Introns do grupo I no LSU rRNA mitocondrial de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii e a sua relação com genótipos e susceptibilidade a antifúngicos

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA. FELIPE EMMANUEL DO ESPÍRITO SANTO GOMES. Introns do grupo I no LSU rRNA mitocondrial de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii e a sua relação com genótipos e susceptibilidade a antifúngicos. NATAL 2017.

(2) FELIPE EMMANUEL DO ESPÍRITO SANTO GOMES. Introns do grupo I no LSU rRNA mitocondrial de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii e a sua relação com genótipos e susceptibilidade a antifúngicos. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Raquel Cordeiro Theodoro Coorientador: Thales Domingos Arantes. NATAL 2017.

(3) Gomes, Felipe Emmanuel do Espírito Santo. Introns do grupo I no LSU rRNA mitocondrial de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii e a sua relação com genótipos e susceptibilidade a antifúngicos / Felipe Emmanuel do Espírito Santo Gomes. - Natal, 2017. 94 f.: il. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de PósGraduação em Bioquímica. Orientadora: Profa. Dra. Raquel Cordeiro Theodoro. Coorientador: Prof. Dr. Thales Domingos Arantes.. 1. Criptococose - Dissertação. 2. Genotipagem Dissertação. 3. Intron do grupo I - Dissertação. 4. Estrutura secundária - Dissertação. 5. Filogenia - Dissertação. 6. Susceptibilidade antifúngica - Dissertação. I. Theodoro, Raquel Cordeiro. II. Arantes, Thales Domingos. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 616.9.

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(5) DEDICATÓRIA. A Deus por sempre me iluminar em todos os passos da minha vida.. A minha família por sempre me motivar perante todas as dificuldades e decisões importantes.. Aos meus amigos que caminharam comigo durante todos esses anos de universidade..

(6) AGRADECIMENTOS. •. A minha orientadora Profa. Dra. Raquel Cordeiro Theodoro pelo inúmero conhecimento adquirido com ela e pela sua paciência e dedicação durante todo o meu processo de aprendizagem desde a graduação;. •. Ao meu coorientador Dr. Thales Domingos Arantes pelo acompanhamento e supervisionamento em minhas práticas laboratoriais;. •. Às agências de fomento (CAPES e CNPq) que financiaram todo este projeto;. •. Ao meu colega de laboratório José Alex que colaborou bastante em minhas análises filogenéticas;. •. Ao Instituto de Medicina Tropical, sob a direção da Profa. Dra. Selma Jerônimo, que forneceu todo o espaço físico necessário;. •. À fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pelo envio dos isolados de referência;. •. Às professoras Dra. Maria Tereza Barreto, Dra. Fernanda Fonseca, Dr. Marilene Henning Vainstein e Dra. Gilda Maria Barbaro Del Negro por terem cedidos alguns de seus isolados;. •. Às professoras Dra. Eveline e Dra. Mônica e Dagoberto pelo envio de amostras de seus pacientes do Hospital Giselda Trigueiro;. •. E a todos os demais, que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste estudo, meus sinceros agradecimentos..

(7) Há muitas pessoas de visão perfeita que nada vêem... O ato de ver não é coisa natural. Precisa ser aprendido!" (Rubem Alves).

(8) RESUMO. A criptococose, causada pelas espécies fúngicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, é uma das micoses oportunísticas e/ou sistêmicas mais importantes no mundo. Cada espécie possui quatro genótipos, usualmente definidos pelo PCR-RFLP do gene URA5, os quais apresentam diferenças em sua ecologia, epidemiologia, distribuição geográfica e susceptibilidade a antifúngicos. Marcadores moleculares de acesso mais direto são atrativos para um rápido reconhecimento de genótipos ou de caraterísticas relevantes como virulência e susceptibilidade antifúngica. Neste sentido, introns autocatalíticos do grupo I, no rRNA LSU mitocondrial foram aqui avaliados como potencial marcador molecular para os genótipos de C. neoformans e C. gattii, bem como quanto a sua relação com a susceptibilidade a antifúngicos. Foram utilizados 77 isolados brasileiros, sendo a maioria do genótipo VNI (39 cepas), seguido de 20 VGII, 5 VNIV, 4 VNII, 3 VNIII, 2 VGI, 2 VGIII e 2 VGIV. Os introns Cne.mL2449 e Cne.mL2504 foram amplificados em um só PCR com primers complementares a região do gene rRNA LSU flanqueadora dos introns. Os produtos de PCR mostraram um polimorfismo de comprimento significativo entre genótipos de C. neoformans e C. gattii. O sequenciamento destes produtos indicou que algumas cepas apresentaram nenhum, um, dois, três ou quatro introns em série. Estes dois novos introns, não descritos anteriormente, foram nomeados de Cne.mL2439 e Cne.mL2584 em C. neoformans e Cga.mL2439 e Cga.mL2584 em C. gattii. Os introns Cne.mL2439/Cga.mL2439 foram classificados como pertences a subclasse IB2 ao passo que Cne.mL2584/Cga.mL2584, pertencentes a subclasse IA1. Curiosamente, os genótipos com isolados sem introns, VNI, VGII, VGI e VNIV, são aqueles conhecidos como mais virulentos e menos susceptíveis a agentes antifúngicos. De fato, tais isolados apresentaram MICs significativamente superiores para 5-flucitosina. Estes achados sugerem que estes elementos podem ser utilizados como potenciais marcadores moleculares para a resistência deste antifúngico. Por fim, análises filogenéticas sugeriram alta similaridade de sequência entre os introns Cne.mL2449, Cne.mL2504, Cne.mL2439/Cga.mL2439 e Cne.mL2584/Cga.mL2584 com outros introns mitocondriais presentes nos genes COX1, COX2, COX3, NAD5, ATP9, COB, LSU de fungos distintos, sustentando a hipótese de origem antiga dos introns (hipótese “introns early”), além da dispersão destes elementos em sítios heterólogos, via splicing reverso. Palavras-chave: Criptococose, genotipagem, intron do grupo I, estrutura secundária, filogenia, susceptibilidade antifúngica..

(9) ABSTRACT. Cryptococcosis, caused by the fungal species Cryptococcus neoformans or Cryptococcus gattii, is one of the most important systemic and/or opportunistic diseases in the world. Each species has four genotypes, usually accessed by PCR-RFLP of the URA5 gene, which present differences in their ecology, epidemiology, geographical distribution and antifungal susceptibility. Easier accessible molecular markers are attractive for rapid recognition of genotypes or relevant characteristics such as virulence and antifungal susceptibility. In this way, group I autocatalytic introns in the mitochondrial LSU rRNA were evaluated as potential molecular marker for the genotypes of C. neoformans and C. gatti, as well as their relationship to antifungal susceptibility. Seventy-seven Brazilian isolates were used, most of the genotype VNI (39 strains) followed by 20 VGII, 5 VNIV, 4 VNII, 3 VNIII, 2 VGI, 2 VGIII and 2 VGIV. The introns Cne.mL2449 and Cne.mL2504 were amplified in a single PCR with complementary primers to the flanking region of the introns LSU rRNA gene. PCR products showed a significant polymorphism between C. neoformans and C. gattii genotypes. Sequencing of the PCR products indicated that some strains had none, one, two, three or four introns followed. This new two introns, not previously described in the mitochondrial genome of Cryptococcus, were named Cne.mL2439 and Cne.mL2584 in C. neoformans and Cga.mL2439 and Cga.mL2584 in C. gattii. Cne.mL2439/Cga.mL2439 introns were classified as belonging to IB2, whereas Cne.mL2584/Cga.mL2584, as belonging IA1 subclass. Interestingly, genotypes with some intronless strains, VNI, VGII, VGI and VNIV, are those known to be more virulent and less susceptible to antifungal agents. Here, we observed that those intronless isolates had significant higher MICs values for 5-flucytosine. The findings suggest that these elements can be used as potential molecular markers for antifungal resistance. Finally, phylogenetic analyzes suggested high sequence similarity between the introns Cne.mL2449, Cne.mL2504, Cne.mL2439/Cga.mL2439 and Cne.mL2584/Cga.mL2584 with other mitochondrial introns present in the genes COX1, COX2, COX3, NAD5, ATP9, COB, LSU of fungi supporting the “introns early” hypothesis, as well as its dispersion to heterologous sites by reverse splicing.. Key-words: Cryptococcosis, genotyping, Group I intron, secondary structure, phylogeny, antifungal susceptibility..

(10) LISTA DE TABELAS. Tabela 1- Isolados utilizados no studo.....................................................................................34. Tabela 2- Genes de homing endonuclease (HEG) estão associados a alguns introns do grupo I do gene LSU RNA de C. neoformans e C. gattii......................................................................48. Tabela 3- Teste para associação entre intron e genótipos virulentos e não-virulentos.............56. Tabela 4- Teste para associação entre intron e espécie.............................................................57. Tabela 5- Modelos logísticos ordenados utilizados para estimar o efeito do intron e espécie sobre o MIC..............................................................................................................................58.

(11) LISTA DE FIGURAS. Figura 1- Rota da criptococose meningoencefálica .................................................................16 Figura 2- Modelo de estrutura secundária dos introns do grupo I ...........................................23 Figura 3- Representação esquemática do processo de auto-splicing dos introns do grupo I.................................................................................................................................................25 Figura 4- Introns descritos no gene mitocondrial 23S..............................................................30 Figura 5- Predição da estrutura secundária para os introns Cne.ml2449 e Cne.mL2504............31 Figura 6- Método de genotipagem por PCR/RFLP do gene URA5..........................................38 Figura 7- Desenho dos primers.................................................................................................39 Figura 8- Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii segundo seu genótipo ........44 Figura 9- Os genótipos de C. neoformans e C. gattii apresentam polimorfismos entre os introns do grupo I...................................................................................................................................45 Figura 10- Variação na amplificação dos introns do grupo I segundo o genótipo ..................46 Figura 11- Posição dos introns do grupo I no gene rRNA LSU de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii...................................................................................................................47 Figura 12- Predição da estrutura secundária para o intron Cne.mL2439..................................49 Figura 13- Predição da estrutura secundária para o intron Cne.mL2584..................................50 Figura 14- Análise molecular filogenética para os três introns utilizando a inferência bayesiana...................................................................................................................................51 Figura 15- Análise molecular filogenética para os introns Cne.mL2439 e Cga.mL2439 utilizando a inferência bayesiana..............................................................................................52 Figura 16- Análise molecular filogenética para o intron Cne.mL2504 utilizando a inferência bayesiana...................................................................................................................................53.

(12) Figura 17- Análise molecular filogenética para os introns Cne.mL2584/Cga.mL2584 utilizando a inferência Bayesiana...............................................................................................................54 Figura 18- Análise molecular filogenética para o intron Cne.mL2449 utilizando a inferência bayesiana...................................................................................................................................55.

(13) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. AFLP. Polimorfismo de tamanho de fragmentos amplificados – Amplified fragment lengh polymorphism. AIDS. Síndrome da Imunodeficiência Adquirida - Acquired immunodeficiency syndrome. BamHI. Enzima de restrição obtida de Bacillus amyloliquefaciens. CGB. Meio de cultura de cavanina-glicina-azul de bromotimol. DMSO. Dimetilsulfóxido. DNA. Ácido desoxirribonucléico. dNTP. Desoxirribonucleotídeo trifosfato. DSB. Double Strand Break. EDTA. Ácido etileno-diamino-tetra-acético. FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz HEG. Homing Endonuclease Gene. HhaI. Enzima de restrição obtida de Haemophilus haemolyticus. HindIII. Enzima de restrição obtida de Haemophilus influenzae. HIV. Vírus da imunodeficiência humana – Human immunodeficiency virus. KCl. Cloreto de Potássio. MgCl2. Cloreto de Magnésio. NaCl. Cloreto de sódio. NaOH. Hidróxido de Sódio.

(14) ORF. Quadros abertos de leitura - Open reading frames. PCR. Reação em cadeia da polimerase – polymerase chain reaction. PH. Potencial hidrogeniônico. RAPD. Análise por DNA polimórfico amplificado ao acaso – randomly amplified polymorphic DNA analysis. RFLP. Análise de fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição - restriction fragment length polymorphisms. RNA. Ácido ribonucleico. Sau96I. Enzima de restrição obtida de Staphylococcus aureus PS96. SDS. Dodecil sulfato de sódio - sodium dodecyl sulfate. TAE. Tampão Tris-Acetato-EDTA. TRIS-HCl. Trisaminometano – hydroxymethyl aminomethane hydrochloride. UNESP. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. URA5. Gene codificador da enzima ortidina monofosfato pirofosforilase. LSU. Grande subunidade ribossomal - Large subunit. COX. Cyclooxygenase gene. COB. Cytochrome b gene. NAD. NAD(P)H dehydrogenase gene.

(15) SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 15 2 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 33 2.1 Objetivo geral .............................................................................................................................. 33 2.2 Objetivos específicos ................................................................................................................... 33 3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................................ 34 3.1 Isolados fúngicos utilizados ........................................................................................................ 34 3.2 Extração de DNA ........................................................................................................................ 37 3.3 PCR e RFLP do gene URA5 ....................................................................................................... 37 3.4 PCR do intron do grupo I e eletroforese ..................................................................................... 39 3.5 Sequenciamento e alinhamento do intron ................................................................................... 40 3.6 Estrutura secundária .................................................................................................................... 40 3.7 Análise filogenética ..................................................................................................................... 40 3.8 Testes de susceptibilidade a antifúngicos .................................................................................... 41 3.9 Análises Estatísticas .................................................................................................................... 42 4 RESULTADOS ................................................................................................................................. 44 4.1 PCR e RFLP do gene URA5 ....................................................................................................... 44 4.2 PCR e sequenciamento do intron do grupo I............................................................................... 44 4.3 Predição da estrutura secundária para os novos introns .............................................................. 48 4.4 Análises filogenéticas .................................................................................................................. 50 4.5 Relação entre presença de introns do grupo I no gene LSU rRNA mitocondrial, susceptibilidade antifúngica e genótipos de C. neoformans e C. gattii ........................................................................ 56 5 DISCUSSÃO ..................................................................................................................................... 59 6 CONCLUSÕES ................................................................................................................................ 67 REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 68 APÊNDICE .......................................................................................................................................... 77 APÊNDICE A- Genotipagem de todos os isolados pelo método PCR-RFLP URA5. ...................... 77 APÊNDICE B- Produtos de PCR obtidos para o intron do grupo I em todos os isolados ................ 80 APÊNDICE C- Alinhamento global da sequência do gene LSU rRNA. .......................................... 84 APÊNDICE D – Polimorfismos entre os introns LSU rRNA ........................................................... 91 APÊNDICE E - Concentrações inibitória mínimas para os isolados fúngicos testados. .................. 94.

(16) 15. 1 INTRODUÇÃO. O gênero Cryptococcus é composto por basidiomicetos da ordem Tremellales caracterizados por leveduras capsuladas mundialmente disseminadas e reconhecidas como importantes patógenos fúngicos, altamente frequentes em indivíduos imunodeprimidos (CHEN; MEYER; SORRELL, 2014; MITCHELL; PERFECT, 1995). Leveduras desse gênero são cosmopolitas e abrigam-se em diversos substratos orgânicos associados às excretas de aves, tanto em ambientes urbanos quanto domiciliares (KWON-CHUNG; BENNETT, 1984; LAZÉRA et al., 1996; SWINNE et al., 1989). Muitos já foram os achados destes microrganismos associados a ocos de árvores em decomposição, como Eucaliptus camaldulensis, Moliquea tomentosa, Cassia grandis, Ficus microcaprae e Terminali acatappa (CALLEJAS et al., 1998; LAZERA et al., 2000; LAZÉRA et al., 1998; SORRELL, 2001). A infecção em humanos tem início pela inalação de propágulos infecciosos (leveduras) encontrados no ambiente, os quais colonizam os pulmões e causam o primeiro ponto de infecção. Em indivíduos imunocompetentes, o fungo normalmente não é disseminado e o quadro clínico é assintomático. Já em indivíduos imunodeprimidos, o patógeno tende a se disseminar rapidamente dos pulmões para o sistema nervoso central (após cruzar a barreira hematoencefálica) onde causa o quadro clínico de meningite ou meningoencefalite. De forma geral, os principais sítios de infecção e diagnóstico são: pulmões, sistema nervoso central, sangue, urina, pele, próstata e olhos. Os imunodeprimidos tendem a apresentar um amplo espectro de sintomas, que incluem febre, mal-estar, dor no peito, perda de peso, dispnéia, tosse, além de lesões na pele, como úlceras, tumores e granulomas (CHEN; MEYER; SORRELL, 2014; MITCHELL; PERFECT, 1995) (Figura 1). A criptococose é causada por duas diferentes espécies do gênero Cryptococcus: Cryptococcus neoformans (Cryptococcus neoformans var. neoformans e Cryptococcus neoformans var. grubii) e Cryptococcus gattii (FRANZOT et al., 1998; KWON-CHUNG et al., 2014). Segundo análises de Xu, Vilgalys & Mitchell (2000), a divergência entre C. neoformans var. neoformans e C. neoformans var. grubii ocorreu a cerca de 18.5 milhões de anos atrás, mas essas linhagens têm sofrido dispersões e hibridizações recentes. As dispersões, que são facilitadas pelos humanos bem como por outros hospedeiros, podem favorecer o aparecimento de gerações híbridas pela simples aproximação de linhagens divergentes que podem vir a se cruzarem..

(17) 16. Figura 1- Rota da criptococose meningoencefálica. Leveduras dessecadas e outros propágulos infecciosos de Cryptococcus sp. são inaladas pelo hospedeiro e formam o primeiro sítio de infecção no pulmão. A levedura tende a se disseminar pela corrente sanguínea deste órgão até o sistema nervoso central, onde causam o quadro clínico de meningoencefalite. Fonte: Modificado de KWON-CHUNG et al. (2014).. Enquanto as infecções por C. neoformans ocorrem mundialmente e são uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes imunodeprimidos (especialmente em pacientes com AIDS), C. gattii usualmente infecta portadores imunocompetentes (D’SOUZA et al., 2011). Embora seja relatado na literatura que C. gattii está geograficamente mais associado a áreas tropicais e subtropicais (SORRELL, 2001), Kidd et al. (2004) sugerem que C. gattii pode se adaptar a novos ambientes, visto que ele já foi encontrado em região de clima temperado em um surto de criptococose na ilha de Vancouver (Vancouver Island), Canadá. De modo geral, apesar dos diferentes padrões de distribuição geográfica, cepas dessas três variedades (C. neoformans var. neoformans, C. neoformans var. grubii e C. gattii) já foram isoladas em todos os continentes, exceto na Antártica (XU; VILGALYS; MITCHELL, 2000)..

(18) 17. De fato, Cryptococcus spp. possuem alguns atributos que aumentam a capacidade de sobrevivência tanto no ambiente saprobiótico como durante uma infecção. Tais adaptações incluem padrões de transdução de sinais que otimizam o metabolismo a responder ao estado nutricional do ambiente, condições de estresse e interações com outros sistemas biológicos. Dentre estes atributos está a cápsula polissacarídica destes fungos, considerada um de seus principais fatores de virulência (MCCLELLAND; BERNHARDT; CASADEVALL, 2006). No ambiente, a cápsula fornece a função de proteção contra situações de estresse, como a desidratação e contra predadores naturais, como nematoides e amebas (CHRISMAN et al., 2011; STEENBERGEN; CASADEVALL, 2003). No hospedeiro vertebrado ela é um importante fator de virulência, pois protege a levedura contra a resposta imune provocada pelas citocinas pró-inflamatórias, que atuam na degradação de patógenos primários, seguida da apresentação de antígenos para células do sistema imune (RETINI et al., 1998). A cápsula ainda atua como uma estrutura protetora contra a fagocitose por macrófagos, mas se esta for inevitável, ela se mantém funcional devido a sua ação protetora contra espécies reativas de oxigênio no interior destas células de defesa (ZARAGOZA et al., 2008). Estudos realizados inicialmente por Fromtling, Shadomy & Jacobson (1982) mostraram que mutantes acapsulados de Cryptococcus neoformans foram capazes de produzir doença em modelos murínicos. Esses mutantes foram capazes de sobreviver e replicar em condições normais de laboratório, mas exibiram uma grande redução em sua virulência. Entretanto, essas cepas acapsuladas podem ser patogênicas para muitos pacientes imunodeprimidos o que implica que estas leveduras ainda mantêm um potencial patogênico (SALKOWSKI; BALISH, 1991). Como a cápsula demonstra um importante papel na interação com o hospedeiro, sua estrutura tem sido o principal foco da atenção de muitos estudos experimentais. Adicionalmente, estudos têm também mostrado que a cápsula polissacarídica tem uma forte propriedade imunomodulatória, levando à evasão do sistema imune e, consequentemente, sua sobrevivência dentro do hospedeiro (MONARI; BISTONI; VECCHIARELLI, 2006; VECCHIARELLI, 2000). Os polissacarídeos são os principais fatores de virulência da cápsula de Cryptococcus, sendo a glucuronoxilomanana (GXM) a substância que se encontra em maior abundância nessas leveduras. Os estudos realizados por Monari, Bistoni & Vecchiarelli (2006) revelaram um novo aspecto imunossupressor do polissacarídeo GXM, sugerindo que essa substância é capaz de levar à inibição da diferenciação e proliferação das células T (Th1) que geram uma resposta ao C. neoformans. O GXM também tem poder de influenciar negativamente na eficiência da apresentação do antígeno do patógeno ao macrófago (MONARI et al., 2005), levando ao seu não reconhecimento por essas células de defesa..

(19) 18. Entre outros fatores de virulência do Cryptococcus tem-se a capacidade de adesão, a produção de enzimas como lacases (enzima produtora da melanina), fosfolipases (atua no rompimento das ligações éster favorecendo a desestabilização e lise da célula hospedeira), urease (promove ação anti-inflamatória mediada por células Th2) e superóxido desmutase (protege a célula fúngica contra a ação antioxidante). A formação de melanina está associada com a virulência, pois ela gera problemas aos indivíduos com o sistema imune comprometido, ao passo que também protege a levedura da ação de antifúngicos e dos macrófagos alveolares, levando à persistência da infecção no hospedeiro (CHEN; MEYER; SORRELL, 2014; NOSANCHUK et al., 1999; ROSAS et al., 2000). De fato, estes fatores de virulência apresentam importantes funções para a levedura dentro do organismo, sendo fundamentais para sua implantação no hospedeiro. Entretanto, Casadevall, Steenbergen & Nosanchuk (2003) sugerem que os fatores de virulência surgiram nessas leveduras bem antes do seu primeiro contato com os hospedeiros vertebrados, ainda no ambiente saprobiótico. Esses fatores apresentavam importantes funções que garantiam a manutenção do fungo nesse tipo de ambiente, como a presença da melanina, que fornecia proteção contra os raios ultravioletas. Porém, quando primordialmente houve a interação patógeno-hospedeiro, esses fatores também passaram a se mostrar importantes para a manutenção do Cryptococcus no organismo. Ainda segundo os autores, a virulência do C. neoformans em vários hospedeiros animais é o resultado das pressões seletivas originadas da relação vertebrado-hospedeiro-fungo, as quais foram essenciais ou altamente favoráveis para a sobrevivência desse organismo. Adicionalmente, a existência de uma única estratégia parasítica intracelular nos macrófagos de mamíferos sugere que a virulência desse fungo patogênico seja resultado dos fatores de seleção no ambiente saprobiótico contra predadores ameboides. O locus mating type também tem sido identificado como um importante fator de virulência, e as cepas MATα têm se mostrado mais virulentas do que as cepas MATa. Como em muitas outras espécies de Basidiomicetos, o locus mating type é altamente complexo e contém uma variedade de genes essenciais para a reprodução sexuada e morfogênese, incluindo genes de feromônios. O sistema mating type é controlado por um locus com dois alelos alternativos funcionais, MATa e MATα (CLARKE et al., 2001; LENGELER et al., 2000; MOORE; EDMAN, 1993). Em adição, os genes mating type podem mostrar importantes funções na epidemiologia e evolução de patógenos. Alguns métodos foram utilizados para determinar os alelos mating type. Um destes métodos utiliza primers mating type específicos para realizar PCR (KWON-CHUNG; EDMAN; WICKES, 1992). Essas técnicas constituem.

(20) 19. ferramentas úteis para serem utilizadas em estudos epidemiológicos, visto que favorecem o entendimento da estrutura populacional e reprodutiva do patógeno. Um dos métodos mais utilizados para a diferenciação entre as espécies C. neoformans e C. gattii é o cultivo em meio CGB (ágar canavanina - glicina – azul de bromotimol). Isso é possível visto que C. gattii é resistente a L-cavanina, um aminoácido não protéico produzido por certas plantas, e quando cultivado em meio CGB esta espécie utiliza a glicina como fonte de carbono e nitrogênio. Durante este processo metabólico haverá a produção de amônia, gerando a alcalinização do meio e alterando sua cor de amarelo (que representa o pH inicial de 5.8±1) para azul cobalto (pH próximo de 7.0) (KWON-CHUNG; POLACHECK; BENNET, 1982). C. neoformans, entretanto, mantém o meio na coloração amarela (C. neoformans não cresce no meio), possibilitando a diferenciação. Embora os autores supracitados tenham relatado a ausência de resultados falso-positivos e falso-negativos para esse método, Mctaggart et al. (2011) relataram uma especificidade menor para esse método, representando aproximadamente 93%. A sorotipagem também foi amplamente utilizada em estudos epidemiológicos para C. gattii e C. neoformans, e a partir desta técnica foram identificados quatro sorotipos (A, B, C e D) para estas espécies de acordo com a composição antigênica de sua cápsula polissacarídica. Dessa forma, os sorotipos A e D, além do híbrido AD foram propostas para a espécie Cryptococcus neoformans ao passo que os sorotipos B e C se mostraram associados a Cryptococcus gattii. A identificação destes sorotipos pode ser realizada através de ensaios imunológicos com a utilização de antígenos específicos que se ligam a constituintes de sua cápsula polissacarídica (FRANZOT et al., 1998; STEENBERGEN; CASADEVALL, 2003). Entretanto, foi a necessidade de técnicas mais precisas que levou ao aumento da utilização das ferramentas moleculares. Desde os últimos anos, várias técnicas de tipagem molecular têm sido aplicadas ao estudo epidemiológico da criptococose, incluindo cariotipagem, RAPD (do inglês “Random Amplification of Polymorphic DNA” em tradução livre “Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso”), RFLP (do inglês “Restriction Fragment lenght Polymorphism” em tradução livre “Polimorfismo de comprimento no fragmento de restrição”), AFLP ( do inglês “Amplifield Fragment length Polymorphism” em tradução livre “Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados”), MLST (do inglês “Multilocus sequence typing” em tradução livre “tipagem por sequência de multilocus”) e PCR (do inglês “Polymerase Chain reaction” em tradução livre “Reação em cadeia da polimerase”) utilizando primers específicos de regiões de minissatélites ou microssatélites e PCR multiplex (BRANDT et al., 1995; LEAL et al., 2008; MEYER et al., 2003, 2009; YAMAMOTO et al., 1995). Por.

(21) 20. meio de técnicas moleculares via PCR fingerprinting com uma sequência de minissatélites específicos do fago M13 (5′ GAGGGTGGCGGTTCT 3′) e de microssatélites [(GACA)4, (GTC)5] foram identificados oito tipos moleculares principais. Estes ensaios usam as sequências de sondas de DNA repetitivo como primers para a detecção de polimorfismos entre diferentes isolados (MEYER et al., 1993). Desse modo, C. neoformans foi agrupado dentro dos tipos VNI (sorotipo A), VNII (sorotipo A), VNIII (sorotipo AD) e VNIV (sorotipo D); C. gattii foi agrupado dentro dos tipos VGI, VGII, VGIII e VGIV (sorotipos B e C) (MEYER et al., 1999). Outra região genômica mais amplamente utilizada para avaliação do polimorfismo e diferenciação dos tipos moleculares de C. neoformans e C. gattii é o gene codificador da orotidina monofosfato pirofosforilase (URA5 – orotidine monophosphate pyrophosphorylase gene). Os oito tipos moleculares de C. gattii e C. neoformans identificados pelas técnicas acima citadas foram confirmados através das análises de RFLP do gene URA5 (MEYER et al., 2003). Segundo estes autores, o RFLP do gene URA5 pode ser realizado a partir de uma dupla digestão com as enzimas de restrição HhaI e Sau96I. Apesar da precisão deste método, a interpretação dos fragmentos de digestão em muitos momentos pode se tornar trabalhosa. Por se tratar de um método que envolve distintas fases (PCR, digestão e eletroforese), a boa realização de todas as etapas é fundamental para o êxito da técnica e interpretação correta dos resultados. Entretanto, esta técnica continua sendo a mais usual para a identificação dos genótipos de C. neoformans e C. gattii tanto na clínica quanto nos estudos epidemiológicos. Por muitos anos, as infecções causadas por C. neoformans eram vistas como uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes imunodeprimidos (especialmente pacientes com AIDS), enquanto que C. gattii usualmente infectava portadores imunocompetentes, como já discutido. Entretanto, Farrer et al. (2015) mostraram que embora todos os tipos moleculares de C. gattii sejam capazes de causar doença, os genótipos VGI e VGII acometem imunocompetentes com maior frequência que os genótipos VGIII e VGIV. Ecologicamente, as duas espécies também tendem a ocupar nichos distintos, uma vez que C. neoformans encontra-se mais relacionado a fezes de pombos (Columba livia) e de outras aves no ambiente, enquanto que C. gattii normalmente é isolado de material vegetal, como em árvores de eucaliptos (GULLO et al., 2013; SORRELL, 2001) Além disso, os genótipos de C. neoformans e C. gattii não são igualmente distribuídos no mundo: VGIV é mais frequente no sul do continente africano; VGII é o C. gattii mais encontrado nas Américas e VGI na Europa. De modo geral, VGII e VGI são os mais encontrados globalmente (CHEN; MEYER; SORRELL, 2014). Quanto à resposta à terapia.

(22) 21. antifúngica, sabe-se que ela é menos expressiva nas infecções causadas por C. gattii, requerendo uma terapia mais prolongada (SORRELL, 2001; SPEED; DUNT, 1995), e que ainda dentro desta espécie, o genótipo VGII é o menos susceptível às drogas antifúngicas (especialmente a azólicos), seguidos pelos isolados VGI, VNI e VNIV (CHONG et al., 2010; HAGEN et al., 2010; IQBAL et al., 2010; TRILLES et al., 2012). Visto que os tipos moleculares de C. neoformans e C. gattii apresentam expressivas diferenças em sua epidemiologia, ecologia, patogenicidade, características moleculares, distribuição geográfica e susceptibilidade antifúngica, temos que apenas a distinção entre as espécies (C. neoformans ou C. gattii) não é mais suficiente para o correto direcionamento do tratamento da criptococose. Portanto, a busca por novos alvos moleculares de fácil acesso e identificação, especialmente aqueles altamente polimórficos são de grande importância para a distinção entre os tipos moleculares de C. neoformans e C. gattii. Além disso, a utilização desses novos alvos com as técnicas de biologia molecular já conhecidas, como PCR e eletroforese, os tornariam ainda mais atrativos uma vez que estas ferramentas já são amplamente empregadas. Neste sentido, o uso de elementos genéticos invasivos, como inteins e introns autocatalíticos parecem ser também atrativos para a distinção entre espécies e genótipos de Cryptococcus, além daqueles tipos moleculares mais resistentes a antifúngicos. Os inteins são sequências transcritas e traduzidas juntamente com a sequência flanqueadora (extein) capazes de sofrer um splicing (excisão) protéico autocatalítico. As sequências protéicas flanqueadoras são unidas por uma ligação peptídica, formando uma proteína funcional. Os inteins geralmente ocorrem em genes importantes para a reprodução e sobrevivência do fungo como genes codificadores de enzimas metabólicas, DNA e RNA polimerases e proteases (GOGARTEN et al., 2002). Butler & Poulter (2005) avaliaram polimorfismos dos inteins PRP8 de C. neoformans e C. gattii (CnePRP8 e CgaPRP8) e observaram que cepas das duas variedades de C. neoformans (neoformans e grubii) e C. gattii podem ser facilmente distinguidas pelo sequenciamento deste elemento. Foi ressaltado que os sorotipos A (C. neoformas var. grubii) e D (C. neoformans var. neoformans) poderiam ser diferenciados por digestão do intein PRP8 com HindIII, e que VGII poderia ser distinguido dos demais C. gattii por digestão com BamHI. Os autores ainda ressaltam que, pelo fato do intein estar presente em regiões conservadas do gene hospedeiro, é relativamente fácil o desenho de primers que os amplifiquem em todas as espécies ou genótipos dentro de C. neoformans e C. gattii. Os introns autocatalíticos, por sua vez, são elementos encontrados em uma grande variedade de organismos (como fungos, algas e em muitos outros eucariotos unicelulares),.

(23) 22. genes (rRNA, tRNA e codificadores de proteínas) e genomas em toda a árvore da vida (HAUGEN; SIMON; BHATTACHARYA, 2005). Existem quatro principais classes de introns, definidos pelo mecanismo de splicing: introns autocatalíticos do grupo I e grupo II, introns spliceossômicos e os introns tRNA ou introns de archea (archaeal introns). Os introns do grupo I estão distribuídos nos genes codificadores do RNA ribossômico nuclear, DNA mitocondrial de fungos, bactérias e bacteriófagos. A distribuição dos introns do grupo I é altamente desigual entre os seres vivos. Sabe-se que estes elementos genéticos são amplamente encontrados nos genes nucleares codificadores de rRNA, além de diversos genes mitocondriais em fungos, como COX1 (Cyclooxygenase 1), COB (Cytochrome b) e LSU rRNA (do inglês “Large subunit” em tradução livre “Grande Subunidade Ribossomal”), ao passo que são ausentes na maioria dos animais e protistas (LANG; LAFOREST;BURGER, 2007). Entretanto, eles já foram encontrados no genoma mitocondrial da anêmona marinha Metridium senilea e no gene mitocondrial da subunidade I do Citocromo c oxidase do coral Acropora tenuis. Os introns do grupo II são encontrados em bactérias e no genoma de organelas. Os introns spliceossômicos são os mais amplamente encontrados nos pré-RNAm nucleares de eucariotos. Já os introns tRNA são encontrados no núcleo eucariótico e em Archaea e são enzimaticamente removidos por um mecanismo de clivagem e colagem que requer ATP e endonuclease (HAUGEN; SIMON; BHATTACHARYA, 2005). Os introns do grupo I são pequenos RNAs, com tamanho entre 250-500 nucleotídeos, que catalisam o seu próprio splicing a partir do RNA precursor (HAUGEN; SIMON; BHATTACHARYA, 2005). Sua parte catalítica constitui uma das principais classes de RNAs catalíticos, as ribozimas do grupo I. Alguns introns do grupo I tem uma organização muito complexa incorporando genes funcionais e outras sequências, estabelecendo profundas relações com o genoma de seus hospedeiros (NIELSEN; JOHANSEN, 2009). Análises das sequências dos introns do grupo I revelaram que estes elementos apresentam uma estrutura secundária em comum, o que inclui a presença de regiões de pareamento de bases designadas P1 a P10 e regiões de loop sem pareamento. Alguns introns podem apresentar estruturas variáveis, especialmente os introns mitocondriais, já que podem não apresentar certos elementos estruturais, como as alças P2, e mais raramente as alças P8, P9 e P10. Os introns do grupo I apresentam algumas sequências conservadas, denominadas regiões P, Q, R e S. As regiões P e Q se pareiam auxiliando na formação da alça P4, ao passo que R e S auxiliam na aça P3. A internal guide sequence (IGS, em tradução livre “Sequência guia interna”) é outra região intrônica localizada próxima à região 5’ que se complementa com o.

(24) 23. exon anterior para determinar a região de 5’ splice site (Figura 2). Assim, observa-se que os introns do grupo I apresentam a sua arquitetura estrutural organizada em três grandes domínios, são eles: os domínios de ligação ao substrato representados por P1 (5’ splice site) e P10 (3’ splice site); o domínio catalítico formado por P3, P7, P8 e P9 e o domínio estrutural ou scaffolding domain, representado por P4, P5 e P6 (HAUSNER; HAFEZ; EDGELL, 2014; LI; ZHANG, 2005; MICHEL; WESTHOF, 1990).. Figura 2- Modelo de estrutura secundária dos introns do grupo I. Representação genérica da estrutura dos introns do grupo I com ênfase nas principais alças e domínios com sequências conservadas. [a] as regiões com linhas em azul indicam ORFs que codificam homing endonucleases, localizadas predominantemente nos loops. As linhas em laranja mostram a localização das sequências conservadas P, Q, R, S e IGS. Retângulos em preto representam exons localizados nas porções anterior e posterior as regiões 5’ e 3’ splice site (triângulos em verde), respectivamente. O local de ligação da guanina exógena (ExoG) no G-binding site, localizado na alça P7, está representado por um asterisco. [b] as ORFs codificando homing endonucleases também podem se estender para as junções que unem as principais alças, como as junções J1/2 e J6/7. Fonte: Hausner; Hafez; Edgell (2014).. O sucesso dos introns do grupo I, bem como também dos introns do grupo II, está relacionado à sua inata capacidade de sofrer auto-splicing, que permite que eles se propaguem pela inserção dentro do gene do hospedeiro (LAMBOWITZ et al., 1999). O processo autocatalítico de remoção do intron do grupo I é essencial para a maturação do RNA hospedeiro e, por consequência, para o desenvolvimento da levedura (CECH, 1990), visto que estes elementos interrompem regiões codificadoras dos genes de mRNA, tRNA, e em sua maioria de rRNA (LI; ZHANG, 2005). Esta habilidade dos introns do grupo I em sofrer auto-splicing foi.

(25) 24. primeiramente demostrada por Kruger et al. (1982) para um intron presente no gene nuclear da grande subunidade ribossomal do protozoário Tetrahymena thermophila. Os introns do grupo I são removidos do RNA precursor através de duas reações de splicing distintas (reações de transesterificação), nas quais a estrutura enovelada participa diretamente da reação. Muitos introns podem sofrer auto-splicing in vitro espontaneamente, ou seja, nenhuma proteína é requerida no processo, enquanto outros necessitam de fatores proteicos para facilitar a correta dobragem do sítio catalítico (CECH, 1990). O pré-requisito para o splicing é a ligação com uma guanosina exógena (ExoG) ou uma de suas formas fosforiladas (GMP, GDP ou GTP) que atuam como cofator no sítio catalítico do intron, chamado G-binding site (localizado na alça P7) (Figura 2). Durante o primeiro passo do splicing, o cofator ataca a região 5’ (SS) e se liga ao intron, resultando na liberação do éxon. Esse processo se dá quando o cofator ataca o átomo de fósforo da região 5’ formando uma ponte 3,5’- fosfodiéster do primeiro nucleotídeo ao intron. O segundo passo é iniciado por um ataque na região 3’ do éxon gerado pelo grupo 3’-hidroxil livre do éxon 5’. Isso promove a liberação da região 3’SS posterior ao último nucleotídeo do intron – que é sempre uma guanina (ωG) -, resultando na ligação dos éxons e a liberação do intron (CECH, 1990; HAUGEN; SIMON; BHATTACHARYA, 2005) (Figura 3). Os introns do grupo I podem ser classificados em cinco subgrupos, sendo eles IA, IB, IC, ID e IE (MICHEL; WESTHOF, 1990; SUH; JONES; BLACKWELL, 1999), e suas sequências e estruturas estão disponíveis no GISSD (do inglês “Group I intron sequence and structure Database” em tradução livre “banco de dados de estrutura e sequência de introns do grupo I”) (http://www.rna.whu.edu.cn/gissd/index.html). Esta classificação leva em consideração a presença de domínios conservados, configurações alternativas de elementos na estrutura secundária e terciária do intron, especialmente as regiões envolvidas com as alças P1, P3, P4, P6 e P7 (por exemplo, a presença das estruturas P7.1, P7.2) (HAUSNER; HAFEZ; EDGELL, 2014; MICHEL; WESTHOF, 1990; ZHOU et al., 2008). Dependendo da presença ou ausência de configurações estruturais específicas, quatro dos cinco subgrupos ainda podem ser subdivididos em IA1, 1A2, IA3, IB1, IB2, IB3, IB4, IC1, IC2, IC3, IE1, IE2, IE3 (ZHOU et al., 2008)..

(26) 25. Figura 3- Representação esquemática do processo de auto-splincing dos introns do grupo I. Fonte: Haugen; Simon; Bhattacharya (2005).. Os introns do grupo I, além da capacidade de auto-splicing, podem codificar genes de homing endonucleases (HEG, do inglês: ‘Homing Endonuclease gene’) de DNA específicas que fazem com que estes elementos genéticos possam se mover dentro do genoma. As Homing endonucleases são enzimas de clivagem de DNA altamente específicas, encontradas dentro de todas as formas bacterianas, bem como em mitocôndrias e cloroplastos de células eucarióticas. Apesar do tamanho reduzido destas proteínas, de modo geral, elas são capazes de reconhecer longas sequências de DNA, geralmente entre 20-30 pares de bases (STODDARD, 2011). Quando o gene da homing endonuclease está localizado dentro de elementos que sofrem autosplicing (introns do grupo I, II e inteins, por exemplo), eles conferem ao elemento uma maior habilidade de invasão dentro do genoma do organismo hospedeiro (STODDARD, 2014). Os introns do grupo I podem ser classificados em duas classes gerais: as que codificam ORFs (do inglês: ‘Open reading frames’ em tradução livre ‘quadros abertos de leitura’) e as que não a contém. Essas ORFs codificando homing endonucleases são encontradas em cerca de 30% dos introns do grupo I. Como as HEG estão associadas a um intron autorremovível, sua presença não interfere na funcionalidade do RNA maduro. A localização dessas ORFs varia dentro da conservada estrutura secundária de RNA, mas eles são geralmente encontrados em loops onde não interferem no centro catalítico do splicing (Figura 2) (EDGELL; CHALAMCHARLA; BELFORT, 2011)..

(27) 26. Basicamente, a mobilidade do intron/HEG ocorre quando a homing endonuclease gera uma quebra na dupla fita de DNA (DSB, do inglês “double strand break”) contendo o alelo cognato sem o intron (portanto sem a homing endonuclease) próximo ou dentro do sítio de inserção do intron. Pelo sistema de reparo por recombinação homóloga, o alelo íntegro, que possui o intron com a homing endonuclease, serve de molde para o reparo, sendo copiado para o alelo cognato, antes vazio (HAUGEN et al., 2007). As lesões no DNA causadas pelas enzimas homing são subsequentemente reparadas por recombinação homóloga usando a maquinaria de reparo da célula (BELL-PEDERSEN et al., 1989; MUELLER; SMITH; BELFORT, 1996). Os genes codificadores de homing endonuclease geralmente ocorrem em regiões não críticas do intron, como os loops terminais, de modo a não interferir em seu auto-splicing (HAUGEN et al., 2007; HAUGEN; SIMON; BHATTACHARYA, 2005). Apesar da proximidade e da intensa relação simbiótica observada entre algumas espécies microbianas e organismos eucarióticos multicelulares, ainda não foi observado caso de relato da existência destes genes codificadores de homing endonuclease dentro do genoma de organismos mais complexos (STODDARD, 2011). As homing endonucleases são classificadas em seis famílias de acordo com os aminoácidos conservados que fazem parte da estrutura e sítio ativo da proteína, sendo elas LAGLIDADG, His-Cys box, H-N-H, GIY-YIG, PD-(D/E) xK e EDxHD. Destas famílias, quatro são mais restritas a introns do grupo I presentes em fagos, bactérias, archea/eucarióticos e protistas, são elas GIY-YIG, PD-(D/E)xK, LAGLIDADG e His-Cys box, respectivamente (HAUSNER; HAFEZ; EDGELL, 2014; STODDARD, 2011). Entretanto, de todas as famílias, a LAGLIDADG apresenta a maior diversidade de distribuição, pois está presente no genoma de organelas de plantas, fungos, protistas, bactérias, metazoários basais e archaea (BELFORT; PERLMAN, 1995). Já as famílias His-Cys box e H-N-H apresentam a arquitetura de seu sítio ativo muito similares, o mesmo ocorrendo para as famílias PD- (D/E)xK e EDxHD (HAUSNER; HAFEZ; EDGELL, 2014). Embora altamente dispersos, a distribuição dos introns do grupo I é tendenciosa, visto que se encontram comumente presentes em alguns taxa de fungos, mas ausente em outros, sugerindo. uma. transferência. horizontal. destes. elementos. (HAUGEN;. SIMON;. BHATTACHARYA, 2005). Além disso, observa-se que um mesmo intron do grupo I pode ter invadido diferentes genes. Tal observação provavelmente não se deve à ação de homing endonucleases, pois como supracitado estas enzimas são sítio específicas. Contudo, outro mecanismo associado à invasão dos introns do grupo I em diferentes sequências do genoma, conhecido como splicing reverso, parece ser o responsável pela sua mobilidade intra e.

(28) 27. intergênica. No splicing reverso, o intron do grupo I livre se insere dentro de um sítio natural de inserção de um outro intron já removido (seja um RNA homólogo ou heterólogo) através da complementariedade de bases entre o intron e o exon do RNA (HEDBERG; JOHANSEN, 2013). O intron do grupo I é capaz de reconhecer sua sequência alvo, que contém entre 4-6 nucleotídeos (bem menor e, portanto, menos específico que o sítio reconhecido pela HE), permitindo que o intron se insira na ligação entre os dois exons. Após a integração no transcrito, o RNA recombinado sofre uma transcrição reversa e o cDNA (DNA complementar) é integrado ao genoma (BIRGISDOTTIR; JOHANSEN, 2005). A maior prevalência dos introns do grupo I em genes de rRNA e tRNA talvez seja um reflexo da enorme abundância destes RNAs – visto que se tratam de genes multicópia. Assim, eles poderiam gerar muitos alvos de cópia via homing ou splicing reverso in vivo deste elemento (BELFORT; PERLMAN, 1995). Além disso, o splicing reverso facilita a mobilidade do intron entre genes distintos, o que seria mais difícil de ocorrer pelo processo de homing. Apesar disso, este último ainda é mais eficiente em promover a mobilidade do intron, visto que ele não depende de passos adicionais requeridos pelo splicing reverso, como a transcrição reversa (BHATTACHARYA et al., 2005). Quanto a presença dos introns do grupo I em Cryptococcus spp., o estudo realizado por Litter et al. (2005), utilizando duas cepas de Cryptococcus, IFO 410 (Cryptococcus neoformans var. grubii - sorotipo A) e IFM 5844 (C. neoformans var. neoformans - sorotipo D), mostrou a existência de alguns destes elementos no genoma mitocondrial deste fungo. Na cepa IFM 5844 foram identificados 5 introns no gene COX1 (introns com tamanho de 953, 1071, 1043, 1104 e 246 pb), dois introns no gene COB (979 e 1143 pb) e dois introns no gene LSU (417 e 1168 pb), ao passo que nenhum intron foi identificado nos genes COX1 e LSU da cepa IFO 410 e apenas um intron no gene COB (com tamanho de 1142 pb). Assim, os polimorfismos de presença e ausência, bem como de tamanho destes elementos observados no genoma mitocondrial de Cryptococcus podem servir para a diferenciação entre genótipos de C. neoformans e C. gattii. Isso porque, assim como os inteins, os introns do grupo I possuem regiões mais e menos variadas, podendo ou não codificar homing endonucleases. Eles também possivelmente podem estar ausentes ou presentes em determinados tipos moleculares, e apresentarem diferentes tamanhos. Dessa forma, avaliar os possíveis polimorfismos existentes entre os introns do grupo I poderá permitir sua utilização em estudos populacionais e epidemiológicos. De fato, os introns do grupo I apresentam uma ampla diversidade na sua estrutura e distribuição. O mesmo também já foi visto para o seu tamanho, uma vez que vários autores já.

(29) 28. relataram diferença de muitos nucleotídeos entre diversos introns. O estudo de Haugen, Simon & Bhattacharya (2005) define os introns do grupo I com um tamanho bastante moderado, variando entre 250-500 nucleotídeos, como já citado. Entretanto, este padrão de tamanho normalmente é observado para os introns do grupo I presentes em genes nucleares. Porém, para introns presentes em genes mitocondriais, a diversidade de tamanho observada é muitas vezes maior, uma vez que eles podem chegar até a 3000 nucleotídeos. Este fato pode ser explicado pela presença de longas inserções, o que inclui as ORFs codificando homing endonucleases (LANG; LAFOREST; BURGER, 2007). Os introns do grupo I já foram estudados em outras espécies de fungos, como Candida albicans. Nessa espécie, o auto-splicing do intron do grupo I (localizado na subunidade 25S do rRNA) é de fundamental importância para a maturação do RNA hospedeiro (ZHANG; LEIBOWITZ; ZHANG, 2009). De forma geral, os introns do grupo I já foram relatados em outros patógenos microbianos como Pneumocystis carinii, Acanthomoeba, Neissseria, Neurospora crassa, Candida dubliniensis, Naegleria andersoni, etc. (BOUCHER et al., 1996; EMBLEY; DYAL; KILVINGTON, 1992; GAST; FUERST; BYERS, 1994; LIU; LEIBOWITZ, 1993; SOGIN; EDMAN, 1989). O auto-splicing do intron do grupo I em fungos é também um importante alvo para fármacos, pois uma vez o splicing inibido, o RNA precursor não se torna funcional. Como os RNAs hospedeiros destes introns são essenciais para o metabolismo básico da célula, a não excisão do intron teria um importante impacto na viabilidade da célula fúngica, com a vantagem de ser um alvo seguro, uma vez que estes elementos invasivos estão ausentes no genoma humano (DISNEY et al., 2001). Isto vem de encontro como acréscimo no número de casos de doenças fúngicas relatadas (especialmente entre os fungos patogênicos oportunistas que acometem pacientes imunodeprimidos), bem como o aumento na incidência da resistência a antifúngicos, o que leva a necessidade da busca de novas drogas e novos alvos terapêuticos (STERNBERG, 1994). Em Candida albicans, o intron do grupo I do gene codificador do rRNA 25S, presente em aproximadamente 40% das cepas (MERCURE; MONTPLAISIR; LEMAY, 1993) é considerado um alvo terapêutico, uma vez que sua presença está relacionada a susceptibilidade a pentamidina, que comprovadamente é capaz de inibir seu splicing, em concentrações de 200 µM, em experimentos conduzidos in vitro e em células. (MILETTI; LEIBOWITZ, 2000). Pequenos oligonucleotídeos modificados por nucleases também apresentaram ação inibitória do auto-splicing através de mecanismos de inibição suicida, no qual o oligonucleotídeo se liga ao RNA precursor e subsequentemente inibe o auto-splicing do intron.

(30) 29. in vivo (DISNEY et al., 2001). Outras moléculas pequenas, além dos oligonucleotídeos e pentamidina, como é o caso do 5-Flurouracil e 5-Flucitosina, também são mostrados como drogas atuantes no intron do grupo I de C. albicans (MERCURE et al., 1997; MERCURE; MONTPLAISIR; LEMAY, 1993). Similarmente, muitos aminoglicosídeos e antibióticos peptídicos foram reportados como inibidores do auto-splicing do intron do grupo I (VON AHSEN; DAVIES; SCHROEDER, 1992; VON AHSEN; SCHROEDER, 1991; WANK et al., 1994). Testes de susceptibilidade conduzidos por Jayaguru & Raghunathan (2007) mostraram a bleomicina como uma importante droga inibitória do auto-splicing do intron do grupo I em C. albicans. A bleomicina é um antibiótico glicopeptídico antitumoral que se mostrou interagir com o intron do grupo I de modo a afetar sua conformação, inibindo o seu auto-splicing. Uma forte correlação entre a presença do intron e a alta susceptibilidade a bleomicina é evidente, de modo que a concentração mínima inibitória da bleomicina para as cepas que continham o intron foi de 1,56 µg/ml enquanto que para aquelas onde o intron estava ausente foi de 6,25 µg/ml. Dessa forma, a bleomicina pode ser utilizada contra esse patógeno, mas sem afetar as células normais do portador. Assim, o desenvolvimento de drogas que inibem esse processo de splicing do intron do grupo I pode ser promissor para a busca de terapias alternativas e com menores efeitos colaterais aos pacientes. Os antifúngicos normalmente utilizados no tratamento da criptococose, como os compostos azólicos (itraconazol, fluconazol), 5-flucitosina e anfotericina B podem causar sérios problemas ao indivíduo. A exemplo tem-se o tratamento com anfotericina B, que por provocar episódios de vômitos, náuseas, hipertensão ou hipotensão, hipóxia, além de sérios efeitos nefrotóxicos ao paciente, torna a sua administração dependente de internação (LANIADO-LABORÍN; CABRALES-VARGAS, 2009). Dessa forma, pode-se considerar os introns do grupo I alvos terapêuticos potencialmente seguros, uma vez que estes elementos estão ausentes no genoma humano (HAUGEN; SIMON; BHATTACHARYA, 2005). Segundo Litter et al. (2005) e a base de dados CRW (Comparative RNA Web site and Project) (http://www.rna.icmb.utexas.edu//) existem dois introns do grupo I no gene mitocondrial 23S de C. neoformans var. neoformans, nomeados Cne.mL2449 (com 1168 pb) e Cne.mL2504 (com 417 pb) (acesso em http://www.rna.whu.edu.cn/gissd//). Esses introns estão localizados em um intervalo de apenas 53 nucleotídeos de distância um do outro (Figura 4) e podem ser identificados no GenBank com número de acesso AY560611.1 para C. neoformans var. neoformans, mas estão ausentes em C. neoformans var. grubii (AY560612.1) (LITTER et al., 2005). A sequência e estrutura desses dois introns supracitados já se encontram disponíveis.

(31) 30. no banco de dados do GISSD (http://www.rna.whu.edu.cn/gissd/search.html), onde ambos foram classificados como pertencentes ao subgrupo IA1 (Figura 5). Entretanto, até o momento não há relato de estudos populacionais dentro do gênero Cryptococcus para averiguar a ocorrência e distribuição desses introns; e ainda, se estes elementos podem servir como marcadores moleculares para a distinção entre tipos moleculares ou como um novo alvo para o indicativo de resistência a drogas antifúngicas em Cryptococcus.. Figura 4- Introns descritos no gene mitocondrial 23S. O esquema ilustrativo mostra os dois introns do grupo I presentes no gene mitocondrial 23S de C. neoformans var. neoformans que já se encontram depositados em banco de dados do GISSD e CRW..

(32) 31. Figura 5- Predição da estrutura secundária para os introns Cne.ml2449 e Cne.mL2504. Ambos elementos já foram identificados no trabalho realizado por Litter et al. (2005) para um isolado de Cryptococcus neoformans var. neoformans (VNIV, sorotipo D) (GenBank número de acesso AY560611.1) e sua sequência e estrutura já se encontram depositadas no GISSD, onde encontram classificados como pertencentes ao subgrupo IA1. Fonte: GISSD..

(33) 32. Assim, a presente pesquisa foi pioneira na realização de um estudo populacional da presença/ausência de polimorfismos de introns do grupo I no gene LSU (23S) em Cryptococcus, apontando seu possível uso na clínica e em estudos epidemiológicos. Portanto, avaliar a possível utilização dos introns do grupo I como novos alvos moleculares para susceptibilidade a antifúngicos e genotipagem foi um dos fins deste estudo..

(34) 33. 2 OBJETIVOS. 2.1 Objetivo geral Avaliar a relação entre os diferentes genótipos de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii e sua susceptibilidade a antifúngicos com a presença e variabilidade dos introns do grupo I do gene codificador do RNA ribossômico 23S (LSU) mitocondrial destes patógenos.. 2.2 Objetivos específicos •. Genotipar isolados de C. neoformans e C. gattii através de RFLP do gene URA5;. •. Avaliar a presença de polimorfismos que possam ser úteis na rápida distinção entre as espécies e seus tipos moleculares, definidos pelo PCR e sequenciamento dos introns do grupo I de C. neoformans e C. gattii, presentes no gene mitocondrial LSU rRNA (23S);. •. Observar a presença de possíveis associações entre a presença do intron e a susceptibilidade às drogas para cada genótipo de C. neoformans e C. gattii;. •. Elucidar a possível origem dos introns descritos pela comparação das sequências obtidas com as sequências similares depositadas no GenBank;. •. Avaliar a presença de possíveis ORFs nos introns;. •. Avaliar a presença de sítios conservados que caracterizam a funcionalidade do intron como elemento autocatalítico e propor modelos de estrutura secundária de RNA para os introns estudados..

(35) 34. 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Isolados fúngicos utilizados Os isolados clínicos e ambientais analisados nesse estudo tiveram origem de fontes distintas. Vinte e nove isolados foram cedidos pelo laboratório de Biologia de Fungos do Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu/SP. Nove isolados foram solicitados a Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) do Rio de Janeiro/RJ, nove vieram do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo – IMT/SP, três da Universidade Federal do Piauí – UFPI, sete da Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS, duas cepas foram obtidas por isolamento ambiental na cidade do Natal (RN), dois foram provenientes do Laboratório Central de Saúde Pública do Rio Grande do Norte (LACEN/RN) e outra do Hospital São Lucas (Natal/RN) e, por fim, pelo convênio existente entre o Instituto de Medicina Tropical – IMT/RN e Hospital Giselda Trigueiro (HGT), 16 amostras clínicas de pacientes (entre eles pacientes imunodeprimidos e imunocompetentes) foram adquiridas por meio de punções do líquido cefalorraquidiano e isolamento em Sabouraud Dextrose Agar realizadas por profissionais de saúde especializados, na rotina diária de diagnóstico micológico. Assim, nesse estudo foram analisados um total de 78 isolados (Tabela 1), sendo um pertencente a espécie C. laurentii, que por ser grupo-irmão de C. gattii e C. neoformans foi escolhido como um grupo externo para a avaliação da presença do intron do grupo I no gene mitocondrial 23S. Os isolados foram cultivados no meio Sabouraud Dextrose Agar, acrescido de cloranfenicol (50 mg/L), mantidos a 37°C durante 72 h e, então, condicionados em geladeira (4°C). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte: CAAE 39640614.8.0000.5537. Tabela 1- Isolados utilizados no estudo. Designação coleção UFRN. Origem/referência. BT1. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT2. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT3. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT4. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT5. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT6. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT7. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT8. Hospital das Clínicas-Botucatu.

(36) 35. BT9. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT10. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT11. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT12. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT13. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT14. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT15. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT16. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT17. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT18. NI. BT19. NI. BT20. Hospital Veterinário – Botucatu. BT21. NI. BT22. Hospital Veterinário – Botucatu. BT23. NI. BT24. NI. BT25. NI. BT26. Hospital das Clínicas-Botucatu. BT27. NI. BT28. NI. BT29. NI. FC1. FIOCRUZ RJ (70302 - WM178). FC2. FIOCRUZ RJ (70301 - WM629). FC3. FIOCRUZ RJ (70299 - WM161). FC4. FIOCRUZ RJ (70297 - WM628). FC5. FIOCRUZ RJ (70296 -WM626). FC6. FIOCRUZ RJ. FC7. FIOCRUZ RJ. FC8. FIOCRUZ RJ (40043). FC9. FIOCRUZ RJ (70300 - WM779). HGT1. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT2. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT3. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT4. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT5. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT6. Hospital Giselda Trigueiro-Natal.

(37) 36. HGT7. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT8. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT9. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT10. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT11. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT12. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT13. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT14. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT15. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HGT16. Hospital Giselda Trigueiro-Natal. HSL1. Hospital São Lucas. UFRN1. Isolamento ambiental/Alecrim- Natal. UFRN2. Isolamento ambiental/Alecrim- Natal. PI1543. Universidade Federal do Piauí. PI1560. Universidade Federal do Piauí. PI1401. Universidade Federal do Piauí. CG606. Instituto de Medicina Tropical – SP. CG201. Instituto de Medicina Tropical – SP. CG751. Instituto de Medicina Tropical – SP. CG769. Instituto de Medicina Tropical – SP. CN772. Instituto de Medicina Tropical – SP. CN894. Instituto de Medicina Tropical – SP. CN216. Instituto de Medicina Tropical – SP. CN508. Instituto de Medicina Tropical – SP. CN117. Instituto de Medicina Tropical – SP. CFP55. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. CFP56. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. CFP57. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. CFP58. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. CFP59. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. CFP61. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. CFP62. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. LCR2002237. LACEN/RN. LCR2002368. LACEN/RN. Lista geral de todos os setenta e oito isolados de Cryptococcus sp. agrupados segundo sua origem. NI- Não informado..

(38) 37. 3.2 Extração de DNA A extração de DNA foi feita de acordo com Trilles et al. (2008). Após o subcultivo, em tubos com Sabouraud-Dextrose Agar (Kasvi, EUA) a 37°C por 48 h, a cultura foi toda removida com o auxílio de uma espátula (em fluxo de biossegurança CSB classe 2), congelada com nitrogênio líquido e triturada em um graal com um pistilo (todos previamente esterilizados). Ao triturado foram adicionados 500 µL de solução de lise (SDS 0,5%, NaCl 1,4%, EDTA 0,73% e Tris-HCl 0,2 M), homogeneizados com o pistilo e, então, transferidos para um micro tubo. A mistura foi agitada no agitador de tubos (vórtex) à temperatura ambiente por 5 minutos; em seguida foram adicionados 500µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (v:v:v 25:24:1). Após homogeneização (por inversão) durante 2 minutos os tubos foram centrifugados por 20 minutos a rotação de 16.000 g. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo previamente identificado e um volume igual (mesmo volume, em microlitros, do sobrenadante retirado) de clorofórmio:álcool isoamílico (v:v 24:1) foi adicionado, seguido de nova homogeneização e centrifugação como anteriormente. O sobrenadante foi novamente transferido para um novo microtubo, onde igual volume de isopropanol foi adicionado (seguindo o mesmo esquema anterior). A mistura foi gentilmente homogeneizada e incubada a -20°C por 1 h ou overnight. O DNA foi precipitado por centrifugação a 16.000 g por 20 minutos para a formação do pellet e o sobrenadante foi removido. Lavou-se o DNA com 1 mL de etanol 70%, seguindo uma nova centrifugação como anteriormente e posterior descarte do sobrenadante. O DNA foi secado no concentrator (eppendorf concentrator plus) (45°C; 15 min.), suspendido em 50 µL de nuclease free water (NFW, Sigma) e mantido a 4°C overnight, para então ser estocado a -20°C. A quantificação do DNA extraído foi estimada por duas técnicas: através de gel de agarose (GE Healthcare) a 1% e corrida em eletroforese com o marcador Low Mass Ladder (Invintrogen) ou por quantificação direta no NanoDrop 2000 Spectrophotometers (Thermo Scientific).. 3.3 PCR e RFLP do gene URA5 Para a reação de PCR do gene URA5, um mix de 50 µL foi preparado contendo 27 µL de nuclease free water (Sigma), 10 µL de PCR buffer CG 5X (200 mM tris-HCL PH 8,4; 1,5 mM MgCl2 50 mM; 500mM KCl), 5 µL de DMSO 30% (Thermo scientific), 1 µL de dNTP a 10 mM cada, 30ng de DNA genômico, 1,25 µL de cada primer URA5 - 5’ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG. -3’). e. SJO1. -. (5’-.