AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA EXPOSIÇÃO PERINATAL À BAIXAS DOSES DE BISFENOL A SOBRE O EIXO HIPOTALÂMICO-HIPOFISÁRIO-TESTICULAR DA
PROLE ADULTA DE RATOS
Guarapuava 2016
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA EXPOSIÇÃO PERINATAL À BAIXAS DOSES DE BISFENOL A SOBRE O EIXO HIPOTALÂMICO-HIPOFISÁRIO-TESTICULAR DA
PROLE ADULTA DE RATOS
Guarapuava 2016
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, área de Concentração Fármacos, Medicamentos e Biociências Aplicadas à Farmácia, UNICENTRO.
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Romano
Co-orientadora: Prof. Dra. Renata Marino Romano
Catalogação na Publicação
Biblioteca Central da Unicentro, Campus Cedeteg Oliveira, Isabela Medeiros de
O48a Avaliação dos efeitos da exposição perinatal à baixas doses de bisfenol A sobre o eixo hipotelâmico-hipofisário-testicular da prole adulta de ratos / Isabela Medeiros de Oliveira. – – Guarapuava, 2016
x, 70 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual do Centro-Oeste, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração em Fármacos, Medicamentos e Biociências aplicadas à Farmácia, 2016
Orientador: Marco Aurélio Romano Co-orientadora: Renata Marino Romano
Banca examinadora: Cláudio Avarenga de Oliveira, Paulo Roberto da Silva
Bibliografia
1. Ciências Farmacêuticas. 2. Bisfenol A. 3. Eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular. 4. Expressão gênica. 5. Desregulador endócrino. 6. Exposição perinatal. I. Título. II. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Dedico este trabalho à minha família, em especial aos meus pais, Odair e Isabel, os primeiros a me ensinar
À Deus, que cria todas as oportunidades, nos capacita e fortalece a cada dia. Obrigada pelo dom da vida e por me ajudar, diariamente, a ser uma pessoa melhor.
À minha família, meus pais Odair e Isabel e meu irmão Patrick, por todo amor, apoio e incentivo em todos os momentos.
Ao Prof. Dr. Marco Aurélio Romano e à Prof. Dra. Renata Marino Romano pela orientação, dedicação e confiança. Obrigada também pelos ensinamentos e auxílio em todas as etapas deste trabalho.
À Patrícia de Campos, pela amizade, companheirismo e pelo auxílio nos experimentos.
Às minhas grandes amigas, Dyenifer e Juliana, que me incentivaram desde o início e sempre estiveram dando força e dividindo experiências.
Às colegas do laboratório de fisiologia humana e toxicologia reprodutiva da UNICENTRO, pelo convívio e ajuda na execução prática, em especial à Nathália, que se tornou uma amiga pra todos os momentos.
À todos que estiveram torcendo por mim e que contribuíram para que este trabalho fosse realizado.
O eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular (HHT) constitui a relação entre o sistema nervoso central e os testículos e desempenha um papel fundamental na produção dos hormônios esteroides e também na reprodução masculina. O bisfenol A (BPA) é um desregulador endócrino químico sintético de alta prevalência no meio ambiente que pode influenciar na função do eixo HHT em ratos adultos. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a exposição ao BPA em doses inferiores à NOAEL reprodutiva, durante a janela de diferenciação sexual hipotalâmica, causa alterações na regulação do eixo HHT. Ratas Wistar foram acasaladas e tratadas com BPA a partir do dia gestacional 18 até o dia pós-natal (PND) 5. O BPA foi diluído em óleo de milho e administrado por via subcutânea uma vez ao dia, só para as mães, em doses correspondentes a zero, 0,5 ou 5 mg de BPA/kg de peso corporal. No PND5 as ninhadas foram padronizados em oito filhotes por mãe e a proporção foi mantida até o desmame (PND21). O crescimento corporal foi acompanhado por pesagens semanais, a partir do desmame até o PND90. A partir do PND30 iniciou-se a avaliação da progressão da puberdade. No PND90 os filhotes foram eutanasiados e o sangue, o hipotálamo, a hipófise e os testículos foram colhidos e armazenados a -80°C. O testículo, epidídimo e vesícula seminal foram pesados. A expressão de mRNA foi avaliada por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). No hipotálamo, foi realizada a avaliação dos seguintes genes: hormônio liberador de gonadotrofinas (Gnrh1), receptor de estradiol alfa (Esr1), receptor de estradiol beta (Esr2) e receptor de andrógenos (Ar). Na hipófise, a expressão do mRNA do receptor do hormônio liberador de gonadotrofinas (Gnrhr), hormônio luteinizante (Lhb), hormônio folículo estimulante (Fshb), Esr1, Esr2 foi analisada. E no testículo foram avaliadas as expressões do mRNA do receptor do hormônio luteinizante (Lhcgr), receptor do hormônio luteinizante (Fshr) e da Inibina beta (Inhbb). As concentrações séricas de testosterona e estradiol foram avaliadas pelo imunoensaio de eletroquimioluminescência e as dosagens séricas de LH e FSH foram realizadas por quimioluminescência. Os dados foram analisados por MANOVA para medidas repetidas (avaliação do crescimento), Kruskal-Wallis seguido de pós-teste de Dunn (idade à puberdade e testosterona), e ANOVA seguido de pós-teste de Tukey para todas as outras comparações com os recursos do software Statistica 7.0, Statsoft Inc. Consideraram-se diferenças estatísticas quando p<0,05. A exposição perinatal ao BPA não alterou o crescimento corporal, porém atrasou a idade e aumentou o peso à puberdade dos animais de ambos os grupos tratados. A vesícula seminal apresentou maior quantidade de fluido nos animais tratados com a maior dose de BPA. O epidídimo teve seu peso reduzido nesse mesmo grupo. A expressão hipotalâmica do mRNA do Gnrh e do Esr2 aumentou nos animais de ambos os grupos tratados. Na hipófise, a expressão do mRNA do Fshb e o Ar aumentou no grupo tratado com a menor dose de BPA, enquanto a expressão do mRNA do Esr1 aumentou no grupo de maior dose. No testículo, houve aumento da expressão dos transcritos do Fshr e Inhbb apenas no grupo tratado com a menor dose de BPA. Os níveis séricos de testosterona e LH foram aumentados no grupo que recebeu a maior dose de BPA. Esses resultados demonstram, pela primeira vez, que a exposição à baixas doses de BPA, durante os períodos críticos de diferenciação sexual hipotalâmica, modifica a atividade do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular da prole com consequências na vida adulta dos ratos.
Palavras chave: Bisfenol A. Eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular. Expressão gênica. Desregulador endócrino. Exposição perinatal.
central nervous system and the testis, playing a key role in the production of steroid hormones and in the male reproduction. Bisphenol A (BPA) is a synthetic endocrine chemical disrupter of high prevalence in the environment that may influence the function of the HPT axis in adult rats. The objective of this study was to evaluate whether exposure to BPA at doses below the reproductive NOAEL, during hypothalamic sexual differentiation window, causes changes in the regulation of HPT axis. Female Wistar rats were mated and treated with BPA from the gestational day 18 until postnatal day (PND) 5. BPA was diluted in corn oil and administered by subcutaneous injection once a day only to mothers, in doses corresponding to zero, 0.5 or 5 mg of BPA / kg of body weight. In PND5 litters were standardized in eight pups per dam and the ratio was maintained until weaning (PND21). Body growth was accompanied through weekly weighing, from weaning until PND90. From the PND30 was initiated the evaluation of puberty progression. In PND90, the offspring was euthanized and blood, hypothalamus, pituitary and testis were collected and stored at -80 °C. The testis, epididymis and seminal vesicles were weighed. The mRNA expression was evaluated by quantitative PCR real time (RT-qPCR). In hypothalamus, was performed the evaluation of the following genes: gonadotropin releasing hormone (Gnrh1), estradiol alpha receptor (Esr1), estradiol receptor beta (Esr2) and androgen receptor (Ar). In pituitary, releasing hormone receptor gonadotropin (Gnrhr), luteinizing hormone (Lhb), follicle stimulating hormone (Fshb), Esr1, Esr2 mRNA expression was analyzed. Finally, in the testis were evaluated luteinizing hormone receptor (Lhcgr), luteinizing hormone receptor (Fshr) and the Inhibin beta (Inhbb) mRNA expression. Serum testosterone and estradiol were assessed by electrochemoluminescence immunoassay and serum LH and FSH were assessed by chemiluminescence. Data were analyzed by MANOVA for repeated measures (evaluation of growth), Kruskal-Wallis followed by Dunn posthoc test (age at puberty and testosterone), and one-way ANOVA followed by Tukey HSD posthoc test for all other comparisons with the resources of the software Statistica 7.0, Statsoft Inc. Statistical differences were considered when p <0.05. The perinatal exposure to BPA did not change the body growth, but delayed the age and increased the weight at puberty in animals of both treated groups. The amount of seminal vesicle fluid increased in animals treated with the higher dose of BPA. The epididymis weight was reduced in the same group. The hypothalamic expression of Gnrh mRNA and Esr2 increased in animals of both treated groups. In pituitary, Fshb and Ar mRNA expression were increased in the group treated with the lowest dose of BPA, while Esr1 mRNA expression was only augmented in the highest dose group. In testis, there was an increase in the transcript expression of Fshr and Inhbb only in the group treated with the lower dose of BPA. Serum testosterone and LH levels were increased in the group treated the higher dose of BPA. These results firstly demonstrate that perinatal exposure to low doses of BPA, during critical period of hypothalamic sexual differentiation, modifies the activity of the HPT axis of the offspring with consequences in adult life of rats.
Key-words: Bisphenol A. Hypothalamus-pituitary-testis axis. Genic expression. Endocrine disruptor. Perinatal exposure.
Quadro 1 – Primers forward (F) e reverse (R) de cada gene utilizados para o ensaio de PCR em tempo e as respectivas sequências de referência ... 27
Figura 1 – Estrutura química do bisfenol A. Fonte: National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Database ... 14 Figura 2 – Eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular. Adaptado. Fonte: Copyright © 2007 Pearson Education, inc., publishing as Benjamin Cummings. Fig. 26-11 ... 18 Figura 3 – Gráfico de evolução do peso corporal dos ratos dos grupos tratados com 0,5 e 5 mg/Kg de BPA e do grupo controle do 21º ao 90º dia de idade dos animais ... 33 Figura 4 – Curva de dissociação e curva padrão relativa mostrando a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios do Gnrh, Esr1 e Esr2 no hipotálamo ... 38 Figura 5 – Curva de dissociação e curva padrão relativa mostrando a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios do Ar e Rpl19 ... 39 Figura 6 – Curva de dissociação e curva padrão relativa mostrando a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios do Gnrhr, Lhb e Fshb na hipófise ... 41 Figura 7 – Curva de dissociação e curva padrão relativa mostrando a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios do Ar, Esr1 e Esr2 na hipófise ... 43 Figura 8 – Curva de dissociação e curva padrão relativa mostrando a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios do Rpl19 na hipófise ... 44 Figura 9 – Curva de dissociação e curva padrão relativa mostrando a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios do Lhcgr, Fshr e Inhbb no testículo ... 45 Figura 10 – Curva de dissociação e curva padrão relativa mostrando a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios do Rpl19 e Ppia no testículo ... 46 Figura 11 – Expressão hipotalâmica dos transcritos de Gnrh, Ar, Esr1 e Esr2 dos ratos dos grupos tratados com 0,5 e 5 mg/Kg de BPA e do grupo controle ... 47 Figura 12 – Expressão hipofisária dos transcritos de Gnrhr, Lhb, Fshb, Ar, Esr1 e Esr2 dos ratos dos grupos tratados com 0,5 e 5 mg/Kg de BPA e do grupo controle ... 48 Figura 13 – Expressão testicular dos transcritos do Lhcgr, Fshr e Inhbb dos ratos dos grupos tratados com 0,5 e 5 mg/Kg de BPA e do grupo controle ... 49 Figura 14 – Testosterona sérica dos ratos dos grupos tratados com 0,5 e 5 mg/Kg de BPA e do grupo controle ... 50 Figura 15 – LH e FSH séricos dos ratos dos grupos tratados com 0,5 e 5 mg/Kg de BPA e do grupo controle ... 51 Figura 16 – Esquema do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular antes (A) e após (B) a exposição perinatal ao BPA ... 60
Tabela 1 – Idade e peso à puberdade dos ratos dos grupos controle e tratados com BPA ... 34 Tabela 2 – Peso absoluto (g) e relativo (mg/100g PC) do testículo dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA ... 34 Tabela 3 – Peso absoluto (mg) e relativo (mg/100g PC) do segmento cabeça e corpo do epidídimo dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA ... 35 Tabela 4 – Peso absoluto (mg) e relativo (mg/100g PC) do segmento cauda do epidídimo dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA ... 35 Tabela 5 – Peso absoluto (g) e relativo (mg/100g PC) da vesícula seminal repleta dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA ... 36 Tabela 6 – Peso absoluto (g) e relativo (mg/100g PC) da vesícula seminal drenada dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA ... 36
1 INTRODUÇÃO ... 12
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 14
2.1 Bisfenol A (BPA) ... 14
2.1.2 Toxicocinética e toxicodinâmica do BPA ... 16
2.2 Eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular (HHT) ... 17
2.3 Eixo HHT e o BPA ... 20
3 OBJETIVOS ... 22
3.1 Hipótese Central e Objetivo Geral ... 22
3.2 Objetivos específicos ... 22
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 23
4.1 Animais ... 23
4.2 Delineamento experimental ... 23
4.3 Curva de crescimento, idade e peso à puberdade ... 24
4.4 Colheita e armazenamento de tecidos ... 24
4.4.1 Sangue ... 24
4.4.2 Colheita dos tecidos para pesagem ... 24
4.4.3 Colheita de tecidos para biologia molecular ... 25
4.5 Identificação das alterações de expressão gênica pela quantificação do mRNA de genes de regulação do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular (HHT) ... 25
4.5.1 Homogeneização e Extração de RNA total de tecidos ... 25
4.5.2 Reação de Transcrição Reversa (RT) ... 26
4.5.3 Confecção dos oligonucleotídeos (primers) ... 26
4.5.4 Padronização dos primers ... 28
4.5.5 Reação de quantificação por PCR em tempo real a partir da transcrição reversa (RT-qPCR) ... 28
4.6 Dosagens séricas hormonais ... 29
4.6.1 Testosterona ... 29
4.6.2 Estradiol ... 30
4.6.3 LH e FSH ... 30
4.7 Análise estatística ... 31
5.3 Peso dos tecidos reprodutivos ... 34
5.3.1 Testículo ... 34
5.3.2 Epidídimo ... 35
5.3.3 Vesícula seminal ... 36
5.4 Efeitos do exposição perinatal ao BPA na expressão de genes que regulam o eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular ... 37
5.4.1 Padronização dos primers ... 37
5.4.1.1 Padronização do Gnrh, Esr1, Esr2, Ar e Rpl19 no hipotálamo ... 37
5.4.1.2 Padronização do Gnrhr, Lhb, Fshb, Esr1, Esr2, Ar e Rpl19 na hipófise ... 40
5.4.1.3 Padronização do Lhcgr, Fshr, Inhbb, Rpl19 e Ppia no testículo ... 44
5.4.2 Efeitos do exposição perinatal ao BPA na expressão hipotalâmica de Gnrh, Esr1, Esr2, Ar e Rpl19 ... 46
5.4.3 Efeitos do exposição perinatal ao BPA na expressão hipofisária de Gnrhr, Lhb, Fshb, Esr1, Esr2, Ar e Rpl19 ... 47
5.4.4 Efeitos do exposição perinatal ao BPA na expressão testicular de Lhcgr, Fshr, Inhbb, Rpl19 e Ppia ... 49
5.5 Efeito da exposição perinatal ao BPA nas concentrações séricas de testosterona e estradiol, LH e FSH ... 50 5.5.1 Testosterona ... 50 5.5.2 LH e FSH ... 50 6 DISCUSSÃO ... 52 7 CONCLUSÃO ... 59 REFERÊNCIAS ... 61 ANEXOS ... 69
1 INTRODUÇÃO
Desreguladores endócrinos são definidos como agentes exógenos que interferem com a produção, liberação, transporte, metabolismo, ligação, ação ou eliminação de hormônios naturais, responsáveis pela manutenção da homeostase e regulação de processos de desenvolvimento (KAVLOCK et al., 1996).
O bisfenol A (BPA) é conhecido como um desregulador endócrino sintético de alta prevalência no meio ambiente. Sua principal utilização é na fabricação de plásticos de policarbonato e resinas epóxi, a partir dos quais uma variedade de produtos é produzida, incluindo recipientes para armazenamento de alimentos, revestimento interno de latas de alimentos e selantes dentários. O aquecimento promove a migração do BPA do recipiente para o alimento, tornando a ingestão dietética a principal forma de exposição dos seres humanos (BILES et al., 1997; VANDENBERG, et al., 2009).
A reprodução masculina, bem como a produção dos hormônios esteroides sexuais, são dependentes da ligação que há entre o sistema nervoso central e os testículos, formada pelo eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular (HHT) (EVERETT, 2006). Sendo assim, a regulação endócrina do sistema reprodutor ocorre através de hormônios esteroides, os quais desempenham um papel fundamental na diferenciação sexual, desenvolvimento e função do eixo reprodutivo.
A toxicidade reprodutiva dos desreguladores endócrinos é mediada, principalmente, pelos receptores de hormônios esteroides (MCLACHLAN, 2001). O BPA interfere no sistema endócrino por perturbar a atividade adequada dos receptores hormonais em um conjunto diversificado de tecidos-alvo, uma vez que pode atuar como agonista ou antagonista da sinalização celular via receptor de estrogênio alfa ou beta (ERα e ERβ). Portanto, é possível dizer que o nível de expressão de ERα e ERβ contribui para a intensidade do efeito do BPA, dependendo de tecido (LI et al., 2012; ROUTLEDGE et al., 2000).
A relação do BPA com problemas do sistema reprodutor tem sido bastante estudada. Devido a sua ação estrogênica o BPA pode perturbar o HHT, e consequentemente, o desenvolvimento e a função do sistema reprodutivo (RAMOS et al., 2003). Estudos indicam que a exposição ao BPA pode levar à um comprometimento da espermatogênese, da fertilidade e alterações no perfil de expressão dos receptores esteroides testiculares (QIU et al., 2013; RICHTER et al., 2007). A perturbação dos esteroides sexuais no início de períodos críticos de diferenciação sexual do cérebro pode alterar o funcionamento do eixo HHT, levando à desregulação da secreção de gonadotrofinas, início da puberdade e fertilidade.
Ainda não há informação disponível sobre os efeitos do BPA após a exposição apenas no período perinatal crítico da diferenciação sexual hipotalâmica. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar in vivo a possível interferência da exposição ao BPA durante a janela de diferenciação sexual hipotalâmica, sobre genes que controlam o eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular da prole adulta.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Bisfenol A (BPA)
O BPA, com nome químico 4,4'-dihidroxi-2,2-difenilpropano, é um monômero que foi sintetizado pela primeira vez por Alexander P. Dianin em 1891, porém a investigação de suas propriedades teve maior desenvolvimento na década de 1930, durante a procura por estrogênios sintéticos. Apesar do seu potencial estrogênico ter sido confirmado, haviam outros estrogênios mais potentes, tornando o uso farmacêutico do BPA inviável (DODDS; LAWSON, 1936; VANDENBEG et al., 2009). A confirmação da atividade estrogênica do BPA é a base para o seu reconhecimento como um desregulador endócrino. Em sua estrutura química há dois anéis de benzeno e dois (4, 4') -OH, o que possibilita a ligação à receptores estrogênicos (figura 1) (KITAMURA et al., 2005).
Figura 1 – Estrutura química do bisfenol A. Fonte: National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Database; CID=6623, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6623 (acesso em 30/09/2015).
As primeiras utilizações do BPA na indústria foram no início de 1950 e logo após as primeiras resinas epóxi serem sintetizadas, deu-se início à produção comercial. As resinas epóxi rapidamente encontraram uso extensivo ao longo da produção industrial, sendo utilizadas em revestimentos de proteção em equipamentos de metal, tubulações, no interior de latas e também em materiais odontológicos (UNIVERSITY OF NORTH TEXAS, 2005). Alguns anos depois,
através do processo de polimerização, foi descoberto outro uso para o BPA, pois quando é polimerizado, o BPA liga-se entre si formando longas cadeias, constituindo assim, um plástico rígido chamado de policarbonato. O plástico de policarbonato possui flexibilidade, resistência e estabilidade ideais para diversas aplicações. Assim, aumentou a utilização do BPA em diferentes materiais, tais como, equipamentos eletrônicos, automóveis e vários tipos de recipientes plásticos (VOGEL, 2009).
O BPA tornou-se um dos produtos químicos produzidos em maior volume em todo o mundo. Em 2009, estimativas indicaram que mais de 3 milhões de toneladas de BPA eram produzidas anualmente e aproximadamente 100 toneladas poderiam ser liberadas na atmosfera a cada ano (VANDERBERG et al., 2009).
A atenção ao BPA foi se tornando cada vez maior devido ao seu grande uso na fabricação de inúmeros produtos de consumo. Dentre eles estão, principalmente, recipientes utilizados para armazenar alimentos, mamadeiras, garrafas plásticas e também a utilização das resinas epóxi no revestimento interno de latas que acondicionam alimentos e bebidas (GEENS et al., 2011; VANDENBERG et al., 2009). Além disso, as aplicações do policarbonato e das resinas epóxi foram estendidas para outros usos, tais como óculos de sol, papéis térmicos, adesivos, materiais de construção, CD, DVD, selantes dentários e dispositivos médicos, aumentando a presença do BPA no meio ambiente (GEENS et al., 2012).
Diversas condições podem fazer o BPA migrar do plástico para o alimento ou meio ambiente, mas em altas temperaturas as ligações do polímero hidrolisam e liberam o BPA do plástico em maiores quantidades (BILES et al, 1997; COOPER et al., 2011). Desta forma, o ser humano pode se expor ao BPA através do ar e do solo ou pelo contato direto com a pele, no entanto a ingestão oral é a principal forma de exposição (KANG et al., 2006).
Cada vez mais evidências associam o BPA ao comprometimento da função reprodutiva masculina (SALIAN et al., 2011, WISNIEWSKI et al., 2015). Alguns estudos já investigaram a ligação da exposição humana ao BPA e o comprometimento da função reprodutiva. A presença de BPA na urina de homens jovens e adultos foi relacionada à uma baixa qualidade de espermatozoides no sêmen (LASSEN et al., 2014; LI et al., 2010, 2011; PERETZ et al., 2014).
Além disso, o BPA também tem sido associado à outros problemas de saúde, dentre eles estão diabetes, obesidade, doenças cardiovasculares, e câncer (BATISTA et al., 2012; LEE et al., 2012; PANT et al., 2011; SHANKAR; TEPPALA, 2012; WANG et al., 2012).
2.1.2 Toxicocinética e toxicodinâmica do BPA
A exposição humana ao BPA já foi demonstrada através da dosagem do BPA no soro de homens e mulheres, com concentração média de 1,49 ± 0,11 e 0,64 ± 0,10 ng/mL, respectivamente (TAKEUCHI; TSUTSUMI, 2002). Já em um estudo utilizando ratos adultos como modelo experimental, o BPA mostrou se distribuir amplamente por todo corpo dos animais (YOO et al., 2000).
O período gestacional e neonatal são conhecidos por possuírem estágios críticos para diferenciação e desenvolvimento dos órgãos. Estudos mostram, em ratos, que no período gestacional, o BPA se distribui rapidamente pelo sangue materno e pode atravessar a barreira placentária, sendo capaz de alcançar o feto em pouco tempo após a administração intravenosa (TAKAHASHI; OISHI, 2000). Além disso, o BPA também já foi detectado no leite da mama de ratas (YOO et al., 2001).
Além dos resultados obtidos em estudos com animais de laboratório, quantidades significativas de BPA já foram dosadas em humanos, confirmando sua presença no soro materno durante a gravidez, soro fetal, líquido amniótico, cordão umbilical e tecido placentário (IKEZUKI et al., 2002; SCHÖNFELDER et al., 2002). O que mostra que o BPA atravessa facilmente a barreira placentária e confirma a exposição fetal ao BPA através da mãe.
O BPA, assim como outros desreguladores endócrinos (EDs), atua como falsa molécula de esteroide, podendo deslocar os estrogênios naturais dos seus respectivos receptores, se ligar à eles e produzir uma resposta, que pode mimetizar ou bloquear a ação dos estrogênios endógenos, causando desregulação no comando do sistema endócrino (HALL; KORACH, 2002; PENNIE et al., 1998; ROUTLEDGE et al., 2000).
A toxicidade reprodutiva dos EDs é mediada, principalmente, por receptores de hormônios esteroides, como os receptores estrogênicos (ERs) e os receptores androgênicos (ARs). O ER é um membro da superfamília de receptores nucleares que modulam a expressão de genes, normalmente como consequência de um ligante vinculativo. Existem dois subtipos de ER, o ER alfa (ERα ou ESR1) e o ER beta (ERβ ou ESR2) (JAMESON, 2006; KUIPER et al., 1997). Resultados de estudos demonstram que o BPA pode interagir com os dois subtipos do receptor de estrogênio desencadeando efeitos estrogênicos ou antiestrogênicos (LI et al., 2012; MATTHEWS et al., 2001).
Inicialmente o BPA foi considerado um estrógeno ambiental fraco devido à sua afinidade relativamente baixa para os ERs, quando comparado à outros xenoestrogênios (ANDERSEN et al., 1999; FANG et al., 2000). No entanto, estudos têm revelado que o BPA
pode estimular respostas celulares em concentrações muito baixas, abaixo dos níveis que se espera que ele se ligue aos ERs, e também que o BPA é equipotente ao estradiol em alguns dos seus efeitos (ALONSO-MAGDALENA et al., 2005; HUGO et al., 2008; ZSARNOVSZKY et al., 2005).
Os efeitos estrogênicos do BPA já foram demonstrados em ensaios de laboratório, tanto in vitro como in vivo (RICHTER et al., 2007; WETHERILL et al., 2007). Esses efeitos podem levar a alterações nos órgãos reprodutores masculinos, incluindo os testículos, epidídimo e vesículas seminais, bem como prejudicar a produção hormonal e espermatogênese (GÁMEZ et al., 2014; NAKAMURA et al., 2010; RICHTER et al., 2007; SALIAN et al., 2009a; WISNIEWSKI et al., 2015) e ocorrem devido à exposição ao BPA no início da vida ou na vida adulta (QUIGNOT et al., 2012; QIU et al., 2013; SALIAN et al., 2009a; VOM SAAL et al., 1998; WANG et al., 2014; WISNIEWSKI et al., 2015).
2.2 Eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular (HHT)
O desenvolvimento do sistema reprodutor ocorre durante a vida fetal, sendo que do final da gestação até o início da vida pós natal, acontece a diferenciação sexual do cérebro, período conhecido como janela de diferenciação sexual hipotalâmica. Nesta fase, a diferenciação sexual ocorre pela presença da enzima aromatase, que no processo de aromatização, converte a testosterona fetal em 17β-estradiol (E2), o qual é responsável pela masculinização do cérebro, tornando o hipotálamo acíclico (MACLUSKY; NAFTOLIN, 1981).
Na infância o sistema reprodutivo fica inativo e a sua reativação acontece na adolescência, quando há maturação sexual, caracterizada pela ativação fisiológica do eixo HHT (MARSHALL; TANNER, 1970). O início da puberdade é decorrente de uma série de eventos complexos que conduzem ao funcionamento do eixo HHT e maturação do sistema reprodutor (OJEDA; SKINNER, 2006; PARENT et al., 2003). O despertar do eixo HHT na puberdade e sua função adequada durante a vida adulta, dependem da organização e função correta do hipotálamo nos períodos críticos do desenvolvimento (GORE, 2008).
O eixo HHT constitui a relação entre o sistema nervoso central e os testículos e desempenha um papel fundamental na produção de hormônios esteroides e também na reprodução masculina. Nesta relação, o hipotálamo age como o centro de integração para o sistema reprodutivo e controla desde os sinais que regulam a região central até o feedback promovido pelos testículos (EVERETT, 2006). O hormônio liberador de gonadotrofinas
(GnRH), o hormônio luteinizante (LH), o hormônio folículo-estimulante (FSH) e os hormônios esteroides sexuais, são produtos hormonais do eixo HHT (figura 2) (JEONG; KAISER, 2006).
Figura 2 – Eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular. Adaptado. Fonte: Copyright © 2007 Pearson Education, inc., publishing as Benjamin Cummings. Fig. 26-11, http://www.colorado.edu/intphys/Class/IPHY3430-200/image/26-11.jpg.
O GnRH é um decapeptídeo produzido dentro de neurônios hipotalâmicos específicos. Após ser secretado pelo hipotálamo no sistema portal hipofisário, o GnRH estimula as células gonadotróficas na hipófise anterior a sintetizar e secretar as gonadotrofinas, LH e FSH. O estímulo hipotalâmico para liberação de gonadotrofinas ocorre em intervalos periódicos (pulsátil), o que favorece a atividade adequada do sistema reprodutor masculino (JEONG; KAISER, 2006).
O LH e o FSH pertencem à família dos hormônios glicoproteicos, juntamente com o hormônio tireotrófico (TSH), que também é produzido pela hipófise, e a gonadotrofina coriônica (CG) produzida pela placenta. Estes hormônios heterodiméricos são constituídos por uma subunidade alfa (α) e uma subunidade beta (β), associadas através de ligações não covalentes. A subunidade α é comum e a subunidade β é responsável pela atividade específica de cada hormônio (BOUSFIELD et al., 2006; NILSSON et al., 1986; PIERCE; PARSONS, 1981). As gonadotrofinas agem sobre as gônadas através da ligação aos receptores localizados
na membrana das células alvo. O LH estimula a síntese dos hormônios esteroides sexuais, como a testosterona e o estradiol, e o FSH atua no controle da produção de espermatozoides. Além de agirem nas gônadas, regulando a gametogênese, os hormônios esteroides fazem a retroalimentação (feedback) sobre o hipotálamo e a hipófise (EVERETT, 2006).
A ação dos genes que controlam o eixo HHT, codifica uma rede complexa de fatores de transcrição, hormônios, enzimas e receptores hormonais, sendo responsável pelo desenvolvimento e manutenção da função reprodutiva (ACHERMANN et al., 2002).
Assim como outros membros da superfamília de receptores nucleares, os receptores androgênicos e estrogênicos funcionam como um fator de transcrição quando induzidos por uma ligação. A ligação dos hormônios aos receptores nucleares induz a dimerização do receptor, o que facilita a sua capacidade de se ligar ao seu elemento de resposta cognato e recrutar co-reguladores para promover a expressão de genes-alvo (HEINLEIN; CHANG, 2002).
O desenvolvimento e a maturação sexual masculina, bem como a manutenção dos órgãos reprodutores e a espermatogênese, necessitam de uma regulação adequada da atividade androgênica. Os androgênios esteroides principais, a testosterona (T) e o seu metabólito 5α-dihidrotestosterona (DHT), medeiam predominantemente os seus efeitos biológicos através da ligação ao receptor androgênico (QUIGLEY, 1998; ROY et al., 1999).
O sistema reprodutor masculino é formado pelos testículos, epidídimos e órgãos acessórios, como as glândulas bulbouretrais, a vesícula seminal e a próstata. O parênquima testicular compreende os túbulos seminíferos com o epitélio germinativo e as células de Sertoli. As células germinativas são envolvidas pelas células de Sertoli desde a periferia até o lúmen do túbulo, formando a barreira hemato-testicular. As células de Leydig estão presentes no tecido intersticial e são responsáveis pela produção testicular de andrógenos (KEER et al., 2006).
O testículo adulto desempenha duas funções principais: primeiramente a atividade endócrina, produzindo andrógenos importantes para a expressão das características sexuais secundárias e manutenção da espermatogênese. Em segundo, a produção de espermatozoides altamente especializados a partir das espermatogônias que se localizam no compartimento basal dos túbulos seminíferos. As funções dos testículos, esteroidogênese e gametogênese, são processos finamente ajustados que envolvem a correlação de várias células. O LH, após ser secretado pela hipófise, atua estimulando as células de Leydig a produzir e secretar testosterona, hormônio essencial para a promoção da espermatogênese, um processo de produção, diferenciação e maturação dos espermatozoides, este processo ocorre nas células de Sertoli, quando estimulada pela presença do FSH (O’DONNELL et al., 2006; VERHOEVEN, 1992).
2.3 Eixo HHT e o BPA
O bom funcionamento do eixo HHT é necessário para a regulação normal do sistema reprodutor masculino. Sendo que o período perinatal é uma fase crítica para o desenvolvimento e organização do eixo reprodutivo, e qualquer perturbação pode influenciar no seu funcionamento normal. Alterações hormonais mínimas, durante este período, podem causar um impacto longo e duradouro sobre a fertilidade (LI et al., 2011).
A gametogênese e a esteroidogênese, principais funções do testículo, são criadas durante a vida fetal e seu desenvolvimento adequado é essencial para a função reprodutiva do adulto. Os problemas relacionados à função reprodutiva masculina vem aumentando progressivamente durante os últimos anos. Estudos clínicos, epidemiológicos e experimentais sugerem que esses problemas podem ter início durante o desenvolvimento fetal (TOPPARI et al., 1996; SHARPE; IRVINE, 2004).
O BPA representa um risco significativo para a saúde devido à sua ampla presença no meio ambiente e em produtos de consumo, principalmente pela sua atividade estrogênica. Estudos indicam que a exposição ao BPA pode causar um comprometimento da fertilidade, espermatogênese e alterações no perfil de expressão de receptores esteroides testiculares (QIU et al., 2013; RICHTER et al., 2007). Tem sido demonstrado também que os efeitos adversos do BPA não possuem uma dose resposta linear, ou seja, seus efeitos, principalmente sobre o eixo reprodutivo, podem ocorrer em doses mais baixas do que se espera, gerando novos padrões na avaliação da toxicidade do BPA (VOM SALL et al., 1998; VOM SAAL; HUGHES, 2005).
A exposição humana aceitável para produtos químicos é calculada após a realização de análises toxicológicas que determinam os níveis de exposição em que não são observados efeitos adversos, a NOAEL (no observed adverse effect level) (MELNICK et al., 2002). A NOAEL reprodutiva para o BPA, em ratos, foi previamente determinada como sendo de 50 mg/kg/dia (FAO/WHO, 2011). Portanto, podem ser considerados efeitos de baixa dose quando a resposta à dose não é linear e resultados com efeitos significativos em doses abaixo da NOAEL (MELNICK et al., 2002).
Muitos estudos com BPA utilizam doses muito abaixo da NOAEL e mesmo assim observam efeitos adversos causados pela exposição ao BPA. Além disso, a vulnerabilidade não é a mesma em todas as fases da vida, existem janelas críticas do desenvolvimento que são mais sensíveis à exposição ao BPA (WELSHONS et al., 2006). No período perinatal, por exemplo, a fase de diferenciação sexual é considerada muito sensível e vulnerável, onde pequenas
perturbações hormonais podem ter um grande impacto sobre a fertilidade (SAUNDERS et al., 1997; WATANABE et al., 2003).
Os estudos disponíveis relacionando os efeitos do BPA sobre a função reprodutiva englobam períodos longos de exposição, o que dificulta o entendimento de mecanismos específicos das alterações observadas. Prejuízos na espermatogênese e alterações no perfil hormonal já foram observados em descendentes expostos durante todo o período de gestação e lactação.
Estudos também já demonstraram que a exposição ao BPA na idade adulta causa danos à função reprodutiva, no entanto faltam informações disponíveis sobre os mecanismos envolvidos na patogênese reprodutiva masculina, causada pela exposição ao BPA apenas durante o período crítico da diferenciação sexual hipotalâmica. Isso torna importante a investigação dos efeitos do BPA na expressão de genes relacionados ao controle do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular, após a exposição no período crítico de diferenciação sexual hipotalâmica.
3 OBJETIVOS
3.1 Hipótese Central e Objetivo Geral
Hipótese central: A exposição perinatal ao bisfenol A (BPA), mesmo em doses consideradas baixas, altera os processos de diferenciação sexual do sistema nervoso central e de início da puberdade, ocasionando distúrbios fisiológicos do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular (HHT) no adulto.
Objetivo Geral: Avaliar se a exposição perinatal ao BPA, em doses inferiores à NOAEL reprodutiva, durante a janela de diferenciação sexual hipotalâmica causa alterações na regulação do eixo HHT.
3.2 Objetivos específicos
Avaliar o efeito da exposição perinatal ao BPA: o na evolução do peso corporal;
o na idade e peso à puberdade;
o no peso de tecidos do trato reprodutivo, como testículo, epidídimo e vesícula seminal; o no perfil sérico hormonal de testosterona, estradiol, LH e FSH;
o na expressão de genes relacionados ao controle do eixo HHT, através da quantificação do mRNA desses genes, no hipotálamo (Gnrh1, Ar, Esr1, Esr2), na hipófise (Gnrhr, Lhb, Fshb, Ar, Esr1, Esr2) e no testículo (Lhcgr, Fshr, Inhbb).
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
Para se avaliar o efeito da exposição perinatal ao bisfenol A (BPA) sobre o eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular foram utilizados ratos Wistar como modelo experimental. Os mesmos foram obtidos no Biotério Central da Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Durante todo o período experimental, os animais foram mantidos em caixas de polipropileno (43 x 43 x 20 cm) com uma camada de 5 cm de maravalha e alimentados com ração comercial (Nuvilab CR-1, Nuvital, PR, Brasil) e água ad libitum. A sala de manutenção foi mantida em ciclo de 12:12 horas claro/escuro e temperatura controlada (22 ± 2 ºC). Todos os procedimentos estão de acordo com o preconizado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa com animais da Universidade Estadual do Centro-Oeste, sob parecer 012/2014.
4.2 Delineamento experimental
Para obtenção das proles a serem avaliadas, doze ratas de 90 dias de idade foram acasaladas em sistema bigâmico. O início da gestação (dia gestacional, GD1) foi confirmado pela constatação de espermatozoide no esfregaço vaginal realizado três vezes ao dia. A partir do GD18 iniciou-se a administração do BPA (Bisphenol A, 2,2-Bis (hydroxyphenyl) propane, Sigma-Aldrich, USA) que se estendeu até o dia pós-natal 5 (PND5).
O BPA foi diluído em óleo de milho e administrado por via subcutânea, somente para as mães, uma vez ao dia, no volume de 0,10 mL/100 g de peso corporal entre 7:00 e 8:00 h. As ratas prenhes foram divididas em 3 grupos:
1 – que recebeu a dose de 0,5 mg de BPA/kg, correspondente a 1/100 da NOAEL reprodutiva (FAO/WHO, 2011);
2 – que recebeu a dose de 5 mg de BPA/kg, correspondente a 1/10 da NOAEL reprodutiva (FAO/WHO, 2011);
3 – ou grupo controle, que recebeu somente o óleo de milho.
No PND5 as ninhadas foram padronizadas para 8 filhotes por fêmea e esta proporção foi mantida até o desmame no PND21 (ROMANO et al., 2012). A quantidade de ratos de cada
grupo foi determinada de acordo com os filhotes machos nascidos de cada rata previamente selecionada para cada tratamento, variando de 16 a 23 por grupo.
No dia do desmame os filhotes machos foram pesados e mantidos em grupos de quatro a cinco animais por caixa até completarem 90 dias de idade (PND90), quando foram eutanasiados por sobrecarga anestésica seguida de decapitação.
4.3 Curva de crescimento, idade e peso à puberdade
Os filhotes foram pesados no dia do desmame e a partir do PND35 foram pesados semanalmente para o acompanhamento da evolução do peso corporal e comparação entre os diferentes tratamentos.
A idade ao início da puberdade foi obtida através da verificação da separação balanoprepucial, que é o descolamento da membrana prepucial que permite a externalização da glande peniana. Esse processo é diretamente relacionado à elevação da testosterona sérica pelo estímulo às células de Leydig, caracterizando o início da maturação reprodutiva (KORENBROT et al., 1977). Essa avaliação foi realizada diariamente a partir do PND30, através da manipulação da região genital, até a idade da completa exposição da glande peniana, ocasião onde o animal foi também pesado.
4.4 Colheita e armazenamento de tecidos
4.4.1 Sangue
Primeiramente, os animais foram anestesiados com uma solução de quetamina (10 mg/100g PC) e xilazina (2 mg/100g PC), o sangue foi coletado por punção cardíaca e centrifugado a 3.500 rpm (Excelsa II 206 BL, São Paulo, SP, Brasil) por 15 min. O soro foi separado em alíquotas individuais e mantido a -80 °C até as subsequentes análises hormonais.
4.4.2 Colheita dos tecidos para pesagem
Em seguida, os animais foram decapitados e um dos testículos, juntamente com o epidídimo e a vesícula seminal de cada animal foram retirados e congelados em nitrogênio líquido e, posteriormente, armazenados em um freezer a -80 ºC até o dia da pesagem. No dia da pesagem, os tecidos foram descongelados e pesados em uma balança de precisão analítica.
O testículo foi separado do epidídimo e pesado, então o epidídimo foi dividido em 3 segmentos, cabeça, corpo e cauda, sendo que a cabeça foi pesada juntamente ao corpo. A vesícula seminal foi pesada primeiramente repleta e depois de drenada. Os resultados foram expressos em valores absolutos e também normalizados para o proporcional a 100g de peso corporal.
4.4.3 Colheita de tecidos para biologia molecular
A hipófise, o hipotálamo e um dos testículos foram rapidamente excisados, armazenados em microtubos, congelados em nitrogênio líquido e mantidos a -80 °C até as subsequentes análises.
4.5 Identificação das alterações de expressão gênica pela quantificação do mRNA de genes de regulação do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular (HHT)
4.5.1 Homogeneização e Extração de RNA total de tecidos
Os tecidos (hipófise, hipotálamo e testículo) foram pulverizados em N2 utilizando-se gral e pistilo. As amostras pulverizadas foram transferidas para microtubos e armazenadas a -80 °C.
O RNA total dos tecidos foi extraído pelo método de guanidina-fenol-clorofórmio (CHOMCZYNSKI; SACCHI, 1987) através da utilização do Reagente Trizol® (Life Technologies, Carlsbad, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Para a extração de RNA total do hipotálamo e da hipófise utilizou-se todo o órgão; e para o testículo utilizou-se uma alíquota de 50mg. Na primeira etapa da extração, homogeneizou-se o pulverizado em 1000 µL do Reagente Trizol® durante 1 min por agitação em vórtex e, a seguir, a amostra foi mantida por 5 minutos em temperatura ambiente. Adicionou-se 200 µL de clorofórmio em cada microtubo, homogeneizou-se em vórtex e incubou-se durante 5 minutos à temperatura ambiente. A separação de fases foi realizada por centrifugação a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. A fase aquosa foi transferida para um microtubo novo e o RNA total presente nesta fase foi precipitado com 500 µL de isopropanol a 100 %, incubando-se as amostras por 10 min a temperatura ambiente (para o testículo) ou overnight a -20 °C (para o hipotálamo e hipófise). Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C, para formação do sedimento (pellet). O sobrenadante foi descartado e o pellet lavado duas vezes
com 500 µL de etanol a 75 %. Após secar a temperatura ambiente por 5 minutos, adicionou-se de 10 a 30 µL de água livre de RNase para ressuspender o pellet.
A concentração do RNA total foi estimada pela densidade óptica (DO) da solução, utilizando nano espectrofotômetro Kasvi modelo K23-0002, mensurando-se a absorbância a 260 nm e o grau de pureza foi determinado pela razão A260nm/280nm. Após a quantificação, uma alíquota das amostras foi submetida à eletroforese em gel de agarose a 1,2 % em tampão TBE, para análise da integridade do RNA e o restante da amostra foi armazenada a -80 °C.
4.5.2 Reação de Transcrição Reversa (RT)
Após a extração, 2,5 µg de RNA total foram submetidos à reação de transcrição reversa (RT) para a síntese de uma fita de DNA complementar à fita de mRNA (cDNA), com o uso do kit GoScriptTM Reverse Transcription System (Promega, Madison, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Para isso, adicionou-se em cada amostra 0,5 µL de oligo dT (0,5µg/µl) e incubou-se a 70 ºC por 5 min, para abertura da fita de RNA. Em seguida, adicionou-se 0,5 mM de cada dNTP, 2 µL de GoScript 5X buffer, 0,25 µL de inibidor de RNAse (Rnasin), 0,5 µL de enzima (200U/µl) M-MLV Reverse Transcriptase e água livre de nucleases qsp 10 µL. A reação ocorreu num ciclo de 25 ºC por 5 min e em seguida a 42 ºC por 60 min (Termociclador Axygem Maxygene modelo THERM-1000). Para cada reação obteve-se 10 µL de solução com concentração final de cDNA estimada em 250 ng/µL. As amostras foram armazenadas a -20 ºC até subsequentes análises de PCR em tempo real.
4.5.3 Confecção dos oligonucleotídeos (primers)
As sequências de referência dos transcritos dos genes de interesse foram obtidas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Os oligonucleotídeos foram confeccionados com o auxílio do recurso Pick Primer disponível no GenBank, de forma a amplificar ao menos uma região de junção entre dois exons distintos, proporcionando maior especificidade e não amplificação de DNA genômico. Os pares de oligonucleotídeos foram verificados quanto à ligações complementares pelos recursos do OligoAnalyzer 3.1 (http://www.idtdna.com/calc/analyzer). O tamanho dos fragmentos gerados pela reação de PCR em tempo real foram confirmadas em eletroforese em gel de agarose a 1,2 % em TBE, onde o padrão de migração da amostra foi comparado ao padrão de massa molar de 100 pb (100bp
DNA Ladder, LifeTechnologies, Carlsbad, USA). No quadro 1 são mostrados os nomes dos genes, as sequências dos oligonucleotídeos e o número da sequência de referência utilizada.
Quadro 1 – Primers forward (F) e reverse (R) de cada gene utilizados para o ensaio de PCR em tempo e as respectivas sequências de referência.
Gene Primer (5’-3’) Sequência de
referência Ar (Receptor de andrógeno) F: GCCATGGGTTGGCGGTCCTT R: AGGTGCCTCATCCTCACGCACT NM_012502.1 Esr1 (Receptor de estradiol 1) F: CCATATCCGGCACATGAGTA R: TGAAGACGATGAGCATCCAG NM_012689.1 Esr2 (Receptor de estradiol 2) F: CTCACGTCAGGCACATCAGT R: TGTGAGCATTCAGCATCTCC NM_012754.1 Gnrh1 (Hormônio liberador de gonadotrofinas) F: AGGAGCTCTGGAACGTCTGAT R: AGCGTCAATGTCACACTCGG NM_012767.2 Gnrhr (Receptor do hormônio liberador de gonadotrofinas) F: GCTGCCTGTTCATCATCCCT R: CTGTAGTTTGCGTGGGTCCT NM_031038.3 Lhb (Hormônio luteinizante) F: ATGAGTTCTGCCCAGTCTGC R: GTGGGTGGGCATCAGAAGAG NM_012858.2 Fshb (Hormônio folículo estimulante) F: AAGTCGATCCAGCTTTGCAT R: GTCCCAGGCCTCTTACAGTG NM_0010075 97.1 Lhcgr (Receptor de hormônio luteinizante) F: AGTGGAGCCTTCCAGGGGGC R: AGGAAGACAGGGCGATGAGCGT NM_012978.1 Fshr (Receptor de hormônio folículo estimulante) F: TCACTGGCTGTGTCATTGCTC R: GAGATCTCTATTTTCTCCAGGTCTC NM_199237.1 Inhbb (Inibina Beta) F: GAGCGCGTCTCTGAGATCAT R: GAAGAAGTACAGGCGGACCC NM_080771.1 Rpl19 (Proteína ribossomal L19) F: CAATGAAACCAACGAAATCG R: TCAGGCCATCTTTGATCAGCT NM_031103.1 Ppia (Peptidilprolil isomerase A) F: GTCAACCCCACCGTGTTCTTC R: ACTTGCCACCAGTGCCATTATG NM_017101.1
4.5.4 Padronização dos primers
Para padronizar os primers, a partir de amostras de teste de cada tecido (testículo, hipófise e hipotálamo), obteve-se o cDNA através da reação de RT. O cDNA foi diluído serialmente e a eficiência de ligação dos primers foi avaliada. Para cada uma das diluições de cDNA foram realizadas curvas com ciclos de amplificação para cada primer. Assim as condições de amplificação (concentrações de cDNA e primer) foram padronizadas para cada gene. A eficiência ideal deve estar entre 90 e 110 % (LIVAK; SCHMITTEGEN, 2001). Foi necessário utilizar reagentes de duas empresas diferentes para o melhor resultado de eficiência: o kit Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UGD (Life Technologies Corporation, Van Allen Carlsbad, CA, USA) e o kit KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X) Universal (Kapa Biosystems, Boston, Massachusetts, United States). Para confirmar a especificidade da reação, fez-se uma curva de dissociação, utilizando como base a temperatura de dissociação (melt point), que consiste no aquecimento lento das amostras, indo de 58 ºC para 95 ºC e deve resultar em um único amplicon por amostra.
4.5.5 Reação de quantificação por PCR em tempo real a partir da transcrição reversa (RT-qPCR)
A expressão dos genes responsivos ao eixo HHT foi avaliada pelo método de PCR quantitativo em tempo real. Neste método, as etapas de amplificação e detecção da reação são combinadas por corantes fluorescentes, onde o aumento do sinal fluorescente é proporcional à quantidade de DNA produzida em cada ciclo de PCR. A quantidade relativa de mRNA dos genes estudados foi comparada com os níveis de mRNA do gene constitutivo de todas as amostras, a proteína ribossomal L19 (Rpl19) ou a peptidilprolil isomerase A (Ppia).
O método utilizado realiza a detecção em tempo real do produto de PCR através do reagente Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix (Life Technologies) ou do reagente KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (Kapa Biosystems), a intensidade da fluorescência emitida foi quantificada pelo equipamento ABI Prism 5700 detector (StepOnePlus, Applied Biosystems, Singapura).
De acordo com a padronização, para cada gene foi realizada uma reação de PCR em tempo real em duplicata. O volume da reação foi de 10 µL, sendo 1 µL de cDNA, 5 µL de Platinum® SYBR® Green SuperMix e 0,8, 1 ou 2 µM de cada par de primer, dependendo do gene a ser quantificado. As condições de amplificação consistiu de uma desnaturação inicial à
uma temperatura de 95 ºC por 2 min seguido de 40 ciclos de 95 ºC durante 15 segundos e 60 ºC durante 30 segundos para anelamento e extensão.
Da mesma forma, para o reagente KAPA SYBR® foram realizadas reações de PCR em tempo real em duplicata. O volume da reação foi de 10 µL, sendo 1 µL de cDNA, 5 µL de KAPA SYBR FAST Master Mix e a quantidade de primer foi de 0,2 ou 1µM, conforme o gene a ser quantificado, de acordo com a padronização descrita anteriormente. As condições de amplificação consistiram de uma desnaturação inicial à uma temperatura de 95 ºC por 3 minutos seguido de 40 ciclos de 95 ºC durante 15 segundos e 60 ºC durante 1 minuto para anelamento e extensão.
Ao final das reações, os dados foram analisados no Excel-Microsoft Office, e as amostras a serem estudadas foram normalizadas pelos seus controles correspondentes, conforme o método de delta-delta Ct (LIVAK; SCHMITTEGEN, 2001).
4.6 Dosagens séricas hormonais
O soro previamente separado e mantido a -80 °C foi encaminhado ao Laboratório de Endocrinologia da Universidade Federal de São Paulo, onde as análises hormonais de testosterona, estradiol foram realizadas. O LH e o FSH foram analisados no Laboratório Especializado em Análises Científicas, LEAC, em São Paulo, SP.
4.6.1 Testosterona
A testosterona foi quantificada no soro dos animais dos grupos tratados e do grupo controle, pelo imunoensaio de eletroquimioluminescência com o uso de kit comercial Elecsys Testosterone II Immunoassay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA. Esse ensaio emprega um princípio competitivo, usando um anticorpo monoclonal com elevada afinidade e especificidade para a testosterona. A testosterona endógena, liberada a partir da amostra pelo 2-bromoestradiol, compete por sítios de ligação nos anticorpos biotinilados com o derivado de testosterona marcado com um complexo rutênio.
Primeiramente incubou-se as amostras com o anticorpo monoclonal biotinilado testosterona específico, onde a quantidade de imunocomplexo formado é dependente da concentração do analito na amostra. Em seguida, adicionou-se micropartículas revestidas de estreptavidina e um derivado de testosterona marcado com um complexo de rutênio, o complexo formado liga-se à fase sólida pela interação da biotina e da estreptavidina. A mistura
da reação foi aspirada para a célula de medição onde as micropartículas são fixadas magneticamente para a superfície do eletrodo. Então, as substâncias não ligadas são removidas pelo ProCell. Por fim, aplicou-se uma corrente elétrica ao eletrodo para induzir a emissão de quimioluminescência que foi medida por um fotomultiplicador. Os resultados foram calculados de acordo com uma curva de calibração, que é gerada especificamente com uma calibração de 2 pontos e uma curva principal incluída no código de barras do reagente.
4.6.2 Estradiol
A quantificação de estradiol foi realizada no soro dos animais utilizando o kit comercial Elecsys Estradiol II Immunoassay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA. O imunoensaio, assim como para dosagem de testosterona, foi realizado por eletroquimioluminescência. O princípio do método é o mesmo utilizado para a testosterona, ressalva a utilização de um anticorpo biotinilado estradiol específico, a técnica foi a mesma descrita anteriormente.
4.6.3 LH e FSH
As concentrações séricas de LH e FSH foram determinadas pelo ensaio de quimioluminescência com o kit comercial Milliplex MAP rat pituitary panel, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA. Este kit utiliza a tecnologia Luminex xMAP baseada no processo que cora microesferas de poliestireno com dois corantes fluorescentes. Com concentrações precisas desses corantes, 100 conjuntos coloridos distintos de esferas podem ser criados, cada conjunto é revestido com um anticorpo de captura específico. O analito da amostra teste é capturado pelas esferas, então ocorre uma detecção biotinilada do anticorpo. Em seguida a reação de mistura é incubada com o conjugado Estreptavidina-ficoeritrina (AS-PE reporter, emite sinal fluorescente), para que complete a reação na superfície de cada microesfera. As microesferas passam rapidamente através de um laser que excita os corantes internos, marcando um conjunto de microsferas. Um segundo laser excita o corante fluorescente PE, na molécula reporter. Por fim, cada microesfera é identificada individualmente por processadores de sinais digitais a alta velocidade, que quantificam o resultado do bio-ensaio baseados em sinais reporter fluorescentes.
4.7 Análise estatística
As variáveis foram primeiramente submetidas ao teste de normalidade de Kolmogorov– Smirnov e o teste de homocedasticidade de Bartlett. Aos dados que apontaram para a análise não paramétrica, foi utilizada a análise de the Kruskal–Wallis seguida pelo pós-teste de Dunn. E quando os dados apontaram para análise paramétrica, foi utilizada ANOVA seguida pelo pós-teste de Tukey HSD (Honest Significance Difference). Todas as análises foram realizadas com o auxílio do software Statistica 7.0 (Statsoft Inc, Tulsa, OK, USA) e Graphpad Prism 5,0. Foram consideradas diferenças estatísticas quando o valor de p foi menor que 0,05.
5 RESULTADOS
Para verificar as possíveis alterações ocasionadas pela exposição perinatal ao BPA durante a janela de diferenciação sexual hipotalâmica, foi avaliada a expressão dos transcritos (mRNA) de genes relacionados com o controle do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular. Além disso, fez-se a dosagem sérica hormonal de testosterona, estradiol, LH e FSH. Para o estudo dos órgãos periféricos realizou-se a pesagem de tecidos androgênio dependentes, testículo, epidídimo e vesícula seminal.
5.1 Evolução do peso corporal
O desenvolvimento dos animais foi acompanhado através da evolução do peso corporal individual. Os animais foram pesados no dia do desmame (PND21) e a partir do PND35 foram pesados semanalmente até o PND77 e no PND90, quando o experimento foi concluído.
O objetivo dessa avaliação foi verificar se o BPA poderia afetar de alguma maneira o desenvolvimento dos animais. Através da figura 3 e pela análise estatística pode-se observar que o BPA não comprometeu o metabolismo dos animais tratados comparando-os ao grupo controle (p=0,20). Esse resultado facilita a interpretação dos parâmetros analisados na sequência, pois delimita as causas das alterações observadas sobre o eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular.
Figura 3 – Gráfico de evolução do peso corporal dos ratos dos grupos tratados com 0,5 e 5 mg/Kg de BPA e do grupo controle do 21º ao 90º dia de idade dos animais. Os valores estão expressos pela média ± E.P.M. Análise multivariada de variâncias para medidas repetidas (MANOVA), p>0,05, n = 16-23/grupo. BPA: bisfenol A; E.P.M.: erro padrão da média.
5.2 Idade e peso à puberdade
A verificação da idade e peso à puberdade foi realizada utilizando o método de separação balanoprepucial e exposição completa da glande peniana. No 30º dia de idade dos animais deu-se início à monitoração em todos os animais de todos os grupos que estendeu-se até a constatação da puberdade. No momento em que a puberdade foi constatada a idade e o peso do animal foram registrados.
A tabela 1 apresenta a mediana da idade em dias, juntamente com o intervalo interquartílico e também a média dos pesos ± E.P.M. dos animais. A exposição ao BPA no período perinatal atrasou a idade à puberdade em ambos os grupos tratados em relação ao controle. O peso corporal também foi maior nesses grupos.
Tabela 1 – Idade e peso à puberdade dos ratos dos grupos controle e tratados com BPA. Os dados estão expressos em mediana e intervalo interquartílico para a idade (Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn) e média ± E.P.M. para o peso (ANOVA e pós-teste de Tukey), n=16-23/grupo. BPA: bisfenol A; E.P.M.: erro padrão da média; ANOVA: análise de variâncias.
Grupos Idade (dias) Peso (g)
Controle 40 (40-41)a 194,03 ± 2,52a
BPA 0,5 mg/Kg PC 44 (43-44)d 208,19 ± 1,50d
BPA 5 mg/Kg PC 44,5 (43,25-45)d 204,66 ± 3,15c
a, d letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente (p<0,001); a, c letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente (p<0,05)
5.3 Peso dos tecidos do trato reprodutivo
5.3.1 Testículo
O peso dos testículos não apresentou diferença significativa dos grupos tratados com BPA comparados ao grupo controle, tanto para o peso absoluto, como para o peso relativo (p>0,05). A média e o desvio padrão dos grupos estão representados na tabela 2.
Tabela 2 – Peso absoluto (g) e relativo (mg/100g PC) do testículo dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. ANOVA e pós-teste de Tukey, n=16-23/grupo. BPA: bisfenol A; E.P.M.: erro padrão da média; ANOVA: análise de variâncias.
Grupos Testículo Peso absoluto (g) Testículo Peso relativo (mg/100g PC) Controle 1,59 ± 0,025 403,48 ± 6,68 BPA 0,5 mg/Kg PC 1,54 ± 0,041 376,77 ± 11,97 BPA 5 mg/Kg PC 1,50 ± 0,033 376,37 ± 12,76
5.3.2 Epidídimo
O epidídimo foi subdividido em três segmentos: cabeça, corpo e cauda, sendo que a cabeça foi analisada juntamente com o corpo. O peso dos segmentos, cabeça + corpo foi menor no grupo tratado com maior dose de BPA (5 mg/Kg) em relação ao grupo controle, tanto no peso absoluto (p<0,05) como no peso relativo (p<0,01), representados na tabela 3. Na tabela 4 observa-se que o peso da cauda do epidídimo foi maior no grupo tratado com 0,5 mg/Kg de BPA (p<0,01) em relação ao controle, porém essa elevação não foi significativa para o peso relativo desse tecido (p>0,05).
Tabela 3 – Peso absoluto (mg) e relativo (mg/100g PC) do segmento cabeça e corpo do epidídimo dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. ANOVA e pós-teste de Tukey, n=16-23/grupo. BPA: bisfenol A; E.P.M.: erro padrão da média; ANOVA: análise de variâncias.
Grupos Epidídimo (cabeça + corpo)
Peso absoluto (mg)
Epidídimo (cabeça + corpo) Peso relativo (mg/100g PC)
Controle 317,82 ± 7,68a 81,77 ± 1,46a
BPA 0,5 mg/Kg PC 326,47 ± 5,14 79,66 ± 1,31
BPA 5 mg/Kg PC 295,24 ± 5,44c 74,24 ± 1,26b
a, b letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente (p<0,01); a, c letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente (p<0,05)
Tabela 4 – Peso absoluto (mg) e relativo (mg/100g PC) do segmento cauda do epidídimo dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. ANOVA e pós-teste de Tukey, n=16-23/grupo. BPA: bisfenol A; E.P.M.: erro padrão da média; ANOVA: análise de variâncias.
Grupos Epidídimo (cauda)
Peso absoluto (mg) Epidídimo (cauda) Peso relativo (mg/100g PC) Controle 213,73 ± 4,73a 55,70 ± 1,65 BPA 0,5 mg/Kg PC 239,89 ± 6,15b 59,27 ± 1,39 BPA 5 mg/Kg PC 224,90 ± 4,62 57,50 ± 1,67
5.3.3 Vesícula seminal
A vesícula seminal foi pesada repleta de fluido e após a drenagem. O seu peso, quando repleta, foi maior no grupo tratado com 5 mg/Kg de BPA, tanto para o peso absoluto (p<0,05), quanto para o peso relativo (p<0,01) comparados ao grupo controle (tabela 5). Já o peso absoluto ou relativo da vesícula drenada não foi diferente em nenhum dos grupos tratados com relação ao controle (tabela 6).
Tabela 5 – Peso absoluto (g) e relativo (mg/100g PC) da vesícula seminal repleta dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. ANOVA e pós-teste de Tukey, n=16-23/grupo. BPA: bisfenol A; E.P.M.: erro padrão da média; ANOVA: análise de variâncias.
Grupos Vesícula seminal repleta Peso absoluto (mg)
Vesícula seminal repleta Peso relativo (mg/100g PC)
Controle 963,14 ± 33,34a 237,39 ± 11,09a
BPA 0,5 mg/Kg PC 1025,65 ± 53,73 255,33 ± 8,80
BPA 5 mg/Kg PC 1139,93 ± 47,94c 291,81 ± 14,05b
a, b letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente (p<0,01); a, c letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente (p<0,05)
Tabela 6 – Peso absoluto (g) e relativo (mg/100g PC) da vesícula seminal drenada dos ratos do grupo controle e dos grupos tratados com BPA. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. ANOVA e pós-teste de Tukey, n=16-23/grupo. BPA: bisfenol A; E.P.M.: erro padrão da média; ANOVA: análise de variâncias.
Grupos Vesícula seminal drenada Peso absoluto (mg)
Vesícula seminal drenada Peso relativo (mg/100g PC)
Controle 407,47 ± 19,93 102,15 ± 6,00
BPA 0,5 mg/Kg PC 474,53 ± 25,45 117,12 ± 5,46
5.4 Efeitos da exposição perinatal ao BPA na expressão de genes que regulam o eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular
5.4.1 Padronização dos primers
Os primers foram padronizados a fim de se obter as melhores condições de amplificação para o ensaio e confirmação da sua especificidade. Para isso, construiu-se curvas de ciclos para diluições seriadas de cDNA e foi feita uma curva padrão relativa para cada transcrito, no intuito de definir um limiar de detecção em torno de 100 % além de otimizar as quantidades de primer e de cDNA a serem utilizadas nas reações de quantificação relativa de cada transcrito. A concentração do primer também foi testada, primeiramente utilizou-se 2 µM de primer e, quando necessário, ajustou-se a concentração para 1 µM, 0,8 µM ou 0,2 µM. A seguir são mostradas as curvas de dissociação, a eficiência de amplificação obtida, as concentrações dos primers e as quantidades de cDNA otimizadas para cada tecido.
5.4.1.1 Padronização do Gnrh1, Esr1, Esr2, Ar e Rpl19 no hipotálamo
No hipotálamo utilizou-se o reagente Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix (Life Technologies) o qual demonstrou melhor resultado na eficiência de amplificação. Para o Gnrh1, a eficiência de amplificação obtida foi de 103 %. Para o Esr1, a eficiência foi de 92,6 %. Para o Esr2 a eficiência foi de 96 %. Para o Ar a eficiência obtida foi de 95,7 %. E para o Rpl19 a eficiência de amplificação foi de 91,5 %. As diluições de cDNA utilizadas para construção da curva de ciclos foram 1:5, 1:10, 1:20 e 1:40, a diluição escolhida para o ensaio com os grupos experimentais foi 1:10, pois os 5 genes apresentaram bom resultado nessa concentração. A curva de dissociação e a curva padrão relativa de cada primer padronizado estão representadas nas figuras 4 e 5.
Figura 4 – Curva de dissociação (à direita) e curva padrão relativa (à esquerda). As imagens mostram a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios
do Gnrh1 (A), Esr1 (B) e Esr2 (C) no hipotálamo. Gnrh1: hormônio liberador de gonadotrofinas; Esr1: receptor de estrógeno alfa; Esr2: receptor de estrógeno beta.
Figura 5 – Curva de dissociação (à direita) e curva padrão relativa (à esquerda). As imagens mostram a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios do Ar (A) e Rpl19 (B) no hipotálamo. Ar: receptor de andrógeno; Rpl19: proteína ribossonal L19.
5.4.1.2 Padronização do Gnrhr, Lhb, Fshb, Esr1, Esr2, Ar e Rpl19 na hipófise
Na hipófise utilizou-se o reagente Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix (Life Technologies) que também demonstrou melhores resultados para a eficiência de amplificação. Para o Gnrhr a eficiência de amplificação obtida foi de 116,8 %, para o Lhb a eficiência foi de 110,7 %, para o Fshb a eficiência foi de 98,36 %, para o Esr1 a eficiência foi de 101,9 %, para o Esr2 a eficiência foi de 104,6 %, para o Ar a eficiência foi de 107,1 % e para o Rpl19 a eficiência de amplificação obtida foi de 113,3 %. Na hipófise também utilizou-se as diluições 1:5, 1:10, 1:20 e 1:40 de cDNA para construção da curva de ciclos, os 7 genes obtiveram melhores resultados na concentração 1:20 que foi otimizada para o ensaio com os grupos experimentais. As figuras 6, 7 e 8 mostram a curva de dissociação e a curva padrão relativa obtidas na padronização dos primers na hipófise.
Figura 6 – Curva de dissociação (à direita) e curva padrão relativa (à esquerda). As imagens mostram a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios
do Gnrhr (A), Lhb (B) e Fshb (C) na hipófise. Gnrhr: receptor do hormônio liberador de gonadotrofinas Lhb: hormônio luteinizante; Fshb: hormônio folículo estimulante.
Figura 7 – Curva de dissociação (à direita) e curva padrão relativa (à esquerda). As imagens mostram a especificidade da reação e a eficiência de amplificação para os ensaios
