Efeito do ácido alfa-lipóico sobre biomarcadores de estresse oxidativo, inflamação e fatores de risco cardiovascular em hipertensos

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS. ALYNE DA SILVA PORTELA. EFEITO DO ÁCIDO ALFA-LIPÓICO SOBRE BIOMARCADORES DE ESTRESSE OXIDATIVO, INFLAMAÇÃO E FATORES DE RISCO CARDIOVASCULAR EM HIPERTENSOS. NATAL – RN 2013.

(2) ALYNE DA SILVA PORTELA. EFEITO DO ÁCIDO ALFA-LIPÓICO SOBRE BIOMARCADORES DE ESTRESSE OXIDATIVO, INFLAMAÇÃO E FATORES DE RISCO CARDIOVASCULAR EM HIPERTENSOS. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica de Medicamentos das UFPB/UFC/UFRN/UFRPE como requisito para a obtenção do título de Doutor em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica de Medicamentos, área de concentração Inovação Tecnológica de Medicamentos. Orientadora: Profª Drª Maria das Graças Almeida Co-orientadora: Profª Drª Mônica Oliveira da Silva Simões. NATAL – RN 2013.

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(4) ALYNE DA SILVA PORTELA. EFEITO DO ÁCIDO ALFA-LIPÓICO SOBRE BIOMARCADORES DE ESTRESSE OXIDATIVO, INFLAMAÇÃO E FATORES DE RISCO CARDIOVASCULAR EM HIPERTENSOS. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica de Medicamentos das UFRN/UFPB/UFC/UFRPE como requisito para a obtenção do título de Doutor em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica de Medicamentos, área de concentração Inovação Tecnológica de Medicamentos. Aprovado em: 01/07/2013.

(5) A uma despedida e a uma benção ao longo do doutorado: A minha avó, Adelaide e a minha filha, Mariana..

(6) AGRADECIMENTOS. A Deus, que me proporcionou força e determinação para superar todos os obstáculos encontrados ao longo do doutorado. Aos meus pais, Nivalcy Portela e Maria das Graças Silva Portela, pelo apoio e incentivo aos estudos desde a infância. Também aos demais familiares que sempre apoiaram meus objetivos. Ao meu marido, Prof Dr Asdrúbal Nóbrega Montenegro Neto, que compartilhou todas as dificuldades e superações, encorajando-me a todo instante. A minha orientadora, Profª Drª Maria das Graças Almeida, por ter me recebido gentilmente em seu grupo, pelo apoio e por todos os ensinamentos transmitidos. A minha co-orientadora, Profª Drª Mônica Oliveira da Silva Simões, pelo incentivo e dedicação para a concretização deste trabalho. Ao Programa de Desenvolvimento e Inovação Tecnológica de Medicamentos, coordenadores, professores e colegas de turma. As instituições de ensino, pesquisa e/ou saúde que possibilitaram a realização desse estudo. Primeiramente, a Universidade Estadual da Paraíba (UEPB), pelo incentivo financeiro, através do Programa de Incentivo à Pós-Graduação e Pesquisa (PROPESQ), como também pela disponibilidade de seus laboratórios e serviços: Laboratório de Avaliação e Desenvolvimento de Biomateriais (CERTBIO), Laboratório de Desenvolvimento de Medicamentos, Laboratório de Pesquisa em Bioquímica Clínica, e Laboratório de Análises Clínicas. Ao Hospital Universitário Alcides Carneiro, da Universidade Federal de Campina Grande. A Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em especial ao Laboratório Multidisciplinar. (LABMULTI).. Ao. Grupo. de. Atenção. Farmacêutica. da. UEPB. (PROTEAFAR) e as professoras Maria do Socorro R. de Queiroz e Cinthya Maria Pereira. A médica cardiologista, Ana Cláudia Andrade Lucena, que de forma voluntária e dedicada atendeu aos pacientes do estudo clínico. E a enfermeira, Ivete Brito, pela disponibilidade ofertada e acompanhamento dos pacientes. A Profª Drª Ana Paula Barreto Gomes e a Profª Drª Ana Cláudia Dantas de Medeiros pelas contribuições neste trabalho. Ao mestrando Paulo César Dantas da Silva pelo empenho e colaboração ao longo da realização de todo o estudo. E aos demais que também colaboram neste trabalho: Gabriel Araújo, Lidiane Correia, Renata Alencar, João Paulo Malheiros, Christiane Cardoso, Danielle Félix, Simone Ângela, Ayana Cartaxo, e Guilherme Lins..

(7) “Entre o desejo e o alcance, apenas dois moradores: o esforço e a determinação”. Lavínia Lins.

(8) RESUMO. O ácido alfa-lipóico (AAL) é um potente antioxidante, com favoráveis efeitos antiinflamatórios, metabólicos e endoteliais, assim vem sendo intensamente investigado no combate aos fatores de risco cardiovascular. O estudo teve como objetivo avaliar o efeito da suplementação oral do AAL sobre biomarcadores de estresse oxidativo, inflamação e fatores de risco cardiovascular em portadores de hipertensão. Trata-se de um estudo clínico randomizado, duplo-cego e controlado com placebo, no qual a intervenção foi avaliada prospectivamente, comparando os resultados nos dois grupos. A amostra foi constituída por 64 indivíduos hipertensos que foram distribuídos aleatoriamente em grupo AAL (n=32), que recebeu 600 mg/dia de AAL por doze semanas e grupo controle (n=32), que recebeu o placebo pelo mesmo período. Foram avaliados antes e depois da intervenção: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRAT), conteúdo da glutationa reduzida (GSH); atividades enzimáticas da glutationa peroxidase (GPx) e da superóxido dismustase; proteína C reativa (PCR-us); triglicerídeos, colesterol total e frações; glicemia de jejum; e indicadores antropométricos. Observou-se uma redução estatisticamente significativa (p < 0.05) nas concentrações séricas de colesterol total, lipoproteína de muita baixa densidade (VLDL), lipoproteína de alta densidade (HDL), triglicerídeos e glicose. No grupo AAL Também houveram reduções do peso corporal e das circunferências abdominais, da cintura e do quadril. Ainda, observou-se um aumento estatisticamente significativo (p < 0.05) do conteudo de glutationa reduzida (GSH) e da atividade da glutationa peroxidase (GPx) no grupo que recebeu o AAL. A administração oral do AAL mostrou-se como um valioso adjuvante terapêutico, que pode contribuir com a diminuição dos danos causados pelo estresse oxidativo e outros fatores de risco cardiovascular que estão associados com o processo aterosclerótico. Palavras-chave: Ácido alfa-lipóico. Estresse Oxidativo. Antioxidantes. Hipertensão..

(9) ABSTRACT. Alpha-lipoic acid (ALA) is a potent antioxidant with favourable anti-inflammatory, metabolic and endothelial effects, and has been widely investigated due to its potential against cardiovascular risk factors. This study aimed to evaluate the effect of oral ALA supplementation on oxidative stress biomarkers, inflammation and cardiovascular risk factors in patients with hypertension. This is a double-blind placebo-controlled randomized clinical trial, where the intervention was evaluated prospectively comparing results in both groups. The sample consisted of 64 hypertensive patients who were randomly distributed into ALA group (n = 32), receiving 600 mg / day ALA for twelve weeks and control group (n = 32), receiving placebo for the same period. The following parameters were evaluated before and after intervention: lipid peroxidation, content of reduced glutathione (GSH), enzymatic activities of glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismustase, ultrasensitive Creactive protein (hs-CRP), triglycerides, total cholesterol and fractions, fasting glucose and anthropometric indicators. There was a statistically significant reduction (p <0.05) in serum concentrations of total cholesterol, very low density lipoprotein (VLDL), high density lipoprotein (HDL), triglycerides and blood glucose. There was a reduction in body weight and waist, abdominal and hip circumferences in the group that received ALA. In addition, there was a statistically significant increase (p <0.05) in the contents of reduced glutathione (GSH) and glutathione peroxidase (GPx) in the group receiving ALA. Oral administration of ALA appears to be a valuable adjuvant therapy, which may contribute to decrease the damage caused by oxidative stress and other risk factors associated with the atherosclerotic process.. Keywords: Alpha-lipoic acid. Oxidative Stress. Antioxidants. Hypertension..

(10) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Figura 1 - Curvas termogravimetricas da matéria-prima (AAL) nas razões de aquecimento de 10, 20, 40, 60 e 80 ºCmin-1............................................... 31. Figura 2 - Curvas termogravimetricas da formulação de AAL nas razões de aquecimento de 10, 20, 40, 60 e 80 ºCmin-1................................................. 32. Figura 3 - Curvas de pressão de vapor da matéria-prima (AAL) nas razões de aquecimento de AAL de 10, 20, 40, 60 e 80 ºCmin-1................................. 32. Figura 4 - Curvas de pressão de vapor da formulação de AAL nas razões de aquecimento de AAL de 10, 20, 40, 60 e 80 ºCmin1………..................….. 33.

(11) LISTA DE TABELAS. Tabela 1 -. Características físicas, hábitos de vida e medicamentos utilizados pelos participantes do estudo............................................................................... Tabela 2 -. Análise comparativa intragrupo e intergrupo de marcadores do perfil lipídico, da glicemia e da PCR-us antes e após a suplementação.............. Tabela 3 -. Análise. comparativa. intragrupo. e. intergrupo. de. Tabela 6 -. 36. indicadores. antropométricos antes e após a suplementação......................................... Tabela 5 -. 35. Análise comparativa intragrupo e intergrupo de biomarcadores de estresse oxidativo antes e após a suplementação …………………....….. Tabela 4 -. 34. 37. Análise comparativa intragrupo e intergrupo de marcadores das funções hepática e renal antes e após a suplementação........................................... 38. Eventos apresentados pelos participantes durante a intervenção............... 39.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. AAL. Ácido alfa-lipóico. ALT. Alanina aminostraferase. AST. Aspartato aminotransferase. ATP. Adenosina trifosfato. CAT. Catalase. CK. Creatina quinase. CoQ10. Coenzima Q10. CoQH2. Coenzima Q reduzida. CT. Colesterol total. DCVs. Doenças cardiovasculares. DHLA. Ácido diidrolipóico. ERO. Espécies reativas de oxigênio. GGT. Gama-glutaril-transferase. GPx. Glutationa peroxidase. GSH. Glutationa reduzida. HAS. Hipertensão arterial sistêmica. HDL. Lipoproteína de alta densidade. HIPERDIA. Plano de Reorganização da Atenção à Hipertensão Arterial e ao Diabetes Mellitus. HMG-CoA. 3-hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A redutase. LDL. Lipoproteína de baixa densidade. NADH. Dinucleotídeo de nicotinamida adenina. NADPH. Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato. NO. Óxido Nítrico. OMS. Organização Mundial de Saúde. ONOO-. Peroxinitrito. ONU. Organizações das Nações Unidas. PCR. Proteína C Reativa. PCR-us. Proteína C Reativa ultrassensível. SOD. Superóxido dismutase.

(13) SRAT. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. SUS. Sistema Único de Saúde. TG. Triglicerídeos. VIGITEL. Sistema de Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico. VLDL. Lipoproteína de muita baixa densidade.

(14) SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 13. 2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................................... 15. 2.1 O estresse oxidativo e sua relação com as DCVs............................................... 15. 2.2 A inflamação na aterogênese............................................................................... 17. 2.3 As estatinas na prevenção e tratamento das DCVs........................................... 18. 2.4 O AAL: uma alternativa...................................................................................... 19. 2.5 Propriedades terapêuticas do AAL..................................................................... 21. 2.6 O AAL em formulações farmacêuticas............................................................... 22. 3 OBJETIVOS……………………………………………………………………….... 24. 3.1 Objetivo geral………………………………...………………………..………... 24. 3.2 Objetivos específicos ……………………………………………...…………..... 24. 4 MATÉRIAS E MÉTODOS……………………….……………………………..…. 25. 4.1 Delineamento do estudo........................................................................................ 25. 4.2 Amostra…………….............................................................................................. 25. 4.2.1 Critérios de inclusão e exclusão…….................………………………….. 25. 4.3 Composição dos grupos........................................................................................ 26. 4.3.1 Acompanhamento dos pacientes e medidas de adesão................................ 26. 4.4 Avaliação da matéria-prima e da formulação de AAL adquirida.................... 26. 4.4.1 Materiais........................................................................................................ 27. 4.4.2 Condições instrumentais e analíticas........................................................... 27. 4.5 Avaliação laboratorial........................................................................................... 27. 4.5.1 Biomarcadores de estresse oxidativo............................................................ 27. 4.5.1.1 Determinação da produção de SRAT................................................. 28. 4.5.1.2 Determinação do conteúdo de GSH em sangue total........................ 28. 4.5.1.3 Determinação da atividade da GPx.................................................... 28. 4.5.1.4 Determinação da atividade da SOD................................................... 28. 4.5.2 Marcador de inflamação subclínica............................................................. 29.

(15) 4.5.3 Avaliação do perfil lipídico e da glicemia..................................................... 29. 4.5.4 Avaliação das funções renal e hepática........................................................ 29. 4.6 Avaliação antropométrica.................................................................................... 29. 4.7 Análises dos dados................................................................................................. 30. 4.8 Ética na pesquisa................................................................................................... 30. 5 RESULTADOS……………………………………………………………………. 31. 5.1 Avaliação da matéria-prima e da formulação do AAL..................................... 31. 5.2 Caracterização da amostra................................................................................... 33. 5. 3 Perfil lipídico, glicemia e PCR-us....................................................................... 34. 5.4 Biomarcadores de estresse oxidativo................................................................... 36. 5.5 Indicadores antropométricos............................................................................... 36. 5.6 Funções renais e hepáticas.................................................................................... 37. 5.7 Principais problemas relatados durante a intervenção..................................... 38. 6 DISCUSSÃO………………………………………………………………………... 40. 7 CONCLUSÃO………………………………………………………………………. 45. REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 46. ARTIGOS PRODUZIDOS......................................................................................... 55. ARTIGO 1 - Estatinas x ácido lipóico na prevenção e tratamento das doenças cardiovasculares....................................................................................... 56. ARTIGO 2- Vapor pressure curve determination of α-lipoic acid raw material and capsules by dynamic thermogravimetric method……………...... 74. ARTIGO 3 - Effect of alpha-lipoic acid on oxidative stress biomarkers, inflammation and cardiovascular risk factors in patients with hypertension... 78. APÊNDICES……………………………………………………………………….... 98. Apêndice A – Ficha clínica de triagem................................................................... 99. Apêndice B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido............................... 101. Apêndice C – Certificado de aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa............. 102.

(16) 13. 1 INTRODUÇÃO. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), a Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS) atinge um bilhão de pessoas e contribui para 9,4 milhões de mortes a cada ano por doenças cardiovasculares (DVCs) no mundo (ONU, 2013). No Brasil, segundo dados do Sistema de Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico (VIGITEL), que aponta a frequência de indivíduos que referem diagnóstico médico prévio de HAS, 22,7% da população com idade igual ou acima de 18 anos é hipertensa (BRASIL, 2012a). A elevação da pressão arterial representa o principal fator de risco para as DCVs, incluindo as complicações agudas da aterosclerose (FAGARD, 2012). Se não tratada, a HAS pode aumentar o risco de acidente vascular encefálico, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca, doença arterial periférica, insuficiência renal crônica e outras complicações (ROBITAILLE et al., 2012). A HAS é uma doença poligênica, complexa e multifatorial, tendo diversos mecanismos implicados em sua fisiopatologia, entre eles a ativação do sistema nervoso simpático, a regulação positiva do sistema renina-angiotensina-aldosterona, a alteração na sinalização do receptor acoplado à proteína G, e a inflamação (MONTEZANO; TOUYZ, 2012). Embora, múltiplos fatores provavelmente contribuam para o desenvolvimento da HAS, a patogênese e a evolução da doença estão associadas, pelo menos em parte, a um estado de estresse oxidativo (KIZHAKEKUTTU; WIDLANSKY, 2010). Muitas evidências indicam que o papel crucial do estresse oxidativo na patogênese da HAS é devido aos seus efeitos sobre a vasculatura, que levam a disfunção endotelial com consequente desenvolvimento do processo aterosclerótico (HIROOKA et al., 2010). A oxidação das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e a inflamação também são fatores característicos da aterosclerose e que tem ligação com o estresse oxidativo, promovendo a formação e a instabilidade da placa aterosclerótica (MORRIS et al., 2012). Da mesma forma, outras condições patológicas como resistência a insulina e obesidade, que são consideradas fatores de risco cardiovasculares adicionais em hipertensos, também possuem envolvimento com o estresse oxidativo (STYSKAL et., 2012). Existem medicamentos disponíveis comercialmente, tais como as estatinas, que devido seus efeitos pleiotrópicos cada vez mais são utilizadas na prevenção primária e secundária das.

(17) 14. DCVs. Entretanto, o elevado custo das estatinas associado aos efeitos adversos provocados pelo seu uso, condicionam a busca de alternativas terapêuticas (SENA et al., 2007). Sabe-se que substâncias antioxidantes ou que funcionam como co-fatores para elementos antioxidantes são capazes de reduzir o estresse oxidativo e a inflamação, podendo atenuar o processo aterogênico (MONTERA, 2007). Neste contexto, o ácido alfa-lipóico (AAL) é um antioxidante, que apresenta efeitos antiinflamatórios, metabólicos e endoteliais (TARDIF; RHÉAUME et al, 2008), tendo papel potencial na prevenção e tratamento das DCVs (SCHIFFRIN, 2010). Desse modo, investigações sobre o AAL nas DCVs estão sendo realizadas, contudo, a grande maioria dos ensaios é em animais, sendo escassos em humanos, principalmente os estudos clínicos controlados. Além disso, as pesquisas realizadas discutem os fatores envolvidos nas DCVs de forma pontual, sem avaliar conjuntamente o efeito do AAL sobre os diferentes componentes envolvidos no processo da aterogênse, sobretudo na população hipertensa. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da suplementação oral do AAL sobre biomarcadores de estresse oxidativo, inflamação e fatores de risco cardiovascular em hipertensos..

(18) 15. 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 O estresse oxidativo e sua relação com as DCVs. As DCVs constituem a causa mais comum de morbidade e a principal causa de mortalidade em países desenvolvidos e em desenvolvimento (RIBEIRO; COSTA; RIBEIRO, 2012). Entre seus principais subgrupos, estão as doenças cerebrovasculares e as doenças isquêmicas do coração que totalizaram mais de 60% dos óbitos por DCVs no mundo (MULLER et al., 2012). No Brasil, os gastos com internações pelo Sistema Único de Saúde (SUS) totalizaram 1,2 milhões de reais em 2009 e, com o envelhecimento da população e mudança dos hábitos de vida, a prevalência e importância das DCVs tende a aumentar nos próximos anos (BRASIL, 2012b). Os principais fatores de risco das DCVs estão bem estabelecidos, sendo eles: a HAS, a hiperlipidemia, o tabagismo, o sedentarismo, a obesidade, o diabetes mellitus. Todos esses fatores em conjunto ou isoladamente são preponderantes na gênese e progressão da aterosclerose (MONTENEGRO NETO et al., 2008). Diferentemente do antigo conceito de que seria uma doença causada apenas pelo acúmulo progressivo de lipídeos na parede arterial, a aterosclerose é uma doença inflamatória crônica de origem multifatorial e que tem na disfunção endotelial o mecanismo fisiopatológico inicial (TELES et al., 2007; SPOSITO et al, 2007), tendo o estresse oxidativo participação decisiva neste processo (MONTEZANO; TOUYZ, 2011). O estresse oxidativo é definido como uma produção excessiva e remoção insuficiente de moléculas altamente reativas como as Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) (MORRIS et al., 2012). As ERO são átomos, íons ou moléculas que contêm oxigênio com um elétron não pareado em sua órbita externa, caracterizadas por grande instabilidade e por isso elevada reatividade, tendendo a ligar o elétron não pareado com outros presentes em estruturas próximas de sua formação, comportando se como receptores (oxidantes) ou como doadores (redutores) de elétrons. Elas compõem dois grandes grupos: os radicalares derivados de O2, como os radicais hidroxila (HO•), superóxido (O2•−), peroxila (ROO•) e alcoxila (RO•); e os não-radicalares, a exemplo do peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido hipocloroso (HClO) (CIRCU; AW, 2010). As ERO são produzidas por todos os tipos de células vasculares, incluindo, células endoteliais, espumosas e adventícias (PARAVICINI; TOUYZ, 2008). Entre as importantes.

(19) 16. fontes de ERO na doença vascular e na HAS, estão: mitocôndrias, xantina oxidase, óxido nítrico sintase desacoplada (eNOS), NAD(P)H-oxidase e cicloxigenases (KIZHAKEKUTTU; WIDLANSKY, 2010). Para combater as ERO, o organismo utiliza os antioxidantes produzidos pelo corpo, os quais agem enzimaticamente, a exemplo do superóxido desmutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) ou, não enzimaticamente a exemplo da glutationa reduzida (GSH), transferrina, ferritina, ácido diidrolipóico (DHLA) e Coenzima Q reduzida (CoQH2). Outros antioxidantes podem ser adquiridos por meio da dieta como o α-tocoferol (vitamina E), β-caroteno (vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C), e compostos fenólicos (flavonóides e poliflavonóides) (STROBEL et al., 2011). Embora o sistema de defesa antioxidante reduza os riscos de lesões oxidativas em estados patológicos como na HAS, a superprodução de ERO sobrecarrega a capacidade antioxidante celular, resultando em estresse oxidativo crônico (GROSSMAN, 2008). Por exemplo, há estudos apontando que indivíduos hipertensos quando comparados com normotensos apresentam redução na atividade das enzimas antioxidantes e aumento da agressão celular (AMIRKHIZI et al., 2010; VASCONCELOS et al., 2011). Os lipídeos são mais susceptíveis aos danos provocados pelas ERO (RODRÍGUEZ et al., 2007). Tal condição acelera o processo de peroxidação de ácidos graxos insaturados dos fosfolipídios das membranas celulares, resultando na perda de sua integridade e formação de produtos citotóxicos (como o malonaldeído), que pode culminar em morte celular (HALLIWELL, 2006). Além disso, a presença de ERO provoca a oxidação da LDL, promovendo alteração na absorção celular do receptor destas partículas, especialmente nas células da íntima dos vasos, monócitos, células musculares lisas e macrófagos de forma descontrolada. Isto gera o acúmulo de lipídios e formação de células espumosas, fase inicial de formação da placa aterosclerótica. Dentro desta placa, ocorre o aumento do estresse oxidativo, que por sua vez evoca eventos inflamatórios que além de gerar mais ERO, dão continuidade ao ciclo de danos ao endotélio (FORGIONE; LOSCALZO, 2000). O aumento na geração e /ou inativação prejudicada de ERO também leva a redução da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO), principal substância antiaterogênica. Essa inativação ocorre porque o NO reage facilmente com o radical superóxido produzindo o peroxinitrito (ONOO-). A reação do peroxinitrito com biomoléculas diminui suas funções, causando toxicidade e alterando vias de sinalização (TSIKAS, 2005). Isto se torna um problema, uma vez que o NO promove o relaxamento dos vasos sanguíneos, evitando a.

(20) 17. agregação e a aderência plaquetária, limita a oxidação das LDL, inibe a proliferação das células musculares lisas vasculares e diminui a expressão de genes pró-inflamatórios, todos fatores envolvidos no processo aterogênico (FÖRSTERMANN, 2010). 2.2 A inflamação na aterogênese. Na segunda metade do século XX, a hipótese criada por Virshow propunha que as lesões da aterosclerose seriam decorrentes da “insudação” de plasma para a camada íntima das artérias, com acúmulo de lipídeos e proliferação celular. Enquanto a teoria de Rokytansky, também conhecida como teoria da “incrustação”, propunha que as lesões ateroscleróticas decorriam de pequenos trombos, que ao se organizarem, incorporavam-se e espessavam a camada íntima (METHE; WEIS, 2007). A tendência atual é agrupar essas duas teorias ao processo inflamatório (VERMA; GUPTA; RIDKER, 2012). O mecanismo inflamatório tem uma função importante na mediação de todas as fases da aterosclerose, desde o recrutamento inicial de leucócitos na parede arterial até a ruptura de uma placa instável (BLACK et al., 2004). Por sua vez, a superprodução de ERO aumenta a expressão gênica de agentes pró-inflamatórios que intensificam o grau de inflamação tanto local quanto sistêmica (MELO et al., 2007). A proteína C reativa (PCR) é um importante marcador inflamatório, cujos valores e possui associação com a aterosclerose (GUPTA, et al. 2012). Valores elevados da PCR estão associados a eventos coronários, mesmo na ausência se fatores de risco cardiovascular (CORRADO et al., 2010). A PCR é produzida predominantemente no fígado, em resposta a interleucina (IL)-6, uma das várias citocinas liberadas pelos leucócitos ativados e células musculares lisas em placas ateroscleróticas (GUPTA, et al. 2012). Além do mais, há evidências de efeitos próinflamatórios e pró-aterotrombóticos diretos da PCR sobre células endoteliais e musculares lisas dos vasos. Entre estes efeitos estão a ativação local da coagulação, a diminuição da produção de NO e de prostaciclinas, o aumento da expressão de moléculas de adesão pelo endotélio, a produção de quimiotaxia para monócitos/macrófagos e a indução da produção de citocinas por estas células (ZHANG, 2013). Portanto, a PCR tem sido mostrada como um forte preditor de risco cardiovascular independente, mesmo entre indivíduos aparentemente saudáveis (MINAME et al., 2007). Quando suas concentrações séricas apresentam valores igual ou superior a 10 mg/L, há indicação que a inflamação encontra-se na fase aguda. Entretanto quando quantificada,.

(21) 18. através do método ultrassensível (PCR-us), pequenas elevações nos seus valores séricos, indicam inflamação subclínica, característica específica de doença aterosclerótica (MONTENEGRO NETO et al., 2011). 2.3 As estatinas na prevenção e tratamento das DCVs. As estatinas são a classe de medicamentos mais vendida nos Estados Unidos e tem a atorvastatina como a subclasse mais prescrita em todo o mundo (GOLOMB; EVANS, 2008). As estatinas são inibidores estruturais da 3-hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A redutase (HMG-CoA), em uma fase inicial da via do mevalonato, com consequente redução na biossíntese do colesterol (KATSIKI et al., 2010). Entretanto, os efeitos benéficos cardiovasculares das estatinas vão além da redução do colesterol, uma vez que também apresentam efeitos pleiotrópicos, entre eles: melhora da função endotelial, aumento da estabilidade de placa aterosclerótica, diminuição do estresse oxidativo e da inflamação, e inibição da resposta trombogênica. Muitos destes efeitos parecem ser mediados pela inibição dos isoprenóides, que servem como ligantes lipídicos de moléculas sinalizadoras intracelulares (ZHOU; LIAO, 2010). Também as estatinas estão sendo indicadas para pacientes que, mesmo não apresentando valores lipídicos alterados, apresentam elevação plasmática da PCR (MINAME et al., 2007). Isto se deve as novas descobertas científicas, a partir do estudo Justification for the Use of statins in Primary prevention: an Intervention (JUPITER), no qual foram analisados 17.802 indivíduos tratados com 20 mg de Rosuvastatina. Neste estudo foi observada uma significante redução de eventos cardiovasculares nos sujeitos que apresentavam valores baixos de LDL e ao mesmo tempo valores elevados da PCR. Isto sugere que a terapia com estatinas pode ser eficaz no tratamento de indivíduos que apresentam elevação da PCR, mesmo estando com valores normais de LDL (MORA; KIDKER, 2006). Entretanto, como todos os medicamentos, as estatinas podem desenvolver efeitos adversos, mais comumente envolvendo o sistema muscular, como mialgia, rabdomiólise e mioglobinúria. A explicação lógica para estes efeitos adversos deve-se ao fato desta classe de medicamentos inibir a síntese do colesterol de forma não seletiva, através da via do mevalonato, que é partilhada por outros compostos, incluindo a coenzima Q10 (CoQ10; ubiquinona), levando assim a diminuição, também, deste último, através do bloqueio na produção do farnesil pirofosfato (RUNDEK et al., 2004)..

(22) 19. Assim, tanto o colesterol quanto a CoQ10 são reduzidas com o uso destes medicamentos (CASO et al., 2007). As estatinas podem reduzir os níveis séricos de CoQ10 em até 40%, juntamente com a redução do LDL (KUMAR et al., 2009). A CoQ10 é uma quinona, solúvel em gordura, que está localizada nas porções hidrofóbicas das membranas celulares, sendo o único lipídio que é sintetizado endogenamente por meio da via do mevalonato que apresenta função redox. Sua forma antioxidante, o ubiquinol (CoQH2), produto da redução de CoQ, inibe a iniciação e propagação da peroxidação lipídica, com consequente redução na formação de ERO, impedindo a disfunção endotelial, provavelmente por aumentar a disponibilidade de NO (VASCONCELOS et al., 2007). Portanto, a deficiência da CoQ10, resultante do tratamento com estatinas, pode prejudicar o metabolismo da energia muscular e reduzir as defesas antioxidantes. Vale ressaltar que os cardiopatas já possuem 25% menos CoQ10 na corrente sanguínea quando comparados a não cardiopatas (MARCOFF; THOMPSON, 2007). Os efeitos cardiovasculares da CoQ10 podem ser atribuídos ao seu papel bioenergético, a sua capacidade de antagonizar a oxidação do LDL plasmático, e ao seu efeito na melhoria da função endotelial (LITTARRU; TIANO, 2010). Além disso, a CoQ10 protege contra o estresse oxidativo e regenera as formas ativas do ácido ascórbico (Vitamina C) e do tocoferol (Vitamina E) (MAHONEY; PARISE; TARNOPOLSKY, 2002). Além destes eventos, as estatinas podem ocasionar toxicidade hepática, que se manifesta. na. clínica. de. diferentes. formas,. como. elevação. assintomática. das. aminotransferases, insuficiência hepática aguda, hepatite e colestase. Entretanto, ainda são pouco conhecidos os mecanismos pelos quais as estatinas provocam hepatotoxicidade (COHEN; ANANIA; CHALASANI,et al., 2006). Ainda, segundo a National Lipid Association Statin Safety Assessment Task Force, a terapia com estatinas aumenta a incidência de insuficiência hepática, transplantes de fígado ou morte associada à insuficiência hepática na população em geral (FORTI; DIAMENT, 2008). Desse modo, justifica-se a busca de alternativas que apresentem ação terapêutica similar as estatinas, entretanto, sem apresentar a quantidade e a severidade de seus efeitos adversos.. 2.4 O ácido alfa-lipóico (AAL): uma alternativa O AAL, ou 1,2 ditiolano-3-pentanóico, também conhecido como ácido tióctico, é um.

(23) 20. ácido graxo de 8 carbonos contendo um anel ditiolato que consiste de um heterocíclico de 5 carbonos com átomos de enxofre inseridos entre os carbonos 6 e 8 (BITO, 2011). Bioquimicamente, o AAL é um cofator essencial do complexo multienzimático que catalisa a descarboxilação oxidativa de α-cetoácidos como o piruvato, α-cetoglutarato e α-cetoácidos de cadeia ramificada na mitocôndria tendo um papel essencial no metabolismo energético (SHAY et al., 2009). O AAL é sintetizado naturalmente no organismo, a partir do ácido octanóico, porém também é encontrado naturalmente em baixos níveis em folhas verdes, batata, cevada, germe de trigo e carne vermelha. Em condições normais, uma dieta balanceada atende as demandas fisiológicas de AAL, entretanto, em condições de estresse oxidativo, a ingestão pode ser insuficiente, sendo recomendada a administração de 600 a 1.200 mg/dia por via oral (GONZÁLEZ; MOY; GUZMÁN, 2008). Cremer et al. (2006) avaliaram a toxicidade e carcinogenidade do AAL em ratos suplementados durante 2 anos com doses de 20 a 180 mg/Kg/dia. Mesmo no grupo que ingeriu 180 mg/Kg, a substância não apresentou potencial carcinogênico ou toxicidade em nenhum dos órgãos avaliados, entre eles: coração, fígado, baço, rins, tireóide e cérebro. Em seres humanos, ensaios clínicos foram realizados para avaliar os efeitos adversos do AAL à saúde dos participantes. No estudo Alpha-Lipoic Acid in Diabetic Neuropathy (ALADIN I, II e III) foi utilizado a suplementação de até 2400 mg/dia do AAL e não foram relatados efeitos adversos em comparação ao placebo (ZIEGLER et al., 1995; RELJANOVIC et al., 1999; ZIEGLER et al., 1999). O AAL também foi administrado por via intravenosa em doses de 600 mg/dia em humanos, durante três semanas, sem evidências de efeitos secundários graves (ZIEGLER et al., 1995). As doses orais de 1800 mg do AAL, por 6 meses, também não provocaram efeitos adversos significativos em comparação com placebo (ZIEGLER et al., 1999). Após a ingestão oral, mais de 93% de uma dose de AAL é absorvido pelo intestino delgado; contudo, apenas 20-30% escapa da metabolização hepática.. Uma vez dentro da. célula ele é reduzido em ácido dihidrolipóico (DHLA), sua forma reduzida (GONZÁLEZ; MOY; GUZMÁN, 2008). Os seus metabólicos são excretados facilmente através da urina (SHAY et al., 2009). Ambos, o AAL e o DHLA são moléculas anfipáticas que atuam como antioxidantes, tanto em ambientes hidrofílicos quanto lipofílicos (ATUKEEN et al., 2010), diferentemente de outros antioxidantes mais conhecidos como o ácido ascórbico (vitamina C) e o α-tocoferol (vitamina E), que trabalham exclusivamente. em meios hidrofílico e lipofílico,.

(24) 21. respectivamente (GONZÁLEZ; MOY; GUZMÁN, 2008). 2.5 Propriedades terapêuticas do AAL Tanto a forma oxidada (dissulfeto) quanto de sua forma reduzida (ditiol: ácido diidrolipóico, DHLA) do AAL possuem efeito antioxidante em sistemas biológicos. Tais efeitos devem-se a quelação de metais de transição, a eliminação de ERO e a regeneração de outros antioxidantes endógenos tais como a glutationa reduzida (GSH) e α-tocoferol (GHIBU et al., 2008). Além disso, o AAL tem características muito próprias, em relação a outros antioxidantes, tais como: 1) distribui-se pela mitocôndria; 2) tem um potencial redox muito baixo, sendo por isso capaz de reciclar outros pares redox antioxidantes; e 3) é regenerado por aumentos do dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADH) induzidos pelo aumento da glicemia e por ação dos ácidos graxos plasmáticos não esterificados (via piruvato desidrogenase), estabelecendo uma ligação entre a atividade antioxidante e o grau de aumento do fluxo metabólico (SENA et al., 2007). Estudos em animais e humanos demostram os efeitos benéficos do AAL no combate ao envelhecimento (KAPOOR; DUREJA; CHADHA, 2009) e no controle de doenças que tem o estresse oxidativo envolvido em sua fisiopatologia, como o diabetes mellitus (ANSAR et al., 2011; BUDIN et al., 2009) e as DCVs (YING et al., 2010). Em estudo com animais diabéticos foi observado melhora significativa das atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD) e redução da peroxidação lipídica (WOLLIN; JONES, 2003). Em humanos com obesidade e intolerância à glicose, McNeilly et al. (2011) observaram que a capacidade antioxidante total foi significativamente melhorada, após o tratamento com AAL. Também, há estudos que mostram a ação do AAL sobre o endotélio e marcadores inflamatórios. Em estudo realizado com humanos portadores da síndrome metabólica, a administração do AAL melhorou em 44% a função endotelial e reduziu marcadores próinflamatórios, fatores que estão implicados na patogênese da aterosclerose (SOLA et al., 2005). Em ratos, Zhang et al. (2007) mostraram que a suplementação com AAL inibe a lesão aterosclerótica, por redução do tecido adiposo, da hipertrigliceridemia e por efeito antiinflamatório..

(25) 22. O AAL também mostrou ter efeitos sinérgicos positivos em estudo realizado com coelhos, onde se constatou que o AAL reduziu o LDL e os triglicérideos, potencializando os efeitos hipolipemiante da sinvastatina. No mesmo estudo foi observado o aumento de 25,8% no nível de HDL nos coelhos que usaram a sinvastatina e 26,7% naqueles que usaram o ácido lipóico. Também o ácido lipóico diminuiu em 18,0% os níveis de triglicérides e potencializou o efeito redutor de triglicérides da sinvastatina (AHMADA et al., 2010). Considerando que a administração de AAL pode prevenir complicações promovidas por fatores de riscos cardiovasculares, mostrando-se como um valioso recurso terapêutico para reduzir o dano oxidativo e recuperar o órgão afetado, seja por meio da dieta normal ou associada à suplementação oral, torna-se recomendável sua utilização como adjuvante terapêutico no tratamento de DCVs (GONZÁLEZ; MOY; GUZMÁN, 2008). 2.6 O AAL em formulações farmacêuticas Como o AAL mostra-se uma alternativa terapêutica promissora, cada vez mais é utilizado em formulações de suplementos vitamínicos na forma isolada ou combinado com outros nutrientes. Todavia, a falta de estabilidade química, dificulta a concepção de uma formulação adequada para administração oral (KULKAMP et al., 2009). Por ser uma substância lábil, o AAL se decompõe gradualmente a temperatura ambiente (BITO, 2011), enquanto temperaturas superiores ao seu ponto de fusão (59-62ºC) causam imediata polimerização, tornando o AAL inutilizável e quase insolúvel em todos os solventes (KOFUJI; ISOBE; MURATA, 2009). Assim, muitas formulações orais com o AAL apresentam problemas devido às características da molécula e das formas farmacêuticas (MIGNINI et al., 2012). Outro ponto relacionado às formulações do AAL é que a maioria dos suplementos disponíveis comercialmente está disponível como uma mistura racêmica de ambos os enantiômeros R e S de AAL (R-AAL e S-AAL) (GHIBU et al., 2009). Entretanto, ainda existem questões não esclarecidas quanto à captação preferencial de um isómero em relação ao outro (SINGU; JIALAL, 2008). Evidências científicas sugerem que o enantiômero R seria a forma mais adequada para proporcionar como suplementos orais, no entanto, o S-AAL na mistura racêmica pode evitar a polimerização do R-AAL, e assim, melhorar a biodisponibilidade global (SHAY et al., 2009). Isso se torna relevante, uma vez que os estudos de farmacocinética demonstraram que os seres humanos absorvem aproximadamente 30% a 40% de uma dose oral de AAL.

(26) 23. racêmico, e que após a administração a concentração plasmática máxima é atingida em um período de 1 hora, seguido de rápido declínio. Assim, a concentração plasmática de AAL pode rapidamente diminuir sem atingir uma concentração terapêutica eficaz (KOH et al. 2011). Essas características podem dificultar a observação dos efeitos do AAL em seres humanos. Por este motivo, houve o interesse em avaliar a estabilidade térmica de uma formulação de AAL, na forma de cápsulas, utilizando um método termogravimétrico. Após a análise termogravimétrica, utilizou-se a formulação do AAL avaliada em um estudo clínico aleatorizado, duplo-cego e controlado com placebo. Neste estudo foi avaliado o efeito da suplementação oral do AAL sobre biomarcadores de estresse oxidativo, inflamação e fatores de risco cardiovascular em hipertensos..

(27) 24. 3 OBJETIVOS. 3.1 Objetivo Geral. Avaliar os efeitos da suplementação oral do AAL sobre biomarcadores de estresse oxidativo, inflamação e fatores de risco cardiovascular em hipertensos.. 3.2 Objetivos específicos . Avaliar a estabilidade térmica da formulação de AAL administrada aos pacientes;. . Determinar o efeito do AAL sobre a concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRAT) em hipertensos;. . Verificar a resposta do sistema antioxidante após a suplementação de AAL, por meio da determinação do conteúdo da GSH e da atividade das enzimas antioxidantes SOD e GPx;. . Verificar os efeitos do AAL sobre o perfil lipídico e a glicemia de jejum;. . Averiguar o efeito antiinflamatório do AAL, através da quantificação da PCR-us;. . Avaliar o estado nutricional dos pacientes, por intermédio de parâmetros antropométricos, antes e após o tratamento com AAL;.  Averiguar o efeito do AAL sobre marcadores das funções renal e hepática;  Investigar a ocorrência de efeitos adversos associados ao uso do AAL..

(28) 25. 4 MATERIAS E MÉTODOS. 4.1 Delineamento do estudo. Trata-se de um estudo clínico aleatorizado, duplo-cego e controlado com placebo. A população participante foi distribuída em grupo tratamento, que recebeu a suplementação oral do AAL, e grupo controle, que recebeu o placebo. A intervenção foi avaliada prospectivamente, comparando-se os resultados nos dois grupos.. 4.2 Amostra. Um total de 133 pacientes participantes do Grupo de Atenção Farmacêutica da Universidade Estadual da Paraíba (UEPB), cadastrados no Plano de Reorganização da Atenção à Hipertensão Arterial e ao Diabetes Mellitus (HIPERDIA) do Ministério da Saúde, na unidade do Serviço Municipal de Saúde de Campina Grande – PB, foi inicialmente contatado para participar do estudo. O convite para participação foi feito pessoalmente logo após serem dadas todas as explicações relativas ao projeto. Os pacientes que aceitaram participar do estudo responderam a um formulário (Apêndice A), no qual foram coletadas informações relacionadas às características demográficas e sócio-econômicas (sexo, idade, escolaridade e renda) e hábitos de vida (sedentarismo, etilismo, tabagismo) dos mesmos. Em seguida, os pacientes foram encaminhados para avaliação clínica com uma cardiologista. Além disso, todos os pacientes realizaram eletrocardiograma e, quando necessário, outros exames cardiológicos complementares. Dos 133 pacientes convidados, 65 obedeceram aos critérios de inclusão e exclusão, sendo que destes, apenas um desistiu durante a suplementação, ficando a amostra, ao final do estudo, composta por 64 pacientes.. 4.2.1 Critérios de inclusão e exclusão. Foram incluídos no estudo indivíduos com hipertensão, de ambos os sexos, sem distinção de etnia, com faixa etária igual ou superior a 18 anos. E foram excluídos do estudo: indivíduos com história de angina instável, infarto do miocárdio, acidente vascular encefálico.

(29) 26. ou cirurgia de grande porte nos seis meses, anteriores ao início do estudo; mulheres grávidas no momento do recrutamento ou que engravidassem no decorrer do estudo; fumantes que consumissem mais de 10 cigarros/dia; indivíduos que ingeriam bebidas alcoólicas diariamente; existência clínica de doenças renal e/ou hepática; indivíduos em uso de drogas hipolipemiantes e/ou antiinflamatórias; atividades das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e/ou alanina aminostraferase (ALT) ≥ 2 vezes o limite superior da normalidade; distúrbios reumatológicos, como lúpus, ou malignidade ativa; hipotireoidismo não tratado; participação simultânea em outro ensaio clínico; indivíduos que fizeram uso de suplementação de AAL nos últimos 6 meses.. 4.3 Composição dos grupos. Após a etapa de seleção os pacientes foram distribuídos de forma probabilística do tipo aleatório simples, divididos em grupo tratamento (n=32) e grupo controle (n=32). O grupo tratamento recebeu 300 mg de AAL em forma de cápsulas, duas vezes ao dia, totalizando 600 mg/dia, durante doze semanas. Enquanto o grupo controle recebeu a mesma posologia de um placebo idêntico ao recebido pelo grupo tratamento em tamanho, cor e consistência, durante o mesmo período.. 4.3.1 Acompanhamento dos pacientes e medidas de adesão. Para garantir a adesão ao estudo, a pesquisadora teve contato direto com todos os participantes, de modo a estimular sua permanência no estudo e de oferecer maior confiança para o relato das queixas sobre a intervenção e sobre o estado de saúde. Semanalmente foram feitos contatos por telefone e mensalmente foram promovidos encontros presenciais para entrega do AAL ou placebo, como também para acompanhamento clínico e esclarecimentos de dúvidas.. Também, neste momento os pacientes eram. questionados sobre a presença de efeitos adversos associados ao uso do AAL, e quando estes existiam eles relatavam espontaneamente, sem o pesquisador citar sinais e sintomas.. 4.4 Avaliação da matéria-prima e da formulação de AAL adquirida. As cápsulas de AAL e do placebo foram adquiridos de uma farmácia magistral, Farmafórmula®, localizada no município de Natal – RN. A matéria-prima e a formulação em.

(30) 27. cápsulas do AAL foram submetidas a estudo termogravimétrico, para avaliação da estabilidade térmica do princípio ativo na formulação adquirida.. 4.4.1 Materiais. O metilparabeno, substância que foi utilizada como padrão de referência, foi adquirido da Dinalab®. A matéria-prima do AAL foi adquirida da DEG Importações de Produtos Químicos®. A mesma matéria-prima foi utilizada para formulação das cápsulas de AAL pela farmácia magistral. A formulação de AAL apresentava a seguinte composição: 300 mg de AAL e 50 mg de excipientes (amido, 78%; talco, 10%; celulose microcristalina, 10%; estearato de magnésio, 1%; dióxido de silício coloidal, 1%).. 4.4.2 Condições instrumentais e analíticas. As curvas termogravimetricas não-isotérmicas da matéria-prima do AAL e de sua formulação foram obtidas usando um termobalança simultânea módulo de TG/DTA, modelo Q600 (TA-Instruments), aplicando as razões de aquecimento 10, 20, 40, 60 e 80 ºC min-1 até 900 ºC em nitrogênio (vazão - fluxo: 50,0 mL min-1). A massa inicial foi de 5,0 ± 0,05 mg usando um cadinho de alumina. As determinações foram realizadas em triplicata. O metilparabeno foi utilizado para calibrar o sistema, por apresentar cinética de ordem zero. O valor de 'k' obtido para metilparabeno nas razões de aquecimento 10, 20, 40, 60 e 80 ºC min-1, utilizados foram respectivamente 125,413; 246,932; 413,676; 597,515; e 709,030 (GOMES et al., 2007). Estes valores foram usados para obtenção das curvas da matéria-prima e das cápsulas de AAL. As curvas foram analisadas pelo programa TA Instruments Universal Analysis 2000, verão 4.7A, da TA Instruments, a fim de caracterizar as etapas de decomposição e perda de massa.. 4.5 Avaliação laboratorial. 4.5.1 Biomarcadores de estresse oxidativo.

(31) 28. 4.5.1.1. Determinação. das. Substâncias. Reativas. ao. ácido. Tiobarbitúrico (SRAT). Utilizou-se como indicador de peroxidação lipídica a determinação da produção de SRAT, através da técnica proposta por Bird e Draper (1984). O método fundamenta-se na reação das SRAT, como o malonaldeído (MDA), derivadas da peroxidação da membrana lipídica, com o ácido tiobarbitúrico (TBA). O resultado foi quantificado por espectrofotometria, na absorbância de 535 nm (Spectrophotometer Shimadzu UV-Visible; mod. UV-1650 PC,Tokio, Japão).. 4.5.1.2 Determinação do conteúdo de glutationa reduzida (GSH) em sangue total. A GSH foi determinada no sangue total conforme descrito por Beutler et al (1963). O método baseia-se na reação de redução do 5,5'ditiobis ácido 2 – nitrobenzóico (DTNB) com a GSH, gerando o ânion tiolato (TNB) de cor amarela, a qual foi quantificada na absorbância de 412 nm (Spectrophotometer Shimadzu UV-Visible; mod. UV-1650 PC,Tokio, Japão).. 4.5.1.3 Determinação da atividade da Glutationa Peroxidade (GPx) - E.C. 1.6.4.2. A atividade da GPx foi determinada em eritrócitos, utilizando o kit Ransel (Randox Laboratories Ltd®, Irlanda). O método baseia-se na medida do decréscimo de absorbância promovida durante a oxidação do NADPH, cuja absorbância é mensurada a 340 nm (Spectrophotometer Shimadzu UV-Visible; mod.-1650 PC, Tokio, Japão).. 4.5.1.4 Determinação da atividade da Superóxido dismutase (SOD) - E.C. 1.1.15.1.1. A atividade da SOD foi determinada em eritrócitos, utilizando o kit Ransod (Randox Laboratories Ltd®, Irlanda). O princípio da reação baseia-se na inibição da formação do vermelho de formazan pela captura do ânion superóxido pela SOD, cuja diminuição da.

(32) 29. absorbância a 505nm foi verificada espectrofotometricamente (Spectrophotometer Shimadzu, UV-Visible; mod. UV-1650 PC, Shimadzu®, Tokio, Japão).. 4.5.2 Marcador de inflamação subclínica. Como marcador de inflamação foi mensurado a PCR-us, através do método de quimioluminescência, utilizando Immulite 1000 (Siemes®, Alemanha) de acordo com as recomendações do kit.. 4.5.3 Avaliação do perfil lipídico e da glicemia. Após jejum de 12 horas, foram determinadas as dosagens de glicemia de jejum, colesterol total (CT), lipoproteína de baixa densidade (LDL), lipoproteína de muita baixa densidade (VLDL), lipoproteína de alta densidade (HDL) e triglicerídeos (TG). Todas as dosagens foram realizadas pelo método enzimático colorimétrico, em analisador automatizado Labtest®, modelo Labmax Plenno, Brasil, seguindo as recomendações do fabricante do kit.. 4.5.4 Avaliação das funções renal e hepática. Para avaliação da função renal foram determinadas as dosagens de ureia e creatina. E para avaliação da função hepática foram realizadas as dosagens séricas de AST, ALT, fosfatase alcalina, gama-glutaril-transferase (GGT) e creatina-quinase (CK). Todos os testes foram realizados em analisador automatizado Labtest®, modelo Labmax Plenno, Brasil, seguindo as recomendações do fabricante do kit.. 4.6 Avaliação antropométrica. Os parâmetros antropométricos mensurados foram: peso, altura, circunferência abdominal (CA) e circunferência da cintura (CC), circunferência de quadril (CQ). O índice de massa corpórea (IMC) foi calculado utilizando a fórmula: IMC = peso corporal (kg) / altura (m2). E a relação cintura-quadril (RCQ) foi calculada dividindo a CC pelo CQ (GROOT et al., 1991). Para verificar o peso e a altura, os participantes permaneceram descalços, na posição de pé, com olhar para frente, trajando apenas roupas leves, com os pés juntos e membros.

(33) 30. acolados ao corpo. Foi uma utilizada uma balança antropométrica eletrônica digital Tanita (modelo VM – 080), devidamente calibrada, com capacidade para 150 Kg e variação de 100g. As circunferências foram mensuradas por três vezes seguidas, com utilização de uma fita métrica do tipo inextensível Sanny®, seguindo os procedimentos descritos por Callaway et al. (1988).. 4.7 Análises dos dados. Inicialmente os dados dos dois grupos foram avaliados quanto à normalidade através do teste de Shapiro-Wilk. Para as variáveis paramétricas, utilizou-se o teste-t pareado para avaliar a resposta ao tratamento intragrupo e o teste-t para comparar a evolução clínica entre os dois grupos. Para as variáveis não-paramétricas, foi utilizado o teste de Wilcoxon para avaliar a resposta ao tratamento intragrupo e o teste de Mann-Whitney para comparar a evolução clínica entre os dois grupos. O nível de significância dos testes foi estabelecido em 5%. Todas as variáveis foram submetidas a análises pelo pacote estatístico Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, EUA).. 4.8 Ética na pesquisa. O estudo atendeu aos preceitos para pesquisa com seres humanos, em conformidade com as normativas do Conselho Nacional de Saúde (CNS) 196/96 e 251/97. Depois de informados sobre os objetivos da pesquisa, os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Apêndice B). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Brasil, com registro de número 0014.0.294.051-09 (Apêndice C)..

(34) 31. 5 RESULTADOS. 5.1 Avaliação da matéria-prima e da formulação do AAL. As curvas de termogravimetria da matéria-prima (AAL) exibiram perdas únicas de massa em todas as razões de aquecimento estudadas. Na taxa de aquecimento de 10 ºCmin-1 a perda de massa (99,69%) ocorreu no intervalo de temperatura de 233,48 a 256,76 ºC. Enquanto isso, na taxa de aquecimento de 80 ºCmin-1, a decomposição ocorreu no intervalo de temperatura de 286,28 a 323,35 ºC, com perda de massa menor do que na taxa de 10 ºCmin-1 (Figura 1).. Figura 1 - Curvas termogravimetricas da matéria-prima (AAL) nas razões de aquecimento de 10, 20, 40, 60 e 80 ºCmin-1. Na análise da formulação do AAL, também ocorreram perdas únicas de massa, em todas as razões de aquecimento. Na razão de aquecimento 10 ºC min-1, a fase de decomposição ocorreu no intervalo 227,16 a 263,89 ºC, correspondendo a 92,87% de perda de massa. Na razão de aquecimento de 80ºC, a etapa de decomposição na razão de aquecimento de 80 ºC min-1 ocorreu entre 279,78 a 319,29 ◦C, correspondente à perda de massa 90,89%. (Figura 2)..

(35) 32. Figura 2 - Curvas termogravimetricas da formulação de AAL nas razões de aquecimento de 10, 20, 40, 60 e 80 ºCmin-1. Assim, como o metilparabeno, a matéria-prima (AAL) e a formulação do AAL apresentaram cinética de ordem zero, confirmando que houve o processo de vaporização (Figura 3 e 4). Figura 3 - Curvas de pressão de vapor da matéria-prima (AAL) nas razões de aquecimento de ALA de 10, 20, 40, 60 e 80 ºCmin-1.

(36) 33. Figura 4 - Curvas de pressão de vapor da formulação de AAL nas razões de aquecimento de ALA de 10, 20, 40, 60 e 80 ºCmin-1. Os perfis das curvas de pressão de vapor foram semelhantes ao se comparar a matéria prima (AAL) e a formulação estudada, em todas as razões de aquecimento, sugerindo que os excipientes utilizados na formulação analisada não interferiram na estabilidade do AAL.. 5.2 Caracterização da amostra. As características físicas, os hábitos de vida e os medicamentos utilizados pelos hipertensos que participaram do estudo clínico são apresentados na Tabela 1..

(37) 34. Tabela 1 – Características físicas, hábitos de vida e medicamentos utilizados pelos participantes do estudo Variáveis AAL Placebo Idade (anos). 66,6 (8,84). 66,1 (9,71). Pressão sanguínea arterial sistólica (mmHg). 136,25 (18,97). 141,25 (18,27). Pressão sanguínea arterial diastólica (mmHg). 84,69 (8,41). 85,31 (9,50). Peso (kg). 68,16 (12,91). 66,19 (12,11). Fumantes (%). 3,10 (1). 3,10 (1). Uso de álcool (%). 0,00 (0). 0,00 (0). Sedentarismo (%). 71,90 (23). 71,90 (23). IECA. 46,87 (15). 50,00 (16). β-bloqueadores. 28,12 (9). 18,75 (6). Diuréticos. 59,37 (19). 21,87 (7). Antagonistas da Angiotensina II. 28,12 (9). 31,25 (10). Bloqueadores do canal de cálcio. 37,50 (12). 25,00 (8). Vasodilatadores diretos. 6,25 (2). 3,12 (1). Antiagregantes plaquetários. 28,12 (9). 28,12 (9). Inibidores adrenérgicos de ação central. 12,50 (4). 6,25 (2). Hipoglicemiantes orais. 25,00 (8). 46,87 (15). Insulina. 15,62 (5). 6,25 (2). Medicamentos (%). Dados em media (± desvio padrão) ou % (n) IECA: Inibidores da enzima conversora de angiotensina. 5. 3 Perfil lipídico, glicemia e PCR-us. Ao analisar os parâmetros bioquímicos, observou-se uma redução significativa (p < 0.05) nos níveis séricos de triglicerídeos, colesterol total, VLDL, HDL e glicose no grupo que recebeu o AAL (Tabela 2). Entretanto, na comparação intergrupo não se observou reduções estatisticamente significantes, após as doze semanas de suplementação..

(38) 35. Tabela 2 - Análise comparativa intragrupo e intergrupo do perfil lipídico, da glicemia e da PCR-us antes e após a suplementação Antes da suplementação. Após a suplementação. Avaliação intragrupo. AAL. 153,50 (91,00). 125,50 (69,00). p = 0,001. Placebo. 157,00 (113,00). 153,00 (128,00). p = 0,106. AAL. 223,59 (36,82). 198,56 (24,23). p = 0,001. Placebo. 212,44 (38,70). 207,25 (31,42). p = 0,314. AAL. 46,06 (8,74). 38,50 (9,89). p = 0,001. Placebo. 39,97 (8,55). 38,34 (7,22). p = 0,239. AAL. 143,06 (34,02). 135,53 (28,03). p = 0,104. Placebo. 136,38 (33,11). 137,41 (30,24). p = 0,845. AAL. 31,00 (19,00). 25,00 (14,00). p = 0,001. Placebo. 31,50 (23,00). 30,50 (26,00). p = 0,217. AAL. 109,50 (29,00). 95,00 (24,00). p = 0,001. Placebo. 103,00 (32,00). 102,00 (41,00). p = 0,139. AAL. 2,76 (3,90). 2,27 (4,33). p = 0,617. Placebo. 2,47 (2,97). 1,42 (2,70). p = 0,072. Parâmetros. Avaliação intergrupo. TG* (mg/dL) p= 0,617. CT† (mg/dL) p = 0,220. HDL† (mg/dL) p = 0,943. LDL† (mg/dL) p = 0,798. VLDL* (mg/dL) p = 0,452. Glicose* (mg/dL) p = 0,453. PCR-us* (mg/L) p = 0,410. TG, triglicerídeos; AAL, ácido alfa-lipóico; CT, colesterol total; HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; VLDL, lipoproteína de muito baixa densidade; PCR-us, Proteína C Reativa. * valores descritos em mediana e amplitude inter-quartis † valores descritos em média e desvio padrão. Dos 64 hipertensos suplementados, 18 apresentaram valores séricos de PCR-us igual ou acima de 10 mg/L, antes ou após a intervenção, por isso foram excluídos da análise para esta variável. Dos 46 participantes que tiveram níveis séricos iguais ou menores que 10 mg/L, 22 faziam parte do grupo placebo e 24 do grupo AAL. Não foi observada redução significativa da PCR-us nos grupos após o período de suplementação (Tabela 2)..

(39) 36. 5.4 Biomarcadores de estresse oxidativo. Entre os biomarcadores de estresse oxidativo, observou-se um aumento do conteúdo de GSH tanto na avaliação intragrupo quanto na avaliação intergrupo. Também foi observado aumento estatisticamente significante da atividade de GPx no grupo AAL, porém o aumento não foi estatisticamente significante na comparação com o grupo placebo. Ainda, para SRAT não foram observadas alterações estatisticamente significativas (Tabela 3).. Tabela 3 - Análise comparativa intragrupo e intergrupo de biomarcadores de estresse oxidativo antes e após a suplementação Antes da. Após a. Avaliação. Avaliação. suplementação. suplementação. intragrupo. intergrupo. AAL. 35,49 (15,51). 54,55 (16,22). p = 0,001. Placebo. 39,11 (13,57). 45,42 (12,16). p = 0,008. AAL. 763,82 (447,29). 1047, 20 (281,91). p = 0,001. Placebo. 627,12 (278,44). 1029,45 (261,57). p = 0,001. AAL. 0,88 (0,34). 0,99 (0,38). p = 0,059. Placebo. 0,92 (0,22). 0,90 (0,20). p = 0,529. AAL. 4,17 (1,59). 4,09 (1,16). p = 0,830. Placebo. 3,93 (1,24). 4,31 (1,53). p = 0,210. Parâmetros GPx (U/g Hb). p = 0,130. SOD (U/g Hb) p = 0,795. GSH (mmol/L) p = 0,018. SRAT (μmol/L) p = 0,516. GPx, glutationa peroxidase; AAL, ácido alfa-lipóico; SOD, superóxido dismutase; GSH, glutationa redutase; SRAT, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Valores descritos em média e desvio padrão. 5.5 Indicadores antropométricos. Houve reduções estatisticamente significantes (p < 0.05) no peso, IMC, CC, CA e CQ no grupo que recebeu o AAL, após o término da suplementação. Entretanto, esta melhoria não foi estatisticamente significativa em comparação com o grupo placebo (Tabela 4)..

(40) 37. Tabela 4 - Análise comparativa intragrupo e intergrupo de indicadores antropométricos antes e após a suplementação Antes da. Após a. Avaliação. Avaliação. suplementação. suplementação. intragrupo. intergrupo. AAL. 68,16 (12,91). 66,78 (12,71). p = 0,001. Placebo. 66,19 (12,12). 66,25 (12,56). p = 0,757. AAL. 26,28 (5,27). 25,92 (5,64). p = 0,001. Placebo. 25,53 (5,27). 25,62 (5,64). p = 0,940. AAL. 87,94 (9,69). 85,40 (8,82). p = 0,001. Placebo. 87,28 (9,62). 87,05 (9,74). p = 0,223. AAL. 94,87 (10,37). 92,25 (9,93). p = 0,001. Placebo. 93,40 (10,84). 93,24 (10,81). p = 0,077. AAL. 102,03 (7,65). 99,47 (7,07). p = 0,001. Placebo. 98,97 (8,48). 97,97 (9,06). p = 0,344. AAL. 0,86 (0,06). 0,86 (0,05). p = 0,438. Placebo. 0,88 (0,07). 0,89 (0,10). p = 0,373. Parâmetros Peso† (Kg). p = 0,867. IMC* (Kg/m2) p = 0,803. CC† (cm) p = 0,482. CA† (cm) p = 0,703. CQ† (cm) p = 0,463. RCQ† p = 0,102. AAL, ácido alfa-lipóico; IMC, índice de massa corporal; CC, circunferência da cintura; CA, circunferência abdominal; CQ, circunferência do quadril; RCQ, relação cintura-quadril * valores descritos em mediana e amplitude inter-quartis † valores descritos em média e desvio padrão. 5.6 Avaliações das funções renal e hepática. Na tabela 5 pode-se observar que o AAL não provocou alterações estatisticamente significativas sobre os marcadores de funções renal e hepática avaliados..

(41) 38. Tabela 5 - Análise comparativa intragrupo e intergrupo de marcadores das funções hepática e renal antes e após a suplementação Antes da. Após a. Avaliação. Avaliação. suplementação. suplementação. intragrupo. intergrupo. AAL. 36,47 (11,83). 33,94 (14,81). 0,216. Placebo. 34,66 (13,91). 36,25 (11,27). 0,209. AAL. 0,97 (0,31). 0,91 (0,30). 0,488. Placebo. 1,06 (0,44). 0,97 (0,31). 0,148. AAL. 18,38 (6,10). 19,81 (8,26). 0,376. Placebo. 22,09 (13,01). 18,88 (8,70). 0,167. AAL. 21,56 (15,45). 25,03 (5,37). 0,221. Placebo. 25,19 (18,60). 27,75 (7,92). 0,340. AAL. 41,88 (28,96). 42,28 (22,15). 0,845. Placebo. 40,69 (25,47). 44,06 (25,63). 0,071. AAL. 199,91 (37,00). 193,59 (34,11). 0,098. Placebo. 207,09 (61,95). 201,59 (65,06). 0,322. AAL. 145,22 (89,24). 139,72 (75,40). 0,608. Placebo. 131,97 (82,33). 135,94 (81,28). 0,679. Parâmetros Ureia (mg/dL). 0,485. Creatinina (mg/dL) 0,480. AST (U/L) 0,660. ALT (U/L) 0,113. GGT (U/L) 0,767. FAL (U/L) 0,540. CK (mg/dL) 0,819. AAL, ácido alfa-lipóico; AST, aspartato aminotransferase; ALT:, alaninaaminotransferase; GGT, gama-glutaril transferase ; FAL, fosfatase alcalina; CK, creatina quinase. † valores descritos em média e desvio padrão. 5.7 Principais problemas relatados durante a intervenção Durante a intervenção, os pacientes relataram espontaneamente alguns sinais e sintomas, que segundo eles, possivelmente estavam relacionadas à suplementação (Tabela 6)..

(42) 39. Tabela 6 – Eventos apresentados pelos participantes durante a intervenção Eventos AAL Placebo (n = 32). (n = 32). Pirose. 17. 1. Azia. 2. -. Plenitude. 1. -. Dor abdominal. 1. -. Poliúria. 1. -. Sonolência. 1. -. Ganho de Peso. -. 1. Palpitação. -. 1.