5.5.1 Testosterona
A dosagem sérica de testosterona aumentou no grupo tratado com 5 mg/Kg de BPA com relação ao controle (p>0,01) e no grupo tratado com 0,5 mg/Kg de BPA o aumento não foi significativo (figura 14). Os níveis de estradiol não apresentaram alteração, ficando abaixo do limite de detecção (dados não mostrados).
Figura 14 – Testosterona sérica dos ratos dos grupos tratados com 0,5 e 5 mg/Kg de BPA e do grupo controle. Houve aumento dos níveis séricos de testosterona no grupo tratado com a maior dose de BPA em relação ao controle. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. (Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn), **p<0,01 vs controle, n=16-23/grupo. BPA: bisfenol A; E.P.M.: erro padrão da média.
5.5.2 LH e FSH
Os níveis séricos de LH e FSH foram dosados e houve aumento do LH no grupo que recebeu 0,5 mg/Kg de BPA (p<0,01) com relação ao controle (figura 15A). Já a dosagem de FSH não apresentou alteração significativa (figura 15B).
Figura 15 – LH (A) e FSH (B) séricos dos ratos dos grupos tratados com 0,5 e 5 mg/Kg de BPA e do grupo controle. Houve aumento dos níveis séricos de LH no grupo tratado com a menor dose de BPA em relação ao controle. Os valores estão expressos em média ± E.P.M. (ANOVA e pós-teste de Tukey), **p<0,01 vs controle, n=7- 8/grupo. LH: hormônio luteinizante; FSH: hormônio folículo estimulante; BPA: bisfenol A; E.P.M.: erro padrão da média; ANOVA: análise de variâncias.
6 DISCUSSÃO
No presente estudo foi avaliado o efeito da exposição perinatal à baixas doses de bisfenol A, durante a janela de diferenciação sexual hipotalâmica. As fases iniciais do desenvolvimento são marcadas por uma série complexa de eventos de maturação que envolvem a organização funcional do hipotálamo, promovendo a capacidade reprodutiva na puberdade e a sua manutenção durante a vida adulta. Estudos indicam que o BPA pode ser capaz de alterar tais eventos, principalmente devido à sua atividade estrogênica. No entanto, os mecanismos desses efeitos no cérebro em desenvolvimento ainda não estão bem delineados.
Os resultados mostram a ação do BPA sobre genes e hormônios responsáveis pelo controle do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular (HHT), na vida adulta. Parâmetros como idade e peso à puberdade e pesagem de tecidos do trato reprodutivo também foram avaliados no sentido de contribuir para a identificação dos mecanismos de ação dessa substância. O objetivo foi simular uma possível contaminação devido ao uso contínuo e incorreto de produtos que contém BPA, durante períodos críticos do desenvolvimento fetal e neonatal.
O BPA demonstrou interferir na expressão de transcritos de genes responsáveis pelo controle do eixo HHT, assim como nos padrões endócrinos dos animais em estudo, afetou o início da puberdade e causou alterações no peso de tecidos androgênio dependentes. Diversos mecanismos podem estar envolvidos nessas alterações, portanto os resultados serão discutidos a fim de se compreender melhor a toxicidade reprodutiva do BPA.
A evolução do peso corporal foi acompanhada através de pesagens semanais a partir do PND21 até o PND90, observou-se que a exposição perinatal ao BPA não alterou o desenvolvimento corporal dos animais. Xi et al (2011), obtiveram o mesmo resultado utilizando camundongos expostos do GD1 ao PND20 ao BPA (12, 25 e 50 mg/Kg/dia), através da gestação e amamentação e depois diretamente por gavagem até completarem 49 dias de idade. Outro estudo com camundongos, onde somente as mães foram tratadas com 10 e 100 µg/Kg/dia de BPA, do GD9 ao GD16, também não apresentou diferença no crescimento dos filhotes machos pesados semanalmente desde o dia do desmame até completarem 6 meses (ALONSO- MAGDALENA et al., 2010). No trabalho de Rubin et al (2001), com ratos expostos ao BPA (0,1 e 1,2 mg/Kg/dia) do GD6 até o PND20, através da administração às mães, houve diferença no peso dos ratos apenas nos primeiros dias após o desmame, mas essa diferença não persistiu até completarem 110 dias de idade.
Estudos já observaram que a alteração no peso corporal é mais evidente logo após o desmame do que na vida adulta e sugerem que a exposição perinatal ao BPA pode alterar o peso
dos animais devido à mudança no ambiente hormonal do útero e de forma dependente da dose e do tempo de exposição (RUBIN; SOTO, 2009). Mostram também que o aumento do peso corporal, após a exposição perinatal ao BPA, ocorre com mais frequência em fêmeas do que em machos (RUBIN; SOTO, 2009). De acordo com o exposto, entende-se que o tratamento perinatal com BPA, pode levar à diferenças no peso corporal durante os primeiros dias de vida, porém após o desmame até a vida adulta, demonstrou não interferir no desenvolvimento dos animais.
Ao avaliar a progressão da puberdade, observou-se que houve alteração em ambos os grupos tratados com BPA, sendo que os animais desses grupos atingiram a puberdade mais tardiamente do que os animais do grupo controle. Consequentemente, o peso à puberdade dos animais tratados também foi maior. A puberdade ainda é um evento que não está totalmente esclarecido, mas sabe-se que seu início é decorrente de uma série de eventos complexos que conduzem ao funcionamento do eixo HHT e maturação do sistema reprodutor (OJEDA; SKINNER, 2006).
O parâmetro utilizado para avaliar a progressão da puberdade foi a separação baloprepucial, que é o descolamento da membrana prepucial, permitindo a externalização da glande peniana. Esse processo está diretamente relacionado à elevação da testosterona sérica, e caracteriza o início da maturação reprodutiva (KORENBROT et al., 1977). A exposição à produtos químicos com efeitos estrogênicos ou antiandrogênicos pode causar atraso no início da puberdade masculina (GE et al., 2007; STOKER et al., 2000). Além disso, substâncias tóxicas podem agir modulando receptores hormonais ou fatores envolvidos na liberação de hormônios responsáveis pelo controle do eixo HHT e causar atraso no início da puberdade (STOKER et al.,2000).
No trabalho de Ge et al (2007), a exposição pré-puberal a uma alta dose de dietilftalato causou uma diminuição nos níveis de testosterona e atraso do início da puberdade, enquanto uma baixa dose causou aumento nos níveis de testosterona e avanço no início da puberdade, a dosagem hormonal foi realizada no PND49. Esses dados apontam que pode haver uma relação entre os níveis de testosterona e as alterações no início da puberdade, porém os mecanismos para estes resultados ainda não são claros.
O atraso da puberdade observado no presente estudo sugere que ocorreram perturbações hormonais nesta fase, porém os dados hormonais obtidos são referente à vida adulta dos animais, sendo assim, o mecanismo para esse resultado não está totalmente esclarecido.
A expressão relativa dos transcritos que codificam genes responsáveis pelo controle do eixo HHT foi analisada e pôde-se observar alterações significativas nos três segmentos,
indicando que a exposição perinatal à baixas doses de BPA modifica a atividade do eixo HHT da prole.
A atividade do sistema reprodutor na vida adulta é consequência de eventos que ocorrem durante o desenvolvimento fetal. Em roedores, está bem estabelecido que o principal sinal molecular responsável pela masculinização do cérebro é a presença do estradiol, produzido localmente pela aromatização da testosterona fetal (MACLUSKY; NAFTOLIN, 1981). Este evento determina como será o desenvolvimento e a organização do hipotálamo, estabelecendo os padrões de secreção pulsátil de GnRH mais tarde na vida (GORE, 2008).
No presente estudo a exposição perinatal ao BPA levou ao aumento na expressão do mRNA do Gnrh1 no hipotálamo dos ratos, sugerindo que o BPA, devido à sua atividade estrogênica, pode ter levado à alterações no hipotálamo durante o desenvolvimento.
O aumento observado na expressão do mRNA do Esr2, no hipotálamo, indica que o BPA induziu a expressão desse receptor durante o período perinatal e permaneceu aumentado até a vida adulta. Os resultados de Ramos et al (2003), mostram que a exposição gestacional à uma baixa dose de BPA, aumentou de forma permanente a expressão do mRNA do Esr2 em estruturas do hipotálamo anterior, pois esta alteração foi observada no rato puberal e adulto. O aumento da expressão de Esr2 em estruturas do hipotálamo anterior pode levar a uma maturação defeituosa dos padrões de liberação do GnRH (HRABOVSZKY et al., 2000). Sendo assim, a hipótese da ligação entre as alterações dos níveis de Esr2 e Gnrh1, observados no hipotálamo dos animas tratados com BPA, não deve ser descartada.
Na hipófise, as subunidades β de LH e FSH, são responsáveis pela produção de gonadotrofinas (NAGIRNAJA et al., 2010) e a expressão do mRNA tanto do FSHβ como do LHβ é regulada principalmente pelo GnRH através da ligação com receptor (GnRHR). A liberação pulsátil do GnRH estimula a expressão do GnRHR, porém a sua liberação contínua parece não afetar a expressão do mesmo (JEONG; KAISER, 2006). E a expressão do mRNA do FSHβ, pode ser aumentada em várias amplitudes de pulsos de GnRH, enquanto a expressão do LHβ e do GnRHR é influenciada por uma gama menor de amplitudes de pulsos de GnRH (JEONG; KAISER, 2006).
Uma vez que a expressão do mRNA do Gnrh1 foi alterada, seu modo de liberação pulsátil também pode ter sido afetado, e estar ligado ao aumento dos níveis de mRNA do Fshb. No trabalho de Xi et al (2011) foram avaliados os efeitos da exposição ao BPA desde o período perinatal persistindo durante a vida pós natal. Os resultados mostraram que, no hipotálamo, a expressão do mRNA do Gnrh1 foi estimulada após a exposição ao BPA, bem como o aumento de Fshb na hipófise dos filhotes. Os autores sugerem que os níveis de expressão alterados de
hormônios hipotalâmicos e hipofisários podem ser a causa ou a consequência de mudanças na esteroidogênese gonadal.
Também na hipófise, houve aumento da expressão do mRNA do Ar no grupo exposto à menor dose e aumento na expressão do mRNA do Esr1 no grupo exposto à maior dose de BPA. O aumento na expressão do mRNA de receptores estrogênicos ou androgênicos na hipófise, sugere a necessidade de estimular os mecanismos de feedback negativo.
A expressão do mRNA dos receptores de LH e FSH e a expressão da Inhbb foram avaliadas no testículo a fim de entender melhor a relação do eixo HHT e se as possíveis alterações hipotalâmicas e hipofisárias influenciam na função testicular. Nos testículos, o LH se liga aos receptores presentes nas células de Leydig e o FSH se liga aos receptores nas células de Sertoli e estimulam a produção de testosterona e a espermatogênese, respectivamente (O’DONNELL et al., 2006).
No presente estudo, a exposição perinatal ao BPA, aumentou a expressão de Lhcgr e Inhbb no grupo exposto à dose de 0,5 mg/Kg. O aumento na expressão do mRNA do Lhcgr pode estar relacionado ao aumento nos níveis séricos de LH, já que a ação do LH se dá através da ligação ao receptor de LH nos testículos. E o aumento de Inhbb pode indicar uma falha no mecanismo de feedback negativo feito pela inibina beta sobre o FSHβ.
Os níveis de LH e FSH são controlados pela secreção pulsátil do GnRH. Enquanto a alta frequência de pulsos estimula a síntese e secreção do LH, a baixa frequência de pulsos estimula a síntese e liberação do FSH. Sugerindo que os mecanismos de regulação são diferentes para as subunidades beta de LH e FSH (JEONG; KAISER, 2006). Além disso, a testosterona faz feedback no hipotálamo e nas células gonadotróficas da hipófise.
O aumento de LH sérico dos animais do grupo tratado com a menor dose de BPA sugere a necessidade de estimular a atividade das células testiculares. A falta de alteração do mRNA do Lhb indica que a modulação dos níveis séricos de LH pelo BPA pode ser mediada por outro mecanismo. Houve aumento do mRNA do Fshb, porém esta alteração não interferiu na síntese do FSH, já que não houve aumento significativo nos níveis séricos de FSH.
Com relação às análises de testosterona e estradiol, o BPA demostrou interferir nos níveis séricos de testosterona, que foram aumentados nos animais do grupo tratado com a maior dose de BPA (5 mg/Kg de PC). Os níveis de estradiol não apresentaram alteração significativa, ficando abaixo dos níveis de detecção. A testosterona é produzida principalmente nos testículos (O’DONNELL et al., 2006). E o estradiol é formado a partir do processo de aromatização da testosterona, nos testículos, e também tem se mostrado fisiologicamente importante para a
espermatogênese. Porém, no macho, sua concentração é maior nos testículos do que na circulação geral (O’DONNELL et al., 2006).
Gámez et al (2014), utilizaram ratos expostos durante todo período de gestação e lactação à 3 µg/Kg de BPA, e observaram que no período pré-púbere (PND35) os níveis séricos de LH e FSH estavam aumentados, porém a testosterona não apresentou alteração. Em um estudo conduzido de forma semelhante, a exposição às doses 25 e 250 µg/Kg de BPA, não alterou os níveis de testosterona dos ratos na idade adulta (RAMOS et al., 2003). Da mesma forma, a menor dose de BPA (0,5 mg/Kg), utilizada em nosso estudo, também não alterou os níveis de testosterona. Já no trabalho de Watanabe et al (2003), a exposição perinatal (GD6 ao PND20) à doses mais altas (4 e 40 mg/Kg) de BPA, causou aumento nos níveis de testosterona nos ratos com 9 semanas (63 dias) de idade. Assim como a maior dose de BPA (5 mg/Kg) utilizada em nosso estudo.
Porém, no trabalho de Salian et al (2009b), após a exposição perinatal (GD12 ao PND21) às doses 1,2 e 2,4 µg/Kg, observou-se que os níveis séricos de testosterona, estradiol, LH e FSH estavam diminuídos em ratos na idade adulta. Outro trabalho de Salian et al (2009a), com ratos expostos, via subcutânea, apenas no período neonatal (PND1 ao PND5) às doses 2,4 e 10 µg de BPA/dia, no PND125 os animais apresentaram redução dos níveis de LH e aumento dos níveis de testosterona. Enquanto o estradiol e o FSH não tiveram alterações significativas. Já no trabalho de Wisniewski et al (2015) ratos foram expostos ao BPA durante a vida adulta e apresentaram redução nos níveis séricos de testosterona, LH e FSH e aumento nos níveis de estradiol.
Esses diferentes resultados encontrados podem ser devido às diferentes doses, período e tempo de exposição, bem como a idade dos animais no momento da análise. O mecanismo pelo qual o BPA altera os níveis hormonais ainda permanece incerto, porém são evidentes os desequilíbrios hormonais, após a exposição em períodos críticos do desenvolvimento, mesmo que em doses consideradas baixas.
Ao avaliar o peso dos testículos não observou-se diferença entre os grupos tratados com BPA em relação ao controle. O peso testicular depende principalmente do número de células de Sertoli, que proliferam em um período preciso, que começa durante a vida fetal e se estende ao período neonatal (SHARPE et al., 1998).
Kabuto et al (2004), utilizaram camundongos que foram expostos ao BPA durante a vida embrionária/fetal e lactação (GD6-PND20), à 25 ou 50 ug de BPA/dia. Houve diminuição do tamanho dos testículos dos animais aos 30 dias de idade (p<0,05). Os autores sugeriram que
o BPA é capaz de induzir a formação de espécies reativas de oxigênio, levando à peroxidação e consequentemente ao subdesenvolvimento do testículo.
Já no trabalho de Gámez et al (2014) ratos expostos à baixas doses de BPA, durante o período perinatal, apresentaram aumento no peso dos testículos na idade pré-púbere. Os autores sugeriram que o BPA pode se ligar aos receptores estrogênicos presentes nas células de Sertoli e diminuir o número de células, causando modificações na estrutura tubular e consequentemente alterar o peso testicular.
O período de exposição foi praticamente o mesmo nos dois trabalhos, porém, no primeiro foram utilizadas doses bem maiores do que no segundo trabalho, sugerido que os efeitos do BPA sobre os testículos é dependente da dose.
No epidídimo pôde-se observar alterações no peso de seus segmentos. O epidídimo é responsável pela maturação dos espermatozoides, tornando-os móveis e capazes de reconhecer e fertilizar o oócito. Chitra et al (2002) observaram que os xenoestrogênios podem causar comprometimento do epitélio do epidídimo em doses baixas e levar à diminuição do seu tamanho. Outra hipótese para a diminuição do tamanho da cabeça e do corpo do epidídimo é o tempo de trânsito estar mais rápido nesses segmentos. A cauda, além de participar do processo de maturação, é responsável pelo armazenamento dos espermatozoides e o aumento do peso pode ser indicativo de aumento das reservas espermáticas. No estudo de Saliam et al (2009b), a maioria dos espermatozoides da cauda do epidídimo no grupo exposto ao BPA apresentaram a presença de gotículas citoplasmáticas, que indicavam o seu estado de imaturidade.
Para avaliar a interferência da exposição ao BPA sobre a vesícula seminal, primeiramente ela foi pesada repleta de fluido e em seguida depois de drenada. Houve aumento no peso da vesícula seminal repleta dos animais do grupo tratado como a maior dose de BPA, enquanto que o peso da vesícula seminal drenada não apresentou alteração, o que mostra uma maior quantidade de fluido na vesícula dos animais do grupo tratado com 5 mg/Kg de BPA. Esse tecido é conhecido como andrógeno dependente e tanto a secreção quanto o funcionamento da musculatura lisa da vesícula seminal são dependentes do hormônio testosterona. Portanto espera-se que ao passo que o nível de testosterona se mostre alterado, altera-se também o desenvolvimento e a manutenção desse órgão acessório do sistema reprodutor.
No trabalho de Gámez et al (2014) ratos wistar foram expostos durante todo período de gestação e lactação à 3 µg/Kg de BPA, ao avaliar o peso da vesícula seminal no período pré- púbere (PND35), não foram observadas alterações no peso da vesícula seminal, bem como nos níveis séricos de testosterona. Já no trabalho de Nakamura et al (2010) ratos foram expostos no
período pré-púbere à altas doses (100 e 200 mg/Kg) de BPA e apresentaram diminuição nos níveis séricos de testosterona bem como no peso da vesícula seminal.
Estes resultados mostram que os níveis de testosterona podem estar diretamente envolvidos no desenvolvimento da vesícula seminal. No presente estudo, os resultados condizem com a literatura e estão de acordo com a dosagem sérica hormonal, visto que houve elevação nos níveis de testosterona nesse mesmo grupo.
Diferentes estudos já observaram que a resposta do BPA não possui uma linearidade com relação à dose e cada tecido responde de uma forma distinta às diferentes doses e fases do desenvolvimento. No presente estudo, esta falta de linearidade na toxicidade do BPA também pôde ser observada. Diferentes mecanismos podem ter ocorrido e levado às alterações observadas sobre o eixo HHT, como por exemplo a dessensibilização e interferência na ativação ou função dos receptores. Porém para a confirmação dessas hipóteses, trabalhos posteriores devem ser realizados a fim de se investigar mais a fundo esses mecanismos.
Devido ao fato de o BPA ter se tornado um composto cada vez mais presente em produtos de consumo e no meio ambiente, vale ressaltar que o risco de exposição humana também venha a ser cada vez maior a este produto químico. Relacionado a isso, podem estar as patologias do sistema reprodutor masculino e os casos de infertilidade e subfertilidade que ocorrem nesse gênero.
É difícil mensurar as quantidades exatas de BPA e o período que os seres humanos estão expostos, porém de acordo com os resultados obtidos em estudos, a exposição humana ao BPA em níveis ambientais pode ser suficiente para afetar o equilíbrio hormonal endógeno e qualidade do sêmen. Tendo em vista a ligação entre a exposição ao BPA presente no ambiente e seu possível efeito sobre a fertilidade, torna-se importante a realização de estudos para esclarecer seus efeitos e consequências para a vida reprodutiva humana.
7 CONCLUSÃO
A exposição perinatal ao BPA levou à alterações na expressão dos transcritos de genes que regulam o eixo HHT. Essas alterações foram (ilustrado na figura 16):
a) Aumento do mRNA do Gnrh1 e Esr2, no hipotálamo; b) Aumento do mRNA de Fshb, Esr1 e Ar, na hipófise; c) Aumento do mRNA do Lhcgr e da Inhbb, no testículo.
Além disso, a exposição perinatal ao BPA:
a) Interferiu nos mecanismos de sinalização de início da puberdade, levando ao atraso desse período;
b) Causou alterações no peso dos tecidos andrógeno dependentes avaliados, tais como epidídimo e vesícula seminal;
c) Aumentou os níveis séricos de testosterona e LH.
Diante do exposto, conclui-se que as alterações observadas comprometeram o funcionamento normal do eixo HHT e podem gerar consequências negativas na vida reprodutiva dos animais.
Em conjunto, esses resultados demonstram, pela primeira vez, que a exposição à baixas doses de BPA, durante os períodos críticos de diferenciação sexual hipotalâmica, modifica a atividade do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular da prole com consequências na vida adulta dos ratos.
Figura 16 – Esquema do eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular antes (A) e após (B) a exposição perinatal ao BPA.
REFERÊNCIAS
ACHERMANN, J. C.; OZISIK, G.; MEEKS, J. J.; JAMESON, J. L. Genetic causes of human