UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO CLEMENTINO FRAGA FILHO (HUCFF-UFRJ)
SERVIÇO DE ANATOMIA PATOLÓGICA
PROTOCOLO PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
Sonia Oliveira Souza
MATERIAIS: Pele, rim, nervo periférico, músculo, etc, obtidos por biopsia. FRAGMENTOS: 1 a 3 milímetros cúbicos.
FIXADOR: Glutaraldeído a 2,5 % em tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7,4.
SECÇÕES: Cortes semifinos, com 0,5 a 1,0 micrômetro e cortes ultrafinos, com 60 a 90 nanômetros. SOLUÇÕES (use balão volumétrico):
TAMPÃO CACODILATO DE SÓDIO 0,2 M, pH 7,4 [cacodilato de sódio = dimetilarsenato de sódio]
Cacodilato de sódio (C2H6AsOONa)✝... 32 gramas.
Água destilada ...até completar 1 litro.
✝BIOSSEGURANÇA: O cacodilato de sódio é tóxico, irritante e não inflamável, porém a sua combustão libera arsênio, monóxido de carbono e dióxido de carbono. Trabalhe em local ventilado. Evite ingeri-lo, inalá-lo, e o contato com a pele, mucosas, ou quaisquer partes do corpo.
TAMPÃO CACODILATO DE SÓDIO 0,3M, pH 7,4 [cacodilato de sódio = dimetilarsenato de sódio]
Cacodilato de sódio (C2H6AsOONa)✝... 48 gramas.
Água destilada ...até completar 1 litro.
✝BIOSSEGURANÇA: O cacodilato de sódio é tóxico, irritante e não inflamável, porém a sua combustão libera arsênio, monóxido de carbono e dióxido de carbono. Trabalhe em local ventilado. Evite ingeri-lo, inalá-lo, e o contato com a pele, mucosas, ou quaisquer partes do corpo.
FERROCIANETO DE POTÁSSIO A 1,6%
Ferrocianeto de potássio [K3Fe(CN)6]✝... 1,6 gramas. Água destilada ... até completar 100 mililitros.
✝BIOSSEGURANÇA: O ferrocianeto de potássio é tóxico, irritante e sensibilizante. Evite ingeri-lo, inalá-lo, e o contato com a pele, mucosas, ou quaisquer partes do corpo.
GLUTARALDEÍDO A 2,5 % EM TAMPÃO CACODILATO DE SÓDIO 0,2 M, pH 7,4 Solução aquosa de glutaraldeído a 25% [OHC(CH2)3CHO]✝... 10 mililitros.
Solução de cacodilato de sódio 0,2 M ... 90 mililitros.
✝BIOSSEGURANÇA: O glutaraldeído é corrosivo, irritante e sensibilizante. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do copo, além da roupa!
TETRÓXIDO DE ÓSMIO A 2% EM TAMPÃO CACODILATO DE SÓDIO 0,3 M Tetróxido de ósmio (OsO4)✝... 2 gramas.
Tampão cacodilato de sódio 0,3M ...até completar 100 mililitros.
✝BIOSSEGURANÇA: O TETRÓXIDO DE ÓSMIO É VENENOSO. USE-O COM EXTREMO CUIDADO. NÃO INALE OS SEUS VAPORES, POIS PODE LEVAR À MORTE. TRABALHE SOB CAPELA COM EXAUSTÃO. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas e quaisquer partes do corpo, além da roupa.
SOLUÇÃO DE ACETATO DE URANILA A 7% EM METANOL Acetato de uranila [UO2(CH3COO)2]✝... 7 gramas.
Metanol (CH3OH)✝...até completar 100 mililitros.
Armazene em frasco escuro (âmbar) e no refrigerador.
✝BIOSSEGURANÇA: O acetato de uranila é muito tóxico. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do copo, além da roupa. Trabalhe em capela com exaustão! O metanol é muito tóxico, inflamável e combustível. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele e as mucosas, além da roupa. Mantenha longe de fontes de calor e de combustíveis. Use roupa protetora.
SOLUÇÃO DE BORATO DE SÓDIO (BÓRAX) A 1%
Borato de sódio (Na2B4O7)...1 grama.
Água destilada ...até completar 100 mililitros. SOLUÇÃO DE AZUL DE TOLUIDINA O A 2% EM BORATO DE SÓDIO A 1%
Azul de toluidina O (C.I. 52040)...2 gramas. Solução de borato de sódio a 1%... até completar 100 mililitros.
SOLUÇÃO DE SACAROSE 0,4 M
Sacarose ... 136,8 gramas. Água destilada ...até completar 1 litro.
PROCEDIMENTO:
1. Clive os fragmentos obtidos por biopsia deixando-os com 1 a 3 milímetros cúbicos para facilitar a
fixação.
2. Deixe em solução de glutaraldeído a 2,5 %, em tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7,4, por 2 horas
até 24 horas, a 4oC.
3. Lave em solução (1:1) de tampão cacodilato de sódio 0,2 M, pH 7,4 + sacarose 0,4 M, duas vezes, 10
minutos em cada, a 4oC. (Nota: a sacarose mantém a osmolaridade em 360 a 400 mOsm).
4. Fixe em solução (1:1) de tetróxido de ósmio a 2%, em tampão cacodilato de sódio, 0,3 M + ferrocianeto de potássio a 1,6%, por 1 hora, a 4oC, para manter a osmolaridade em torno de 360 a 400 mOsm (Nota: o ferrocianeto de potássio aumenta o contraste da membrana citoplasmática).
5. Lave em água destilada, por duas vezes, rapidamente.
6. Desidrate em soluções aquosas crescentes de etanol a 30%, 50%, 70% e 90%, 10 minutos em cada. A
seguir em etanol a 100%, 3 vezes, 10 minutos em cada.
7. Desidrate na solução (1:1) de etanol a 100% + óxido de propileno, por 15 minutos.
✝BIOSSEGURANÇA: O óxido de propileno (CH3CH[O]CH2) é irritante, sensibilizante, combustível e inflamável. Evite
inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do copo, além da roupa. Mantenha-o longe de fontes de calor e de outros inflamáveis e combustíveis!
8. Desidrate em óxido de propileno puro, 2 vezes, 10 minutos em cada.
9. Faça a impregnação (infiltração) em solução (1:1)de resina epoxi (epoxídica) (Epon 812) + óxido de propileno, por 1 hora, em temperatura ambiente.
10. Faça a impregnação (infiltração) com resina epoxi (epoxídica) (Epon 812) pura, durante 2 dias, por
meio de várias trocas durante o dia, para a extração completa dos desidratantes e a substituição total pela resina epoxi.
11. Faça a inclusão (emblocamento) por meio de formas de silicone, em estufa a 60oC, durante 48 horas,
para a confecção dos blocos de resina epoxi.
12. Faça, em ultramicrótomo, cortes semifinos, com 0,5 a 1,0 micrômetro, e core-os em solução aquosa de azul de toluidina a 1% em borato de sódio (bórax) a 1% (mantém o pH alcalino, facilitando a
coloração), para observação ao microscópio óptico.
13. Faça, em ultramicrótomo, cortes ultrafinos com 60 a 90 nanômetros e contraste-os com acetato de uranila (acetato de urânio) a 7% em metanol, durante 50 minutos, e citrato de chumbo (segundo
Reynolds), durante 10 minutos, para a observação em microscópio eletrônico de transmissão.
REFERÊNCIA:
Reynolds, E.S. – The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.
