Preparação de nanocompósitos de ouro e carbono para desenvolvimento de
sensores electroanalíticos
̶ Versão Definitiva ̶
Dissertação de Mestrado
Mestrado em Engenharia Biomédica
JOÃO FILIPE GONÇALVES DA SILVA BRAGA
Orientadora: Profª Dr.ª Maria Cristina Fialho Oliveira Coorientadora: Dr.ª Sofia Gabriel Meirinho
Preparação de nanocompósitos de ouro e carbono para desenvolvimento de
sensores electroanalíticos
̶ Versão Definitiva ̶
Dissertação de Mestrado
Mestrado em Engenharia Biomédica
JOÃO FILIPE GONÇALVES DA SILVA BRAGA
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Cristina Fialho Oliveira Coorientadora: Dr.ª Sofia Gabriel Meirinho
Composição do júri:
Presidente: Prof. Dr. Luís José Calçada Torres Pereira Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Cristina Fialho Oliveira Arguente: Prof. Dr. António Manuel Coelho Lino Peres
Este trabalho foi realizado no Departamento de Química da Escola das Ciências da Vida e do Ambiente da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro sob a supervisão da Professora Doutora Maria Cristina Fialho Oliveira e da Doutora Sofia Gabriel Meirinho.
Este trabalho foi expressamente elaborado como Dissertação original para o efeito de obtenção de grau de Mestre em Engenharia Biomédica na Universidade de Trás-os-Montes e
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fundamental para que este trabalho fosse levado a bom porto. Assim sendo expresso aqui os meus mais sinceros agradecimentos.
Às minhas orientadoras, Professora Doutora Maria Cristina Fialho Oliveira e Doutora Sofia Gabriel Meirinho pela oportunidade de desenvolver este trabalho, por todos os conhecimentos transmitidos, disponibilidade, empenho, orientação e correções, sem os quais esta dissertação não seria possível.
Ao Professor Doutor Pedro Tavares e à mestre Lisete pela colaboração na utilização das instalações da Unidade de Microscopia Eletrónica da UTAD que permitiram a deteção das AuNPs.
À Universidade de Vigo, pela utilização dos seus dispositivos de TEM, HRTEM e DRX. À doutoranda Andreia Veloso pela síntese do nanomaterial hidrofílico de carbono e por todo o apoio, companheirismo e paciência ao longo de todo este processo.
Ao Sr. Carlos, técnico do laboratório, pela disponibilidade e simpatia com que sempre me recebeu.
Ao Dr. Carlos Daniel Ferreira, por todo o suporte e orientação ao longo desta etapa. À minha namorada, Luciana de Oliveira, por estar sempre do meu lado, me apoiar e motivar ao longo do desenvolvimento deste projeto.
Aos meus colegas e amigos Nathaniel Bailey, Ana Faria, Marta Costa, Ricardo Oliveira, Filipe Martins, Filipa Silva, Maria Vale, Vilma Martelo, Sara Fernandes e Cristina Sampaio por sempre me motivarem e ajudarem em tudo que puderam.
Aos meus pais, irmã e cunhado, por todo o apoio e para os quais espero que este venha a ser um motivo de orgulho.
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Artigo científico:
Braga J., Veloso A. D., Meirinho S. G., Oliveira M. C. (2020) Fabrication of an electrochemical sensing platform based on hydrophilic carbon/gold nanoparticles composite. (Artigo aceite para publicação na revista Materials Chemistry and Physics).
Comunicação oral:
João Braga, Sofia G. Meirinho, M. Cristina Oliveira, “Preparation of AuNPs nanocomposites for electroanalytical sensors development”, XXV Encontro Galego-Portugués de Química, 20-22 de Novembro de 2019, Ciudad de la Cultura, Santiago de Compostela-Galicia (Espanha).
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ouro (AuNPs). O trabalho é motivado pela recente descoberta de que nanomaterial à base de carbono gerado electroquimicamente exibe elevada capacidade redutora. A abordagem de síntese difere dos procedimentos convencionais, na medida em que o nanomaterial à base de carbono desempenha simultaneamente o papel de agente redutor e substrato sobre o qual as AuNPs são depositadas, dando origem a um compósito de AuNPs-carbono. Este por sua vez pode ser transformado em simples AuNPs dada a elevada solubilidade do material de carbono em água, sendo esta uma mais valia para aplicações que exijam a imobilização de AuNPs sobre uma superfície, nomeadamente em aplicações eletroanalíticas, tais como a deteção de proteínas específicas.
O compósito preparado foi caracterizado por espectrofotometria UV-Visível (UV-Vis), microscopia eletrónica de transmissão (TEM), microscopia eletrónica de transmissão de alta resolução (HRTEM), espectroscopia de disperso de raios-X (EDS), dispersão dinâmica de luz (DLS) e potencial Zeta. Prevendo a aplicação deste compósito no desenvolvimento de sensores eletroquímicos, este foi imobilizado, sem modificações adicionais, sobre um elétrodo de carbono vítreo (GCE). O seu comportamento eletroquímico foi comparado com o de um elétrodo modificado com AuNPs após remoção do nanomaterial de carbono. A área eletroativa e a quantidade de AuNPs imobilizado foram avaliadas por voltametria cíclica, bem como a estabilidade química do nanomaterial imobilizado. Verificou-se a estabilidade das AuNPs imobilizadas em GCE após vários ciclos voltamétricos em meio básico.
Foi avaliado o comportamento das AuNPs na preparação de aptassensores que integram aptâmeros marcados com biotina e com grupos tiol para deteção específica de osteopontina (um marcador tumoral comum em vários tipos de cancro), tendo sido verificada alta sensibilidade, nomeadamente com aptâmero marcado com grupo tiol, mas baixa especificidade na deteção desta proteína. Observa-se também uma maior sensibilidade à presença desta proteína em aptassensores desenvolvidos com EHC em comparação com os seus homónimos desenvolvidos com AuNPs.
Avaliou-se também o desempenho do elétrodo modificado com as AuNPs na redução eletroquímica de peróxido de hidrogénio e de oxigénio. Verificou-se um comportamento eletrocatalítico na redução do oxigénio, e um significativo aumento de sensibilidade na redução do peróxido de hidrogénio, moléculas de grande importância na medição de parâmetros
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A nova via sintética explorada fornece um método muito simples para a fabricação de nanopartículas e compósitos para as aplicações catalíticas e sensoriais testadas.
Palavras-chave: Nanomateriais Hidrofílicos de Carbono, Nanopartículas de Ouro,
(AuNPs). This work is motivated by the recent finding that electrogenerated carbon-based material (EHC) exhibits a high reducing ability. The synthesis approach differs from conventional procedures in the way that the carbon-based nanomaterial plays simultaneously the role of reducing agent and substrate on which the AuNPs are deposited, giving rise to an AuNPs-carbon composite. This material may be turned into simple AuNPs due to its high solubility in water, this means it can be widely used in applications which require immobilizing AuNPs over a surface, namely in electroanalytic applications such as specific protein sensing.
The as-prepared composite was characterized by UV-Visible spectrophotometry, transmission electron microscopy (TEM), high resolution transmission electron microscopy (HRTEM), energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS), dynamic light scattering (DLS) and Zeta potential. Envisaging the application of this composite in the development of electrochemical sensors, the as-prepared AuNPs, without further modification, were immobilized on a glassy carbon electrode (GCE). Its electrochemical behavior was compared to an AuNPs modified GCE after removing the carbon nanomaterial. The electroactive area and metal loading on the modified electrode were evaluated by cyclic voltammetry, as well as the chemical stability of the immobilized nanomaterial. The stability of the AuNPs immobilized on the GCE was verified after several voltammetric cycles in a basic solution.
The behavior of the synthesized AuNPs on the preparation of aptasensors integrating biotin-labeled and thiol-labeled aptamers for osteopontin specific detection (a common tumor marker in various types of cancer) was appraised, confirming its high sensibility but lo specificity detecting this protein. A higher sensibility to the presence of osteopontin was observed in aptasensors developed with EHC rather than those developed with AuNPs.
In addition, it was investigated the ability of the AuNPs modified electrode for the electrocatalytic reduction of hydrogen peroxide and oxygen. An electrocatalytic behavior was found in the oxygen reduction reaction, whereas a significant increase in the electrode sensibility for the hydrogen peroxide, highly important molecules in the assessment of biological parameters, compared to non-modified GCE or the GCE modified s with EHC were observed.
The new synthetic route provides a very simple method for the fabrication of nanoparticles and nanocomposites for catalytic and sensing applications.
ix
Agradecimentos ... i
Trabalhos apresentados com base nesta dissertação ... iii
Resumo ... v
Abstract ... vii
Índice geral ... ix
Índice de Figuras ... xii
Índice de Tabelas ... xiv
Lista de abreviaturas e símbolos ... xv
Introdução ... 1
1. Considerações gerais ... 3
2. Nanomateriais ... 5
2.1. Nanopartículas de Ouro (AuNPs) ... 6
2.2. Nanocompósitos de ouro e carbono ... 8
2.3. Nanomaterial hidrofílico de carbono gerado eletroquimicamente (EHC) ... 11
3. Sensores eletroquímicos ... 11
3.1. Aptassensores eletroquímicos ... 12
3.2. Sensores de peróxido de hidrogénio ... 14
3.3. Sensores de oxigénio ... 15
Objetivos ... 17
1. Objetivos gerais ... 19
2. Objetivos específicos ... 19
Parte experimental ... 21
1. Síntese de nanocompósitos de ouro e carbono ... 23
1.1. Síntese do nanomaterial hidrofílico de carbono ... 23
1.2. Preparação de nanocompósitos de ouro e carbono ... 23
1.3. Caracterização ótica, química e estrutural dos nanocompósitos ... 24
2. Caracterização eletroquímica ... 25
2.1. Fundamentos das técnicas de voltametria ... 25
2.2. Célula eletroquímica ... 27
x
3.2. Técnicas de imobilização do aptâmero ... 29
3.3. Estudo da interação aptâmero-proteína por técnicas eletroquímicas ... 29
3.3.1. Aptassensor eletroquímico com aptâmero marcado com biotina ... 29
3.3.2. Aptassensor eletroquímico com aptâmero marcado com grupo tiol ... 31
Resultados e Discussão ... 33
1. Caracterização física e química de nanocompósitos de ouro e carbono ... 35
1.1. Caracterização ótica do nanocompósito EHC@AuNPs ... 35
1.2. Caracterização do tamanho e dispersão das AuNPs ... 37
2. Caracterização eletroquímica ... .39
2.1. Estudo em H2SO4 0,5 M ... 39
2.1.1. Caracterização dos nanocompósitos de ouro (EHC@AuNPs) imobilizados num elétrodo GC ... 39
2.1.2. Caracterização das nanopartículas de ouro (AuNPs) imobilizadas num elétrodo GC...41
2.2. Estudo em NaOH0.10 M ... 42
2.2.1. Caracterização dos nanocompósitos de ouro (EHC@Au-NPs) imobilizados em GC...42
2.2.2. Caracterização das nanopartículas de ouro (AuNPs) imobilizadas em GC ... 43
2.3. Estudo em HCl0.10 M ... 45
3. Aplicação dos nanocompósitos EHC@AuNPs em sensores eletroanalíticos ... 48
3.1. Aptassensores ... 48
3.1.1. Construção e caracterização de aptassensores com aptâmero marcado com biotina...48
3.1.1.1. Desempenho do aptassensor com a sonda redox de [Ru(NH)6]Cl3 ... 48
3.1.1.2. Desempenho do aptassensor com a sonda redox de [Fe(CN)6]3-/4- ... 49
3.1.2. Construção e caracterização de aptassensores com aptâmero marcado com grupos tiol ... 51
3.1.3. Estudo comparativo do desempenho dos aptassensores com aptâmero marcado com biotina e com grupos tiol ... 53
3.1.4. Comparação da especificidade do nanomaterial de carbono (EHC) na deteção das proteínas (OPN e BSA) ... 54
3.2. Sensores de peróxido de hidrogénio ... 55
3.3. Sensores de oxigénio ... 58
xii
potencióstato. Abreviaturas: WE (Elétrodo de trabalho), RE. (Elétrodo de Referência), CE (Contra elétrodo) e N2 (Entrada de azoto)...28 Figura 2- Método de imobilização das AuNPs sobre o GCE. Fonte: Adaptado de Randviir et
al. (2014). [1]...30
Figura 3- Representação esquemática do procedimento experimental usado na preparação do
aptassensor com aptâmero marcado com biotina...33
Figura 4- Representação esquemática do procedimento experimental usado na preparação do
aptassensor com aptâmero marcado com grupos tiol (-SH)...34
Figura 5- Registo da cor de soluções de EHC (1 mL) antes e após adição de 7.7 µl (L), 12.4 µl
(U), 16.5 µl (V) e 20.7 µl (Q) de solução de HAuCl4 28,0 mM...37 Figura 6- Registo dos espectros de UV-Vis de uma solução de EHC (2 mL) antes e após adição
de 16,6 µl solução de HAuCl4 28,0 mM...38 Figura 7- Imagens de TEM dos nanocompósitos EHC@AuNPs-M, EHC@AuNPs-L (N =
713), EHC@AuNPs-U (N = 442) e EHC@AuNPs-Q (N = 194) e respetivos histogramas percentuais. Em destaque a) o reduzido número de AuNPs visíveis no nanocompósito EHC@AuNPs-M e b) imagem de TEM que sugere a fusão entre AuNPs-L adjacentes...39
Figura 8- Imagens de TEM de AuNPs-M e AuNPs-Q e respetivos histogramas percentuais (N
= 416, 548, respetivamente). Destaque para a) a estrutura cristalográfica das AuNPs obtida por HRTEM e b) respetivo espetro EDS...40
Figura 9- Voltamogramas cíclicos em solução de H2SO4 0,5 M dos nanocompósitos a)
EHC@AuNPs-M e b) EHC@AuNPs-L imobilizados em elétrodos de carbono vítreo. υ= 50 mV/s...42
Figura 10- Voltamogramas cíclicos em solução de H2SO4 0,5 M das nanopartículas a)
AuNPs-M, b) AuNPs-L e c) AuNPs-Q depositados em elétrodos de carbono vítreo. υ= 50 mV/s...43
Figura 11- Voltamogramas cíclicos, em solução de NaOH 0,1 M, dos nanocompósitos a)
EHC@AuNPs-M, b) EHC@AuNPs-L c) EHC@AuNPs-U, d) EHC@AuNPs-V e e) EHC@AuNPs-Q depositados em elétrodos de carbono vítreo. υ= 50 mV/s...44
Figura 12- Voltamogramas cíclicos, em solução de NaOH 0,1 M, das nanopartículas a)
AuNPs-M, b) ANPs-L, c) AuNPs-U, d) AuNPs-V e e) AuNPs-Q depositadas em elétrodos de carbono vítreo e respetivo ΔEpred entre os dois primeiros varrimentos. υ= 50 mV/s...46
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em solução de NaOH 0,1 M em ensaios independentes e correspondente intensidade do pico de redução (j AuNPs). υ= 50 mV/s...46 Figura 14- Representação da área superficial das AuNPs em função da razão Au/ EHC da
solução utilizada na síntese do nanocompósito [email protected]
Figura 15- Voltamogramas de stripping anódico em solução de HCl 0,1 M dos elétrodos
modificados com a) AuNPs-M, b) AuNPs-U e c) AuNPs-Q. υ= 50 mV/s...48
Figura 16- Representação da massa de Au determinada a partir dos ensaios de stripping dos
nanocompósitos Au@EHC-X, em função da razão Au/EHC...48
Figura 17- Resposta da interação 5’-biotina-aptâmero-OPN (200 nM) por CV utilizando a
sonda redox [Ru(NH)6]Cl3, do aptassensor montado tendo AuNPs-Q como interface de ligação
ao GCE. υ=50 mV/s...51
Figura 18- Resposta da interação 5’-biotina-aptâmero-OPN (200 nM) por CV utilizando a
sonda redox de [Fe(CN)6]3-/4- do aptassensor montado tendo AuNPs-Q como interface de
ligação ao GCE. υ=50 mV/s...52
Figura 19- Resposta da interação 5’-biotina-aptâmero-OPN (200 nM) por CV utilizando a
sonda redox de [Fe(CN)6]3-/4- do aptassensor montado tendo EHC como interface de ligação
ao GCE. υ=50 mV/s...53
Figura 20- Resposta da interação 5’-tiol-aptâmero-OPN (200 nM) por CV utilizando a sonda
redox de [Fe(CN)6]3-/4- do aptassensor montado tendo AuNPs-Q como interface de ligação ao
GCE. υ=50 mV/s...54
Figura 21- Resposta da interação 5’-tiol-aptâmero-OPN (200 nM) por CV utilizando a sonda
redox de [Fe(CN)6]3-/4- do aptassensor montado tendo EHC como interface de ligação ao GCE.
υ=50 mV/s...55
Figura 22- Comparação da resposta dos aptassensores desenvolvidos com 5’-biotinaAPT e
com 5’-TiolAPT à presença de osteopontina (200 nM) em voltametria cíclica através da sonda redox de [Fe(CN)6]3-/4- tendo AuNPs-Q como interface de ligação ao GCE. υ=50
mV/s...56
Figura 23- Comparação da resposta dos eléctrodos modificados com EHC na deteção das
xiv
comparação da corrente de redução do H2O2 8,045 mM em GCE e EHC-GCE...58 Figura 25- Voltamogramas lineares de elétrodos de carbono vítreo modificados com o
nanomaterial EHC e AuNPs-Q, numa solução de PBS saturada de oxigénio e/ou saturada com azoto. υ= 20 mV/s...60
Índice de Tabelas
Tabela 1 – Revisão da literatura sobre a síntese de AuNPs por redução com nanomateriais de
carbono. Abreviaturas: SWCNT (Nanotubos de carbono de camada simples), rGO (Óxido de grafeno reduzido), N-GQDs (Pontos quânticos de grafeno dopados com azoto), r-GQDs (Pontos quânticos de grafeno reduzido), GQDs (Pontos quânticos de grafeno), CDots (Pontos quânticos de carbono), SPR (Ressonância plasmática de superfície), SERS (Espectroscopia Raman amplificada por superfície) e H2O2 (Peróxido de hidrogénio)...10 Tabela 2- Condições de síntese dos nanocompósitos [email protected] Tabela 3- Análise do Potencial Zeta por mobilidade eletroforética e do diâmetro das AuNPs
por dispersão dinâmica de luz...41
Tabela 4- Percentagem de ouro imobilizado nos elétrodos EHC@AuNPs/GC, calculado a partir
do número de moles de Au determinados nos ensaios de stripping anódico e do número de moles de Au depositados sobre os elétrodos...49
Tabela 5- Sensibilidade, limite de deteção e limite de quantificação dos elétrodos de GC
modificados com EHC, AuNPs-V e AuNPs-Q para a redução eletroquímica de peróxido de hidrogénio...59
xv
ΔI – Diferença de correntes de pico em percentagem
ΔIred – Diferença de correntes de pico de redução em percentagem
ΔIoxid – Diferença de correntes de pico de oxidação em percentagem
υ – Velocidade de varrimento AuNPs – Nanopartículas de Ouro
BSA – Albumina de Soro Bovino (do inglês, Bovine Serum Albumin) CDots – Pontos quânticos de Carbono (do inglês, Carbon Dots) CE – Contra-elétrodo (do inglês Counter Electrode)
CTAB – Brometo de cetrimónio
CV – Voltametria Cíclica (do inglês Cyclic Voltammetry)
DLS – Dispersão Dinâmica de Luz (do inglês Dynamic Light Scattering) DNA – Ácido Desoxirribonucleico (do inglês Deoxyribonucleic Acid) DPA – Ácido 3,3-ditiodipropiónico
EASA – Área Superficial Eletroquímica Ativa (do inglês Electrochemical Active Surface Area) EDS – Espectroscopia de Disperso de Raios-X
EDC – Cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida
EHC – Carbono Hidrofílico Gerado Eletroquimicamente (do inglês, Electrogenerated
Hydrophylic Carbon)
EHC@AuNPs – Nanocompósito de ouro e carbono Ep – Potencial de pico
ETA – Etanolamina
GC – Carbono Vítreo (do inglês Glassy Carbon)
GCE – Elétrodo de Carbono Vítreo (do inglês Glassy Carbon Electrode) GO – Óxido de Grafeno (do inglês Graphene Oxide)
GQDs – Pontos Quânticos de Grafeno (do inglês Graphene Quantum Dots)
HRTEM − Microscopia Eletrónica de Transmissão de Alta Resolução (do inglês, High
Resolution Transmission Electron Microscopy)
I − Intensidade de corrente MCH – 6-mercapto-1-hexanol
N-GQDs – Pontos quânticos de grafeno dopados com azoto (do inglês Nitrogen doped
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NHS – N-hidroxissuccinimida NM – Nanomaterial
NPs – Nanopartículas OPN – Osteopontina
PBS – Tampão fosfato salino (do inglês, Phosphate Buffered Saline) PEI – Polietilenimina
PVP – Polivinilpirrolidinona
RE – Elétrodo de Referência (do inglês Reference Electrode)
rGO – Óxido de grafeno reduzido (do inglês Reduced Graphene Oxide)
r-GQDs – Pontos quânticos de grafeno reduzido (do inglês Reduced Graphene Quantum Dots) RHE – Elétrodo de Referência de Hidrogénio (do inglês Reference Hydrogen Eletrode)
RNA – Ácido Ribonucleico (do inglês Ribonucleic Acid)
SELEX – Evolução Sistemática de Ligandos por enriquecimento exponencial (do inglês
Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)
SERS – Espectroscopia Raman Amplificada por Superfície (do inglês Surface Enhanced
Raman Spectroscopy)
SPR – Ressonância Plasmática de Superfície (do inglês, Surface Plasmon Ressonance)
ssDNA – Ácido Desoxirribonucleico de cadeia Simples (do inglês Single Strand
Deoxyribonucleic Acid)
ssRNA – Ácido Ribonucleico de Cadeia Simples (do inglês Single Strand Ribonucleic Acid) SWCNTs − Nanotubos de Carbono de Camada Única (do inglês, Single Wall Carbon
Nanotubes)
TCEP – Tris-2-carboxietil-1-fosfina
TEM − Microscopia Eletrónica de Transmissão (do inglês, Transmission Electron Microscopy) UV-Vis − Ultravioleta-Visível
Capítulo I
___________________________________________________________________________
Introdução
Preparação de nanocompósitos de ouro e carbono para
desenvolvimento de sensores electroanalíticos
3 1. Considerações gerais
De entre as aplicações mais relevantes da nanotecnologia, destaca-se o desenvolvimento de novas abordagens na deteção e regulação de processos biológicos que ocorrem a uma escala nanométrica, potenciando finalidades com forte impacto nas áreas da biologia e da medicina, nomeadamente, nas aplicações terapêuticas e de diagnóstico. [2,3] Devido às dimensões das nanopartículas, semelhantes às das biomoléculas e estruturas biológicas, a sua utilização revela-se extremamente oportuna para o estudo e controlo de processos biomédicos. As características específicas de cada tipo de nanopartícula, tal como o tamanho, a geometria, a carga superficial e a capacidade de interagirem com agentes biológicos, condicionam fortemente a eficácia de aplicações terapêuticas e de diagnóstico médico. Nesta área, destaca-se o papel que os nanomateriais desempenham no desenvolvimento de sensores, os quais não só viabilizam novas técnicas de deteção, como permitem uma maior seletividade e sensibilidade na deteção do sinal analítico. [4,5]
Um grupo de sensores de relevo na área biomédica são os sensores eletroquímicos, cujo funcionamento se baseia na deteção de um sinal de natureza elétrica (corrente, potencial, condutividade ou resistividade) em elétrodos integrados numa célula eletroquímica. [6,7]Estes tipos de sensores são bastante atrativos pois são capazes de fornecer informação em tempo real, apresentam um baixo custo, facilidade de automação, portabilidade e possibilidade de miniaturização. Dentre os sensores eletroquímicos, destacam-se os biossensores, os quais utilizam componentes biológicos imobilizados na superfície do elétrodo como elementos de reconhecimento do analito. Há dois tipos de biossensores, dependendo da natureza do reconhecimento: os biossensores catalíticos e os biossensores por afinidade. Os aptassensores são exemplos de biossenssores por afinidade, que promovem uma interação seletiva com o analito. [8,9]
Tendo como foco essencial o diagnóstico precoce e altamente preciso de diversos tipos de cancro, têm vindo a ser desenvolvidos aptassensores altamente sensíveis à presença de proteínas resultantes do seu metabolismo, de entre as quais se destaca a osteopontina (OPN). Esta proteína é parte integrante dos mecanismos de desenvolvimento de determinadas neoplasias, nomeadamente cancro da mama, pulmão, próstata e cólon, entre outros, para estados avançados através da regulação de parâmetros do desenvolvimento dos tumores, designadamente na proliferação celular, na angiogénese e no processo de metastização. Assim, a sua deteção pode ser extremamente útil enquanto indicador da presença e severidade destas
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neoplasias, tanto no diagnóstico precoce como na monitorização a médio ou longo prazo após tratamento oncológico. [10,11]
Os sensores eletroquímicos demonstram também um excelente desempenho na deteção e quantificação de outros agentes importantíssimos enquanto indicadores metabólicos, designadamente o peróxido de hidrogénio (H2O2) e o oxigénio (O2), que podem servir como
indicadores fisiológicos de patologias, tais como cancro, enfarte do miocárdio ou doença de Alzheimer. [12–14]
Tendo como base as premissas apresentadas que suportam a importância dos nanomateriais no desenvolvimento de sensores com aplicações médicas, este trabalho visa a síntese e caracterização de nanopartículas de ouro (AuNPs) e sua aplicação em três tipos diferentes de sensores eletroquímicos: aptassensor de OPN, sensor de O2 e sensor de H2O2. No
processo de síntese das AuNPs será utilizada uma nova abordagem, na qual os iões de ouro serão reduzidos por um nanomaterial hidrofílico de carbono (NHC), reação da qual resulta a formação de um novo tipo de nanocompósito.
5 2. Nanomateriais
Em 1959, o físico Richard Feynman, na sua palestra There’s plenty of room at the
bottom [15] lançou as bases conceptuais do que viria a ser a nanotecnologia. Nesta palestra,
Feynman, profetiza que a mimetização do modo como a matéria é organizada na natureza a nível atómico e molecular, tornaria possível o desenvolvimento de novos dispositivos à escala nanométrica, capazes de intervir e promover avanços em áreas como a medicina, o setor energético e a ecologia. [15,16]
A nanotecnologia é uma área multidisciplinar do conhecimento caracterizada por conciliar e aplicar conceitos provenientes de áreas que vão desde a ciência e engenharia de materiais à bioeletrónica, abrangendo setores como a química, a física, a robótica e a biologia e que tem como objetivo a síntese e aplicação de materiais com dimensões compreendidas entre 1 e 100 nanómetros em pelo menos uma das suas dimensões espaciais. [16] À escala nanométrica os materiais apresentam propriedades físico-químicas diferentes, e muitas vezes antagónicas, das verificadas à escala micro ou macroscópica. Este efeito resulta, por um lado, do aumento da razão entre área de superfície e volume e, por outro lado, do efeito de confinamento quântico que conduz à quantização dos estados eletrónicos, refletindo-se nas propriedades óticas, elétricas, magnéticas e catalíticas do material.
Os processos de fabrico de nanomateriais (NM) podem ser descritos como top down, em que um sólido é desgastado dando origem a fragmentos menores até que estes adquiram dimensões nanométricas, ou como bottom up, em que os materiais são agregados a partir de estruturas menores, tais como sais metálicos ou moléculas. Os métodos bottom up permitem a organização dos nanomateriais em estruturas altamente complexas e contemplam um conjunto de processos físicos, químicos e biológicos. [17–22]
Como resultado das suas excelentes propriedades físico-químicas, os nanomateriais têm entrado no nosso quotidiano e protagonizado uma revolução silenciosa no nosso estilo de vida sendo, nos dias de hoje, usados nas mais diversas áreas, indo desde os cosméticos até aos materiais de construção, passando pela eletrónica, a produção alimentar e a biomedicina. [22]
Num contexto clínico, as nanopartículas (NPs) revelam ser uma mais-valia: • Podem funcionar em simultâneo como agente de diagnóstico e terapêutico;
• Devido à sua elevada razão entre área de superfície e volume e à possibilidade de ocorrência de organizações estruturais que maximizam o volume interno, podem encapsular grandes quantidades de fármacos;
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• Uma vez que a sua superfície pode ser modificada, podem promover a especificidade de ligação a determinados tipos de células-alvo, tornando as terapias mais eficazes e minimizando os efeitos secundários. [23]
Por estes motivos, prevê-se que a nanotecnologia venha a ser um dos principais motores de inovação científica e tecnológica no presente século, sendo alvo de grande investimento, nomeadamente no ramo da nanomedicina, no diagnóstico precoce e tratamento de infeções,
doenças degenerativas e cancro. [18,23,24] De entre as aplicações biomédicas, as nanopartículas de óxido de ferro, ouro e prata têm um papel preponderante. As AuNPs recebem especial atenção pois são relativamente inócuas para os sistemas biológicos e são produzidas e manuseadas através de processos físico-químicos relativamente simples. [25]
2.1. Nanopartículas de Ouro (AuNPs)
As AuNPs encontram-se entre os nanomateriais mais importantes da atualidade devido às suas características únicas e facilidade de síntese.
Estas nanopartículas destacam-se pelas suas propriedades óticas ajustáveis (dependentes do tamanho e forma), alta atividade eletrocatalítica, facilidade de funcionalização, elevada velocidade de transferência eletrónica, alta razão entre área de superfície e volume e biocompatibilidade. Boa parte das propriedades óticas de interesse dos nanomateriais metálicos resulta das propriedades de ressonância plasmática de superfície (SPR). Com efeito, as NPs de ouro, à semelhança das de prata, possuem uma absorção bem definida em regiões distintas do espectro visível, denominadas de banda plasmónica. Esta absorção ocorre devido à oscilação coletiva dos eletrões de condução em resposta à excitação ótica promovida pela aplicação de um campo eletromagnético externo. A banda plasmónica de NPs metálicas é diretamente afetada pelo tamanho, pela forma e distância entre as NPs, assim como pela constante dielétrica do meio. [26,27]
A capacidade de funcionalização da superfície das AuNPs também tornam estas num objeto de estudo muito aliciante, na medida em que providenciam um meio estável de imobilização de moléculas orgânicas, assegurando a manutenção da sua atividade e representando assim uma mais-valia na sua aplicação. [28,29] Quando integradas em sensores eletroquímicos, como por exemplo os biossensores de proteínas, permitem a transferência direta de eletrões entre o centro ativo das proteínas a ser detetadas e o material do elétrodo, o que dispensa a necessidade de outros mediadores na transferência de eletrões, significando assim uma melhoria na sensibilidade, especificidade e repetibilidade na implementação dos mesmos.
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[30] Na literatura existem diversos métodos de síntese de AuNPs. Maioritariamente as reações descritas usam tetracloreto de ouro (HAuCl4)como material de partida, que pode ser reduzido
por um agente redutor forte como borohidreto de sódio, hidrazina ou formaldeído. Apesar de serem muito eficientes, estes agentes redutores são nocivos e tóxicos, representando uma limitação para a aplicação das AuNPs para fins biomédicos. Outros agentes redutores mais fracos, como o citrato, o ácido ascórbico ou agentes fitoquímicos (nomeadamente carboidratos, catequina ou proteínas de alto peso molecular) são preferíveis apesar de exigirem altas temperaturas na síntese de AuNPs. [21,26,31]
O método mais comum de síntese de AuNPs consiste na redução do ião AuCl4-, com
recurso ao ião citrato em meio aquoso, como inicialmente descrito por Turkevitch et al. (1950) e adaptado por Kimling et al. (2006) e por Chakraborty et al. (2015). [32–34] Neste caso, assim como na síntese e processamento de outros tipos de nanopartículas metálicas, o citrato funciona, não só como agente redutor, mas também como estabilizador aniónico.
Os agentes de estabilização são essenciais a fim de inibir a agregação das NPs, travando a coalescência por repulsão eletrostática ou por impedimento estérico. [13] Com efeito, as NPs são frequentemente instáveis ou metaestáveis a nível termodinâmico, como resultado da alta energia de superfície que advém da sua elevada área superficial e das interações atrativas dipolo-dipolo. [35] A estabilização das NPs tanto pode ser conseguida por repulsão das cargas à sua superfície, quanto pela interação estérica, a qual envolve a presença de moléculas de grande dimensão ligadas à sua superfície. Existe um conjunto de moléculas amplamente utilizado para estabilizar nanopartículas, verificando-se que quanto maiores forem as moléculas estabilizadoras adsorvidas, maior a sua eficácia enquanto agentes estabilizadores de AuNPs, como resultado das limitações geométricas que causam. Na maioria das vezes esses agentes estabilizadores são moléculas contendo grupos terminais –SH, -CH, -NH2, entre outros. Os
estabilizadores mais eficazes são o brometo de cetrimónio (CTAB), polietilenimina (PEI), polivinilpirrolidinona (PVP), citrato e aminas. Uma classe muito utilizada são os tióis de cadeia longa, que apresentam funções hidrofóbica e hidrofílica na mesma molécula. [5,23,36,37] Contudo, a estabilização é muitas vezes acompanhada por uma menor atividade catalítica das AuNPs, sendo essencial encontrar um compromisso entre a estabilidade das AuNPs e respetiva atividade catalítica.
A investigação atual tende no sentido de otimizar as condições das reações para obter NPs mais monodispersas, assim como modificar NPs tendo em vista a sua aplicação nos ramos da biotecnologia e da biomedicina. [21] Desperta também um grande interesse a possibilidade
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da combinação das propriedades das nanopartículas com outros tipos de materiais, formando os chamados nanocompósitos ou materiais híbridos. Uma breve abordagem aos nanocompósitos de ouro e carbono será feita de forma específica no item que se segue.
2.2. Nanocompósitos de ouro e carbono
Os compósitos estão entre alguns dos materiais com características mais interessantes que podem ser sintetizados pelo Homem pois permitem associar e explorar propriedades de dois ou mais tipos de materiais em simultâneo. [38] Da mesma forma, os compósitos de nanomateriais permitem a associação de várias substâncias tirando proveito de novas propriedades físico-químicas que surgem nos materiais à escala nanométrica. Nanocompósitos de ouro e carbono são correntemente utilizados para otimizar a capacidade de resposta de sensores na deteção de moléculas específicas, nomeadamente peróxido de hidrogénio, glicose, proteínas e fármacos, mas também em processos catalíticos, na alteração das propriedades eletrónicas de materiais e estudos de cinética química de reações. [39–41]
São aplicados vários métodos de síntese deste tipo de nanocompósitos. Genericamente, estes métodos podem ser classificados como métodos in-situ (quando as NPs metálicas se formam diretamente sobre o nanomaterial de carbono) ou ex-situ (quando as NPs são previamente preparadas antes de serem adicionadas ao nanomaterial de carbono). O método mais vulgar consiste no método in-situ de redução química do ião metálico com agentes redutores, tais como o etileno glicol, citrato de sódio e borohidreto, na presença do nanomaterial de carbono. Mais especificamente, a carga negativa dos grupos funcionais existentes na superfície do nanomaterial de carbono permite a atração eletrostática dos catiões metálicos, resultando no crescimento das NPs na superfície do nanomaterial de carbono após a adição do agente redutor. O óxido de grafeno (GO) e o óxido de grafeno reduzido (rGO) são modelos especialmente promissores para esse objetivo devido à presença de defeitos e grupos funcionais de oxigénio nas suas superfícies, o que permite a nucleação, crescimento e fixação de vários metais. Utilizando este processo, diversos investigadores defendem que compósitos de rGO-NPs conseguem preservar as propriedades elétricas do grafeno. [42] Embora este método seja altamente eficiente e fácil de executar, o tamanho e a morfologia das nanopartículas metálicas no compósito podem ser difíceis de controlar, resultando em amostras decoradas com nanopartículas que têm uma ampla distribuição de tamanhos. Por outro lado, este método requer que exista no pós-síntese uma etapa de separação do agente redutor utilizado (e respetivo produto de oxidação).
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Outra forma de obter estes nanocompósitos é através de uma única etapa de síntese, na qual são misturadas dispersões de nanomateriais de carbono com uma solução do precursor das NPs, sendo estas diretamente reduzidas pelo próprio nanomaterial de carbono. [43–45] Deste modo, o nanomaterial de carbono funciona não só como agente redutor, mas também como agente imobilizador, dispensando ainda a etapa pós-síntese de separação do agente redutor. No que concerne a redução direta da solução de HAuCl4 pelo material de carbono, a Tabela 1
sumaria algumas características do processo de síntese, o tipo de nanomaterial de carbono utilizado como agente redutor, o tamanho das AuNPs obtidas e a sua aplicação. Como é possível verificar, os pontos quânticos de grafeno (na designação anglo-saxónica Graphene Quantum
Dots - GQDs) ou os pontos quânticos de carbono (mais conhecidos pela sua designação
anglo-saxónica Carbon Dots - CDots), são de todos os nanomateriais de carbono os mais utilizados como agentes redutores na síntese de AuNPs. Contudo, é importante salientar que nem todos os GQDs e CDots sintetizados exibem propriedades redutoras, não se conhecendo até à data qualquer correlação entre as condições de síntese destes nanomateriais de carbono e as suas propriedades redox. Por outro lado, existe uma grande variabilidade nas próprias condições de síntese das AuNPs, em termos da concentração da solução de HAuCl4, concentração da
suspensão de nanopartículas de carbono, temperatura (Tamb– 100 0C) e tempo de reação. Como
resultado, são obtidas AuNPs de geometria esférica, mas de diâmetro variável, de dimensões compreendidas entre 5 e 90 nm, como resultado das muitas variáveis inerentes ao processo de síntese.
Importa assim desenvolver métodos de preparação de nanocompósitos de carbono e nanopartículas que permitam a redução do HAuCl4 pelo nanomaterial de carbono, métodos
estes que devem ser de fácil execução, ambientalmente sustentáveis, de baixo custo e, acima de tudo, reprodutíveis. A questão da reprodutibilidade não deverá cingir-se apenas às propriedades das NPs (e.g. tamanho e dispersão), mas também à capacidade redutora intrínseca do nanomaterial de carbono.
Neste trabalho será desenvolvido um novo processo de síntese de AuNPs que se baseia na utilização de um nanomaterial hidrofílico de carbono que foi desenvolvido no nosso grupo e cujas propriedades redutoras são inquestionavelmente muito reprodutíveis, tendo sido o seu método de síntese e respetivas propriedades patenteadas. [46] Este material foi designado de
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Tabela 1 – Revisão da literatura sobre a síntese de nanopartículas de ouro (AuNPs) por redução com nanomateriais de carbono. Abreviaturas: SWCNT (Nanotubos de carbono de camada simples), rGO (Óxido de grafeno reduzido), N-GQDs (Pontos quânticos de grafeno dopados com azoto), r-GQDs (Pontos quânticos de grafeno reduzido), GQDs (Pontos quânticos de grafeno), CDots (Pontos quânticos de carbono), SPR (Ressonância plasmática de superfície), SERS (Espectroscopia Raman amplificada por superfície).
Agente
redutor Método de síntese
Diâmetro das AuNPs (nm) SPR (nm) Aplicação Ref. SWCNT HAuCl4: 1 mM a 10 mM) (10 min, T amb.) 25 550 Aumentar a condutividade elétrica de filmes de SWCNT [47] rGO PEI/rGO: 10 mL, 2 mM HAuCl4: 30 mL (0.1M), (T amb.) 20 n.d. Determinação de peróxido de hidrogénio [12] N-GQDs HAuCl4: 0.5 ml (0.1 M) (100 °C, 10 min) 3.3 550
Deteção de glicose por
eletroquimioluminescência [41] N-GQDs: 2 ml, 10 mg/ml HAuCl4: 0.5 ml a 0.10 M (100 ºC) 5.2 450 Determinação de H2O2 em ambiente biológico [48] r-GQDs r-GQDs: 2 mL (20 mg/mL) 100º C, 20 min HAuCl4: 0.5 mL (0.1 M), 4 n.d. Degradação catalítica de nitrofenol [49] HAuCl4: 10 mL (0.1 mM) r-GQDs: 50 μL (10 mg/ml) (100º C, 10 min) 18 a 21 525 Determinação de cisteína [50] GQDs HAuCl4: 0.5 mL (0.5%, m/m) GQDs: 25 ml (0.02 g/l) (100º C) 15 520 Determinação de glicose [51] HAuCl4: 0.5 mL (31.4 mM) GQDs: 1 mL (0.4 mg/ml) (T amb.) 7.7 527 Deteção de vitamina B1 na
presença de outras vitaminas [52] GQDs: (2.25 a 3.50 nm)
HAuCl4: (2,5.10-4 a 5,0.10-3 mmol)
13.4 a 32.6 n.d. Estudo da cinética da redução de 4-nitrofenol [40] CDots C-dots: 200 l em 9.8 ml de água. AuCl3: 1 mM (10 min, T amb.) 10 530 Determinação de dopamina [19] HAuCl4: 150 l (0.83 mg/mL) CDots: 3 mL (0.03 mg/ml) (80 min, 100º C) 24 543 SERS [53] CDs: 350 μL (5 mg/ml) (T amb.) decaédrica:30
triangular:100 250–270 Redução de 4-nitrofenol [54] HAuCl4: até 1.2x10–1 mg/mL CDs (0.06 mg/mL) (40 a 100 ºC, 1 a 24 h) 8.7 a 16.4 541 Redução de 4-nitrofenol [55] CDs: 5 mL (20 μg/mL) HAuCI4: 1 mL (0.01 M) (T amb., 30 min)
n.d. 551 Sonda de fluorescência para
deteção de cisteína [56] HAuCl4: 0.625 ml (8.0 mM) CDots: (2.0 mg/ml) (T amb., no escuro) 20-68 5.6-17.3 6-14.4 400 Redução do p-nitrofenol [57] HAuCl4: 50 µl (10-80 mM) (T amb) 90 528
Deteção de fármacos contendo grupos tiol [58] HAuCl4: 2.0 μL (50 mM) CDots: 1 ml (0.07 mg/ml) (37 °C, 10 min) n.d. 527 Determinação de imunoglobulina G e troponina I cardíaca humana [59]
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2.3. Nanomaterial hidrofílico de carbono gerado eletroquimicamente (EHC)
O EHC é composto por aglomerados carbonáceos do tipo amorfo que exibem carbono sp2 que podem ser produzidos por um método eletroquímico inovador desenvolvido na UTAD a partir de elétrodos de grafite. Designa-se por nanomaterial hidrofílico de carbono, dada a sua elevadíssima solubilidade em água, contrariamente a outros nanomateriais de carbono produzidos igualmente a partir da grafite, tais como os flocos e folhas de grafeno ou óxidos de grafeno. Este método eletroquímico é muito atraente devido à sua simplicidade, baixo custo, execução rápida e capacidade de controlar a composição e propriedades redox do EHC. [60]
Até ao momento é sabido que as propriedades físico-químicas deste NM dependem da natureza do eletrólito, do elétrodo onde são geradas (no ânodo ou no cátodo) e do tempo da polarização dos elétrodos. Não se conhece exatamente dimensões deste NM , as quais estão abaixo do limite de deteção das técnicas de microscopia eletrónica de transmissão, mas sabe-se que tem a capacidade de se auto-organizar, formando estruturas bidimensionais que têm propriedades condutoras. As suas propriedades redutoras assemelham-se às do ácido ascórbico, tendo sido caracterizadas por voltametria cíclica (CV). [24]
3. Sensores eletroquímicos
Sensores eletroquímicos são dispositivos que usam como elemento de reconhecimento de um analito-alvo, um elétrodo capaz de gerar um sinal elétrico proporcional à concentração do analito em questão. Estes podem ser amperométricos (geram uma corrente elétrica), potenciométricos (geram um potencial elétrico) ou condutimétricos (geram uma variação de condutividade). Os elétrodos podem, por sua vez, ser quimicamente modificados. Isto significa que, na sua superfície, podem imobilizar-se espécies químicas (ou biológicas) que permitem modificar a natureza físico-química da interface elétrodo/solução, tornando-a mais ativa, seletiva ou sensível.
De entre os materiais modificadores, os nanomateriais são amplamente utilizados uma vez que oferecem muitos benefícios, como por exemplo elevada área de superfície, o que conduz à promoção do transporte de massa, promoção da eletrocatálise e capacidade de imobilização de determinadas moléculas. Estas características proporcionam um melhor desempenho analítico na deteção eletroquímica dos analitos-alvo, nomeadamente, um menor limite de deteção, maior sensibilidade e menor potencial de trabalho. Com efeito, quanto maior a área exposta do sensor, maior a corrente transferida e, por conseguinte, maior a amplitude do
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sinal obtido, o que se traduz numa maior capacidade de deteção do sensor. [17,43] Assim, as nanopartículas providenciam soluções elegantes e eficientes na transdução de sinais biológicos em sinais elétricos.
Por outro lado, os dispositivos eletroquímicos têm características únicas que atendem aos requisitos de reduzido tamanho, potência e custo de implementação. As AuNPs, destacam-se enquanto agentes optimizadores do dedestacam-sempenho de destacam-sensores eletroquímicos devido à sua excelente condutividade e capacidade de adsorver grandes quantidades da molécula-alvo à superfície do elétrodo. [61] Neste sentido, é de todo o interesse o estudo do desempenho de sensores eletroquímicos que integram nanomateriais para deteção de biomoléculas, agentes patogénicos ou poluentes.
3.1. Aptassensores eletroquímicos
Tal como foi dito anteriormente, os biossensores utilizam um agente específico de bio-reconhecimento, sensível e seletivo, responsável pela ligação à molécula-alvo, e um transdutor capaz de traduzir a ligação num sinal elétrico mensurável. De uma forma sucinta, podem ser definidos como dispositivos analíticos baseados num biorrecetor e que são capazes de detetar analitos biologicamente relevantes através de uma leitura elétrica ou ótica. [62] Atualmente são usadas como agentes de reconhecimento, entre outros, os aptâmeros, que consistem em oligonucleótidos de cadeia simples de DNA (ssDNA) ou RNA (ssRNA), com 20 a 100 nucleótidos capazes de se dobrar em estruturas terciarias únicas.[55]
Os aptâmeros têm capacidade de ligação específica e estável a estruturas-alvo que podem ir desde pequenas moléculas a células. [63] A facilidade na sua síntese e modificação faz com que sejam uma valiosa ferramenta de estudo em áreas como a biologia, a ecologia e a medicina. Podem ser desenvolvidos aptassensores para qualquer molécula para a qual um aptâmero possa ser gerado, de entre as quais se destacam os biomarcadores presentes nos fluidos corporais. [8]
A implementação dos aptassensores em deteção eletroquímica, desde o início da década de 90 do século passado, constituiu uma mais valia devido à sua alta sensibilidade, instrumentação simples, baixo custo de produção, resposta rápida e portabilidade. [62] Estes sensores são relativamente fáceis de fabricar e alterar quimicamente, possuem alta sensibilidade e seletividade para a molécula-alvo, boa estabilidade em ambientes complexos e alta resistência à desnaturação e degradação. Estas características tornam os aptassensores alternativas viáveis aos imunossensores, podendo ser facilmente fabricados por um processo de seleção,
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nomeadamente pelo método SELEX (systematic evolution of ligands by exponential
enrichment). [64–66]
Os aptassensores eletroquímicos consistem na imobilização de um aptâmero específico à superfície de um elétrodo ligado a um transdutor, de modo a monitorizar a interação entre o aptâmero e a molécula-alvo, através de alterações mensuráveis na corrente ou potencial elétrico que ocorrem na interface entre a superfície, o biorrecetor e o transdutor. [9] A ligação dos aptâmeros ao elétrodo de trabalho pode ser efetuada através da extremidade 5’- ou da extremidade 3’-, sendo que a ligação através da extremidade 3’- tem vindo a ser descrita como mais eficaz na deteção de alvos biológicos pois esta conformação confere-lhes maior resistência à atividade de nucleases. [67]
A imobilização de um aptâmero sobre a superfície de um elétrodo para desenvolver aptassensores reutilizáveis pode ser efetuada de vários modos, designadamente, por adsorção física em cuja imobilização se baseia na interação entre cargas estabelecidas entre os grupos com carga negativa presentes no DNA e cargas positivas na superfície do elétrodo; por quimisorção, em que um aptâmero tiolado se liga a uma superfície de ouro através de ligações covalentes entre os átomos de ouro e enxofre; através da interação específica entre a estreptavidina e a biotina e pela ligação covalente entre um aptâmero marcado com grupo amina e uma superfície funcionalizada com um grupo funcional (p.e. -NH2). [68–70]
O método de adsorção física de aptâmeros consiste na sua modificação com biotina e na promoção da sua ligação à estreptavidina, avidina ou neutravidina, como resultado da alta afinidade entre estes compostos. [67] A ligação da estreptavidina à superfície do elétrodo pode ser efetuada por ligação não covalente ou adsorção física, exigindo quantidades muito reduzidas de aptâmero, condições físico-químicas pouco específicas (designadamente concentração da solução eletrolítica, agentes desnaturantes, pH e temperatura), resultando numa diminuição da adsorção não-específica e melhoria da razão sinal-ruído. [68]
O método de quimisorção do aptâmero é amplamente empregue em elétrodos de ouro e consiste na marcação do aptâmero com grupos tiol (-SH), que resulta na formação de ligações covalentes como consequência da alta afinidade entre os átomos de enxofre e de ouro e que são caracterizadas pela formação de uma monocamada estável e flexível, que podem integrar várias camadas de aptâmeros. [71]
O desenvolvimento de aptassensores eletroquímicos pode ser baseado em diversas estratégias de deteção do analito, designadamente com base em alterações de configuração, alterações de conformação e alterações de condutividade. Os aptassensores dividem-se
14
maioritariamente em sensores labelled e sensores label-free. Nos aptassensores eletroquímicos
labelled, o biorrecetor pode ser identificado com uma grande variedade de compostos redox
que se ligam ao aptâmero, induzindo um sinal eletroquímico aquando da formação do complexo entre o aptâmero e a estrutura-alvo. [72]
Um método de montagem que resulta numa maior sensibilidade e seletividade na deteção da molécula-alvo é a estrutura em sandwich. Esta implica a existência de dois locais de ligação (epítopos) na estrutura-alvo à qual dois aptâmeros distintos se ligam, sem afetar a ligação de outras estruturas, e a seleção de dois ou mais aptâmeros específicos para a estrutura-alvo. [73]
Um outro grupo de aptassensores são os “label-free”, nos quais o biorrecetor não se liga a um composto redox. Nestes casos exige-se a implementação de sondas redox, como complexos de ferrocianeto e de ruténio ([Fe(CN)6]3−/4− e [Ru(NH3)6]3+) que podem ser
associados eletrostaticamente ou interagir difusivamente (através de atração ou repulsão) com os aptâmeros. [70]
3.2. Sensores de peróxido de hidrogénio
O peróxido de hidrogénio (H2O2) é um dos oxidantes mais versáteis e poderosos que
existe. O seu potencial padrão de redução (1,77 V vs elétrodo normal de hidrogénio (NHE)) é superior ao do cloro e permanganato de potássio. Apesar do seu poder de reação, é um metabólito natural no organismo. Com efeito, está presente em inúmeras reações biológicas como principal produto de várias oxidases, sendo um parâmetro importante na quantificação destes bioprocessos. A sua determinação também se reveste de grande importância na área médica porque é um indicador de stress oxidativo nas células. [74]
Dada a relevância do H2O2 no diagnóstico médico, designadamente na deteção precoce
de patologias como enfarte do miocárdio, cancro, doença de Alzheimer e Parkinson, entre outros, torna-se extremamente importante o desenvolvimento de tecnologias de deteção altamente precisa e seletiva de H2O2 em condições fisiológicas. [13,48] A sua monitorização
também é muito pertinente em diversos setores da indústria, nomeadamente na indústria têxtil, alimentar e do papel, assim como no tratamento de efluentes, especialmente os que utilizam processos oxidativos avançados (e.g. O3/H2O2, O3/H2O2/UV, H2O2/Fe2+). Para este fim, são
utilizadas técnicas como a espectrofotometria, a quimiluminescência, a fluorescência e a eletroquímica, ocupando esta última um lugar de destaque. Contudo, a sensibilidade, especificidade e facilidade de implementação ainda necessitam ser melhoradas sendo, portanto,
15
de grande relevância, o desenvolvimento de novas tecnologias aplicadas a sensores de H2O2.
[12]
Os biossensores enzimáticos, amplamente empregues na deteção de produtos metabólicos, usam frequentemente o oxigénio molecular como mediador de transferência eletrónica. Assim, o seu modo de funcionamento baseia-se na deteção de H2O2 ou O2
envolvidos na reação enzimática (constituem os biossensores enzimáticos de 1ª geração). Contudo, a deteção do H2O2 nestes sistemas analíticos é muitas vezes afetada pela presença de
O2 e pela baixa estabilidade das medições como resultado do envenenamento da superfície dos
elétrodos pela adsorção de espécies biológicas. [75]
Tendo em consideração esta limitação, atualmente estão a ser levados a cabo esforços no sentido de sintetizar e caracterizar materiais que permitam desenvolver sensores eletroquímicos seletivos e sensíveis, mas menos passíveis de envenenamento.
3.3. Sensores de oxigénio
A reação de redução do oxigénio é uma das reações eletroquímicas mais extensivamente estudadas, tanto do ponto de vista mecanístico como cinético, devido à sua importância no desenvolvimento de células de combustível, armazenamento e conversão de energia, estudos de corrosão, na indústria farmacêutica e alimentar (nomeadamente nos processos de fermentação) e em análises bioquímicas.
A importância da monitorização do oxigénio na área biomédica está bem patente no prémio Nobel da Medicina atribuído no corrente ano (2019). Este prémio foi atribuído a um grupo de investigadores como resultado de estudos realizados no âmbito da deteção e adaptação por parte das células à presença de oxigénio. Esta variável leva frequentemente a alterações metabólicas. Designadamente, situações de hipoxia estimulam o crescimento de vasos sanguíneos no interior dos tumores, o que promove o processo de metastização. Embora nestes estudos tenham sido utilizadas técnicas de imagiologia médica para identificar áreas com menor concentração de oxigénio dentro dos tumores, é revelador da importância de se controlar o teor de oxigénio no meio celular. [26,76]
Na área da bioquímica, destaca-se a utilização de sensores de oxigénio (recorrendo a elétrodos de Clarck) na determinação de atividade enzimática das oxidases, tal como foi referido anteriormente. [77]
Os catalisadores de platina são caracterizados por uma alta eficiência na reação de redução do oxigénio (promovem o mecanismo de 4e-), contudo, apresentam sérias limitações:
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elevado custo de aquisição, escassez de fontes e propensão para envenenamento por moléculas biológicas e orgânicas (e.g. metanol). Estes constrangimentos justificam o intenso esforço que tem sido feito no sentido de substituir este material por outros de baixo custo, maior abundância e que sejam menos suscetíveis de envenenamento, tais como carbono ativado, grafite, enzimas, micro-organismos, porfirinas de metais de transição, ftalocianinas, nanopartículas metálicas e nanomateriais à base de carbono. [78]
A redução do oxigénio pode envolver quatro eletrões, no que resulta a formação de água, ou pode envolver apenas dois eletrões, sendo o peróxido de hidrogénio o produto da reação. O mecanismo reacional e, por conseguinte, a natureza do produto da reação de redução de oxigénio depende essencialmente da natureza do material de elétrodo. A necessidade de utilizar um material que favoreça um mecanismo de 2e- ou de 4e- depende essencialmente do tipo de aplicação do elétrodo. Em aplicações bioanalíticas poderá ser irrelevante a natureza do produto da reação. O mesmo não se passa nas aplicações na área energética (e.g. pilhas de combustível), onde se procura evitar a formação de espécies fortemente oxidantes. [75,76]
Surpreendentemente, a reação de redução do oxigénio com recurso a AuNPs em meio neutro foi ainda pouco estudada, sendo a pesquisa neste tópico de todo o interesse para o desenvolvimento de aplicações em medicina. [14,38,76]
Capítulo II
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Objetivos
Preparação de nanocompósitos de ouro e carbono para
desenvolvimento de sensores electroanalíticos
19 1. Objetivos gerais
Os objetivos gerais deste trabalho centram-se no desenvolvimento de uma nova metodologia de preparação de AuNPs usando um nanomaterial hidrofílico de carbono como agente redutor e imobilizador, tendo em vista a sua aplicação em sensores eletroanalíticos.
2. Objetivos específicos
1. Estabelecer um método de síntese de AuNPs monodispersas utilizando um nanomaterial de carbono gerado electroquimicamente (EHC) como agente redutor e como substrato de imobilização.
2. Estabelecer uma metodologia de modificação química de um elétrodo de carbono vítreo (GCE) com as AuNPs sintetizadas.
3. Caracterizar, por métodos voltamétricos, a estabilidade química das AuNPs imobilizadas em meio ácido e básico.
4. Verificar o efeito dos parâmetros de síntese (razão HAuCl4/EHC) na área eletroquímica
ativa e na massa de ouro imobilizado.
5. Investigar a viabilidade da utilização de elétrodos quimicamente modificados com AuNPs na construção de biossensores, nomeadamente, de aptassensores com capacidade de deteção de osteopontina.
6. Investigar a viabilidade de utilizar elétrodos quimicamente modificados com AuNPs na construção de sensores químicos de peróxido de hidrogénio e de oxigénio.
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Capítulo III
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Parte experimental
Preparação de nanocompósitos de ouro e carbono para
desenvolvimento de sensores electroanalíticos
23
1. Síntese de nanocompósitos de ouro e carbono 1.1. Síntese do nanomaterial hidrofílico de carbono
A síntese do nanomaterial hidrofílico de carbono (EHC) foi realizada segundo o descrito por Veloso et al. (2017). Utilizou-se uma célula eletroquímica de três elétrodos estando os compartimentos anódico e catódico divididos por uma fina camada de cerâmica porosa. Os elétrodos foram polarizados sob controlo galvanostático (I = 60 mA) por um potenciostato Autolab PGSTAT 100. Foram usados como elétrodo de trabalho (ânodo) e contra-elétrodo (cátodo) varetas de grafite (99,999%, Goodfellow) com 10,0 mm de diâmetro e 2,0 cm de comprimento com uma distância de 15 cm entre elas. Utilizou-se um elétrodo saturado de calomelanos como referência. Foi usada uma solução de tampão fosfato 0,03 M (pH = 7) como eletrólito. A fim de diminuir a concentração de azoto dissolvido, foi borbulhado árgon na solução eletrolítica durante 15 minutos e foi mantido um fluxo suave sobre a solução eletrolítica durante o ensaio eletroquímico. Após 1 hora de polarização, foram recolhidas amostras das soluções presentes no compartimento anódico e catódico e armazenadas em frascos de vidro escuro. Nos passos seguintes do procedimento experimental foi utilizada a solução retirada do compartimento anódico que tipicamente contém 900 a 1200 mg/L de nanomaterial hidrofílico de carbono, com desvio padrão máximo de 25 mg/L. [79]
1.2. Preparação de nanocompósitos de ouro e carbono
De modo a avaliar o impacto da composição das soluções nas propriedades físicas e eletroquímicas dos nanocompósitos, foram preparadas várias soluções contendo diferentes volumes de uma solução de HAuCl4 28,0 mM (5,8 a 20,7 µl) preparada a partir do reagente
HAuCl4.3H2O, (Sigma-Aldrich, 99.995%) adicionada a 1 ml de suspensão de nanomaterial
hidrofílico de carbono (EHC) recém-sintetizado. Após a adição de solução de HAuCl4, as
misturas foram homogeneizadas por agitação durante 10 segundos, sendo depois mantidas à temperatura ambiente durante 1 hora antes de serem devidamente rotuladas e guardadas a 4°C. As soluções coloidais e respetivos nanocompósitos foram denominados EHC@AuNPs ou como EHC@AuNPs-X onde EHC é acrónimo de Electrogenerated Hydrophylic Carbon e X corresponde à designação atribuída a uma solução coloidal contendo uma razão HAuCl4/EHC
específica. A Tabela 2 sumaria os volumes de soluções de HAuCl4 28 mM e EHC utilizados,
assim como as respetivas quantidades em número de equivalentes e razão HAuCl4/EHC. No
24
conversão baseia-se na semelhança entre o comportamento eletroquímico do EHC e do ácido ascórbico, designadamente na proximidade dos respetivos potenciais de pico (Ep) de oxidação. A opção de expressar a quantidade de EHC em equivalentes, em vez de moles, resulta do facto de não se conhecer a massa molar de EHC. Este valor sofre variações ligeiras em virtude de condições experimentais que não é possível controlar (nomeadamente características intrínsecas aos elétrodos de grafite). No caso do HAuCl4, o número de equivalentes foi
calculado com base no número de moles e na suposição de serem transferidos 3e-/mol de
HAuCl4.
Tabela 2- Condições de síntese dos nanocompósitos EHC@AuNPs.
Solução
Volume 28 mM HAuCl4
(µL)
Quantidade de HAuCl4 Concentração
de EHC HAuCl4/
EHC
(µmol) (µeq) (µeq/mL)
M 6 0,162 0,054 0,280 0,19
L 8 0,216 0,071 0,280 0,25
U 12 0,347 0,116 0,245 0,47
V 17 0,462 0,154 0,245 0,63
Q 21 0,580 0,193 0,295 0,65
1.3. Caracterização ótica, química e estrutural dos nanocompósitos
Os metais nobres apresentam características químicas, elétricas, magnéticas e óticas de interesse que são intrinsecamente relacionadas com seu tamanho e se revelam importantes em inúmeras aplicações tecnológicas.[80] Uma característica das AuNPs é a ressonância plasmática de superfície que depende das suas dimensões e que é percetível num pico de absorbância entre os 520 e os 580 nm. Para partículas de dimensões muito reduzidas, este pico é atenuado devido à limitação das trajetórias médias dos eletrões. Este efeito permite inferir sobre o diâmetro das NPs através da análise dos picos de absorbância característicos verificando-se, na literatura, uma correlação entre o diâmetro das AuNPs e o comprimento de onda do pico de absorbância.
A técnica em questão permite efetuar uma avaliação preliminar do diâmetro, geometria e dispersão das AuNPs sem recorrer a métodos mais complexos e morosos, nomeadamente a dispersão dinâmica de luz (DLS) e a microscopia eletrónica de transmissão (TEM).
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Traçaram-se os espectros de absorvância num espectrofotómetro LLG-uniSPEC 2 UV/VIS-Spectrometer num intervalo de comprimentos de onda entre os 300 e os 800 nm.
As análises por TEM foram efetuadas na unidade de microscopia eletrónica do CACTI da Universidade de Vigo. Começou-se por imobilizar o material sobre grelhas de Formvar através da imersão destas nas soluções EHC@AuNPs. Após a análise por TEM, parte das grelhas foram imersas em água ultrapura e novamente analisadas. Posteriormente, foram também analisadas por microscopia eletrónica de transmissão de alta resolução (HRTEM) .
As imagens de TEM foram obtidas num dispositivo Jeol JEM 1010 com uma aceleração de feixe de 100 kV e foram analisadas estatisticamente recorrendo ao software Image-J para obtenção do número de partículas e respetiva dimensão. A partir do tratamento estatístico destes dados, foram elaborados histogramas representativos das dimensões das AuNPs. A análise por HRTEM foi efetuada num dispositivo JEOL 2010F com feixe eletrónico de 200 kV, equipado com EDS Oxford INCA X-Sight para obtenção automática do respetivo espectro.
A obtenção das dimensões das AuNPs por DLS e do respetivo potencial Zeta, foi levada a cabo num dispositivo Litesizer™ 500 (Anton Paar) caracterizado por operar com um feixe LASER com comprimento de onda fixo de 658 nm.
2. Caracterização eletroquímica
2.1. Fundamentos das técnicas de voltametria
Os métodos eletroanalíticos têm por base o recurso a propriedades elétricas dos materiais que podem ser medidas aquando da interação físico-química destes com uma solução eletrolítica que contém uma espécie química com interesse do ponto de vista analítico. Através da criação de perturbações devidamente controladas, nomeadamente na diferença de potencial entre elétrodos, é possível avaliar e descrever o comportamento eletroquímico do material em estudo relacionando-o com parâmetros químicos inerentes ao mesmo. Em voltametria mede-se a intensidade de corrente gerada, entre o elétrodo de trabalho e o elétrodo auxiliar (ou contra elétrodo), quando é aplicada uma diferença de potencial entre o elétrodo de trabalho e o elétrodo de referência, a qual é varrida linearmente entre dois limites de potencial. O varrimento de potencial inicia-se num valor onde não se espera nenhuma reação faradaica (normalmente corresponde ao valor do potencial de circuito aberto), seguido de variação no sentido catódico ou anódico, consoante se pretenda estudar reações de redução ou oxidação, respetivamente. Após atingido um dos limites de potencial, o varrimento passa a correr no sentido contrário, daí
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a designação de voltametria cíclica. Quando não há inversão do varrimento de potencial a técnica designa-se por voltametria linear. [81]
De um modo geral, recorre-se a uma célula eletroquímica equipada com três elétrodos (elétrodo de trabalho (WE), elétrodo de referência (RE) e contra-elétrodo (CE)), esquematizada na Figura 1.
Figura 1- Representação esquemática da célula eletroquímica e respetiva ligação ao potencióstato. Abreviaturas: WE (Elétrodo de trabalho), RE. (Elétrodo de Referência), CE (Contra elétrodo) e N2 (Entrada de azoto).
Quando o objeto de estudo se encontra na solução eletrolítica (p.e. quando se pretende quantificar uma dada espécie em solução), o elétrodo de trabalho utilizado é usualmente um material inerte (p.e carbono vítreo). Contudo, o elétrodo de trabalho também poderá ser um material não convencional (p.e. liga metálica), ou um elétrodo inerte modificado quando o objeto de estudo é o próprio material de elétrodo ou o material que se encontra imobilizado no elétrodo (p.e. quando se pretende aumentar a área superficial do elétrodo ou catalisar uma dada reação). [82] Outra possibilidade é o objeto de estudo se encontrar na solução eletrolítica, em que se recorre a elétrodos modificados para tornar a análise mais seletiva e sensível.
No desenvolvimento de sensores eletroquímicos, recorre-se geralmente a elétrodos inertes modificados, sendo o material de natureza biológica, orgânica ou inorgânica, imobilizado na superfície do elétrodo.
