JÉSSYKA VIVIANE ANDRADE DIAS
INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE DIFENILIODÔNIO EM PROPRIEDADES FÍSICAS E BIOLÓGICAS DE UM CIMENTO DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO
MODIFICADO POR RESINA
NATAL/RN 2019
JÉSSYKA VIVIANE ANDRADE DIAS
INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE DIFENILIODÔNIO EM PROPRIEDADES FÍSICAS E BIOLÓGICAS DE UM CIMENTO DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO MODIFICADO
POR RESINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas com área de concentração em clínicas odontológicas. Orientador: Prof. Dr. Boniek Castillo Dutra Borges
NATAL/RN 2019 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento de Odontologia
Dias, Jéssyka Viviane Andrade.
Influência da adição de difeniliodônio em propriedades físicas e biológicas de um cimento de hidróxido de cálcio modificado por resina / Jéssyka Viviane Andrade Dias. - 2019.
45f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas) -
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Natal, 2019.
Orientador: Boniek Castillo Dutra Borges.
1. Materiais Dentários - Dissertação. 2. Cimentos de Resina - Dissertação. 3. Difeniliodonio - Dissertação. I. Borges, Boniek Castillo Dutra. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D151 Elaborado por Hadassa Daniele Silva Bulhões - CRB-CRB 313/15
JÉSSYKA VIVIANE ANDRADE DIAS
INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE UM CATALIZADOR DE POLIMERIZAÇÃO EM PROPRIEDADES FÍSICAS E BIOLÓGICAS DE UM CIMENTO DE HIDRÓXIDO
DE CÁLCIO MODIFICADO POR RESINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas com área de concentração em clínicas odontológicas.
Aprovado em: ____/____/____
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________________ Prof. Dr. Boniek Castillo Dutra Borges – Orientador
Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte
_____________________________________________________________ Profa. Dra. Marília Regalado Galvão Rabelo Caldas – Membro interno
Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte
_____________________________________________________________ Profa. Dra. Emanuelle Dayana Vieira Dantas – Membro externo
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva da UFRN por todos os conhecimentos obtidos.
Aos meus pais Ricardo e Marta Dias, pelo amor durante toda minha vida, e por tornar possível cada um dos meus sonhos. Obrigada por sempre acreditar em mim!
Ao meu amor e melhor amigo, Jerônimo Rosado pelo apoio, paciência, e por tantas outras razões que foram essenciais ao longo desta jornada. Obrigada por compartilhar comigo os meus sonhos e pelo incentivo na hora de realizá-los.
A minha irmã Tâmara. Pelo cuidado, preocupação, e por ser a minha incentivadora e acreditar sempre no meu potencial.
As minhas avós Zulmira e Francisca (in memoriam) que são fontes de amor pra mim.
Ao meu orientador, Boniek Castillo Dutra Borges, pelo exemplo de professor e ser humano. Por saber a hora de cobrar e a hora de me deixar ir sem cobranças, acreditando que eu cumpriria todas as obrigações quando chegasse o tempo. Por ter sido excepcional no ato de transmitir seus conhecimentos.
A Letícia Chaves, por me ajudar em todos os momentos da realização desse trabalho, pela competência e dedicação demonstradas auxiliando na execução de algumas etapas laboratoriais desta pesquisa. A Rodolfo Xavier, por sua disponibilidade e auxilio durante esses dois anos.
RESUMO
Objetivo: Avaliar a influência da adição de um catalisador de polimerização (difeniliodônio hexafluorfosfato - DFI), nas concentrações de 0%, 2%, 4% e 8%, em um cimento de hidróxido de cálcio modificado por resina nas propriedades de grau de conversão (GC), profundidade de polimerização (PP), resistência flexural (RF), módulo de elasticidade (ME), sorção/solubilidade (SS), liberação de hidroxila (LH) e citotoxicidade (CT). Materiais e métodos: O cimento de hidróxido de cálcio Ultra-Blend plus foi utilizado. Para inclusão do DFI, quatro grupos foram criados de acordo com diferentes concentrações: grupo controle (G0) sem inclusão de DFI; adição de 2% de DFI (G2); adição de 4% de DFI (G4) e 8% de DFI (G8). Para análise dos dados dos testes de GC, PP, RF, ME, SS utilizaram-se os testes ANOVA 1 fator e para o teste de LH o ANOVA 2 fatores e pós teste de Tukey (p<0,05). Resultados: Para o GC, G (2) e G (8) apresentaram os maiores valores, em contrapartida G (4) expôs resultado intermediário e G (0) desfecho inferior entre todos. No entanto, para PP, houve diferença significativa entre as concentrações de 0% e 8%. Na RF, G (2) exibiu valores superiores dentre todos os grupos, enquanto que G (4) e G (8) revelaram efeitos estatísticos similares. No ME, G (2) e G (8) obtiveram seus valores superiores estatisticamente ao G (4) e G (0) apresentou-se inferior entre todos. Na Sorção, G (8) obteve resultado superior aos demais grupos, ao passo que, na Solubilidade G (0) foi significativamente maior que os demais grupos. Na LH, G (0) e G (2) tiveram seus picos máximos de liberação no tempo de 72h. Entretanto, G (4) e G (8), tiveram pico máximo de liberação em 72h e 7 dias, todavia, todas os grupos mostraram-se estatisticamente semelhantes no tempo de 14 dias, exibindo valores inferiores a todos os tempos estudados. Para CT, houve diferença estatisticamente significativa entre as porcentagens no tempo de 24h em contato com o meio (p<0,05). Conclusão: Os grupos com adição do difeniliodonio apresentaram as propriedades mecânicas e biológicas superiores ao grupo controle, tendo melhores resultados na concentração de 2%.
Palavras-chave: Materiais Dentários. Cimentos de Resina. Difeniliodonio. Hidróxido de Cálcio. Catalisador. Polimerização.
ABSTRACT
Objective: To evaluate the influence of the addition of a polymerization catalyst (diphenyliodonium hexafluorphosphate - DFI) at concentrations of 0%, 2%, 4% and 8% in a resin modified calcium hydroxide cement on the conversion grade properties. (GC), polymerization depth (PP), flexural strength (RF), elastic modulus (ME), sorption / solubility (SS), hydroxyl release (LH) and cytotoxicity (CT). Materials and methods: Ultra-Blend plus calcium hydroxide cement was used. For DFI inclusion, four groups were created according to different concentrations: control group (G0) without DFI inclusion; addition of 2% DFI (G2); addition of 4% DFI (G4) and 8% DFI (G8). For data analysis of GC, PP, RF, ME, SS tests we used the one-way ANOVA tests and for the LH test the two-way ANOVA and post Tukey test (p <0.05). Results: For CG, G (2) and G (8) presented the highest values, in contrast G (4) showed intermediate result and G (0) lower outcome among all. However, for PP, there was significant difference between 0% and 8% concentrations. In RF, G (2) showed higher values among all groups, while G (4) and G (8) showed similar statistical effects. In the ME, G (2) and G (8) obtained their values statistically higher than G (4) and G (0) was lower among all. In Sorção, G (8) was better than the other groups, whereas in Solubility G (0) was significantly higher than the other groups. In LH, G (0) and G (2) had their maximum release peaks at time 72h. However, G (4) and G (8) had a maximum release peak at 72h and 7 days; however, all groups were statistically similar at 14 days, showing values lower than all studied times. For TC, there was a statistically significant difference between the percentages in 24h time in contact with the environment (p <0.05). Conclusion: The groups with diphenyliodonium addition presented the mechanical and biological properties superior to the control group, having better results in the concentration of 2%.
Keywords: Dental Materials. Resin Cements. Diphenyliodonium. Calcium hydroxide. Catalyst. Polymerization.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Materiais utilizados neste estudo... 23 TABELA 2 - Grupos deste estudo... 24 TABELA 3 - Médias ± desvios-padrão dos valores do GC de acordo com as
porcentagens de DFI adicionadas... 30 TABELA 4 - Médias ± desvios-padrão dos valores de PP de acordo com acordo com
as porcentagens de DFI adicionadas... 30 TABELA 5 - Médias ± desvios-padrão dos valores da RF de acordo com as
porcentagens de DFI adicionadas... 31 TABELA 6 - Médias ± desvios-padrão dos valores do ME de acordo com as
porcentagens de DFI adicionadas... 31 TABELA 7 - Médias ± desvios-padrão da SS de acordo com as porcentagens de DFI
adicionadas... 32 TABELA 8 - Médias ± desvios-padrão da LH de acordo com as porcentagens de
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DFI - Difeniliodônio hexafluorofosfato HC - Hidróxido de cálcio GC - Grau de conversão PP - Profundidade de polimerização RF - Resistência flexural ME - Módulo de elasticidade SS - Sorção e solubilidade LH - Liberação de hidroxila CT - Citotoxicidade CQ - Canforoquinona
Bis-GMA - Bisfenol A dimetacrilato de glicol UDMA - Uretano Dimetacrilato
TEGDMA - Trietileno Glicol Dimetacrilato
FTIR - Espectroscopia Infravermelha Transformada de Fourier LED - Diodo Emissor de Luz
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 10
2 REVISÃO DE LITERATURA... 12
2.1 CIMENTO DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO... 12
2.2 UTILIZAÇÃO DO DIFENILIODÔNIO... 14
2.3 PROPRIEDADES FÍSICAS E BIOLÓGICAS... 15
2.3.1 Grau de conversão e profundidade de polimerização... 15
2.3.2 Resistência flexural e módulo de elasticidade... 16
2.3.3 Sorção e solubilidade... 17 2.3.4 Liberação de hidroxila... 18 2.3.5 Citotoxicidade... 19 3 OBJETIVOS... 21 3.1 OBJETIVO GERAL... 21 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 21 4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL... 22 5 MÉTODOS... 23
5.1 MANIPULAÇÃO DOS MATERIAIS... 23
5.2 GRAU DE CONVERSÃO... 24
5.3 PROFUNDIDADE DE POLIMERIZAÇÃO... 25
5.4 ANÁLISE DA RESISTÊNCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE 25 5.5 SORÇÃO/SOLUBILIDADE E LIBERAÇÃO DE HIDROXILA... 26
5.6 CITOTOXICIDADE... 27 6 RESULTADOS... 30 6.1 GRAU DE CONVERSÃO... 30 6.2 PROFUNDIDADE DE POLIMERIZAÇÃO... 30 6.3 RESISTÊNCIA FLEXURAL... 31 6.4 MÓDULO DE ELASTICIDADE... 31 6.5 SORÇÃO E SOLUBILIDADE... 32 6.6 LIBERAÇÃO DE HIDROXILA... 32 6.7 CITOTOXICIDADE... 33 7 DISCUSSÃO... 34 8 CONCLUSÕES... 39 REFERÊNCIAS... 40
1 INTRODUÇÃO
No tratamento das lesões de cárie profundas, a manutenção da vitalidade do complexo dentino-pulpar é fundamental, visto que a polpa requer proteção contra invasão bacteriana, condução termoelétrica e proteção química dos materiais restauradores sobrejacentes. Desse modo, o pH alcalino do hidróxido de cálcio e sua atividade antimicrobiana através da liberação de íons hidroxila promovem a inibição enzimática dos microorganismos (KOMABAYASHI T et al., 2016).
Outrossim, materiais à base de cálcio apresentam propriedades físico-químicas satisfatórias e tem sido o padrão ouro para capeamento pulpar indireto (DESAI; CHANDLER, 2009; MOHAMMADI; DUMMER, 2011). Na literatura há vários estudos sobre cimentos à base de hidróxido de cálcio (HC)²(GANDOLFI et al., 2015) na forma clássica de apresentação (cimentos quimicamente ativados). Esses cimentos deixam a desejar em relação à estética e possuem presa rápida, assim, o operador precisa estar atento e ser ágil.
Diante disso, a indústria lançou a versão modificada por resina com melhores características mecânicas, logo, aumenta a resistência à fratura da restauração, além de beneficiar a estética, aumentar o tempo de trabalho e, consequentemente, evitar o desperdício de material (GROTEN; PROBSTER, 1997; ROSENTIEL, 1998). O cimento Ultra-Blend® plus (Ultradent Products Inc. – South Jordan, UT, EUA, Ultradent do Brasil Produtos Odontológicos Ltda) é um material de base para forramento de cavidades, radiopaco, fotopolimerizável, apresenta adesão à dentina, contém hidróxido de cálcio (HC) e hidroxiapatita de cálcio em uma base de dimetacrilato uretano (UDMA).
Entretanto, para o alcance de uma adequada polimerização, a densidade de energia emitida pelo aparelho fotoativador deve atingir esse cimento para que haja uma boa resistência de união pós cimentação (MORAES 2006; ATAI, M, 2005). A polimerização insatisfatória acarreta características mecânicas deficientes, maior sorção/solubilidade de água e menor estabilidade de cor do material de proteção (FERRACANE, 1997; ATAI, M, 2005).
Dessa forma, os efeitos deletérios às partículas inorgânicas causam a liberação de monômeros não reagidos ou subprodutos da degradação hidrolítica da matriz de resina que, além de ter impacto na biocompatibilidade do material, criam zonas que aumentam a retenção de água. Portanto, é de extrema importância avaliar a citotoxicidade desse matérial. Em se tratando de materiais resinosos, o aspecto da solubilidade e o pH do
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material é relevante na sua prescrição, pois pode levar à sua dissolução (NATALE et al., 2005).
Outra propriedade como a profundidade de polimerização pode comprometer a
qualidade e longevidade das restaurações (SHIN et al., 1993). Estudos demonstram que para se obter a melhora das propriedades mecânicas de compósitos é preciso aumentar a reatividade do material utilizando sistemas fotoiniciadores mais efetivos, o que poderia apresentar efeito benéfico na polimerização.
Nesse contexto, o uso de um sal de iodônio como co-iniciador polimérico apresentou bons resultados em cimentos resinosos (SHIN;1993). Da mesma forma, as pesquisas de OGLIARI et al., (2007) mostraram que a adição do difeniliodônio hexafluorofosfato (DFI) à sistemas de fotoiniciação pode atuar como um catalisador, diminuindo a energia de ativação da fotoiniciação e trazendo vantagem na cinética de polimerização.
Sendo assim, a inclusão de difeniliodônio em cimentos de hidróxido de cálcio modificados por resina poderia aumentar a profundidade de polimerização e melhorar as características físicas e biológicas do material, tornando-os mais seguros para aplicação clínica.
Dessa maneira, o presente trabalho tem como proposta avaliar o efeito da inclusão de diferentes concentrações do difeniliodônio (0%, 2%, 4% e 8%) no grau de conversão, profundidade de polimerização, resistência flexural/módulo de elasticidade, sorção/solubilidade, liberação de hidroxila e citotoxicidade de um cimento de hidróxido de cálcio modificado por resina. A hipótese nula é que a inclusão do difeniliodonio não influenciará as propriedades testadas.
2 REVISÃO DE LITERATURA
Na elaboração desta revisão de literatura, foram utilizadas as bases de dados PubMed e Google Acadêmico. Na base PubMed foram utilizadas combinações das palavras chaves: “Calcium Hydroxide”, “Resin Cements” Polymerization, “Diphenyl
iodonium”, “Degree of conversion’’, Depth of polymerization”, “Flexural strength”, “Elastic modulus”, “Sorption and solubility”,“Release of hydroxyl” e “Citotoxicity”. Para o Google Acadêmico foram utilizadas combinações das palavras chave “Cimentos resinosos”, “Hidróxido de cálcio” “Cimento resinoso e “Difeniliodônio”, “Grau de conversão”, “Profundidade de polimerização”, “Resistência flexural”, “Módulo de elasticidade” “Sorção e solubilidade”, “Liberação de hidroxila” e “citotoxicidade”. Na base PubMed, foram selecionados apenas artigos na língua inglesa e que se enquadraram dentro da temática abordada e na base Google Acadêmico, foram selecionados artigos em inglês e português com preferência aos trabalhos de dissertação de mestrado e tese de doutorado em repositórios das universidades.
2.1 CIMENTO DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO
O hidróxido de cálcio foi inserido no mercado a partir do século XX, na Alemanha, por B. W. Hermann e designado comercialmente como Calxyl (CALHEIROS; ZANIN; PACHECO, 2013). É um material largamente utilizado na odontologia em razão da sua biocompatibilidade, boas propriedades físicas e baixo custo (ALMEIDA FREIRES; CAVALCANTI, 2011). Além de possuir características estimulantes na formação de dentina terciária, esses materiais podem ser denominados de base protetoras do complexo dentina-polpa (NAGEM FILHO, 2000). A vista disso, têm sido considerado como principal escolha para a proteção do complexo dentino-pulpar especialmente em cavidades profundas (HILTON, 1996; 2009).
Além disso, possui propriedades bactericidas e mineralizadoras que são dependentes do seu pH alcalino (ESTRELA et al., 1995), de modo que, prejudica as condições físico-químicas propícias para o crescimento de microrganismos (NOLTE, 1982). Dessa forma, a dissociação em íons cálcio e hidroxila influenciam no metabolismo e na divisão celular bacteriana, uma vez que, alteram as propriedades da membrana citoplasmática. (CALHEIROS; ZANIN; PACHECO, 2013). Em pH extremo por longo período a inativação enzimática das bactérias pode ser irreversível, porém, quando esta
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condição não for mantida por muito tempo, pode haver uma reversibilidade na atividade enzimática no nível da membrana citoplasmática bacteriana (AMABIS, 1976).
O processo de formação de dentina reparadora é desencadeado a partir do meio alcalino produzido pelo cimento de hidróxido de cálcio ativando enzimas teciduais como a fosfatase alcalina (SUBRAMANIAM et al., 2006). Essa enzima possui ação hidrolítica e reage com os íons cálcio da corrente sanguínea para formar um precipitado, o fosfato de cálcio na matriz orgânica, a unidade molecular da hidroxiapatita (SELTZER e BENDER, 1979), que se acredita estar intimamente relacionada ao processo de mineralização. Além disso, esse processo pode ser ligeiramente tóxico à polpa gerando uma necrose superficial das células pulpares, as quais produzirão dentina reparadora e uma ponte de dentina (MURRAY et al., 2003).
Nagem Filho (2000), concluiu que a principal função desses cimentos é de conservar a integridade da polpa ao promover o vedamento dos túbulos dentinários, impedindo a penetração de agentes agressores. Entretanto, o cimento de hidróxido de cálcio apresenta baixa resistência mecânica (STANLEY; LUNDY, 1972), é solúvel ao meio bucal (FRANCISCONI et al., 2009) e não possui adesão à dentina ou esmalte (NAGEM FILHO, 2000). Existem evidências de que os CHC sofrem dissolução sob os materiais restauradores favorecendo a infiltração marginal e comprometendo a integridade do tecido pulpar e a longevidade da restauração (SOUZA COSTA et al., 2007).
Como forma de amenizar essas deficiências mecânicas foi introduzido na prática clínica os materiais a base de hidróxido de cálcio modificados por resina. Estes apresentam melhores características mecânicas, uma vez que, aumentam a resistência à fratura da restauração (GROTEN; PROBSTER, 1997), exibem maiores valores para testes de resistência flexural, resistência à tração, módulo de elasticidade, dureza e quando comparado aos cimentos tradicionais, esses materiais de ativação somente por luz apresentam vantagens como maior tempo de trabalho e melhor estabilidade de cor. (ROSENSTIEL et al., 1998). No entanto, para obtenção de alta resistência de união após a cimentação, uma densidade de energia adequada emitida pelo aparelho fotoativador deve atingir o cimento para permitir adequada polimerização (MORAES et al., 2008; WATTS, 2005)
Os cimentos resinosos ativados por luz são compósitos odontológicos micro híbridos comercializados em sistemas de pasta única que apresentam matriz orgânica constituída principalmente por monômeros metacrilatos como Bisfenol-Glicidil
diMetAcrilato (Bis-GMA) e uretano dimetacrilato (UDMA), além de monômeros diluentes como o trietileno glicol dimetacrilato (TEGDMA) (JUNG et al., 2001; FERRACANE, 2011). Todavia, é desejável que os cimentos resinosos tenham valores de radiopacidade maiores em relação à dentina e similares ou maiores que o esmalte (BOTTINO et al,. 2000), além da radiopacidade para distinguir a linha de cimentação (verificação de excessos ou falhas) e a presença de cárie recorrente (ROSENSTIEL et al., 1998; KRAMER et al., 2000).
2.2 UTILIZAÇÃO DO DIFENILIODÔNIO
O DFI é um sal de caráter iônico, solúvel e quando associado a canforoquinona (CQ) pode melhorar o grau de conversão reagindo com a CQ inativa através da liberação de um radical fenil capaz de iniciar a polimerização e melhorar as deficiências estéticas do sistema iniciador CQ/amina (SHIN; RAWLS, 2009). Os sais de DFI são co-iniciadores catiônicos eficazes mediante a ativação da polimerização e baixa energia na ligação sobre exposição a luz (STANSBURY, 2012).
Sendo assim, a transferência de elétrons pela fotoativação e absorção da luz pela CQ geram espécies excitadas, as quais liberam o radical fenil (efetivo na iniciação da reação de polimerização de metacrilatos) funcionando como um co-iniciador e viabilizando o aumento da reatividade do sistema obtido. (HUA; JIANG; CRIVELLO, 2002). Segundo Anusavice (1998), a polimerização por luz visível é iniciada quando uma elevada concentração de radicais livres é formada sendo necessário que um número particular de fótons seja absorvido pelo sistema iniciador, o que é diretamente relacionado com o comprimento de onda, intensidade e tempo de exposição.
Ogliari et al., (2007), (2008) e Shin & Rawls (2009), observaram que a adição do DFI pode aumentar a cinética de polimerização em cimentos resinosos por meio de um sistema prévio de reação (fotoiniciador + Amina + Difeniliodônio HexaFluorofosfato - DPIHFP), em regiões de difícil acesso como cimentação de pinos intrarradiculares estes fotoiniciadores são ativados abaixo de um comprimento de ondas de 300nm (GONÇALVES et al., 2009). Além disso, possibilita a compatibilidade entre monômeros anfifílicos e iniciadores, melhora o grau de conversão e outras 19 propriedades mecânicas de um adesivo, em ambiente úmido, (LOGUERCIO, 2013).
Nesse contexto, foi demostrado que a combinação de um sal de iodônio e canforoquinona pode promover a decomposição do sal, resultando em um radical livre de
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dimetacrilato (SAKAGUCHI; WILTBANK; MURCHISON, 2004; SHIN; RAWLS, 2009). O estudo como o de Gonçalves (2013), avaliou a influência da DFI em diferentes proporções em cimentos resinosos e observou uma maior excitação no material testado na concentração 0,5 mol% apresentou melhora nas propriedades estudadas. Do mesmo modo, Ogliari et al. (2007), mostrou que a adição do DFI pode melhorar o grau de conversão e estética do compósito e que o sal de iodônio utilizado – difeniliodônio hexafluorfosfato – aumentou a cinética de polimerização de adesivos para dentina.
2.3 PROPRIEDADES FÍSICAS E BIOLÓGICAS
2.3.1 Grau de conversão e profundidade de polimerização
A estética na clínica odontológica está intimamente ligada aos materiais resinosos e para garantir adequadas propriedades físico-mecânicas devem ser idealmente polimerizados para obter um elevado grau de conversão de monômeros em polímeros (PEARSON; LONGMAN, 1989; IMAZATO et al., 1995). Dessa forma, a resistência ao desgaste, cisalhamento e dureza também atingiriam melhores resultados (ALVIM et al., 2007; SAKAGUCHI et al., 2009). Entretanto, a polimerização inadequada pode afetar no desempenho dos materiais resinosos, elevar a toxicidade por ação dos monômero residuais e dificultando a estabilidade da cor (STANSBURY et al., 2005).
Outrossim, existem alguns métodos para avaliar o grau de conversão e a profundidade de polimerização na literatura, onde a PP é avaliada através da razão da microdureza do topo e base e o GC na microscopia ótica e eletrônica de varredura, espectroscopia no infravermelho com transformação de Fourier (FTIR) e a espectroscopia Raman (SHIN et al., 1993, PIANELLI C et al., 1999). Segundo Cook e Standish (1983); Newman et al.15 (1983), a profundidade de polimerização é influenciada por fatores tais como: intensidade de luz e tempo de polimerização.
Além disso, fatores como o tipo de material resinoso, a sombra e translucidez, espessura do incremento, período de pós-irradiação, tamanho e distribuição das partículas de carga afetam a profundidade de fotopolimerização. Dessa forma, existem três características da unidade fotoiniciadora que são essenciais para polimerização suficiente dos compósitos resinosos: saída de luz adequada, comprimentos de onda da luz adequados e adequado tempo de exposição. (ALRAHLAH; SILIKAS, 2014, p. 149)
2.3.2 Resistência flexural e módulo de elasticidade
Explorar as propriedades físicas dos materiais resinosos utilizados é de grande importância para que possamos entender o comportamento destes materiais sob influência das forças mastigatórias.
Consoante o entendimento de Ozturk, et al. (2005) a avaliação da resistência flexural e módulo de elasticidade expõem indiretamente o grau de conversão de compósitos (SANTOS et al., 2007) e pode indicar a capacidade de um material em resistir as tensões e forças verticais, além da sua deformação (GORACCI et al., 2014).
Nesse contexto, existem alguns ensaios para avaliar essas propriedades nos materiais resinosos, tais como: teste flexural de três pontos, teste flexural de quatro pontos, teste de flexão biaxial, mini-flexão, entre outros. De acordo com a International
Standards Organization (ISO), o teste de flexão com três pontos é o ideal para ser
utilizado em compósitos resinosos (KUMAR, 2013).
Yap e Teoh (2003) compararam a resistência flexural de materiais resinosos usando o teste de três pontos e o de mini-flexão e chegaram à conclusão de que há uma alta correspondência entre os valores apresentados por ambos os testes. No entanto, por se apresentar fácil de ser realizado e por exigir que o tamanho da amostra seja menor, assemelhando-se mais às dimensões dentárias reais (aproximadamente 12 mm, correspondente ao que seria um molar), usa menos material para construção do espécime e, de forma geral, mimetiza a prática clínica (SOUZA- LIMA, 2018).
Conforme Kamur (2013), os materiais podem proporcionar uma dispersão da luz e alterar propriedades, tais como grau de conversão, a qual, influência nas propriedades físicas. Dessa maneira, a literatura tem se mostrado vasta quanto aos testes possíveis para avaliar a resistência a flexão/módulo de elasticidade dos materiais resinosos que, apesar da ISO 4049 ser bastante aceita, as pesquisas mostram que outros testes podem se adequar mais a realidade clínica. Por conseguinte, o pesquisador deverá selecionar o teste a ser utilizado a partir da metodologia que se enquadre melhor no seu trabalho propiciem resultados mais confiáveis ao que ocorre no ambiente bucal (SOUZA- LIMA, 2018).
2.3.3 Sorção e solubilidade
Em relação à sorção e solubilidade do cimento de hidróxido de cálcio, sabe-se que a dissolução desses materiais protetores é benéfica e desejável para que sua ação
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terapêutica seja obtida, todavia, ela deve ser de forma controlada. Como os cimentos HC apresentam propriedades mecânicas deficientes e alta solubilidade (NATALE et al., 2005), a dissolução do material e/ou sorção em água, quando agravadas, exposição a meio aquoso favorecem a instabilidade da restauração deixando-a sem suporte, assim como, a cavidade sem a proteção necessária (FRANCISCONI et al., 2009).
Dessa forma, as propriedades físico-químicas de pH, liberação de íons cálcio e solubilidade, das pastas de hidróxido de cálcio têm sido motivo de inúmeros estudos pelos pesquisadores em função da importância que tais propriedades têm para o seu mecanismo de ação (RABELO, 2003; BASRANI et al., 2004). Essa dissociação iônica é responsável pelas propriedades biológicas que o hidróxido de cálcio apresenta, tais como sua ação antimicrobiana (LEONADO et al., 2000; NELSON FILHO, 2000) e indutora de reparo por tecido mineralizado (HOLLAND et al., 1999; TANOMARU FILHO, 2002).
Fan et al., 1985, estudaram interpretações alternativas dos valores de sorção de água de compósitos resinosos, com os valores obtidos com um, sete ou trinta dias após imersão em 10ml de água destilada. A solubilidade após trinta dias de imersão foi calculada pela pesagem da amostra secada em sílica gel até se obter peso constante e o conteúdo inorgânico foi mensurado gravimetricamente com queima até peso constante a 500ºC. Os valores de sorção de água foram calculados em mg/cm2, como % de peso da amostra e mg/g de conteúdo de matriz orgânica. Os resultados mostraram que os valores de sorção de água, tanto das resinas com carga, como das resinas sem carga, foram mais parecidos no período de 30 dias, quando expressos em mg/g de conteúdo de matriz orgânica. Essa interpretação é indicativa das características de sorção de água da matriz resinosa, e os valores foram mais significativos quando a solubilidade foi levada em consideração. Os autores sugerem que outros fatores podem também influenciar a interpretação dos valores de sorção de água, incluindo a área de superfície das partículas e as partículas propriamente ditas.
Em 2002, Knobloch et al. compararam a sorção de água durante 7 dias de armazenamento, e solubilidade em água e solubilidade em ácido láctico de 3 cimentos resinosos e 3 cimentos de ionômero de vidro modificado por resina. Espécimes em forma de disco medindo 15mm X 0,5mm foram preparados de acordo com as instruções de cada fabricante e dessecados por 24h a 37 + 2ºC. Os espécimes foram transferidos para um segundo dessecador a 23º + 2ºC por uma hora e pesados em balança analítica até obter uma massa inicial constante (m1), ou seja, quando a perda de massa não foi maior que 0,2mg em 24 horas. Os espécimes foram imersos em água destilada a 37º + 2ºC por 7 dias
e após esse período foram removidos, lavados em água destilada e secados com jato de ar por 15 segundos. Os espécimes foram pesados novamente um minuto após terem sido retirados da água (m2). Os discos foram colocados novamente dessecados a 37ºC seguidos por 23ºC, pelos mesmos períodos descritos anteriormente para essas duas temperaturas e pesados até obter massa constante (m3). A solubilidade em ácido láctico também foi mensurada por imersão em 0,01M com pH=4,0 seguindo recomendações de estudos prévios. A análise de variância de um fator, seguida pelo Ryan-Einot-Gabriel-Welsch (REGW) foram realizados em todos os dados. Significativas diferenças foram encontradas entre os cimentos testados para cada propriedade investigada. Devido à natureza hidrófoba, todos os cimentos de ionômero de vidro mostraram valores significativamente maiores de sorção de água, quando comparado aos cimentos resinosos. O tempo de armazenagem de 7 e 14 dias, é considerado um período suficiente para a observação do grau de sorção, já que segundo Chutinan et al. (2004), é nas duas primeiras semanas que acontece mais intensamente a sorção de água. Além disso, Gerdolle et al. (2008), observaram que os cimentos resinosos apresentam pouca alteração pós polimerização, o que explica a mínima alteração na absorção de água entre 4 e 7 dias, justificando que o tempo de 7 e 14 dias são suficientes e ideais para a análise (CHUTINAN et al., 2004).
2.3.4 Liberação de hidroxila
A influência do pH no mecanismo de ação do hidróxido de cálcio é traduzida pela alteração no crescimento, no metabolismo e na divisão celular bacteriana. É importante esclarecer que a alteração na divisão celular bacteriana é causada pela injúria química produzida aos componentes orgânicos e ao transporte de nutrientes ou pela destruição dos fosfolipídeos ou de ácidos graxos insaturados da membrana citoplasmática (ESTRELA et al., 1995; SJÖGREN et al., 1991). As propriedades antimicrobianas e biológicas são resultado da dissociação em íons cálcio e hidroxila e da ação que esses íons exercem sobre os tecidos e as bactérias (ESTRELA et al., 1999).
Camargo et al. (2006) compararam o pH de pastas de hidróxido de cálcio com diferentes veículos em dentes humanos e bovinos. A pasta Calen PMCC foi estatisticamente mais efetiva quanto ao aumento no pH e liberação de íons cálcio. O período de 14 dias mostrou maior liberação de íons cálcio do que após sete dias.
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Além disso, íons hidroxila difundem-se pela dentina elevando o pH do meio até valores que chegam a 12.6, produzem um ambiente extremamente alcalino e proporcionam a atividade antimicrobiana característica do hidróxido de cálcio. Valores elevados de pH, como os produzidos pela dissociação e difusão iônica do hidróxido de cálcio têm a capacidade de alterar a integridade da membrana citoplasmática bacteriana pelos efeitos tóxicos gerados durante a transferência de nutrientes para o interior da bactéria (ESTRELA et al., 1999).
Dessa forma, a atividade antimicrobiana do Hidróxido de Cálcio está relacionada com a liberação dos íons hidroxila em um meio aquoso. Os íons hidroxila são radicais livres altamente oxidativos que mostram altíssima reatividade, com várias biomoléculas, logo esses radicais livres raramente difundem-se para longe dos sítios onde são gerados. (SIQUEIRA JR. et al., 1999).
A avaliação do potencial irritante de novos produtos ou ingredientes surgidos no mercado é geralmente realizada em animais, anteriormente aos testes em seres humanos. Recentemente vários métodos alternativos in vitro para testar o potencial tóxico de alguns materiais têm sido propostos preferencialmente aos testes in vivo em animais. (LEE et al., 2000) A partir de 1999, a International Organization for Standardization (ISO) renovou a regulamentação de 1991 para a realização de testes da citotoxicidade in vitro, mediante o documento ISO 10993-5, listando três categorias para tais avaliações: testes de extração, testes de contato direto e testes de contato indireto.
2.3.5 Citotoxicidade
A análise das características biológicas dos materiais in vivo tornou-se inviável. Porém, estudo com animais torna-se demorado e muitas vezes inaplicável à realidade humana devido às proporções dos modelos animais utilizados. Nesse contexto, a cultura de células torna-se mais rápida e fácil de reproduzir e aplicar (SCHUESTER et al., 2001). Entre os testes utilizados para avaliar viabilidade celular/citotoxicidade de sistemas adesivos, os mais comuns são MTT Assay, Alamar Blue e teste da barreira dentinária (SILVA et al., 2013; ELIAS et al., 2015).
Lee et al. (2016) avaliaram a citotoxicidade através do teste de MTT de células odontoblásticas expostas a adesivos autocondicionantes e concluiu que todas as marcas testadas induziram atividade apoptótica, variando entre os produtos testados. Lanza et al.
(2009) chegaram a resultados similares ao avaliar o poder de difusão em dentina e a citotoxicidade de sistemas adesivos autocondicionantes através do teste MTT. Segundo os autores, as quatro marcas testadas apresentaram poder de difusão em dentina e induziram uma significante redução da atividade celular na linhagem testada. Kusdemir
et al. (2011) avaliaram a citotoxicidade de seis sistemas autocondicionantes em células
L929 e concluiu que todos apresentaram toxicidade em maior ou menor grau, a depender da marca. Assim, é quase consensual o poder citotóxico dos sistemas adesivos apontando para a necessidade e desafio de desenvolver de novos monômeros, componentes e adesivos, em geral, com menor potencial lesivo.
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3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a influência da adição de um catalizador de polimerização (Difeniliodônio) em propriedades físicas e biológicas de um cimento de hidróxido de cálcio modificado por resina.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Mensurar o GC de um cimento de hidróxido de cálcio modificado por resina após a adição difeniliodônio em diferentes concentrações (0%, 2%, 4% e 8%).
b) Avaliar a PP de um cimento de hidróxido de cálcio modificado por resina após a adição difeniliodônio em diferentes concentrações (0%, 2%, 4% e 8%).
c) Avaliar a RF/ME de um cimento de hidróxido de cálcio modificado por resina após a adição difeniliodônio em diferentes concentrações (0%, 2%, 4% e 8%).
d) Mensurar a LH e a S/S de um cimento de hidróxido de cálcio modificado por resina após a adição difeniliodônio em diferentes concentrações (0%, 2%, 4% e 8%).
e) Mensurar a CT de um cimento de hidróxido de cálcio modificado por resina após a adição difeniliodônio em diferentes concentrações (0%, 2%, 4% e 8%).
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O presente estudo é caracterizado como ensaio laboratorial, in vitro, cujas variáveis de respostas são: Grau de conversão, profundidade de polimerização, resistência flexural/módulo de elasticidade, sorção/solubilidade, liberação de hidroxila e citotoxicidade, onde os fatores em estudo são a concentração de difeniliodonio (0%, 2%, 4% e 8%) e o tempo de análise para liberação de hidroxila (0h, 24h, 72h 7 e 14 dias).
4.2 MANIPULAÇÃO DOS MATERIAIS
A quantidade de DFI incorporada ao cimento é dada pela medida em massa de acordo com a concentração em porcentagem necessária para cada grupo. As porcentagens foram de: 2% (G2) e 4% (G4), e 8% (G8), conforme a tabela 2. Para os grupos com adição do catalisador, foi posta em uma placa de vidro a quantidade suficiente do cimento para confecção das amostras e posteriormente pesada em uma balança analítica de precisão (Marte/Shimadzu mod ay-220, Kyoto, Japão).
Depois de realizada a pesagem inicial, foi calculado o valor de massa necessário para se alcançar a porcentagem ideal. Em seguida, o material foi novamente adicionado à placa de vidro e pesado para confirmação das massas. Após isso, o material foi espatulado cuidadosamente, sempre com o mesmo operador, durante dois minutos, estando pronto para a confecção dos corpos-de-prova logo em seguida. Para o grupo controle (G0), não foi adicionado o difeniliodônio. Os materiais utilizados neste estudo estão detalhados na tabela 1.
Todo o processo de manipulação e confecção dos corpos-de-prova foi realizado em ambiente livre de luz externa, sendo utilizada apenas uma pequena fonte de luz e para evitar a polimerização indesejada do material, a área de manipulação foi protegida com papel celofane laranja.
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Tabela 1 - Materiais utilizados neste estudo
Material Fabricante Composição Química Número de lote Ultra-Blend® Ultradent Products
Inc. (South Jordan, UT)
Diuretano Dimetacrílico (UDMA) <60%, Sulfato de bário <11%, Hidróxido de cálcio 5 ≤%. D059A Sal de hexafluorofosfat o de difeniliodônio (DFI) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA)
(C6H5)2I(PF6) BCBP1499V
Tabela 2 - Grupos avaliados neste estudo
Grupos % de DFI G (0) 0% G (2) 2% G (4) 4% G (8) 8% 4.3 GRAU DE CONVERSÃO
Na mensuração do Grau de Conversão, utilizou-se um espectrofotômetro (RT-FTIR Shimadzu IRPrestige 21- Kyoto, Japan). Quantidades padronizadas de cada grupo foram dispensadas sobre o cristal de ATR com o n=10. Uma tira de poliéster (3M ESPE, St. Paul, MN, EUA) e uma lâmina de vidro foram utilizadas para assegurar o contato como o cristal de diamante da unidade de ATR.
Previamente a fotoativação, a superfície do material foi coberta com uma tira de poliéster através da qual foi realizada a fotoativação com unidade LED. A distância entre o aparelho fotopolimerizador (Coltolux LED Coltène Whaledent, Langenau, Alemanha – 1200 W/cm2) e a amostra foi padronizada com ajuda de um suporte universal e uma garra,
uma vez fotopolimerizado o material, uma nova leitura foi realizada. O espectrofotômetro fez a leitura e o espectro correspondente apareceu na tela. Para este momento, o usuário já tem dois espectros diferentes, um do material sem polimerizar e outro do material polimerizado
A partir de ditos espectros, foi feita uma reação entre os picos correspondentes às vibrações das ligações envolvidas no processo de polimerização. Os picos utilizados foram 1638 cm-1 (carbono alifático C=C) e 1609 cm-1 (ligações duplas carbono aromático C-C). O grau de conversão foi calculado pela redução de absorção a 1638 cm-1 entre o material não polimerizado e o material polimerizado usando as equações a seguinte fórmula:
(1638/1609 para a resina polimerizada)
%DC = 1 - ____________________________________ x 100 (1638/1609 para resina não polimerizada)
4.4 PROFUNDIDADE DE POLIMERIZAÇÃO
Neste ensaio, foram confeccionadas 12 amostras de formato circular (N=12) e para isso, utilizamos uma matriz cilíndrica bipartida de aço inoxidável pré-fabricada de acordo com a ISO 4049 (10mm x 5mm). Para a confecção dos corpos de prova, o cimento foi dispensado na matriz cilíndrica e sobre ela foi acomodado uma matriz de poliéster (3M ESPE, St. Paul, MN, EUA) juntamente com uma lâmina de vidro na porção de topo. O material foi pressionado com o intuito de padronizar as amostras na distância entre o material e o LED com transmissão da luz de cura, buscando a obtenção de superfícies regulares com total acomodação do material e visualização de reação de presa. Em seguida, a fotoativação foi realizada utilizando o Fotopolimerizador Coltolux LED (Coltène Whaledent, Langenau, Alemanha) – 1200 W/cm2, durante 20 segundos, como preconiza o fabricante.
Após polimerização, os espécimes foram submetidos ao teste de raspagem da porção não polimerizada, a qual consiste em descartar o material não polimerizado utilizando uma lâmina de bisturi n.º 15 (Solidor, Osasco – SP, Brasil). Em seguida, com o auxílio de um paquímetro digital (Mitutoyo Suzano – SP, Brasil), foi medida a altura polimerizada da amostra obtendo-se os valores de profundidade de polimerização.
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4.5 RESISTÊNCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE
Para realização desses testes, 40 amostras em formato de barra (10mm x 2mm x 1mm) foram confeccionadas (n=10), utilizando-se uma matriz de silicone (Express XT, 3M ESPE, St. Paul, MN, US) e uma matriz transparente de poliéster (3M ESPE, St. Paul, MN, EUA) foi posicionada sobre as superfícies do topo e base, sendo a fotoativação realizada com 1200 mW/cm2 durante 40 segundos em cada lado, utilizando aparelho Coltolux LED (Coltène Whaledent, Langenau, Alemanha). Em seguida, os corpos-de-prova foram removidos da matriz e o acabamento foi realizado manualmente com lixas de carbeto de silício granulação 1200 (Norton S/A, São Paulo, SP), sob refrigeração à água. Os corpos-de-prova foram então armazenados em água destilada em estufa a 37° C por 24 horas. Decorrido este período, as dimensões de cada corpo-de-prova foram conferidas com paquímetro digital (Mitutoyo, Tóquio, Japão) com precisão de 0,01 mm. Na avaliação da Resistência Flexural e do Módulo de Elasticidade, foi executado o teste de flexão de três pontos 24 horas após a confecção das amostras, utilizando uma Máquina de Ensaios Universal (OM 150, ODEME, Luzerna, SC, Brasil). Sobre dois suportes com 6 mm de distância entre eles (dois pontos) e um êmbolo (terceiro ponto e responsável pela aplicação da carga) foi pressionado perpendicularmente sobre a amostra (em forma de barra), a uma velocidade de 0,5 mm/min com uma carga de 50N até a ruptura.
O teste de resistência à flexão foi monitorado pelo software (Analysis v4.0 Odeme® Dental Research) em um computador conectado à máquina mecânica de ensaios, o qual gerou automaticamente um gráfico tensão x deformação para cada corpo-de-prova. Dessa forma, os resultados da resistência flexural foram obtidos em N e convertidos em MPa utilizando a fórmula RF= 3FI/2BH², da especificação ISO 4049: onde `F´ é a carga máxima suportada, `I´ o comprimento entre os pontos, `B´a largura e `H´ a espessura do prisma. Enquanto que o módulo de elasticidade para cada corpo-de-prova foi calculado a partir da porção linear da curva tensão x deformação, correspondendo à deformação elástica do material, utilizando a fórmula: M = FI3 / 2BH², onde “F” = Carga máxima,
“I”: Comprimento, “B”: Largura,“H”: Espessura.
Para esta modalidade, foram confeccionadas 40 amostras de formato circular obtidos por meio de uma matriz plástica pré-fabricada com 1mm de espessura e 5mm de diâmetro (n=10). Os espécimes foram armazenados em frascos abertos e identificados dentro de um dessecador de vidro com manômetro contendo sílica gel por 22 horas em uma estufa a temperatura de 37°. Após esse tempo, as amostras foram colocadas em uma bancada a temperatura ambiente por 2 horas, completando assim um ciclo de 24 horas. Após esse tempo, as amostras foram pesadas numa balança analítica de precisão 0,001 diariamente até que a diferença entre pesagens não fosse maior que 0,1 mg, conforme
ISO 4049 (2001 International Standard Organization specification 4049: Dentistry —
polymer-based filling). Esse valor foi a M1.
Esses dados foram tabelados juntamente com duas medidas de diâmetro e cinco medidas de espessura de cada espécime através de um paquímetro digital (Mitutoyo Suzano – SP, Brasil). Através da média do diâmetro e da espessura foi calculado o volume em mm3.
Os espécimes retornaram para seus respectivos frascos e foram recobertos com água deionizada, colocados com o auxílio de uma pipeta na quantidade de 15 mililitros. Os frascos foram tampados e levados novamente a estufa, após 14 dias foram pesadas para a obtenção da M2. Em seguida, foram novamente acondicionados por mais 24 horas em estufa e posteriormente pesados diariamente até se obter a massa 3, em que a variação foi menor que 0,1 mg de um dia para o outro (M3).
Com esses dados foi calculada a sorção (Wsp) em micrograma por milímetro cubico, através da M2/M3 (massas 2 e 3) e o V (volume):
Wsp14d = M2(14d) - M3 / V.
E a solubilidade (Wsl) pela seguinte fórmula onde M1/M3(massas 1 e 3) e V(volume):
Wsl = M1 - M3 / V.
Para mensurar a liberação de hidroxila da água em que os espécimes estavam imersos, foi utilizado um pHmetro (Hanna, HI 2221, Instruments Brasil) acoplado a um eletrodo convencional (Mettler Toledo) que possui a sua membrana de aferição da solução no vértice do eletrodo. Soluções com pH de 4.0, 7.0 e 12.0 foram empregadas para a calibração do aparelho antes das medidas. Devido ao tamanho reduzido da amostra, a liberação de componentes seria insuficiente na medição do pH da água, desta forma, foi necessário unir o conteúdo de dois fracos (que passaram a formar pares), com o intuito de aumentar sua relevância. Cada amostra foi mantida em um frasco com 10ml de água
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destilada em virtude da necessidade de o pHmetro requerer um volume a partir de 20ml para uma leitura adequada. Foram realizadas as medidas de liberação de hidroxila nos períodos de 24h, 72h, 7 dias e 14 dias. Dez amostras foram realizadas para cada grupo (n=10).
4.7 CITOTOXICIDADE
Para avaliar a citotoxicidade, utilizamos o método descrito por Elias et al (2015) com algumas adaptações. Para os ensaios de citotoxicidade foram utilizados células pulpares obtidos a partir de dentes humanos. As células foram expandidas em garrafas de cultivo celular (TTP, Switzeland) contendo meio de cultivo ALFAMEM enriquecido com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos e antimicóticos (todos da Gibco, USA). A citotoxicidade foi avaliada pelos ensaios do MTT e do Alamar Blue. Para tanto, as células foram previamente cultivadas em placas de 96 poços, na densidade de 5x103 células por poço para garantir a adesão celular à superfície do plástico de cultivo.
Foram utilizados discos de papel absorvível (diâmetro de 3,5mm). Para cada grupo (com o n=8), foram dispensadas sobre os discos de papel gotas padronizadas de 1µl com auxílio de uma seringa de insulina, colocada uma tira de poliéster sobre uma lâmina de vidro e em seguida fotoativadas durante 20s com um unidade fotoativadora (Coltolux LED (Coltène Whaledent, Langenau, Alemanha) colocada exatamente sobre a lâmina de vidro. Após isso, os círculos foram colocados no fundo dos poços da placa de 96 poços de forma que a superfície que recebeu a gota ficasse voltada para cima e o meio contendo a cultura foi vertido sobre estes papéis de forma a ficar 24 horas a 37ºC em contato com as células e seguiram para os testes. Todos os experimentos foram realizados em duplicata (Figura 1).
O ensaio de MTT avalia a atividade metabólica das células quantificando a redução do MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] por desidrogenases mitocondriais que resulta na produção de cristais de formazam intensamente corados no interior das células. Decorridas 24h de contato com o cimento, as células foram incubadas com 100 µL de meio de cultura contendo 1mg/ml de MTT por 4 horas e em seguida o produto colorimétrico (formazan) foi solubilizado com 100 µL de dimetilsufóxido (DMSO). A absorbância das amostras foi medida em espectofotômetro (Epoch-Biotech Instruments, USA) no comprimento de onda de 570 nm.
O ensaio do Alamar Blue (Invitrogen, USA) consiste em um método colorimétrico que permite a detecção da atividade metabólica das células a partir da redução da resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona 10-óxido), um corante azul fracamente fluorescente em resorufina, um corante rosa com altíssima fluorescência em vermelho. Decorridas 24 horas de contato com os adesivos, o meio foi removido e as células foram cultivadas com 10 µL de Alamar blue (Invitrogen, USA) e 90 µL de meio ALFAMEM, a 37°C em atmosfera úmida com 5% de CO2 por 4 horas, de acordo com o protocolo do fabricante. Após quatro horas, as absorbâncias das soluções foram medidas em leitor de microplaca (Epoch-Biotech Instruments, USA) nos comprimentos de onda de 570 nm (forma reduzida) e 600 nm (forma oxidada). O meio de cultura puro, sem adição de células, foi considerado como branco do ensaio e o meio contendo 10% de Alamar Blue o controle negativo. A redução do Alamar Blue foi então calculada a partir da equação fornecida pelo fabricante.
Figura 1- Imagem ilustrativa de metodologia da análise da citotoxicidade.
Legenda: A: círculos de papel após corte; B: gotejamento padronizado dos cimentos; C: cobertura com tira de poliéster + lâmina de vidro + fotoativação por 20 s; D: inserção do papel com cimento fotoativado no fundo do poço; F: inserção do meio de cultura DMEM + células sobre os papéis impregnados com cimento e manutenção durante 24h; G: análise de citotoxicidade através dos testes MTT Assay e Alamar Blue.
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Os resultados das análises do Grau de Conversão, Profundidade de Polimerização, Resistência Flexural, Módulo de Elasticidade e Sorção/Solubilidade foram submetidos à análise de variância ANOVA-1fator/Tukey. Para o teste de Liberação de Hidroxila ANOVA-2fatores/Tukey (p<0,05) e o teste de Kruskal-Wallis/Mann Whitney (p<0,05) para Citotoxicidade, todos com o auxílio do software estatístico GRAPHPAD PRISMA.
5 RESULTADOS
5.1 GRAU DE CONVERSÃO
Houve diferenças estatisticamente significativas entre as concentrações (p<0,05). A comparação entre os grupos está listada na tabela 3. Para a concentração de 0%, o GC mostrou-se inferior as demais concentrações. No entanto, para 4% mostrou-se inferior as porcentagens de 2% e 8%.
Tabela 3 - Médias ± desvios-padrão dos valores de Grau de Conversão (%) de acordo com as concentrações de difeniliodonio.
Grau de Conversão
% de DFI Média ± Desvio padrão
G (0) 44,79 ± 4,64 c G (2) 56,43 ± 2,09 a G (4) 49,84 ± 3,48 b G (8) 58,69 ± 2,63 a
Letras minúsculas distintas indicam diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes tipos de porcentagens de DFI. (p<0,05).
5.2 PROFUNDIDADE DE POLIMERIZAÇÃO
Houve diferenças estatisticamente significativas entre as porcentagens de difeniliodônio (p<0,03). A comparação entre os grupos está listada na tabela 4. Na PP, o grupo com 8% exibiu resultado superior ao grupo com 0%.
Tabela 4 - Médias ± desvios-padrão dos valores de Profundidade de Polimerização em (mm) de acordo com as concentrações de difeniliodonio.
Profundidade de Polimerização
% de DFI Média ± Desvio padrão
G (0) 0,73 ± 0,20 c G (2) 0,96 ± 0,05 bc G (4) 1,03 ± 0,05 bc G (8) 1,13 ± 0,15 ab
Letras minúsculas distintas indicam diferenças estatisticamente significativas entre a adição de diferentes porcentagens de difeniliodonio (p<0,03).
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5.3 RESISTÊNCIA FLEXURAL
Houve diferenças estatisticamente significativas entre as porcentagens de difeniliodônio (p<0,01). A comparação entre os grupos está listada na tabela 5. O grupo com 2% apresentou maiores resultados para a resistência a flexão. Enquanto os grupos com 4% e 8% mostraram-se estatisticamente iguais e grupo com 0% inferior à todos os grupos.
Tabela 5 - Médias ± desvios-padrão dos valores da Resistência Flexural (Mpa) de acordo com as concentrações de difeniliodonio.
Resistência Flexural
% de DFI Média ± Desvio padrão
G (0) 58.07 ± 5,32 c G (2) 212.46± 18,82 a G (4) 188.80± 11,15 b G (8) 193.95± 15,02 b
Letras minúsculas distintas indicam diferenças estatisticamente significativas entre a adição de diferentes porcentagens de difeniliodonio (p<0,01).
5.4 MÓDULO DE ELASTICIDADE
Para o ME houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p<0,01). A comparação entre os grupos está listada na tabela 6. As porcentagens de 2% e 8% obtiveram seus valores de módulo de elasticidade superiores estatisticamente ao grupo com 4%. Entre as porcentagens, o grupo com 0% de DFI apresentou menor módulo de elasticidade.
Tabela 6 - Médias ± desvios-padrão dos valores de Módulo de Elasticidade (GPa) de acordo com as concentrações de difeniliodonio.
Módulo de Elasticidade
% de DFI Média ± Desvio padrão
G (0) 25,48±3,25 c G (2) 64,90±6,40 a G (4) 51,75±4,28 b G (8) 61,77±5,26 a
Letras minúsculas distintas indicam diferenças estatisticamente significativas entre a adição de diferentes porcentagens de difeniliodonio (p<0,05).
5.5 SORÇÃO E SOLUBILIDADE
Houve diferenças estatisticamente significativas sorção e solubilidade em água entre as porcentagens de DFI (p<0,05). A comparação entre os grupos está listada na tabela 7. Os grupos G (0) e G (2) não apresentaram valores de sorção com diferença estatística entre si, entretanto, o G (4) apresentou valor intermediário e grupo com adição de 8% apresentou maior valor. No teste de solubilidade em água, a maior perda de massa foi verificada no grupo com 0% de DFI. No entanto, o grupo com 8% apresentou resultado superior aos grupos com 2% e 4%, os quais apresentaram resultados intermediários entre os demais.
Tabela 7 - Médias ± desvios-padrão dos valores de Sorção (μg/mm3) e Solubilidade (μg/mm3) de acordo com as concentrações de difeniliodonio.
Sorção Solubilidade % de DFI Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão
G (0) 151,35 ± 28,30 c 640,02 ± 37,47 a G (2) 126,43 ± 6,10 c 151,35 ± 28,30 c G (4) 217,45 ± 13,80 b 126,43 ± 6,10 c G (8) 353,30 ± 13,00 a 217,45 ± 13,80 b
Letras minúsculas distintas indicam diferenças estatisticamente significativas entre a adição de diferentes porcentagens de difeniliodonio (p<0,05).
5.6 LIBERAÇÃO DE HIDROXILA
Houve diferenças estatisticamente significativas entre as concentrações (p<0,05). A comparação entre os grupos está listada na tabela 8. A análise das liberações de hidroxila, assim como o tempo de cada grupo mostra que no G (0) e G (2), apresentaram picos máximos de liberação de hidroxila no tempo de 72h e mínima liberação em 14 dias. Entretanto, nos grupos G (4) e G (8) obtiveram resultados similares com picos máximos de liberação entre os tempos de 72h e 7 dias. No grupo com 4%, a menor liberação foi
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nos tempos de 24h e 14 dias, enquanto que o G (8) teve liberação mínima apenas em 14 dias.
Com relação aos diferentes tempos, houve diferenças significativas entre as concentrações de 0% e 8% nos períodos de 24h e 72h. No entanto, no ciclo de 7 dias, todos os grupos apresentaram resultados similares. Para o tempo de 14 dias, as concentrações de 4% e 8% diferiram estatisticamente, ambas apresentaram resultados superiores a concentração de 2%.
Tabela 8 - Médias ± desvios-padrão da Liberação de Hidroxila em mg/l, de acordo com os materiais analisados.
Liberação de Hidroxila
% DFI Tempo de Liberação
24 h 72 h 7dias 14 dias
G (0) 7,27 ± 0,07 Ba 7,67 ±0,12Aa 7,16 ±0,09 Ba 6,64± 0,13Cab
G (2) 6,96 ± 0,27 Bab 7,65 ± 0,16 Aab 7,22 ± 0,02 Ba 6,53 ± 0,03 Cb G (4) 6,68 ± 0,36 Bab 7,50 ± 0,06 Aab 7,27 ± 0,01 Aa 6,92 ± 0,06 Ba
G (8) 6,29 ± 0,40 Bb 7,49 ± 0,06 Ab 7,27 ± 0,02 Aa 6,84 ± 0,04 Ca
Letras minúsculas distintas indicam diferenças estatisticamente significativas entre os materiais para um mesmo tempo de avaliação. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças estatisticamente significativas entre um mesmo material entre os diferentes tempos de liberação.
5.7 CITOTOXICIDADE 5.7.1 Alamar blue
Houve diferença estatisticamente significativa entre as porcentagens no tempo de 24h em contato com o meio (p<0,05). A comparação entre os grupos está listada na figura 2. A análise da citotoxicidade mostrou que os grupos G (0) e G (4) obtiveram resultados superiores em relação aos demais grupos. No entanto, os grupos G (2) e G (8) apresentaram-se de forma semelhante com uma maior taxa de viabilidade celular.
Figura 2 - Resultados das médias do percentual de redução de Alamar Blue em células NH3-T3 ± desvio padrão para concentração de DFI adicionada comparados ao grupo controle.
% r e d u ç ã o A la m a r B lu e Co ntr ole 0% DF I 2% DF I 4% DF I 8% DF I 10 % D MS O 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 6 DISCUSSÃO
A hipótese nula de que a adição do DFI não influenciaria as propriedades testadas foi rejeitada, já que os resultados estatísticos entre o grupo controle e os grupos com adição do catalisador da reação de polimerização confirmam a influência do DFI nas propriedades físicas e biológicas do material testado.
Estudos foram encontrados na literatura comprovando a melhora do grau de conversão através da adição do sal Difeniliodonio, visto que, o aumento ocorre devido à reação entre o DFI e canforoquinona no estado triplex, do radical amino gerado pela canforoquinona no estado exciplex que reage quebrando a ligação C-I gerando dois radicais fenil ativos (Canforoquinona-DFI e amina-DFI) que posteriormente podem reagir com aminas residuais gerando outros radicais livres ocasionando o aumento do GC (KIM; SCRANTON, 2004). Na análise do GC do presente trabalho, reforçamos a concepção dos estudos anteriores, pois os grupos do cimento resinoso com adição de DFI exibiram resultados estatisticamente superiores ao controle.
Dessa forma, os resultados para o GC deste estudo mostraram que a concentração de 2% e 8% de adição do catalizador obtiveram melhores resultados e, de forma intermediária, apresentou-se o grupo com 4% de DFI, e o resultado inferior, o grupo sem adição do DFI. Entretanto, a hipótese para esse fenômeno é que a molécula do difeniliodônio tenha detecção similar ao pico de 1638 para o espectrofotômetro ter feito
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a leitura mostrando que mais ligações duplas foram consumidas e, tendo como consequência, o aumento do grau de conversão na concentração de 8%.
Neste estudo, a profundidade de polimerização foi avaliada através da medida do topo/base e foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre o G (8) e o G (0). Os dados da PP deste estudo concordam com os resultados de estudos anteriores que mostram aumento da (PP) e (GC) dos cimentos resinosos nos quais sais de iodônio foram adicionados (KIM; SCRANTON, 2004)
Gonçalves et al. (2013) mostraram que o módulo de flexão foi maior para materiais contendo DFI e chegaram à conclusão de que o uso de DFI poderia resultar em melhor eficiência de polimerização de cimentos à base de resina, e que seu efeito na reatividade da fotopolimerização é dependente da concentração. Este estudo corrobora com os resultados de Gonçalves, pois os grupos com adição do sal de DFI exibiram efeitos superiores ao grupo controle. Entretanto, o G (2) foi estaticamente superior ao G (4) e G (8), o que possivelmente demonstra a superioridade na concentração de 2% de DFI em relação aos demais grupos. Logo, subentende-se que esta é a concentração a ser adicionada ao cimento resinoso com a finalidade de melhorar suas propriedades. Sendo assim, esses achados corroboram com a hipótese gerada para o GC, pois não houve potencialização da RF na concentração de 8%.
Neste trabalho, o ME mostrou-se estatisticamente superior nas concentrações de 2% e 8% de adição do sal de DFI. Entretanto, há relatos de que o ME está diretamente ligado a forma, tamanho e quantidade das partículas de carga das resinas compostas (YASSE, 2016). Isto posto, seria uma possível explicação para os resultados do G (8), pois detém maior percentual do sal de DFI e o excesso deste pode se comportar como partícula de carga quando comparado ao G (4). Outra hipótese, é que todo o DFI adicionado seria consumido durante a reação. Sendo assim, é possível atrelar essa elevação do ME à sua composição química.
Paralelo a isso, com relação á Sorção, houve diferença estatística significativa entre as porcentagens, principalmente para 8%, a qual se mostrou superior aos demais grupos, corroborando com a hipótese de que o excedente do sal de DFI na composição do cimento pode gerar um comportamento de partículas de carga. Consoante ao trabalho de Chutinan et al. (2004), é nas duas primeiras semanas que acontece mais intensamente a sorção de água. Além disso, Gerdolle et al. (2008), observaram que os cimentos resinosos apresentam pouca alteração pós polimerização, o que explica a mínima
alteração na absorção de água entre 4 e 7 dias, justificando que o tempo de 7 e 15 dias são suficientes e ideais para a análise.
Quando se trata da solubilidade, Titus, Drahein, Murrey (1988), revelam que a solubilização dos cimentos protetores é benéfica e desejável para que sua ação terapêutica seja obtida, todavia, ela se dar de forma controlada. No presente estudo, foi evidenciada diferença estatística significativa entre os grupos, onde o grupo controle obteve maior solubilização entre os demais. Este fato também está de acordo com o trabalho de Lopes
et al. (2009), que indica que o cimento é mais sensível à sorção de água, levando a um ganho de massa que poderia mascarar a solubilidade real. Isso não significa que não ocorreu solubilidade, mas que a sorção de água foi maior que a solubilidade.
No presente trabalho in vitro, foram realizadas observações em quatro tempos, dentro do período experimental de 14 dias para determinar a liberação de íons hidroxila. A metodologia empregada para a determinação da liberação dos íons hidroxila, se deu através do emprego de um eletrodo acoplado ao pHmetro que propicia a uma padronização na reprodutibilidade das medidas. (LEONARDO et al., 1993).
Diante disso, o comportamento dos grupos foi semelhante no início, ocorrendo um aumento significativo no pH de ambas no período de 72 horas a 7 dias. Assim, foi possível observar que as concentrações de 0% e 2% permitiram a liberação progressiva no período de 72h. No início, a liberação em ambas foi menor com aumento gradativo e períodos de estabilização, como aconteceu com as mensurações do pH das concentrações de 4% e 8% que tiveram liberação gradual até 7 dias. Entretanto, pôde ser observado os menores valores de íons cálcio ao final de 14 dias em todos os grupos avaliados. Esses achados indicam os picos máximos de liberação de desses íons visto que, o fator determinante para a ação protetora dos cimentos de HC se origina de sua dissociação iônica quando em meio aquoso, promovendo a liberação dos íons hidroxila (OH-) e cálcio (Ca2+).
Embora apresente caráter protetor, deve-se ressaltar que os materiais a base de HC não atuam como bioestimulantes. As células em contato com o HC sofrem necrose em decorrências de seu alto pH, formando uma camada denominada de zona de cauterização. O tecido pulpar adjacente a essa camada é responsável pela cicatrização pulpar, associada à formação de uma barreira de tecido duro (KOMABAYASHI, 2016). Assim, o baixo potencial de alcalinização após 7 dias pode gerar uma menor camada necrótica (SCARANO et al., 2003), colocando em dúvida os efeitos biológicos e terapêuticos
