima de 0,2 foi caracterizado como multirresistência (Krumperman, 1983).
Extração de DNA
Isolados que apresentaram resistência aos carbapenêmico meropenem no teste de sensibilidade em disco foram criopreservados e posteriormente reativados pela semeadura em meio BHI (Prodimol Biotecnologia) e incubadas a 37ºC durante 24 horas, em três cultivos sucessivos. As culturas bacterianas foram enviadas ao laboratório de Biotecnologia da Universidade Federal de Minas Gerais, onde foram submetidas a extração de DNA pelo método digestão por proteinase K, seguida por fenol-clorofórmio (Barea et al., 2004) com modificações.
Um volume de 1,5mL de cada cultura de Staphylococcus coagulase negativo foi centrifugado a 5000 rpm durante 15 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento de células bacterianas ressuspendido em 40µL de tampão de lise (NaCl 0,9%, EDTA 0,2M e
35
proteinase K 20mg/mL). Foi adicionado 40µL de SDS a 20% e as amostras incubadas em banho maria a 60ºC durante 10 minutos e em seguida resfriados a temperatura ambiente. A integridade e quantificação dos DNA’s extraídos foram verificados por eletroforese em gel de agarose a 1%. Este material foi utilizado nas reações de PCR.
Detecção de gene universal para bactérias-16S rDNA
Para assegurar que o DNA extraído referia-se a bactérias, realizou PCR utilizando os
primers DG74 (5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3') e RW01
(5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3') gerando um amplicon de 370 bp, nas condições descritas por Xavier et al., (2017). As reações foram conduzidas utilizando-se um mmix contendo 2XGoTaq® Green Master Mix (Promega Corporation, USA), MgCl2 (2.5 mm), 10 µM de cada primer, e 50 ng de DNA bacteriano bacterial DNA, in a final total volume de reação de 50 μL. As condições foram as seguintes: um ciclo inicial de desnaturação em 94 ° C por 5 min seguido por 35 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 s, anelamento a 57 ° C por 30s, extensão a 72 ° C por 45 s e extensão final de 10 min. Os amplicons foram visualizados em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio e fotografado e documentado. Como controle positivo da PCR, uma estirpe nosocomial de Klebsiella pneumoniae identificado pela codificação do gene 16S rDNA bacteriano universal foi usado.
Análise de PCR para detecção dos genes de resistência blaOXA23 e blaKPC
Todos os primers utilizados neste trabalho foram sintetizados pela Integrad DNA Technology USA e estão apresentados no quadro a seguir:
Quadro 1 Sequência dos oligonucleotídeos, genes alvo, tamanhos dos fragmentos amplificados (amplicons em pares de bases- pb) e referências que foram utilizados nas análises moleculares.
Oligonucleotídeo Sequência Gene Alvo Amplicon Referência OXA23F OXA 23R ATGTGTCATAGTATTCGTCG TCACAACAACTAAAAGCACTG-3
blaOXA-23 1057 pb Fonseca et al., (2013)
Bla KPC F Bla KPC R
TGT CAC TGT ATC GCC GTC CTC AGT GCT CTA CAG AAA ACC
bla KPC 876 pb Yigit et al., (2001);
As reações para pesquisa presença do gene blaOXA-23 ocorreram em uma mistura contendo 1X Taq buffer do kit Kappa PCR, 2,5 mM MgCl2, 1 µM desoxinucleotídeos, 0,5 U Taq Polimerase Taq, 1,25 µM de cada primer, e 1 µL (50 ng / µL) de DNA bacteriano, para um volume final da reação de 25µL.
As condições de amplificação foram as seguintes: um ciclo de desnaturação inicial a 95 ° C por 3 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 s, anelamento a 55 ° C por 30 s, extensão a 72 ° C por 30 s, e um final extensão de 5min Carvalho et al., (2016). Como controle positivo para a PCR, foi utilizada uma cepa de Acinetobacter baumannii isolada em pesquisas anteriores e geneticamente identificados por um laboratório brasileiro de referência (Fundação Ezequiel Dias) como A. baumannii codificando o gene blaOXA-23. Como controle negativo, utilizou-se uma cepa de Escherichia coli, ATCC 25922.
Para rastrear o gene blaKPC, as amplificações foram realizadas em uma PCR contendo 2x Go Taq Green Master Mix® (Promega, EUA), 2,5mM MgCl2, 10µM cada iniciador e 50ng de DNA bacteriano em um volume final de 50µL. As condições de amplificação foram de 5 minutos a 95ºC, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 minuto, anelamento a 58ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 1 minuto e meio. A amplificação obteve uma extensão final a 72ºC por 10 minutos. Como controle positivo para PCR, utilizou se a cepa K. pneumoniae e água como controle negativo. Yigit et al., (2001);
Todos amplicons dos genes descritos foram visualizados em gel de agarose a 1,5% corados com brometo de etídeo e fotodocumentados.
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Análise estatística
Os resultados foram submetidos à estatística descritiva por meio da distribuição das frequências relativa para os achados microbiológicos. Foi utilizado o teste qui-quadrado em nível de significância de 5% para avaliar a diferenças entre a frequência de Staphylococcus coagulase negativo (SCN) nas propriedades e nos municípios. Para verificar se houve associação entre resistência dos antimicrobianos nas propriedades e nos municípios foi realizado o mesmo teste estatístico descrito acima. As análises foram realizadas através do programa R versão 3.5.0.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Espécies de Staphylococcus spp identificados pelo MALDI-TOF MS
Através da técnica MALDI - TOF MS o gênero mais encontrado com 56,8% (n= 63/111) foi o Staphylococcus spp. Entre estes, Staphylococcus aureus correspondeu a 70,0% (n= 44/63) e o grupo Staphylococcus coagulase negativo apresentou frequência de 27,0% (n= 17/63).
No quadro 2 estão apresentados os resultados de localização das cepas identificadas como SCN, bem como, os resultados na coloração pelo método de Gram, teste de coagulase e análise proteômica.
Fazenda* Data de Isolamento
Município Perfil de resistência a antimicrobianosa
Analise microbiologia-coloração pelo Gram
Teste bioquímico- coagulase Análise proteômica MALDI-TOF Gene 16S rDNA universal de bactéria Perfil Genômico Gene blaKpc Gene blaOXA23
MUG 1 16/02/2018 Porteirinha CFO, OXA, VAN Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT MUG 2 16/02/2018 Porteirinha Sensível Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT
NP 1 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + - -
NP 2 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT
NP 3 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA, VAN Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT
NP 4 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA Staphylococcus spp - Staphylococcus haemolyticus + NT NT
VA 1 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA Staphylococcus spp - Staphylococcus warneri + NT NT
VA 2 16/02/2018 Janaúba Sensível Staphylococcus spp - Staphylococcus chromogenes + NT NT
TR 1 16/02/2018 Bocaiuva CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus crhomogenes + - - TR 2 16/02/2018 Bocaiuva CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus chromogenes + - - GU 1 16/02/2018 Icaraí de Minas CFO. OXA Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT GU 2 16/02/2018 Icaraí de Minas CFO, OXA, VAN Staphylococcus spp - Staphylococcus chromogenes + NT NT FEHAN 1 16/02/2018 Montes Claros CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus crhomogenes + - -FEHAN 2 16/02/2018 Montes Claros CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus auriculares + - -FEHAN 3 16/02/2018 Montes Claros Sensível Staphylococcus spp - Staphylococcus chromogenes + NT NT FEHAN 4 16/02/2018 Montes Claros CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus haemolyticus + - -FEHAN 5 16/02/2018 Montes Claros Sensível Staphylococcus spp - Staphylococcus auriculares + NT NT
CFO= Cefoxitina; OXA= Oxacilina; MER= Meropenem; VAN= Vancomicina; NT= Não testado- maiores detalhes em material e métodos; (-) Resultado negativo; (+) Resultado positivo
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S. epidermidis e S. chromogenes foram identificados na mesma frequência, correspondendo a 35,3% dos isolados, seguidos de S. auriculares, S. haemolyticus e S.warneri (Graf.1). Estudos relatam a presença das mesmas espécies de SCN aqui identificadas, ainda que utilizando metodologias diferentes para identificação.
Gráfico 1- Frequência de espécies de Staphylococcus spp multirresistentes identificados pelo MALDI- TOF MS em vacas com mastite subclínica
Mello et al., (2017), Silva et al., (2014) também observaram frequência semelhante de Staphylococcus chromogenes e Staphylococcus epidermidis em leite de tetos com mastite
subclínica. Já Lange et al., (2015) observaram Staphylococcus chromogenes (38.5%) em frequência superior a S. epidermidis (13.1%). Os autores supracitados também observaram em menor frequência S. haemolyticus, Staphylococcus auricularis S. warneri além de outros SCN. Em outros países, a frequência de espécies de SCN é variável, conforme descrito por Pyörälä e Taponen (2009); Piessens et al., (2011); Piessens et al., (2012); De Vliegher et al., (2012) e Thorberg et al., (2009) também observaram maior frequência de Staphylococcus chromogenes e Staphylococcus epidermidis em leite de tetos com mastite subclínica e Taponen et al., (2016)
0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% F req uê nc ia (%) Espécies identificadas Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus chromogenes Staphylococcus auricularis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus warneri
frequência em mastite subclínica.
Essas pesquisas utilizaram identificação genética de SCN. Já Tomazi et al. (2014) utilizaram MALDI-TOF e Frey et al. (2013) também encontraram uma diversidade de espécies em leite de tetos com mastite subclinica, corroborando em parte com o estudo, pois, S. chromogenes (74,07%) com maior prevalência seguido de S. haemolyticus e S. epidermidis entre
outros SCN.
A eficiência do MALDI- TOF MS utilizado nos isolados de leite bovino contaminados por mastite subclínica foi de 92% (n=102/111) corroborando com o trabalho de Schaubauer et al., (2014) que, ao empregar a mesma técnica, obteve 90,5% de acerto em vinte e uma amostras de isolados de leite em vacas com mastite subclínica.
A metodologia MALDI- TOF MS, comparado com outras técnicas laboratoriais para a identificação de microrganismos, possuí a vantagem de agilidade e exatidão nos resultados. Entre o preparo do depósito até a leitura final, um resultado isolado pode ser obtido em menos de trinta minutos (Croxatto; Prod’Hom e Greub, 2012).
Ao avaliar epidemiologicamente a participação de SCN entre os rebanhos estudados, a frequência de espécies de Staphylococcus coagulase negativo identificados foi semelhante entre as fazendas (Graf. 2) (p= 0,1546) e municípios (Graf. 3) (p= 0,3917). A prevalência de espécies SCN na etiologia de mastite bovina é variável com as regiões de estudo (ISAAC et al., 2017; NYMAN et al., 2017; VANDERHAEGHEN et al., 2015,) e com uma diversidade epidemiológica entre rebanhos e entre as espécies (PIESSEN et al., 2012), conforme observado neste trabalho.
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Gráfico 2- Frequência de espécies de SCN em cada propriedade do Norte de Minas Gerais (p= 0,1546)
Gráfico 3: Frequência de SCN em cada município do Norte de Minas Gerais (p= 0,3917).
A avaliação da clonalidade entre estes isolados poderá indicar mais claramente a veiculação entre e intra rebanhos, conforme observado por Piessens et al., (2012) ao detectarem genótipos semelhantes de SCN em leite contaminado por mastite, de diferentes rebanhos, assim como no ambiente. 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% 18% 20% Fr e q u ê n c ia S CN
Propriedades de bovinos leiteiros do Norte de Minas Gerais S.chromogenes S. epidermidis S.hamolyticus S.auricularis S.warneri 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% 18% 20% Fr e q u ê n c ia d e S CN
Municipios do Norte de Minas Gerais
S.chromogenes S.epidermidis S.haemolyticus S.auricularis S.warneri
