DETERMINAÇÃO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA RESISTÊNCIA À ERITROMICINA E À CLINDAMICINA EM CEPAS DE Streptococcus agalactiae DE
ORIGENS HUMANA E BOVINA ISOLADAS NO BRASIL
Tatiana de Castro Abreu Pinto
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia).
Orientador: Leslie Claude Benchetrit
Rio de Janeiro Agosto de 2006
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.Trabalho realizado no Laboratório de Cocos
Patogênicos do Departamento de Microbiologia
Médica do Instituto de Microbiologia Professor Paulo
de Góes, sob orientação do Professor Leslie Claude
Benchetrit.
DETERMINAÇÃO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA RESISTÊNCIA À ERITROMICINA E À CLINDAMICINA EM CEPAS DE Streptococcus agalactiae DE
ORIGENS HUMANA E BOVINA ISOLADAS NO BRASIL
Tatiana de Castro Abreu Pinto
Orientador: Leslie Claude Benchetrit
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da Universidade federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia).
Aprovada por:
Prof. Sérgio Eduardo Longo Fracalanzza – Doutor, IMPPG, UFRJ - Presidente
Profa. Bernadete Teixeira Ferreira Carvalho – Doutora, IMPPG, UFRJ
Prof. João Ramos Costa Andrade – Doutor, UERJ
Regina Maria Pilotto Domingues – Doutora, IMPPG, UFRJ
Rio de Janeiro Agosto de 2006
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Marcia e Marcos, pelo grande amor, a verdadeira amizade, os valiosos ensinamentos, o incondicional apoio em todas as minhas escolhas e a presença constante em minha vida.
À minha querida família, Júlia, Sílvia, Vera, Bernardo e Angela, pelo exemplo de união, amor, carinho e pelo grande esforço em entender os microrganismos.
Ao meu namorado, Gustavo, pelo incentivo, amor, amizade, atenção, companheirismo e por fazer parte da minha vida, estando longe ou perto, e à sua família, pelo carinho e interesse sempre demonstrados.
À família do meu pai, Celinha, Catarina e Gilmar, por me acolher tão carinhosamente e também torcer por mim.
Ao Professor Leslie Claude Benchetrit pela orientação, paciência e apoio, que foram vitais para a realização deste trabalho.
À grande amiga e colega de trabalho Ivi Cristina Menezes de Oliveira, que é parte fundamental não só deste trabalho como também da minha vida.
Aos meus amigos do Laboratório de Cocos Patogênicos, Ana Beatriz, Marcos, Helena e Ana Rosa, sem os quais a realização deste trabalho seria muito mais difícil e não teria a menor graça.
Às equipes do Laboratório de Biologia Molecular de Bactérias, do Laboratório de Biologia de Anaeróbios, do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, do Laboratório de Epidemiologia de Infecções e do Laboratório de Bacteriologia Médica, nas quais eu conquistei grandes amigos.
Aos funcionários e amigos do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes por estarem sempre dispostos a ajudar.
Aos Professores Sergio Eduardo Longo Fracalanzza, Regina Maria Pilotto Domingues e Bernadete Teixeira Ferreira Carvalho pelo incentivo, carinho e atenção.
À professora Angela Cristina Dias de Castro por ceder cordialmente as cepas-controle para este estudo.
Aos donos e funcionários da Fazenda Miguel Pereira pela disponibilidade e pela gentileza.
RESUMO
PINTO, Tatiana de Castro Abreu. Determinação dos mecanismos envolvidos na resistência à eritromicina e à clindamicina em cepas de Streptococcus agalactiae de origens humana e bovina isoladas no Brasil. Rio de Janeiro, 2006. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas – Microbiologia) – Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Os Streptococcus agalactiae ou estreptococos do grupo B (EGB) são importantes agentes de infecções em adultos imunocomprometidos, gestantes e neonatos. Além disso, este microrganismo é uma das principais causas de mastite bovina, o que acarreta prejuízos na indústria pecuária mundial. A penicilina é a droga de escolha para tratamento e profilaxia das infecções causadas pelo EGB, já que cepas resistentes a este antibiótico ainda não foram detectadas, enquanto que a eritromicina e a clindamicina são alternativas em pacientes alérgicos a β-lactâmicos, apesar dos índices de resistência a essas duas drogas terem aumentado consideravelmente na última década, em vários países do mundo. A partir dessas observações, os objetivos deste trabalho foram estudar os mecanismos de resistência à eritromicina e à clindamicina em cepas de EGB, de origens humana e bovina, isoladas no Brasil entre 1980 e 2006, através das técnicas de disco-difusão para a verificação do fenótipo de resistência e de “PCR” para pesquisa dos genes ermA, ermB, mefA e linB. Os resultados demonstraram índices de resistência à eritromicina e à clindamicina de 3,9% e 2,8% para cepas de origem humana e de 36% e 32% para cepas de origem bovina, respectivamente, sendo o fenótipo MLSB constitutivo e o gene ermB predominantes, sugerindo que no Brasil
essa resistência ainda não emergiu entre as cepas isoladas de humanos, mas sim entre as cepas isoladas de bovinos. Além disso, os dados indicam que a resistência à eritromicina e à clindamicina nas cepas analisadas está associada ao sorotipo V e que os índices de resistência vêm aumentando ao longo dos anos, apresentando-se maior na última década.
PALAVRAS CHAVE: Streptococcus agalactiae, bovino, humano, resistência, eritromicina, clindamicina.
ABSTRACT
PINTO, Tatiana de Castro Abreu. Determination of the mechanisms involved in erythromycin and clindamycin resistance in Streptococcus agalactiae strains from human and bovine origin isolated in Brazil. Rio de Janeiro, 2006. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas – Microbiologia) – Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Streptococcus agalactiae or group B streptococci (GBS) are important agents of infections in immune compromised adults, pregnant women and neonates. Besides that, this microorganism is one of the major causes of bovine mastitis, which leads to economic losses in the farming industry world widely. Penicillin is the drug of choice for treating and preventing GBS infections, since resistant strains have not been detected, while erythromycin and clindamycin are alternatives in patients allergic to β-lactam agents, although the resistance levels to these two drugs have considerably increased in the last decade, in different countries of the world. The aim of the present study was to evaluate the mechanisms of erythromycin and clindamycin resistance in GBS strains of human and bovine origin, isolated in Brazil between 1980 and 2006, through the disk-diffusion method to check the resistance phenotype and through the PCR method to screen for ermA, ermB, mefA e linB genes. The results show erythromycin and clindamycin resistance levels of 3,9% e 2,8% for strains of human origin, and 36% e 32% for strains of bovine origin, respectively, with the MLSB
constitutive phenotype and the ermB gene being the prevalent, suggesting that in Brazil this resistance has not emerged yet in strains isolated from humans, but has emerged in strains isolated from cattle. Besides that, the data indicate that erythromycin and clindamycin resistance in the analyzed strains is associated with serotype V and that resistance levels have been increasing through the years, with higher numbers in the last decade.
KEY WORDS: Streptococcus agalactiae, bovine, human, antimicrobial resistance, erythromycin, clindamycin.
SUMÁRIO
Introdução 1
1) Streptococcus agalactiae 1
2) Classificação sorológica 2
3) Distribuição dos sorotipos 4
4) Infecções em bovinos 7
5) Infecções em humanos 8
5.1) Colonização e manifestações clínicas em adultos não gestantes 8 5.2) Colonização e complicações em mulheres grávidas 9 5.3) Síndromes clínicas em crianças 10
6) Profilaxia Antibiótica Intraparto (“IAP”) 13
7) Susceptibilidade aos antimicrobianos 15
Objetivos 20 Material e métodos 21 1) Cepas bacterianas 21 1.1) Isoladas de humanos 21 1.2) Isoladas de bovinos 21 2) Meios de cultura 21 3) Soluções 22 4) Teste de susceptibilidade das cepas de origem bovina (antibiograma) 22 5) Análise fenotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina 23 6) Análise genotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina 24
Resultados 27
Teste de susceptibilidade das cepas de origem bovina (antibiograma) 27 Análise fenotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina 27 Análise genotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina 27
Tabelas 29 Tabela 1 29 Tabela 2 30 Tabela 3 31 Tabela 4 32 Tabela 5 33 Figuras 34 Figura 1 34 Figura 2 35
Figura 3 36 Figura 4 37 Figura 5 38 Discussão 39 Conclusões 49 Referências bibliográficas 50
INTRODUÇÃO
1) Streptococcus agalactiae
O gênero Streptococcus é formado por bactérias Gram-positivas, catalase-negativas, que crescem em pares ou cadeias. Esses cocos podem ser encontrados como componentes da microbiota anfibiôntica ou como agentes de infecções em homens e outros animais (SCHUCHAT, 1998).
A espécie Streptococcus agalactiae coloniza mucosas de adultos saudáveis, particularmente as dos tratos gastrointestinal e genitourinário, de forma persistente, intermitente ou passageira (SCHRAG et al., 2002).
Além disso, a espécie pode também ser encontrada colonizando porcos, macacos, gatos, cachorros e outros animais, ou, ocasionalmente, causando doenças nestes hospedeiros (LÄMMLER, ABDULMAWJOOD & WEIB, 1998).
O S. agalactiae apresenta um histórico epidemiológico dinâmico. Esta espécie foi inicialmente descrita em 1887 como um patógeno animal responsável por quadros de mastite bovina (NOCARD & MOLLEREAU, 1887 apud KEEFE, 1997). Tal doença permanece até hoje como um dos mais importantes problemas econômicos na indústria mundial do gado, já que a qualidade e a quantidade do leite são substancialmente alteradas pela presença do microrganismo (MERL et al., 2003).
A capacidade de colonizar e provocar infecções em humanos foi reportada 50 anos depois, a partir da década de 1930 (FRY, 1938). No entanto, somente na década de 1960, o S. agalactiae foi reconhecido como importante agente de doenças em recém-nascidos, emergindo como um significante causador de morbidade e mortalidade neonatal nos anos 70, quando aproximadamente 50% dos neonatos infectados pela bactéria chegavam ao óbito (MCCRACKEN, 1973).
invasivas e 80 mortes em bebês por ano, nos Estados Unidos, sendo, portanto, a ocorrência deste microrganismo relativamente rara (SCHRAG et al., 2002).
Entretanto, apesar de raras atualmente, as síndromes neonatais causadas por este microrganismo continuam sendo severas e fatais e, nas últimas décadas, o foco da atenção de vários profissionais da saúde vem sendo a elaboração de medidas que consigam reduzir ainda mais a incidência dessas doenças. Uma dessas medidas foi a implementação nacional nos Estados Unidos, a partir dos anos 90, do programa de profilaxia antibiótica intraparto (Intrapartum Antibiotic Prophylaxis, “IAP”; CDC, 1996), estima-se que consiga prevenir de 4.000 a 4.500 casos de infecções invasivas e de 200 a 225 casos de morte em neonatos por ano (SCHRAG et al., 2002).
2) Classificação sorológica
Os estreptococos β-hemolíticos são classificados e identificados pelo método de LANCEFIELD (1933). Os antígenos detectados nesse sistema podem ser polissacarídeos da parede celular, como nos grupos A, B, C, F e G, ou ácidos lipoteicóicos, como nos grupos D e N.
A espécie S. agalactiae representa o grupo B de Lancefield e, por este motivo, é também designada como estreptococo do grupo B (EGB). O polissacarídeo, também denominado carboidrato C, detectado nesta espécie é composto de galactose, N-acetilglucosamina, ramnose e glucitol fosfato (SCHUCHAT, 1998).
Além do carboidrato C, o EGB apresenta polissacarídeos tipo-específicos capsulares e antígenos protéicos ancorados à superfície bacteriana, ambos utilizados na tipagem sorológica deste microrganismo.
Atualmente os polissacarídeos tipo-específicos que podem ser isolados tanto de humanos como de animais são Ia, Ib, II, III, IV e V e, mais raramente de humanos, VI, VII e
VIII (MARTINEZ et al., 2000). Em todos esses sorotipos a cápsula contém ácido siálico, que atua como o fator crucial para a sobrevivência bacteriana no sangue humano, em função da interferência com a ativação do sistema complemento e com os mecanismos opsonofagocíticos dos neutrófilos (DORAN, LIU & NIZET, 2003).
Já entre os antígenos protéicos, são encontrados cα, cβ, R e X. Os antígenos cα (resistente à tripsina) e cβ (sensível à tripsina e ligador de IgA) formam uma única proteína, a proteína c, apesar de poderem ser encontrados isoladamente nas cepas de S. agalactiae (FLORES & FERRIERI, 1996). A subunidade cα, codificada pelo gene bca, possui uma região N terminal, unidades repetitivas idênticas e consecutivas e uma região C terminal (MICHEL et al., 1992), e foi identificada como uma importante invasina para aderência, internalização e translocação do microrganismo em células eucarióticas (BOLDUC et al., 2002). Já a subunidade cβ, codificada pelo gene bac, possui uma região N terminal, um domínio C terminal, que se estende ao longo da membrana e da parede celular, e dois domínios funcionais, denominados A e B, que são responsáveis pela ligação à IgA (JERLSTRÖM, CHHATWAL & TIMMIS, 1991).
As proteínas R são resistentes à tripsina e apresentam estrutura semelhante a da proteína cα (FLORES & FERRIERI, 1996). Já a proteína X é mais freqüentemente isolada de cepas de origem bovina, se destacando como um bom imunógeno nesses casos (RAINARD et al., 1991).
Como já mencionado, a cápsula polissacarídica é um dos fatores de virulência mais importantes do EGB. Entretanto, o papel das proteínas de superfície na patogênese e proteção deste microrganismo ainda está sob investigação.
Estudos iniciais realizados nos Estados Unidos acerca da distribuição dos sorotipos, nas décadas de 1960 e 1970, demonstraram a predominância dos sorotipos Ia e III dentre cepas de S. agalactiae obtidas de adultos e neonatos, sendo estas isoladas tanto de casos clínicos como de carreadores assintomáticos (EICKHOFF et al., 1964; BAKER & BARRETT, 1974).
Em estudos pioneiros realizados no Brasil na década de 1980, BENCHETRIT e colaboradores (1982) demonstraram a predominância dos tipos Ia e Ib dentre cepas obtidas de gestantes e seus recém-nascidos na cidade do Rio de Janeiro, enquanto que SMÂNIA e colaboradores (1988) sugeriram a predominância dos sorotipos II e III para casos semelhantes, na cidade de Florianópolis.
WENGER e colaboradores em 1990 observaram que 36% das crianças menores de 7 dias de vida e 71% das crianças maiores de 7 dias de vida estudadas foram acometidas por infecções associadas ao sorotipo III, enquanto que 20% das infecções em adultos estavam associadas a este mesmo sorotipo, nos Estados Unidos.
Entretanto, a partir dos anos 90, o sorotipo V, descrito pela primeira vez na década de 1970 (WILKINSON, 1977), emergiu como um freqüente colonizador e causador de doenças invasivas em adultos não gestantes em vários países do mundo. Além disso, particularmente nos Estados Unidos e na Europa, este sorotipo vem se destacando como uma causa relevante de síndromes neonatais (HARRISON, DWYER & JOHNSON, 1995; ELLIOT, FARMER & FACKLAM, 1998; HICKMAN et al., 1999; ZALEZNIK et al., 2000).
Em Atlanta, nos Estados Unidos, cepas pertencentes ao sorotipo V foram detectadas em 14% das cepas de EGB isoladas de neonatos e em 31% das cepas isoladas de adultos não gestantes (BLUMBERG et al., 1996). Em Maryland, este sorotipo foi responsável por 30 a 45% das infecções invasivas em adultos não gestantes (HARRISON et al., 1998).
vários países, tanto a partir de casos invasivos como a partir de carreadores assintomáticos (BLUMBERG et al., 1996; KO et al., 2001; FERRIERI et al., 2004; FIGUEIRA-COELHO et al., 2004), embora estudos realizados na Argentina e na Alemanha tenham encontrado uma prevalência moderadamente alta do sorotipo II (LOPARDO et al., 2003; BRIMIL et al., 2005).
Os sorotipos VI e VIII têm sido mais freqüentemente encontrados como agentes de infecções em mulheres grávidas no Japão, onde os tipos VI e VIII representam, respectivamente, 25% e 36% de todos os sorotipos identificados em gestantes (LACHENAUER et al., 1999). Além disso, MATSUURA e colaboradores (1996) observaram que 28,6% a 35,3% das cepas de EGB isoladas de idosos no Japão pertenciam ao sorotipo VIII.
Através de estudos de citotoxicidade, HAYASAKI e colaboradores (1999) sugeriram que os sorotipos VI e VIII seriam menos virulentos, enquanto que os tipos Ib e III seriam altamente virulentos. Contudo, recentemente, MATSUBARA e colaboradores (2006) reportaram, pela primeira vez, três casos de infecção fatal causados pelo sorotipo VI no Japão, dentre os quais dois envolviam homens adultos apresentando diabetes e o terceiro caso um neonato prematuro, demonstrando o potencial de agressão deste sorotipo.
A colonização vaginal e/ou retal em mulheres por múltiplos sorotipos já foi relatada. Recentemente, FERRIERI e colaboradores (2004) observaram a presença de múltiplos sorotipos em 21,6% das mulheres sexualmente ativas não gestantes. A maioria dessas mulheres (61,8%) apresentava doenças sexualmente transmissíveis e é possível que a aquisição e a colonização por diferentes sorotipos esteja relacionada com o número de parceiros sexuais. Igualmente, MEYN e colaboradores (2002) demonstraram que relações sexuais freqüentes e múltiplos parceiros sexuais estavam associados à aquisição vaginal de um novo sorotipo de S. agalactiae por mulheres jovens não gestantes.
Em relação aos antígenos protéicos, o c, principalmente a subunidade cα, e o R são os mais comumente encontrados em cepas coletadas de humanos (FERRIERI et al., 2004; STRAKOVÁ & MOTLOVÁ, 2004).
Dentre as cepas bovinas, o tipo III é um dos mais isolados no Quênia, Canadá, Brasil e Estados Unidos (MOSABI, ARIMI & KANG'ETHE, 1997; DAIGNAULT et al., 2003; DUARTE et al., 2004; DOGAN et al., 2005). Na Alemanha e Eslováquia predominam os tipos Ia, III e IV (BOPP & LÄMMLER, 1995; MERL et al., 2003; SHAKLEINA et al., 2004). Já na Indonésia e Inglaterra o sorotipo II é o mais encontrado em rebanhos (ESTUNINGSIH et al., 2002; BISHARAT et al., 2004).
Dentre os antígenos protéicos, a proteína X é a mais freqüentemente encontrada nas cepas de origem bovina (SELLIN et al., 1992; BOPP & LÄMMLER, 1995; QUENTIN et al., 1995; MARTINEZ et al., 2000; DAIGNAULT et al., 2003; MERL et al., 2003).
Algumas cepas de EGB são não-tipáveis, ou seja, não têm um polissacarídeo detectado, fato que ocorre principalmente entre as cepas de origem bovina (WIBAWAN & LÄMMLER, 1990). Uma possível explicação é o fato de que essas cepas podem não apresentar cápsula. Já foi relatado anteriormente que o cultivo in vitro de S. agalactiae provoca nessas cepas uma mudança da forma capsulada para a forma não capsulada (SALASIA et al., 1994).
Em relação às cepas de origem humana, FERRIERI e colaboradores (2004) observaram que há uma baixa prevalência de cepas não-tipáveis em mulheres que apresentam doença invasiva, enquanto há uma grande prevalência de cepas não-tipáveis em mulheres carreadoras assintomáticas, o que pode ser reflexo da perda da cápsula no trato genital feminino colonizado por longos períodos. Além disso, os autores verificaram que quase 80% das cepas não-tipáveis expressavam alguma proteína, sendo a proteína R a predominante.
O S. agalactiae é atualmente considerado um dos maiores agentes de infecções bovinas intramamárias. Esta bactéria é um patógeno obrigatório da glândula mamária, onde pode sobreviver por longos períodos de tempo, além de ser altamente contagioso (KEEFE, 1997).
A mastite causada por EGB pode ser clínica, caracterizada pela presença de sinais visíveis da doença tais como dores, tumefação e rubor da mama, ou subclínica, onde há a ausência dos sintomas, tornando o animal um importante reservatório do microrganismo (FARIA, FIGUEIREDO & SANTOS, 1982).
A presença do microrganismo no quarto mamário é freqüentemente associada a contagem elevadas de células somáticas e à baixa produção de leite (KEEFE, 1997). Além disso, ocorrem mudanças na composição do leite que resultam na redução do valor nutricional e na perda de sabor. A qualidade e a validade de produtos derivados do leite, como o queijo, também diminuem, devido ao aumento de crescimento bacteriano (OZ, HILLMANN & FARNSWORTH, 1985).
A mastite bovina freqüentemente se torna crônica e pode levar à perda total do quarto mamário. Por esse motivo, uma identificação rápida dos casos é importante para um controle eficaz da infecção, o que nem sempre é atingido, principalmente em casos de mastite subclínica (RIFFON et al., 2001).
Visando à detecção mais rápida e eficaz dos casos clínicos e subclínicos, foram criados em diversos países programas nacionais e regionais de controle da doença, nos quais o foco é o desenvolvimento de métodos para a prevenção e terapia em todo o rebanho, em vez de tratar casos individuais (KEEFE, 1997).
Esses programas têm como base o aprimoramento da prática da ordenha, a limpeza das tetas e a terapia antimicrobiana intramamária, utilizando soluções comerciais contendo um ou mais antibióticos, dentre os quais destacam-se as penicilinas e seus derivados, as
cefalosporinas e as tetraciclinas (BASEGGIO et al., 1997).
Em Israel, a ocorrência do microrganismo em gados foi reduzida de 28% para menos de 2% nos primeiros cinco anos do programa (BAR-MOSHE et al., 1987). Na Dinamarca houve um decréscimo de 13% em 20 anos (AGGER et al., 1994) e nos Estados Unidos, durante o ano de 1992, foram observados índices de cura da doença maiores do que 90% devido à implementação do programa de controle (KEEFE, 1997).
5) Infecções em humanos
5.1) Colonização e manifestações clínicas em adultos não gestantes
O S. agalactiae coloniza o trato genital e gastrointestinal de 25% dos adultos saudáveis e também pode ser encontrado compondo a microbiota da faringe (LÓPEZ et al., 2002). Os índices de colonização podem variar de acordo com a etnia, idade do indivíduo e localização geográfica (HANSEN et al., 2004).
Classicamente o EGB é relacionado a patologias gestacionais e neonatais. No entanto, vem ocorrendo, nas últimas décadas, um aumento na incidência de infecções invasivas e o aparecimento de novas formas clínicas, causadas por este microrganismo, em adultos não gestantes. Este fato está possivelmente relacionado com a maior expectativa de vida de pacientes que apresentam algum grau de imunodepressão ou enfermidades graves (DE CUETO & DE LA ROSA, 1998). Além disso, o avanço de novas medidas e explorações médicas também pode colaborar com o maior desenvolvimento de infecções por esta bactéria (LÓPEZ et al., 2002).
A apresentação clínica mais freqüente em adultos é a bacteremia sem foco aparente, seguida por infecções de tecidos moles, do trato urinário e, mais raramente, endocardites, meningites, infecções osteoarticulares, peritonites e pneumonias (JACKSON et al., 1995; MUÑOZ et al., 1997).
Já foram descritos vários fatores que predispõem esses indivíduos para infecções por S. agalactiae, como apresentar idade superior a 55 anos, diabetes mellitus, hepatopatia crônica e neoplasias, todos relacionados com um certo grau de imunodepressão, evidenciando um aspecto oportunista desta bactéria (GIMÉNEZ et al., 1996).
HENNING e colaboradores (2001) observaram que idosos moradores de asilos apresentavam um maior risco de desenvolver doenças por EGB do que idosos vivendo na comunidade. Uma possível explicação para este fato é a maior prevalência de doenças crônicas nos idosos dessas casas de amparo, se comparado com os da comunidade. Além disso, os pesquisadores também notaram uma maior incidência de infecções por este microrganismo nos senis negros, tanto entre os idosos dos asilos como entre os idosos da comunidade.
Em adultos não gestantes saudáveis, o S. agalactiae raramente causa algum tipo de doença invasiva. AGOURIDAKIS e colaboradores (2005) reportaram recentemente um caso de meningite por EGB em uma mulher jovem não gestante após a sua primeira relação sexual, na Grécia. A paciente não apresentava nenhum imunocomprometimento e a microbiota vaginal foi apontada pelos autores como a fonte da infecção.
5.2) Colonização e complicações em mulheres grávidas
Apesar da colonização reto-vaginal ser geralmente assintomática, o S. agalactiae pode causar doenças em carreadores susceptíveis. Nos Estados Unidos, 10 a 35% das gestantes carreiam assintomaticamente este microrganismo nos tratos genital e gastrointestinal no momento do parto (REGAN, KLEBANOFF & NUGENT, 1991).
O tratamento de grávidas colonizadas pelo EGB erradica o microrganismo temporariamente, já que a maioria dessas mulheres é recolonizada em até seis semanas após o tratamento (SHET & FERRIERI, 2004).
A colonização materna por S. agalactiae é freqüentemente associada a partos prolongados, ruptura antecipada de membrana amniótica e partos prematuros. No entanto, não existem ainda evidências suficientes e definitivas que confirmem esta relação causa-conseqüência (SCHUCHAT, 1998).
Em gestantes, o EGB pode ocasionar desde infecções do trato urinário até sepses, incluindo corioamnionite, endometrite, cistite, pielonefrite e bacteremia. Febre no período pós-parto também é uma manifestação comum (SHET & FERRIERI, 2004). Infecções do trato urinário associadas ao EGB ocorrem em 2 a 4% de todas as gestantes (SCHRAG et al., 2002). Corioamnionite e endometrite pós-parto ocorrem mais freqüentemente em gestantes colonizadas pelo microrganismo do que nas não colonizadas (YANCEY et al., 1994).
5.3) Síndromes clínicas em crianças
A enfermidade no infante se manifesta, principalmente, como sepse, pneumonia ou meningite, e aproximadamente 25% das infecções ocorrem em prematuros. Endocardites e epiglotites já foram descritas em crianças com mais idade (YOUNG, FINN & POWELL, 1996; ALSOUB, NAJMA & ROBIDA, 1997).
Mais de 80% das infecções causadas por S. agalactiae em neonatos ocorrem nos primeiros dias de vida e, por isso, são chamadas de síndrome precoce. Já as infecções que acontecem entre a 1ª semana e 3 meses de vida são chamadas de síndrome tardia (SCHUCHAT, 1998).
Os recém-nascidos com síndrome precoce geralmente adquirem a bactéria no momento do parto, por transmissão vertical, ao entrar em contato com o trato genital materno que se encontra colonizado. Em mais de 80% dos infantes, a apresentação sintomática inicial, geralmente durante as primeiras 24 horas, é a dificuldade respiratória. Além disso, em aproximadamente 70% dos casos ocorrem complicações obstétricas na mãe (SHET &
FERRIERI, 2004).
Contudo, algumas das infecções precoces são resultados da difusão ascendente do microrganismo, geralmente após a ruptura da membrana, no fluido amniótico, que, uma vez aspirado pelo infante, leva ao surgimento de doenças invasivas. Se o EGB alcançar o trato respiratório inferior e danificar as células epiteliais pulmonares, o neonato pode apresentar pneumonia e disfunções respiratórias logo nas primeiras horas de vida. Se a bactéria conseguir invadir o sistema circulatório e o hospedeiro for incapaz de eliminá-la, pode ocorrer sepse severa (SPELLERBERG, 2000).
Além disso, há relatos de que a transmissão do S. agalactiae possa ocorrer através de membranas amnióticas intactas e os eventos subseqüentes da aspiração do fluido amniótico contaminado pelo feto ocorrerem in utero, resultando em bebês natimortos ou falecimento logo após o parto (KATZ & BOWES, 1988).
Segundo SHET & FERRIERI (2004), as maiores complicações relacionadas com a síndrome precoce são bacteremias sem foco primário de infecção, pneumonias e meningites, representadas por 50, 35 e 15% dos casos, respectivamente, com índice de mortalidade de 10 a 15%.
A patogênese da síndrome tardia é diferente da precoce e ainda não muito bem elucidada, embora alguns casos provavelmente reflitam a aquisição do S. agalactiae durante a passagem do neonato pelo canal vaginal. Estudos demonstraram que aproximadamente 50% das mães carreavam o EGB do mesmo sorotipo que acarretava a síndrome tardia na criança (ANTHONY, OKADA & HOBEL, 1979; DILLON, KHARE & GRAY, 1987). No entanto, a transmissão do microrganismo geralmente ocorre a partir de outras fontes, como as nosocomiais (NOYA et al., 1987). Há também relatos de síndromes tardias associadas à ingestão de leite materno contaminado (KENNY, 1977; KUBIN et al., 1987; BINGEN et al., 1992; OLVER et al., 2000).
Os sintomas iniciais neste tipo de síndrome são febre, letargia, irritabilidade, má alimentação e taquipnéia. A manifestação clínica mais comum é a meningite e mais de 20% dos infantes sobreviventes podem desenvolver seqüelas neurológicas permanentes de severidades variáveis, incluindo paralisia cerebral, retardamento mental e surdez (SCHUCHAT, 1998). O índice de mortalidade é de 2 a 6% (SHET & FERRIERI, 2004).
As enfermidades causadas pelo S. agalactiae ocorrem com maior freqüência em neonatos afro-americanos do que em outros grupos raciais (ZANGWILL, SCHUCHAT & WENGER, 1992). Embora parte desta diferença esteja relacionada com a maior prevalência de fatores de risco entre os afro-americanos, como baixo peso dos recém-nascidos e prematuridade, a colonização pelo microrganismo é significantemente mais comum entre pessoas com descendência africana (NEWTON, BUTLER & SHAIN, 1996).
Embora 50 a 65% dos bebês nascidos de mães carreadoras sejam colonizados no momento do parto e apresentem culturas positivas para EGB de membranas mucosas e pele (canal auditivo externo, garganta, umbigo, sítios anorretais), somente 1 a 2% dessas crianças apresentam infecções invasivas (HICKMAN et al., 1999). Isto porque a transmissão passiva de anticorpos maternos contra os polissacarídeos capsulares do S. agalactiae parece proteger o neonato contra o desenvolvimento dessas doenças.
Foi demonstrado que gestantes com altos níveis desses anticorpos no soro raramente têm bebês com síndromes causadas por EGB e os recém-nascidos, nos quais a infecção consegue se estabelecer, geralmente apresentam baixos níveis desses anticorpos (BAKER & KASPER, 1976). Além disso, CAMPBELL e colaboradores (2000) observaram que grávidas colonizadas pelo microrganismo possuíam concentrações significantemente maiores de IgG no momento do parto do que as gestantes não colonizadas.
Além da colonização materna, diferentes fatores aumentam o risco do neonato desenvolver infecções por EGB, tais como prematuridade, ruptura prolongada de membrana,
corioamnionite, febre intraparto e ter irmão que tenha apresentado síndrome precoce (SCHRAG et al., 2002).
6) Profilaxia Antibiótica Intraparto ("IAP")
As recomendações da "IAP", desenvolvidas pelo Centers for Disease Control and Prevention ("CDC"), para profilaxia de síndromes precoces foram originalmente postas em prática em 1996 (CDC, 1996).
Na época, duas abordagens preventivas foram propostas: uma baseada na cultura para EGB de todas as gestantes e outra baseada na presença de fatores de risco.
O primeiro procedimento consiste na pesquisa do microrganismo em todas as mulheres grávidas entre a 35ª e a 37ª semana de gestação, utilizando culturas vaginais e retais. Antibióticos são administrados em todas as que apresentam cultura positiva, independentemente da presença de fatores de risco clínicos.
Já o segundo procedimento consiste na administração de antibióticos baseada somente na presença de fatores de risco pré-natais e intrapartos, tais como parto prematuro, ruptura prolongada (mais de 18 horas) ou prematura (antes de 37 semanas) de membrana amniótica, febre intraparto (mais de 38°C), histórico de um prévio bebê com síndrome precoce e bacteriuria por S. agalactiae durante a gestação.
Atualmente, a abordagem baseada na cultura reto-vaginal das gestantes é o procedimento padrão, porque mostrou ser 50% mais eficiente em prevenir as síndromes precoces, sendo a sua grande vantagem a inclusão de gestantes colonizadas pela bactéria que podem nunca apresentar nenhum dos fatores de risco clínicos, mas cujos neonatos possuem maiores chances de desenvolver doença do que aqueles nascidos de mães não colonizadas. Além disso, este protocolo se apresentou menos ambíguo, mais fácil de ser seguido e mais freqüentemente implementado de forma correta (JOLIVET, 2002).
Os agentes antimicrobianos de escolha para a administração intraparto são a penicilina ou a ampicilina. A penicilina é sempre preferível quando possível porque possui um amplo espectro de ação e menor propensão de contribuir para o desenvolvimento e a disseminação de resistência em outros patógenos, um sério e preocupante aspecto da saúde pública mundial atualmente. Além disso, este antibiótico apresenta uma passagem transplacentária eficiente e baixo custo (STOLL et al., 2002).
No entanto, se a gestante é alérgica a beta-lactâmicos, são recomendados cefazolina, para casos com baixo risco de anafilaxia, e clindamicina ou eritromicina, para casos de alto risco de anafilaxia. Aproximadamente 10% dos adultos demonstram alergia à penicilina e o índice de anafilaxia induzida por esta droga varia de quatro casos em 10.000 a quatro casos em 100.000 (SCHRAG et al., 2002).
Baixo risco de anafilaxia ocorre quando a paciente apresenta um histórico de “rash” como reação alérgica, principalmente se foi primeiramente induzida pela utilização de ampicilina. Já um alto risco de anafilaxia ocorre quando a gestante possui histórico de reações de hipersensibilidade imediata (SALKIND, 2001).
Para todas as gestantes com alto risco de anafilaxia, as amostras de EGB coletadas devem ser submetidas a testes de sensibilidade a clindamicina e eritromicina e, no caso de resistência a esses dois antibióticos, a vancomicina é recomendável.
O "CDC" recomenda ainda não oferecer a "IAP" para gestantes que serão submetidas a operações cesarianas. Apesar do EGB ser capaz de atravessar membranas amnióticas intactas, a incidência de infecções por este microrganismo nestes casos particulares é tão baixa que os riscos associados à aplicação de antibiótico intravenoso superam os benefícios (RAMUS, MCINTIRE & WENDEL, 1999).
A incidência de síndromes precoces causadas por S. agalactiae nos Estados Unidos foi reduzida em 31% entre os anos de 2000 e 2004, comprovando a eficácia da “IAP” (CDC,
2005).
7) Susceptibilidade aos antimicrobianos
A penicilina é a droga de escolha para a profilaxia e para o tratamento das infecções causadas pelo S. agalactiae e cepas deste microrganismo resistentes a este antibiótico ainda não foram encontradas, embora alguns pesquisadores já tenham detectado cepas tolerantes ou com sensibilidade diminuída (ou intermediária), um fenômeno de significado questionável por outros autores (KIM & ANTHONY, 1981; BETRIÚ et al., 1994; VILLAR, JUGO & FARINATI, 1994; WU et al., 1997; MERCER et al., 1999; DE AZAVEDO et al., 2001; HSUEH et al., 2001; MORIKAWA et al., 2003).
Os macrolídeos e as lincosaminas são a segunda opção no tratamento das doenças por EGB e a alternativa em indivíduos alérgicos à penicilina.
Ambas as drogas atuam no ribossomo bacteriano, impedindo a síntese protéica do microrganismo. A eritromicina, principal representante dos macrolídeos, é produzida pelo Streptomyces erythreus e impede os movimentos de translocação se fixando à subunidade ribossomal 50S. Já as lincosaminas, representadas pela lincomicina, produzida pelo Streptomyces lincolensis, e seu cloro-derivado, a clindamicina, impedem a união dos aminoácidos pela inibição da peptidiltransferase bacteriana (DE AZAVEDO et al., 2001; DE MOUY et al., 2001; GONZÁLEZ & ANDREU, 2003).
Resistência à eritromicina em cepas de EGB vem sendo reportada desde 1962 nos Estados Unidos (EICKHOFF et al., 1964) e, durante a última década, emergiu em vários países, levantando questões sobre a possibilidade do tratamento e da profilaxia estarem inadequados se continuarmos a utilizar esses agentes como segunda opção.
Para cepas de S. agalactiae já foram descritos dois diferentes mecanismos de resistência a macrolídeos: um baseado na modificação do alvo do antibiótico, e outro baseado
na expulsão do antibiótico para fora da célula bacteriana.
No primeiro mecanismo, enzimas metiltransferases adicionam radicais metil a uma adenina específica do rRNA 23S bacteriano, impedindo a ligação do antibiótico à subunidade 50S do ribossomo (LIVERMORE, 2003). Esse foi o primeiro mecanismo de resistência a macrolídeos relatado nesta espécie e resulta em uma resistência cruzada a macrolídeos, lincosaminas e estreptograminas B, constituindo o fenótipo MLSB (DE MOUY et al., 2001).
As metiltransferases são codificada por genes erm (sigla em inglês para “erythromycin ribosome methylation”) e podem adicionar um ou dois grupos metil ao rRNA 23S (MENSA, GARCÍA-VÁZQUEZ & VILA, 2003). Entre os muitos genes que compõem a grande família erm, foram detectados no gênero Streptococcus, até o presente momento, somente os genes ermA, ermB, ermC, ermF e ermQ, sendo os dois primeiros predominantes (ROBERTS et al., 1999).
O fenótipo MLSB pode ainda ser subdividido em constitutivo, no qual a cepa de EGB
se apresenta constitutivamente resistente à eritromicina e à clindamicina, e induzido, no qual a cepa de EGB se apresenta constitutivamente resistente à eritromicina e indutivamente resistente à clindamicina na presença de eritromicina (LIU & DOUTHWAITE, 2002). O fenótipo induzido predominava nas décadas de 1960 e 1970, no entanto, atualmente, é muito mais comum, em diferentes áreas geográficas, encontrar a predominância de cepas apresentando o fenótipo constitutivo (ROBERTS et al., 1999).
No segundo mecanismo, como já mencionado, ocorre o efluxo do antibiótico para fora da célula bacteriana através de proteínas hidrofóbicas presentes na membrana, que provavelmente utilizam a energia da força próton motora para tal (CLANCY et al., 1996). Essas proteínas são codificadas pelo gene mefA (sigla em inglês para “macrolide efflux”) e a este mecanismo é atribuído o fenótipo M, que foi descrito mais recentemente, no final da década de 1980. Este fenótipo confere resistência aos macrolídeos cuja estrutura química
apresenta anel com 14 átomos (eritromicina e claritromicina) ou 15 átomos (azitromicina). Entretanto, as cepas continuam sensíveis aos macrolídeos que apresentam anel com 16 átomos (josamicina, espiramicina e tilosina), às lincosaminas e às estreptograminas (ARPIN et al., 1999; DE MOUY et al., 2001).
HSUEH e colaboradores (2001) relataram o aumento na resistência a eritromicina e clindamicina, em cepas de EGB isoladas de humanos em Taiwan, de 19 e 18% em 1994 para 46 e 37% em 1997, respectivamente. Os autores também verificaram que o fenótipo MLSB
constitutivo foi o predominante e que a resistência estava relacionada aos sorotipos III e IV. FITOUSSI e colaboradores (2001) detectaram 18% de resistência à eritromicina em cepas isoladas de neonatos e gestantes na França, com o fenótipo MLSB induzido e o gene
ermB sendo prevalentes, representando 71 e 47% dos casos, respectivamente.
Na Espanha, GONZÁLEZ & ANDREU (2003) observaram que 12,45% e 11,8% das cepas de S. agalactiae de origem humana analisadas apresentavam resistência a eritromicina e clindamicina, respectivamente, sendo o fenótipo MLSB constitutivo o mais encontrado.
Estudos realizados em um hospital de Portugal com cepas de EGB de origem humana revelaram índices de resistência à eritromicina e à clindamicina de 10,7 e 9,9%, respectivamente, sendo o fenótipo MLSB constitutivo o mais comum (FIGUEIRA-COELHO
et al., 2004).
Em cepas de S. agalactiae de origem bovina isoladas na Argentina foram relatados índices de resistência à eritromicina e à clindamicina de 27,6 e 25,5%, respectivamente, sendo o fenótipo MLSB constitutivo o prevalente, representando 23,4% de todas as cepas resistentes
(DENAMIEL et al., 2005).
Na Bélgica, 16,7% e 11% de cepas de EGB isoladas de gestantes se apresentaram resistentes à eritromicina e à clindamicina, respectivamente, com o fenótipo MLSB
Já MOSCA, RUSSO & MIRAGLIOTTA (2006) observaram que 19,2% de cepas isoladas de gestantes na Itália se apresentaram resistentes à eritromicina e à clindamicina simultaneamente.
Nos Estados Unidos, DIPERSIO & DIPERSIO (2006) verificaram, recentemente, índices de resistência à eritromicina e à clindamicina de 54% e 33%, respectivamente, em cepas isoladas de humanos a partir da vagina e do reto. Já DOGAN e colaboradores (2005), no mesmo país, observaram índices de 26,9% de resistência à eritromicina em cepas humanas e de 3,6% em cepas de origem bovina. Nestas últimas, somente o gene ermB foi detectado.
No Brasil, D’OLIVEIRA e colaboradores (2003) relataram 4,3% e 1,1% de resistência à eritromicina e à clindamicina, respectivamente, em cepas de EGB de origem humana, com a maioria apresentando o fenótipo MLSB induzido e o gene ermA.
Igualmente, na cidade do Rio de Janeiro, foi demonstrado que 4,6% das cepas humanas apresentavam resistência à eritromicina e à clindamicina, dentre as quais se destacaram o fenótipo MLSB induzido, o gene ermA e os sorotipos Ia e V. Já entre as cepas de
origem bovina, isoladas no Rio de Janeiro e em Minas Gerais, 23,7% se apresentaram resistentes à eritromicina e à clindamicina, destacando-se o fenótipo MLSB constitutivo, o
gene ermB e os sorotipos II e III (DUARTE et al., 2005).
Em contraste a resistência cruzada, conferida pelo fenótipo MLSB, a resistência
específica às lincosaminas, obtida pela modificação bacteriana desses antibióticos, já foi relatada para esta espécie. DE AZAVEDO e colaboradores (2001) observaram, pela primeira vez, a presença do gene linB (sigla em inglês para “lincosamide inactivation nucleotidylation”) em uma cepa de S. agalactiae que era sensível à eritromicina, mas resistente à clindamicina. Este gene, que codifica para uma nucleotidiltransferase responsável pela adenilação da hidroxila na posição 3 das moléculas de lincosaminas, é um mecanismo de resistência descrito inicialmente em Enterococcus faecium (BOZDOGAN et al., 1999).
Outros estudos também observaram a existência de cepas de EGB resistentes à clindamicina mas sensíveis à eritromicina. Porém, nestes estudos a presença do gene linB não foi analisada (GONZÁLEZ & ANDREU, 2003; WERNO, ANDERSON & MURDOCH, 2003).
A contribuição do genótipo no desenvolvimento do fenótipo de resistência tem importantes implicações na terapia antimicrobiana, já que há diferenças na susceptibilidade às drogas dependendo do mecanismo de resistência utilizado.
Por este motivo, torna-se cada vez mais necessária a verificação dos mecanismos de resistência mais comuns, através da análise genotípica e fenotípica, para uma melhor orientação em medidas profiláticas e terapêuticas contra o S. agalactiae.
Entretanto, poucas informações sobre os índices de resistência à eritromicina e à clindamicina em cepas de EGB de origem humana isoladas no Brasil estão disponíveis atualmente, assim como não há dados suficientes sobre esses mesmos índices em cepas de origem bovina. Além disso, não há relatos na literatura, até o presente momento, sobre a presença do gene linB nas cepas brasileiras de S. agalactiae de ambas as origens.
Portanto, o desconhecimento atual de tais informações e dados, que apresentam aplicações diretas e importantes na clínica médica, intensifica a necessidade de estudos mais freqüentes e minuciosos, incluindo não só as cepas de origem humana, como também as de origem bovina, isoladas no Brasil.
Tendo em vista os dados expostos anteriormente, os objetivos deste trabalho foram: ¾ Analisar a susceptibilidade de cepas de S. agalactiae de origem bovina a sete
diferentes antibióticos, como cloranfenicol, eritromicina, vancomicina, clindamicina, tetraciclina, rifampicina e ampicilina;
¾ Determinar para as cepas de origem bovina que se apresentem resistentes à eritromicina e/ou à clindamicina, os mecanismos responsáveis por esta resistência; ¾ Determinar os mecanismos de resistência à eritromicina e à clindamicina em cepas de
S. agalactiae de origem humana que se apresentaram resistentes à eritromicina em estudo realizado previamente em nosso laboratório (I. C. M. OLIVEIRA et al., dados não publicados).
1) Cepas bacterianas
1.1) Isoladas de humanos:
Foram utilizadas 15 cepas de S. agalactiae de origem humana, isoladas entre os anos de 1980 e 2002 nos estados do Rio de Janeiro e São Paulo, cujos sorotipos já foram estabelecidos, pertencentes à Coleção de Culturas do Laboratório de Cocos Patogênicos (Departamento de Microbiologia Médica, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro). Tais cepas apresentaram-se resistentes à eritromicina e/ou à clindamicina em teste de susceptibilidade a antimicrobianos pelo método de disco-difusão em meio sólido (antibiograma), realizado previamente em nosso laboratório (I. C. M. OLIVEIRA et al., dados não publicados) (Tabela 1).
1.2) Isoladas de bovinos:
Foram utilizadas 25 cepas de S. agalactiae de origem bovina, isoladas entre os anos de 1987 e 2006 nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Santa Catarina, cujos sorotipos já foram estabelecidos, também pertencentes à Coleção de Culturas do Laboratório de Cocos Patogênicos (Tabela 2).
2) Meios de cultura
♦ Blood Agar Base (Merck): Base acrescida de 5% de sangue desfibrinado de carneiro, denominada agar sangue, utilizada para cultivo das cepas congeladas e verificação de pureza das mesmas.
♦ Mueller-Hinton Agar (Merck): Meio que foi suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro para ser utilizado nos testes de disco-difusão.
♦ Todd-Hewitt Broth (Difco): Caldo utilizado para crescimento das cepas.
♦ Salina: solução de NaCl a 0,85%, utilizada no preparo do inóculo para os testes de disco-difusão.
♦ TBE 0,5X: solução de Tris 0,05 M; ácido bórico 0,05 M; e EDTA dissódico 0,01 M; pH final 8,0. Utilizada no preparo do gel de agarose e como tampão da eletroforese. ♦ TE: solução de Tris – HCl 10 mM (pH 8,0) e EDTA dissódico 1 mM (pH 8,0).
Utilizada no processo de extração do DNA.
♦ Solução de lise: lisozima (10 mg/mL), mutanolisina (5 U/mL), Brij (0,5% v/v) e RNAse (3,75 U/mL) (todos obtidos na Amershan Pharmacia Biotech). Utilizada no processo de extração do DNA.
♦ Solução de degradação protéica: protease (Amershan Pharmacia Biotech) (10 mg/mL) e SDS (Amershan Pharmacia Biotech) 10%. Utilizada no processo de extração do DNA.
♦ Solução de precipitação: acetato de sódio (Reagen) 3M e etanol (Reagen) PA gelados. Utilizada no processo de extração do DNA.
4) Teste de susceptibilidade das cepas de origem bovina (antibiograma)
A susceptibilidade das cepas de EGB de origem bovina foi avaliada pelo método de disco-difusão em meio sólido (antibiograma) de acordo com os parâmetros estabelecidos pelo “NCCLS/CLSI” (Clinical Laboratory Standards Institute, 2003).
As cepas congeladas foram semeadas em placas de Petri contendo agar sangue e incubadas a 37°C por 24 horas. Após crescimento, cada cepa foi então ressemeada em nova placa contendo agar sangue e incubada a 37°C por 18 horas.
A seguir, algumas colônias foram emulsificadas em um tubo de vidro contendo salina estéril e a turbidez foi ajustada de modo que ficasse equivalente ao padrão 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente 108 UFC/mL).
A partir desse tubo, com o auxílio de um “swab”, foi realizada uma semeadura confluente em 3 planos em placas contendo agar Mueller-Hinton suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro.
Em seguida, foram colocados discos de cloranfenicol (30μg), eritromicina (15μg), vancomicina (30μg), clindamicina (2μg), tetraciclina (30μg), rifampicina (5μg) e ampicilina (10μg) (todos obtidos na CECON) na superfície da placa. Essas placas foram então incubadas a 37°C por 18 horas.
Após esse período, os halos de inibição do crescimento bacteriano foram então avaliados e as cepas foram classificadas como resistentes, intermediárias ou sensíveis aos antibióticos utilizados.
A cepa Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 foi utilizada como controle de qualidade dos testes de antibiograma.
5) Análise fenotípica do mecanismo de resistênciadas cepas de origem humana e bovina
O mecanismo fenotípico de resistência à eritromicina foi determinado através da técnica de disco-difusão descrita por SEPPÄLÄ e colaboradores (1993).
As cepas de EGB de origem humana e bovina resistentes à eritromicina e/ou clindamicina foram semeadas em placas de Petri contendo agar sangue e incubadas a 37°C por 24 horas. Após crescimento, cada cepa foi então ressemeada em nova placa contendo agar sangue e incubada a 37°C por 18 horas.
A seguir, algumas colônias foram emulsificadas em um tubo de vidro contendo salina estéril e a turbidez foi ajustada de modo que ficasse equivalente ao padrão 0,5 da escala de McFarland.
A partir desse tubo, com o auxílio de um “swab”, foi realizada uma semeadura confluente em 3 planos em placas contendo agar Mueller-Hinton suplementado com 5% de
sangue desfibrinado de carneiro.
Em seguida, foram colocados um disco de eritromicina (15μg) (CECON) e um disco de clindamicina (2μg) (CECON), no centro da placa, a uma distância de aproximadamente 16 mm entre eles. Essas placas foram então incubadas a 37°C por 18 horas.
Após esse período, os halos de inibição do crescimento bacteriano foram avaliados de acordo com os parâmetros estabelecidos pelo “NCCLS/CLSI” (2003) e o resultado foi interpretado da seguinte forma:
Fenótipo M: foi atribuído àquela cepa que se apresentou resistente à eritromicina e sensível à clindamicina;
Fenótipo MLSB constitutivo: foi atribuído àquela cepa que se apresentou resistente à
eritromicina e à clindamicina;
Fenótipo MLSB induzido: foi atribuído àquela cepa que se apresentou resistente à
eritromicina e sensível à clindamicina, mas com a presença de um estreitamento do halo de inibição da clindamicina próximo ao disco de eritromicina, formando uma letra “D” (SEPPÄLÄ et al., 1993);
Fenótipo L: foi atribuído àquela cepa que se apresentou sensível à eritromicina e resistente à clindamicina (DE AZAVEDO et al., 2001).
6) Análise genotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina
O mecanismo genotípico de resistência foi avaliado através da detecção dos genes ermA, ermB, mefA e linB nos cromossomos das cepas estudadas.
Para tal, foi realizada a amplificação desses genes pela técnica de reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction, “PCR”), utilizando primers previamente descritos por outros autores e sintetizados pela BIOSYNTHESIS (Tabela 3).
FRITSCH & SAMBROOK, 1989). As cepas congeladas foram primeiramente semeadas em placas contendo agar sangue e incubadas a 37°C por 24 horas. Após esse período, algumas colônias foram transferidas para tubos de vidro contendo 1 mL de caldo, que foram incubados a 37°C por 18 horas.
Em seguida, este crescimento foi vertido em tubos Falcon contendo 10 mL de caldo, que foram incubados a 37°C por 5 a 6 horas. Após o período de incubação, o crescimento foi novamente vertido em garrafas de vidro contendo 90 mL de caldo. Estas foram então incubadas a 37°C “overnight”.
Posteriormente, o crescimento bacteriano presente nas garrafas foi transferido para tubos, que foram centrifugados a 3000 g por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante foi então desprezado e 1 mL de TE foi acrescentado e homogeneizado a cada tubo.
Esses tubos foram então novamente centrifugados a 3000 g por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi então desprezado e 1 mL da solução de lise foi adicionado a cada tubo, que foi incubado a 37°C “overnight”.
A seguir, 1 mL da solução de degradação protéica foi adicionado a cada tubo, que foi incubado a 37°C por 1 hora. Após esse período, 1 mL da solução de precipitação gelada foi adicionado a cada tubo, que foi incubado a -20°C por 30 minutos. Esses tubos foram, então, centrifugados a 4000 g por 30 minutos a 5°C. O sobrenadante foi desprezado e o “pellet” suspenso em 1 mL de água bidestilada estéril.
Em seguida, mais 1 mL da solução de precipitação gelada foi adicionado a cada tubo, que foi incubado e centrifugado novamente utilizando os parâmetros descritos anteriormente. O sobrenadante foi desprezado e o “pellet” suspenso em 1 mL de etanol 70% gelado e transferido para eppendorfs, que foram então centrifugados a 10.000 g por 5 minutos a frio.
O sobrenadante foi desprezado e os eppendorfs invertidos para evaporação do etanol a 37°C. Após a evaporação, o DNA purificado foi suspenso em água bidestilada estéril e
estocado a -20°C até ser utilizado na reação de “PCR”.
A mistura para o “PCR” conteve um volume total de 50 μL, incluindo 1 U da enzima Taq DNA Polymerase (Biotools do Brasil), 50 ng de DNA cromossômico purificado, 20 pM de cada primer, 10 nM de cada deoxinucleotídeo e 2 mM de cloreto de magnésio.
Para os genes ermA, ermB e mefA foi realizado um “PCR” multiplex, cujo ciclo incluiu uma desnaturação inicial a 93°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 93°C por 1 minuto, anelamento dos primers a 52°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto, seguidos de uma extensão final a 72°C por 5 minutos (SUTCLIFFE et al., 1996).
Para esses três genes foram incluídas cepas de EGB de controle positivo, cordialmente cedidas pela Professora Angela Cristina Dias de Castro, cujos números de identificação são 06196 (controle positivo para o gene mefA), 53157 (controle positivo para o gene ermA) e 015195 (controle positivo para o gene ermB). Além disso, foram incluídas também 2 cepas de EGB sensíveis à eritromicina e à clindamicina, pertencentes a nossa Coleção de Culturas, como controle negativo, cujos números de identificação são 87149 (origem bovina) e 02008 (origem humana).
Para a detecção do gene linB, o ciclo compreendeu uma desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 45 segundos, anelamento a 54°C por 45 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto, seguidos de uma extensão final a 72°C por 5 minutos (BOZDOGAN et al., 1999; DE AZAVEDO et al., 2001).
A análise eletroforética dos produtos de amplificação foi realizada em gel de agarose a 1%, que foi preparado com TBE 0,5X, onde foi também incluído o padrão de massa molecular Low DNA Mass Ladder (Invitrogen). Após a eletroforese, o gel foi corado com brometo de etídio a 1%, visualizado sob luz ultravioleta e fotografado com filme Polaroid 667.
Teste de susceptibilidade das cepas de origem bovina (antibiograma):
Todas as 25 cepas de EGB de origem bovina analisadas (100%) apresentaram-se sensíveis ao cloranfenicol, à vancomicina, à rifampicina e à ampicilina. Vinte cepas (80%) apresentaram resistência à tetraciclina e nove cepas (36%) apresentaram-se resistentes à eritromicina. Destas últimas, 8 cepas ou 88,9% também apresentaram-se resistentes à clindamicina, representando 32% do total de 25 cepas analisadas (Tabela 4 e Figura 1).
Análise fenotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina:
Entre as 15 cepas de EGB de origem humana resistentes à eritromicina, 4 (26,7%) apresentaram o fenótipo M e 11 (73,3%) apresentaram o fenótipo MLSB constitutivo.
Entre as 9 cepas de EGB de origem bovina resistentes à eritromicina, 1 (11,1%) apresentou o fenótipo M e 8 (88,9%) apresentaram o fenótipo MLSB constitutivo.
Entre as 24 cepas resistentes à eritromicina analisadas, incluindo 15 de origem humana e 9 de origem bovina, 5 (20,8%) apresentaram o fenótipo M e 19 (79,2%) apresentaram o fenótipo MLSB constitutivo (Tabela 5 e Figura 2).
Os fenótipos MLSB induzido e o fenótipo L não foram encontrados em nenhuma cepa
de origem humana ou bovina.
Análise genotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina:
Entre as 15 cepas de EGB de origem humana resistentes à eritromicina, 4 (26,7%) apresentaram somente o gene mefA, 3 (20%) apresentaram somente o gene ermB, 2 (13,3%) apresentaram os genes ermB e mefA, 1 (6,6%) apresentou os genes ermA e mefA, 1 (6,6%) apresentou os genes ermA e ermB e 4 (26,7%) não apresentaram nenhum dos três genes pesquisados.
Entre as 9 cepas de EGB de origem bovina resistentes à eritromicina, 1 (11,1%) apresentou somente o gene mefA, 6 (66,7%) apresentaram somente o gene ermB, 1 (11,1%) apresentou os genes ermA e ermB e 1 (11,1%) apresentou os genes ermA e mefA.
Entre as 24 cepas analisadas, incluindo as de origem humana e bovina, 5 (20,8%) apresentaram somente o gene mefA, 9 (37,5%) apresentaram somente o gene ermB, 2 (8,3%) apresentaram os genes ermA e mefA, 2 (8,3%) apresentaram os genes ermA e ermB, 2 (8,3%) apresentaram os genes ermB e mefA e 4 (16,7%) não apresentaram nenhum dos 3 genes (Tabela 5, Figuras 3 e 5).
De um modo geral, incluindo as cepas de origem humana e bovina, o gene mefA esteve presente em 9 cepas (37,5%), o gene ermA presente em 6 cepas (25%) e o ermB presente em 13 cepas (54,2 %) (Figura 4).
O gene linB não foi encontrado em nenhuma das cepas analisadas, originárias tanto de origem humana como bovina.
sorotipo e susceptibilidade à eritromicina e à clindamicina das cepas de Streptococcus agalactiae de origem humana analisadas.
Número Ano de isolame nto Origem clínica Local de isolame nto Sorotipo Suscept.# à eritromici na Suscept. à clindamici na Suscept. à tetracicli na 80358 1980 Cérvice HUCFF
(RJ)¹ II Resistente Sensível Resistente
81055 1981 Orofaringe ND III Resistente Sensível Resistente
81376 1981 Cérvice HUCFF
(RJ)¹ II Resistente Resistente Resistente
90180 1990 Urina IFF
(RJ)² Ia Resistente Sensível Resistente 90184 I 1990 Orofaringe IFF
(RJ)² III Resistente Sensível Resistente
96008 1996 ND Marília
(SP) IV Resistente Resistente Resistente
96009 1996 ND Marília
(SP) IV Resistente Resistente Resistente
02019 2002 ND LABS
(RJ)4 NT Resistente Resistente Sensível
02031 2002 ND LABS
(RJ)4 V Resistente Resistente Resistente
02054 2002 ND LABS
(RJ)4 V Resistente Resistente Resistente
02056 2002 ND LABS
(RJ)4 IV Resistente Resistente Resistente
02060 2002 Urina LABS
(RJ)4 NT Resistente Resistente Resistente
02063 2002 Urina LABS
(RJ)4 NT Resistente Resistente Resistente
02065 2002 Urina LABS
(RJ)4 V Resistente Resistente Resistente
02082 2002 ND HUGG
(RJ)³ NT Resistente Resistente Resistente # Susceptibilidade
RJ – Rio de Janeiro; SP – São Paulo; ND – Não descrito.
¹ HUCCF – Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (UFRJ) ² IFF – Instituto Fernandes Figueira
³ HUGG - Hospital Universitário Gafrée Guinle (UNIRIO)
4
Tabela 2 – Número de identificação, ano de isolamento, origem clínica, local de isolamento e
sorotipo das cepas de Streptococcus agalactiae de origem bovina analisadas.
Número Ano de isolamento Origem clínica Local de isolamento Sorotipo
87149 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 87151 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 87153 1987 leite IBSP (SP)¹ Ia 87154 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 87155 1987 leite IBSP (SP)¹ Ia 87159 1987 leite IBSP (SP)¹ V 87160 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 87161 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 87162 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 87163 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 87164 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 87165 1987 leite IBSP (SP)¹ V 87166 1987 leite IBSP (SP)¹ V 87167 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 87169 1987 leite IBSP (SP)¹ NT 88057 1988 leite Florianópolis (SC) V 88058 1988 leite Florianópolis (SC) V 03028 2003 leite Penedo (RJ) II 03029 2003 leite Penedo (RJ) Ia
06001 2006 leite Miguel Pereira (RJ) V
06002 2006 leite Miguel Pereira (RJ) V
06003 2006 leite Miguel Pereira (RJ) V
06004 2006 leite Miguel Pereira (RJ) NT
06005 2006 leite Miguel Pereira (RJ) V
06006 2006 leite Miguel Pereira (RJ) NT
SP – São Paulo; SC - Santa Catarina; RJ - Rio de Janeiro. ¹ Instituto Biológico de São Paulo, São Paulo.
Tabela 3 – Genes de resistência relacionados, seqüência dos primers, tamanho esperado dos
amplicons e referências dos primers utilizados.
Gene
Seqüência dos primers
forward reverse Tamanho do amplicon (em pares de bases) Referência ermA 5’ GCATGACATAAACCTTCA 3’
5’ AGGTTATAATGAAACAGA 3’ 206 pb SEPPÄLÄ et al., 1998 ermB 5’ CGAGTGAAAAAGTACTCAACC 3’ 5’ GGCGTGTTTCATTGCTTGATG 3’ 616 pb KLUGMAN et al., 1998 mefA 5’ AGTATCATTAATCACTAGTGC 3’ 5’ TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG 3’ 348 pb SUTCLIFFE et al., 1996 linB 5’ CTACCTATTGTTTGTGGAAC 3’ 5’ ATAACGTTACTCTCCTATTC 3’ 900 pb BOZDOGAN et al., 1999; DE AZAVEDO et al., 2001
Tabela 4 – Número de identificação e susceptibilidade ao cloranfenicol, eritromicina,
vancomicina, clindamicina, tetraciclina, rifampicina e ampicilina das cepas de S. agalactiae de origem bovina analisadas.
Número CLO¹ ERI VAN CLI TET RIF AMP
87149 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87151 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87153 Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível 87154 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87155 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87159 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87160 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87161 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87162 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87163 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87164 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87165 Sensível Resistente Sensível Resistente Resistente Sensível Sensível 87166 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87167 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível 87169 Sensível Resistente Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível 88057 Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível 88058 Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível 03028 Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível 03029 Sensível Resistente Sensível Resistente Resistente Sensível Sensível 06001 Sensível Resistente Sensível Resistente Resistente Sensível Sensível 06002 Sensível Resistente Sensível Resistente Resistente Sensível Sensível 06003 Sensível Resistente Sensível Resistente Resistente Sensível Sensível 06004 Sensível Resistente Sensível Resistente Resistente Sensível Sensível 06005 Sensível Resistente Sensível Resistente Resistente Sensível Sensível 06006 Sensível Resistente Sensível Resistente Resistente Sensível Sensível
¹ CLO – cloranfenicol; ERI – eritromicina; VAN – vancomicina; CLI – clindamicina; TET –
Tabela 5 – Número de identificação, origem, sorotipo, fenótipo e genótipo de resistência das
cepas de origens humana e bovina analisadas.
Número Ano de
isolamento Origem Sorotipo Fenótipo Genótipo
80358 1980 Humana II M mefA
81055 1981 Humana III M mefA
81376 1981 Humana II MLSB Constitutivo ermA e mefA
87165 1987 Bovina V MLSB Constitutivo ermA e ermB
87169 1987 Bovina NT M mefA
90180 1990 Humana Ia M mefA
90184 I 1990 Humana III M mefA
96008 1996 Humana IV MLSB Constitutivo ermB e mefA
96009 1996 Humana IV MLSB Constitutivo ermB e mefA
02019 2002 Humana NT MLSB Constitutivo -
02031 2002 Humana V MLSB Constitutivo -
02054 2002 Humana V MLSB Constitutivo -
02056 2002 Humana IV MLSB Constitutivo -
02060 2002 Humana NT MLSB Constitutivo ermB
02063 2002 Humana NT MLSB Constitutivo ermB
02065 2002 Humana V MLSB Constitutivo ermB
02082 2002 Humana NT MLSB Constitutivo ermA e ermB
03029 2003 Bovina Ia MLSB Constitutivo ermA e mefA
06001 2006 Bovina V MLSB Constitutivo ermB
06002 2006 Bovina V MLSB Constitutivo ermB
06003 2006 Bovina V MLSB Constitutivo ermB
06004 2006 Bovina NT MLSB Constitutivo ermB
06005 2006 Bovina V MLSB Constitutivo ermB
36%
32%
80%
Eritromicina
Clindamicina
Tetraciclina
Porcentagem de cepas resistentes
Figura 1 – Porcentagem de cepas de Streptococcus agalactiae de origem bovina resistentes à
20,8%
79,2%
Fenótipo M Fenótipo MLSB constitutivo
Figura 2 - Distribuição dos fenótipos de resistência à eritromicina e à clindamicina das cepas
20,8% 37,5% 8,3% 8,3% 8,3% 16,7% mefA ermB ermA + ermB ermA + mefA ermB + mefA Nenhum gene
Figura 3 – Distribuição específica dos genes pesquisados, utilizando a técnica de “PCR”,
entre as cepas de Streptococcus agalactiae de origens humana e bovina resistentes à eritromicina.
25,0%
54,2%
37,5%
ermA
ermB
mefA
Figura 4 - Distribuição geral dos genes pesquisados, utilizando a técnica de “PCR”, entre as
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 2000 pb 1200 pb 800 pb 400 pb 200 pb 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2000 pb 1200 pb 800 pb 400 pb 200 pb
Figura 5 – Avaliação da presença dos genes de resistência nas cepas de Streptococcus
agalactiae de origens humana e bovina analisadas. Canaletas 1 e 14: Padrão de massa molecular (Low DNA Mass Ladder); 2: Controle negativo (cepa 87149); 3: Controle positivo do gene ermB (cepa 015195) (616 pb); 4: Controle positivo do gene mefA (cepa 06196) (348 pb); 5: Controle positivo do gene ermA (cepa 53157) (206 pb); 6: cepa 80358 (origem humana; mefA); 7: cepa 81055 (humana; mefA); 8: cepa 03029 (bovina; ermA e mefA); 9: cepa 87165 (bovina; ermA e ermB); 10: cepa 87169 (bovina; mefA); 11: cepa 90180 (humana; mefA); 12: cepa 90184 I (humana; mefA); 13: cepa 96008 (humana; ermB e mefA); 15: cepa 02065 (humana, ermB); 16: cepa 96009 (humana; ermB e mefA); 17: cepa 02019 (humana; negativo para os 3 genes); 18: cepa 02031 (humana; negativo para os 3 genes); 19: cepa 02054 (humana; negativo para os 3 genes); 20: cepa 02056 (humana; negativo para os 3 genes); 21: cepa 06001 (bovina; ermB); 22: cepa 06004 (bovina; ermB).
