UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO
VIVIAN CHIACCHIO BUCHIGNANI
AÇÃO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NO PROCESSO
DE REPARO ÓSSEO DE RATOS
BAURU
2015
VIVIAN CHIACCHIO BUCHIGNANI
AÇÃO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NO PROCESSO
DE REPARO ÓSSEO DE RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Oral do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Sagrado Coração como parte dos requisitos para a obtenção do titulo de mestre em Biologia Oral, área de concentração Biologia Oral, sob orientação da Profa. Dra. Pâmela Letícia dos Santos.
BAURU
2015
Buchignani, Vivian Chiacchio B9196a
Ação do LASER de baixa intensidade no processo de reparo ósseo de ratos / Vivian Chiacchio Buchignani. -- 2015.
39f. : il.
Orientadora: Profa. Dra. Pâmela Letícia dos Santos. Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade do Sagrado Coração – Bauru – SP.
1. Terapia a LASER de Baixa Intensidade. 2. Reparo ósseo. 3. Ratos. I. Santos, Pâmela Letícia dos. II. Título.
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Profa. Dra. Pâmela Letícia dos Santos, sem ela esse trabalho Jamais seria realizado. A maneira honesta, justa e simples com que conduziu esse trabalho me trouxe muito ensinamento, confiança e admiração pela senhora. Obrigada pela confiança, pela compreensão em saber que eu iniciava o curso de mestrado com uma neném de apenas seis meses, sempre disposta a manter um horário bom para mim, intercalando entre mamadas para a neném e tarefas a realizar. Sou grata a Deus por ter colocá-la em meu caminho. Espero não tê-la decepcionado. Obrigada por acreditar em mim, me incentivar. Serei eternamente grata por tudo o que me proporcionou e espero que nossa amizade se fortaleça cada vez mais. Muito obrigada. Fica aqui minha admiração e gratidão ao seu noivo Aroldo, o qual sempre me recebeu muito bem.
Ao meu marido, Daniel, por todo amor, carinho, companheirismo. Agradeço a Deus por ter você em minha vida. Obrigada pela compreensão e paciência, sei que não foi fácil. Obrigada também por compartilhar minhas conquistas, sempre torcendo, incentivando e me acalmando. Que Deus abençoe para sempre o nosso AMOR. Obrigada meu AMOR, por entender meus sonhos e sonhar comigo. Te amo muito!
A minha filha, Maria Júlia, por ser tão pequena, mas tão grande ao mesmo tempo, minha razão de viver. Obrigada por compreender minha ausência. Te amo eternamente!
A minha mãe, Marilda, por ser o alicerce da minha vida. Sempre me incentivando em acreditar nos meus sonhos. Você será fundamental na minha vida. Te amo muito!
A minha irmã, Marcela, que sempre esta e esteve ao meu lado, me apoiando, acalmando, incentivando, minha amiga. Te amo muito minha irmã.
A minha tia, Marisa, minha segunda mãe, que cuidou com todo carinho da minha filha, nas minhas ausências, para que eu pudesse realizar este sonho. Tenho um grande carinho por você, e por tudo o que me fez até hoje, sempre me tratando como filha. Muito obrigada. Amo você.
A minha sogra, Zara, e ao sogro, João Cicero (Ciro), sempre presentes em minha vida, torcendo muito pelo meu sucesso. Acolheram-me como filha, tenho um grande carinho por vocês.
Agradecimento especial a Deus, as pessoas que sempre o Senhor colocou em minha vida. Obrigada por me proteger, guiar e estar ao meu lado todos os dias. Este trabalho jamais seria concluído senão fosse a fé! Fé de que tudo daria certo se fosse realizado com muito esforço e dedicação.
A Profa. Dra. Jessica Lemos Gulinelli, obrigada pelas suas dicas, companheirismo nos procedimentos cirúrgicos das ratas. Fica aqui minha admiração e gratidão.
Aos meus colegas de mestrado:
- Antonio Carlos Medina Junior (Medina), obrigada pela amizade, troca de experiências, pelo colega de profissão. Amizade que vem desde a graduação e que durará para a vida toda. Você é um guerreiro, um homem honesto, digno, desejo todo sucesso do mundo para você.
- Ao Prof. Dr. Rodrigo Ricci Vivan (Digão), pelo exemplo de profissional que é. Sempre sendo nosso professor particular, companheiro, sempre dividindo sua sabedoria. Amigo de coração.
- A Vanessa Greatti, minha colega de mestrado, que se tornou uma grande amiga. Uma mulher de garra, terá um futuro brilhante, tenho certeza que logo estará no lugar que merece. - Ao colega de mestrado e oficial “pegador das ratinhas”, Evandro Germano, sem sua ajuda essa pesquisa também não seria possível. Sempre disposto em ajudar e sempre lá na hora que fosse, o meu muito obrigada.
- Ao Dr. Jordan Lima, muito obrigada pelo auxilio na cirurgia das ratas.
Aos responsáveis do biotério da USC, Alexandre e Deivide por cuidarem tão bem dos nossos animais. E a veterinária Camile Bermejo Andreo, sua ajuda foi fundamental para esta pesquisa, muito obrigada.
A Dra. Aline Castilho, a que me incentivou a vir fazer o curso de mestrado, sempre pronta para me ajudar. Não esqueço o dia que ela me mandou um email dizendo “venha fazer mestrado conosco...”. Minha eterna gratidão.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar o processo de reparo ósseo em tíbia de ratas submetidas a LASER terapia de baixa potência (LLLT), por meio de análise histomorfométrica. Para isto foram utilizadas 20 ratas albinas adultas (Rattus norvegius
albinus, Wistar), as quais foram distribuídas em dois grupos, de acordo com o tratamento:
Grupo Controle (GC) - animais submetidos à criação do defeito ósseo na tíbia esquerda sem aplicação de LLLT; e Grupo Experimental (GL) - animais submetidos à criação do defeito ósseo na tíbia direita e a uma única sessão de LLLT. Foram confeccionados os defeitos ósseos de 2 mm nas tíbias dos animais de todos os grupos. No pós-operatório imediato foi aplicado na tíbia direita dos animais do grupo GL, LLLT na dose total de 32 J/cm2com potência de 0,03 W durante 133 segundos por ponto. Após os períodos de 14 e 28 dias da aplicação do LASER, os animais foram submetidos à eutanásia para a remoção dos espécimes. Após a obtenção dos espécimes seguiu-se o processamento histológico para inclusão em parafina e, posteriormente análise histomorfométrica. O grupo GL apresentou maior neoformação óssea quando comparado com o grupo GC. Baseado nos resultados deste estudo, pode-se concluir que a utilização do LLLT foi capaz de acelerar o processo de reparo ósseo e aumentar a área de tecido ósseo neoformado, apenas com uma aplicação do LASER no pós-operatório imediato.
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the bone repair process in the tibia of rats to low-power laser therapy (LLLT), by histomorphometric analysis. For this we used 20 adult albino rats (Rattus norvegius albinus, Wistar), which were divided in to two groups according to treatment: Control Group (CG) - animals submitted to the creation of the bone defect in the left tibia without application of LLLT; and Experimental Group (GL) - animals submitted to the creation of the bone defect in the right tibia and a single session of LLLT. Bone defects in the tibia 2mm animals from all groups were prepared. In the immediate postoperative period was applied to the right tibia of animals the GL group, LLLT at a total dose of 32 J / cm2com power of 0.03 W at 133/2 per point. After periods of 14 and 28 days after the application of the laser, the animals were sacrificed for removal of specimens. After obtaining the specimens followed by histological processing for paraffin embedding and later histomorphometric analysis. The GL group had higher bone formation compared to the control group. Based on the results of this study, it can be concluded that the use of LLLT was able to accelerate the bone healing process and increase the area of newly formed bone tissue, with only one application of LASER in the immediate postoperative period.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA ... 8
2 OBJETIVO ... 13 3 MATERIAL E MÉTODO... 15 3.1 ANIMAIS ... 16 3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ... 16 3.3 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO ... 17 3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO ... 20 3.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA ... 20 3.6 ANÁLISE HISTOMÉTRICA ... 20 3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 21 4 RESULTADOS ... 22 4.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA ... 23 4.1.1 Período de 14 dias ... 23 4.1.2 Período de 28 dias ... 23 4.2 ANÁLISE HISTOMÉTRICA ... 26 5 DISCUSSÃO ... 28 6 CONCLUSÃO ... 31 REFERÊNCIAS ... 33
APÊNDICE A - DESCRIÇÃO DOS PRINCIPAIS ESTUDOS RELACIONADOS A PROCESSO DE REPARO ÓSSEO EM TÍBIAS DE RATOS E TERAPIA COM LASER DE BAIXA INTENSIDADE ... 37
ANEXO A - CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NA EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL ... 39
1 INTRODUÇÃO E
REVISÃO DA LITERATURA
1 Introdução e Revisão da Literatura 9
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA
A reparação óssea se mostra um complexo processo regenerativo onde se pode incluir a interação de processos biológicos, entre esses, a ação de uma grande quantidade de células e proteínas e a síntese ativa de genes, sendo esses os principais determinantes a integrar restauração do tecido ósseo.1 Porém, defeitos resultantes de patologias ósseas severas e traumas, podem ser um dos problemas nas cirurgias reconstrutivas craniofaciais e ortopédicas, pois geram deficiência na regeneração e não formação óssea.2
Devido a essas limitações na formação óssea, em defeitos críticos, alternativas clínicas estão sendo desenvolvidas para acelerar o reparo ósseo, incluindo a utilização de enxertos ósseos autógenos, implantes homógenos, materiais bioativos, aplicação de proteínas ósseas morfogenéticas e a terapia com LASER.3
A palavra LASER é uma sigla de origem inglesa (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation). O primeiro emissor de LASER surgiu na Califórnia (USA) em 1960, criado por Theodore Maiman (1960), com 694,3nm e tendo como ativador o rubi.4
O LASER libera uma radiação eletromagnética não ionizante, sendo essa emissão de radiação monocromática (um comprimento de onda), por isso sua densidade de energia concentra-se em pequenos pontos. Pode-se classificar o LASER segundo sua densidade de potência, medida em watts, como sendo: (1) Cirúrgico/Cruento/Alta Potência – utilizados para procedimentos de corte e coagulação de tecido, nesses incluem o LASER de Argônio, LASER de neodinio-Itrio, Alumina e Garnete (Nd-YAG), LASER de Dióxido de Carbono (CO2); (2) LASER Terapêutico ou de Baixa Potência - no qual a função está relacionada com a ativação da luz, exemplos LASER de Hélio e Neônio (He-Ne), LASER Arsênio e Gálio (AsGa) e Arsênio-Galio-Alumínio (AsGaAl).5
Dentre os tipos de LASER supracitados, destaca-se o LASER de baixa intensidade (LLLT), o qual é usado na prática odontológica, com a finalidade de reduzir a dor, acelerar o processo de reparo em feridas, reduzir o processo inflamatório e induzir a proliferação de fibroblastos gengivais.4
Além disso, acelera o metabolismo no processo do reparo ósseo, pois estimula a diferenciação de células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos e, consequentemente a proliferação celular e aumento na formação de matriz óssea.6
1 Introdução e Revisão da Literatura 10
Pretil et al.5 estudaram o efeito do LASER de baixa intensidade (GaAlAs) nos defeitos criados em mandíbulas de ratos, nos períodos de 14, 45 e 60 dias. Para essa pesquisa, foram utilizados 30 ratos Holtzman, divididos em dois grupos: (1) grupo controle – sem aplicação de LASER, e (2) grupo LASER – LASER aplicado diariamente na área do defeito por 40 segundos. Os autores concluíram que o grupo LASER apresentou uma resposta mais rápida de formação de matriz óssea aos 15 e 45 dias, em comparação ao grupo controle, por outro lado não houve diferença significativa entre os grupos no período de 60 dias.
Blaya et al.7 avaliaram histologicamente o efeito de tipos de LASER de 830nm e 685nm, em 18 ratos Wistar, divididos em 3 grupos: (1) controle – sem aplicação de LASER, (2) LASER 830nm infravermelho, e (3) LASER 685nm. Os animais foram irradiados em intervalos de 48 horas, começando imediatamente após o preparo do defeito até serem submetidos a eutanásia, nos períodos de 15, 21 e 30 dias. Os autores concluíram que houve maior grau de formação de osso novo e regeneração vertical, nos grupos irradiados.
Segundo Gerbi & Pinheiro8 em 2010, o LASER de baixa potência tem efeito fotoquímico, na luz visível (até 780nm), e fotofísico e/ou fotoelétrico no infravermelho (entre 780-830nm), provocando mudanças no potencial de membrana e causando um aumento da síntese de trifosfato de adenosina (ATP), favorecendo reações que intervém no metabolismo celular.
A ação do LASER de baixa intensidade no aumento da enzima ciclo-oxigenase-2 (Cox-2) já foi pesquisado no reparo de defeitos ósseos em tíbias de ratos,9-10 indicando uma significativa atuação do LASER em nível molecular e contribuindo para uma pequena fração de sua biomodulação sobre o reparo ósseo.
O processo de consolidação óssea em defeitos criados em tíbias de coelhos tratados com LASER de baixa intensidade (830nm, 100mW, 120J/cm2) foi avaliado por meio das análises biomecânica e histológica do calo ósseo, concluindo que o LASER foi capaz de acelerar o processo de reparo ósseo em ratos.1
O efeito do LASER de baixa intensidade também foi investigado por Nascimento et al.11 em 2010, nesse estudo o reparo ósseo foi avaliado em ratas castradas bilateralmente. Para isto, os animais foram divididos em quatro grupos: controle (somente criação do defeito ósseo), tratados com calcitonina de salmão, tratados com LASER de baixa intensidade AsGa e tratados com calcitonina de salmão e LASER, nos períodos de 7,14 e 21 dias, por meio de análise densiométrica. Conclui-se que os grupos que utilizaram o de tratamento com LASER
1 Introdução e Revisão da Literatura 11
obtiveram maior grau de regeneração óssea nos períodos de 14 e 21 dias, bem como maior densidade óssea comparado com os grupos controle e calcitonina de salmão.
Fáravo-Pípi et al.12 em 2011, avaliaram o reparo ósseo em defeitos ósseos não críticos submetidos a terapia a LASER iniciada 24 horas e continuada com intervalos de 48 horas até completar 12 sessões, por meio da análise histológica e imunoistoquímica. Nesse estudo, conclui-se que houve uma melhora no processo de reparo ósseo principalmente nos períodos tardios.
Em 2012, Perussi et al.13 avaliaram o efeito do LASER Er,Cr:YSGG no reparo de tecido ósseo e mole, nos períodos de 3,7,15 e 30 dias, constatando uma rápida e maior formação óssea, comparado ao grupo sem aplicação do LASER.
Garcia et al.3 em 2013, estudaram o processo de reparo ósseo em calvaria de ratos tratados com LASER terapia de baixa intensidade (660nm) aplicado imediatamente após o procedimento cirúrgico e concluíram que houve uma estimulação na formação óssea.
No mesmo modelo experimental supracitado, porém em tíbia, Fernandes et al.14 em 2013, avaliaram o processo de reparo ósseo em defeitos criados na tíbia de ratos submetidos a tratamento com LASER (830nm), nos períodos 3 e 5 dias pós-operatórios e concluíram que os grupos tratados havia maior controle no processo inflamatório e o processo de reparo ósseo ocorreu de forma mais precoce do que no grupo sem terapia com LASER.
Barbosa et al.15 em 2014, estudaram radiograficamente o processo de reparo ósseo tratados com LASER terapia de λ: 660nm G e λ: 830nm G, em fêmur de ratos, nos períodos de 7, 14 e 21 dias e concluíram que houve uma completa regeneração óssea para os dois tipos de LASER.
Em 2014, Sella et al.16, investigaram o efeito da terapia com LASER de baixa intensidade na reparação óssea em fraturas de fêmur de ratas, nos períodos de 8, 13 e 18 dias. Para isto, os pesquisadores utilizaram 60 ratas divididos em dois grupos: (1) ostectomia associado a terapia com LASER, e (2) ostectomia associado a terapia com LASER em ratas ovarectomizadas. Nesse estudo os autores concluíram que o LASER de baixa intensidade desempenha papel importante no aumento da formação de tecido ósseo, o que é relevante para o reparo da fratura.
Tendo em vista a influência do LASER no processo de reparo ósseoe a ausência de um protocolo de dosagem e forma de aplicação do LASER, considerou-se relevante avaliar a
1 Introdução e Revisão da Literatura 12
dinâmica do processo de reparo ósseo em tíbias de ratas tratadas em uma única sessão com LASER terapia de baixa potência, por meio da análise histomorfométrica.
2 Objetivo 14
2 OBJETIVO
Avaliar o processo de reparo ósseo em defeitos críticos criados em tíbias de ratas submetidas a uma sessão de terapia com LASER de baixa potência (LLLT), no pós- operatório imediato, por meio da análise histomorfométrica.
3 Material e Método 16
3 MATERIAL E MÉTODO
3.1 ANIMAIS
Foram utilizadas 20 ratas fêmeas (Rattus norvegius albinus, Wistar), com cinco meses de idade e aproximadamente 350gramas, provenientes do Biotério da Universidade Sagrado Coração (USC). Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno, forradas com maravalha branca de pinho autoclavada trocada três vezes por semana. Durante todo o período experimental, os animais permaneceram no biotério da Universidade do Sagrado Coração – USC - Bauru, sob condições controladas de temperatura (22 ± 2oC) e ciclo de luz de 12 horas claro/escuro, recebendo água e ração sem restrição. O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da USC – Bauru com número de protocolo 006/13 (Anexo A).
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Os animais foram distribuídos em 2 grupos: (GC) Grupo Controle - animais submetidos à criação do defeito ósseo na tíbia esquerda sem aplicação de LASER; e (GL) Grupo Experimental - animais submetidos à criação do defeito ósseo na tíbia direita e a sessão de LASER terapia de baixa potência (Fluxograma 1).
Fluxograma 1 - Delineamento experimental. 20 ratas 40 tíbias Controle 14 dias (n=10) 28 dias (n=10) Experimental 14 dias (n=10) 28 dias (n=10)
3 Material e Método 17
3.3 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Os animais foram submetidos à sedação por meio de injeção intramuscular do sedativo Cloridrato de Xilazina (Virbaxyl 2%, Virbac Ltda., São Paulo, Brasil), associado ao anestésico Ketamina a 1% (Francotar, Virbac Ltda., São Paulo, Brasil), na dosagem recomendada pelo fabricante.
Em seguida, foi realizada tricotomia das tíbias direita e esquerda, e antissepsia da região a ser incisada com Polivinil Pirrolidona Iodo Degermante (PVPI 10%, Riodeine Degermante, Rioquímica, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil), associado ao PVPI tópico. Após a degermação, os animais receberam anestesia local por meio de cloridrato de mepivacaína (0,3 ml/Kg, Scandicaine 2% com adrenalina 1:100.000, Septodont, França) para auxiliar na hemostasia do campo operatório (Figura 1).
Figura 1 - Tricotomia na tíbia e antissepsia realizada.
Com uma lâmina número 15 (Feather Industries Ltda., Tókio, Japão) montada em cabo de bisturi n° 3 (Hu-Friedy, Alemanha), foi realizada uma incisão de aproximadamente 1 cm de comprimento na porção medial das tíbias, até a base óssea e, a seguir, o tecido mole foi divulsionado e afastado com o auxílio de descoladores de periósteo, expondo o tecido ósseo (Figuras 2 e 3).
3 Material e Método 18
Figura 2 - Incisão na tíbia. Figura 3 - Descolamento dos tecidos e exposição do osso tibial.
Posteriormente, foi realizada a criação do defeito ósseo de dois milímetros de diâmetro, na cortical superior das tíbias da rata. O preparo de defeito ósseo foi realizado por meio da ostectomia utilizando uma fresa lança acoplada a um motor elétrico com irrigação constante com cloreto de sódio a 0,9% (Darrow, Rio de Janeiro, Brasil), durante toda a preparação (Figura 4).
Figura 4 - Defeito ósseo de 2mm criado na tíbia.
A irradiação LASER foi realizada imediatamente após a fresagem, nas regiões de defeitos ósseos criados cirurgicamente. Os animais do Grupo Experimental foram irradiados com LASER arseneto de gálio alumínio (ArAlGa), (Photon Lase, DMC, São Carlos, São Paulo, Brazil), com comprimento de onda de 808nm, tamanho do ponto de 0,07cm2, potência de 0,03 W durante 133 segundos por ponto, irradiância de 0,42W/cm2 e energia de 4J/ponto (57,14J/cm2/point). A área recebeu um total de energia de 32J. A aplicação foi realizada uma vez em oito pontos ao redor do defeito ósseo, em contato com o tecido ósseo, e também em um ponto central do defeito ósseo (Figura 5). No grupo controle, não houve aplicação do LASER.3
3 Material e Método 19
Figura 5 - Aplicação do LASER.
Os tecidos moles foram cuidadosamente reposicionados e suturados em planos empregando-se fio absorvível (Poligalactina 910 – Vycril 4.0, Ethicon, Johnson Prod., São José dos Campos, Brasil) com pontos contínuos no plano profundo e com fio monofilamentar (Nylon 5.0, Ethicon, Johnson, São José dos Campos, Brasil) com pontos interrompidos no plano mais externo, obtendo-se o fechamento primário da ferida. Após a sutura novamente foi realizada a antissepsia da área com Polivinil Pirrolidona, iodo Tópico (PVPI 10%, Riodeine, Rioquímica, São José do Rio Preto) (Figura 6).
Figura 6 - Sutura finalizada.
No pós-operatório os animais receberam administração intramuscular de Pentabiótico (0,1mL/Kg, Fort Dodge Saúde Animal Ltda., Campinas, São Paulo, Brasil) com uma dose no pós-operatório imediato e de Dipirona Sódica (1mg/kg/dia, Ariston Indústrias Químicas e Farmacêuticas Ltda., São Paulo, Brasil) totalizando 3 doses. Nenhuma restrição alimentar ou de movimentação foi imposta aos animais.
Nos períodos de 14 e 28 dias do início da aplicação do LASER, os animais foram submetidos à eutanásia por meio de sobredosagem anestésica para a remoção dos espécimes.
3 Material e Método 20
3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
As amostras de tíbias, contendo a região do defeito ósseo, foram removidas e imersas em formalina neutra tamponada a 10%, durante 48 horas. Em seguida, foi realizada a descalcificação das mesmas em ácido etileno-diaminotetracético (EDTA) a 5%, por 3 meses. Finalizado o processo de descalcificação, as peças foram lavadas em água corrente por 24 horas, desidratadas, diafanizadas e incluídas em parafina. A partir dos blocos de parafina contendo porções de tíbia foram obtidos cortes longitudinais de 5 e 6 µm de espessura. Cortes seriados de 6 µm no sentido longitudinal foram corados com hematoxilina e eosina (HE), e posteriormente foram utilizados para a análise morfológica do processo de reparo ósseo ocorrido nos diferentes grupos estudados.
3.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA
Para a avaliação morfológica foram considerados o padrão do infiltrado inflamatório, neoformação, maturação, remodelação e viabilidade óssea. As imagens foram obtidas por meio de uma câmera de captura de imagem com resolução de 1,3 megapixels (Leica DFC 300FX, Leica microsystems, Heerbrugg, Switzerland) acoplada a um microscópio de luz comum e ao computador (Leica Aristoplan Microsystems-Leitz, Benshein, Alemanha).
3.6 ANÁLISE HISTOMÉTRICA
Para a análise histométrica, foi realizada a individualização e delimitação da área do defeito correspondente à região da cortical das tíbias, esta área foi denominada Área Total (AT). Dentro da Área Total (AT), realizou-se a delimitação das áreas correspondentes ao osso neoformado obteve-se área de osso neoformado (AON). Sempre usando os recursos do “software” ImageJ, procedeu-se ao cálculo da Área Total (AT) anteriormente delimitada, transferindo os valores medidos para uma “Planilha de Cálculos”, sendo o valor da Área Total (AT) considerado como 100% da área total analisada. A seguir, o cálculo da Área de Osso Neoformado (AON), anteriormente delimitada, também foi realizado, transferindo os valores medidos para outra “Planilha de Cálculos”. O valor de AON foi calculado como uma porcentagem de AT, da seguinte forma:
3 Material e Método 21
Medida de AT = 100% da área analisada AON% = 100 x AON
AT
Os valores de AON de cada animal foram usados para o cálculo das médias e dos desvios-padrão de cada grupo.
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a comparação entre os valores médios obtidos nos diferentes grupos e períodos experimentais, foi realizado o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov, em seguida, foi realizado o teste paramétrico t-test(α = 5%).
4 Resultados 23
4 RESULTADOS
Os resultados obtidos foram descritos após a análise qualitativa das seguintes estruturas do defeito ósseo: bordas do defeito, morfologia do tecido ósseo neoformado, características do tecido conjuntivo (disposição e organização celular), tipo de infiltrado inflamatório e remanescentes do substituto ósseo após 14 e 28 dias pós-operatórios. Na pesquisa, não foi observada evidencia macroscópica de infecção.
4.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA
4.1.1 Período de 14 dias
Em todos os espécimes, do grupo controle (sem aplicação de LASER) a loja cirúrgica encontra-se preenchida por tecido conjuntivo sem diferenciação óssea contendo fibroblastos e fibras colágenas dispostas de forma desorganizada, sem a presença de infiltrado inflamatório, caracterizando um tecido ósseo imaturo. Nas margens do defeito esse tecido é pouco vascularizado e apresenta aumentado no número de fibroblastos, sendo possível observar apenas o osso remanescente. Já o centro do defeito esta preenchido em sua maior parte por tecido conjuntivo e finas trabéculas ósseas em algumas regiões (Figuras 7, 8 e 9).
No grupo experimental (com aplicação de LASER), nota-se o defeito preenchido com tecido ósseo neoformado e discretas áreas de tecido conjuntivo. Nas regiões de margem, observaram-se trabéculas ósseas neoformadas rodeadas por tecido conjuntivo organizado, com presença de vasos sanguíneos. No centro da loja cirúrgica, além das trabéculas ósseas neoformadas estarem envoltas por tecido conjuntivo, o mesmo aparece na região superior do defeito com fibroblastos e fibras colágenas dispostos paralelamente (Figuras 7, 8 e 9).
4.1.2 Período de 28 dias
No grupo controle, em uma vista panorâmica do defeito ósseo nota-se o início do preenchimento ósseo (Figura 7). Nas bordas, há presença de trabéculas ósseas espessas com reduzido espaço intertrabecular, e não há tecido conjuntivo próximos a essa região. Também visualiza-se a linha cimentante. Na região central, o defeito é preenchido com tecido conjuntivo desorganizado com a presença de trabéculas ósseas maduras (Figura 8 e 9).
4 Resultados 24
Em todos os espécimes do grupo experimental, nota-se aos 28 dias, a loja cirúrgica preenchida completamente por trabéculas ósseas desenvolvidas com ausência de tecido conjuntivo (Figuras 8 e 9).
Figura 7 - Fotomicrografias de cortes corados com hematoxilina e eosina nos períodos pós-operatórios
de 14 e 28 dias. Processo de reparo após osteotomia sem aplicação de LASER (grupo controle, à esquerda) e com aplicação de LASER (grupo experimental, à direita). Aumento original de 40x.
4 Resultados 25 F ig u ra 8 -F o to m ic ro g ra fia s d e c o rte s c o ra d o s co m h e m ato x ilin a e eo si n a n o s p er ío d o s p ó s-o p er ató rio s d e 1 4 e 2 8 d ia s. P ro ce ss o d e r ep ar o a p ó s o st eo to m ia s e m ap li ca çã o d e L A S E R ( g ru p o c o n tr o le , à es q u er d a) e c o m a p lic aç ão d e L A S E R ( g ru p o e x p er im en ta l, à d ir eit a) . R eg iõ es d e b o rd a d ir eita ( A , D , G , J) , ce n tr o ( B , E , H , L ) e b o rd a es q u er d a d o d e fe ito ( C , F , I, M ), n as q u ai s h á p re se n ça d e o ss o r em an e sc en te ( O R ), t ec id o c o n ju n tiv o ( T C ), o ss o n eo fo rm ad o ( O N ), o ss o m ad u ro ( M ) e lin h a ci m en ta n te ( se ta ). A u m en to o ri g in al d e 1 0 0 x .
4 Resultados 26
Figura 9 - Fotomicrografias de cortes corados com hematoxilina e eosina nos períodos
pós-operatórios de 14 e 28 dias. Processo de reparo após osteotomia sem aplicação de LASER (grupo controle, à esquerda) e com aplicação de LASER (grupo experimental, à direita). Nota-se a presença de osso remanescente (OR), tecido conjuntivo (TC), osso neoformado (ON) e osso maduro (M). Aumento original de 400x.
4.2 ANÁLISE HISTOMÉTRICA
A análise histométrica foi realizada entre os grupos no mesmo período e entre os períodos do mesmo grupo, obtendo os seguintes resultados.
No grupo controle, comparando os períodos, nota-se que há uma tendência a diminuição de tecido ósseo com o decorrer dos tempos avaliados, com média e desvio padrão de 45,2 ± 32,34% para 14 dias e 35,43 ± 28,26% para 28 dias, porém sem diferença estatisticamente significante (p=0,993).
No grupo experimental, foi observado tecido ósseo neoformado em maior quantidade no tempo final, com média de 64,13 ± 3,51% e 97,3 ± 2,16% para os períodos de 14 e 28 dias, respectivamente. Após a análise estatística, confirmou-se que houve diferença estatisticamente significante na comparação dos períodos estudados para o grupo experimental com p≤0,001.
4 Resultados 27
No período de 14 dias, foi observado maior formação de tecido ósseo preenchendo o defeito criado cirurgicamente, no grupo experimental quando comparado ao grupo controle, porém não houve diferença estatística entre os grupos para esse período (p=0,690). Já no período de 28 dias, houve diferença estatística na comparação dos grupos com p=0,012, com médias e desvio padrão supracitados (Tabela 1).
Tabela 1 - Valores, médias e desvios-padrão (DP), em porcentagem, para os grupos estudados, de acordo a
histometria.
Ratos
Períodos
14 dias 28 dias
Controle Experimental Controle Experimental
1 3,98 64,13 35,43 99,50 2 40,24 61,72 33,88 95,67 3 85,49 59,00 95,57 94,34 4 92,36 68,87 19,74 99,97 5 45,20 66,83 73,27 97,30 Média ± DP 45,20 ± 32,34 64,13 ± 3,51 34,43 ± 28,26 97,30 ± 2,16
5 Discussão 29
5 DISCUSSÃO
Pesquisas realizadas para avaliar o processo de reparo ósseo em defeitos submetidos a terapia com LASER, são amplas na literatura, tanto com modelo experimental em animal, como em humanos.1-10 Esse processo de reparo ósseo pode ser avaliado através do comportamento clínico, histológico, imaginológico e pela técnica de imunoistoquímica.1-16 Neste estudo, optou-se por ratas, como modelo experimental, sendo utilizada a porção medial da tíbia direita das ratas como área cirúrgica, pois essa área está localizada distante do centro de crescimento, a metáfise tibial.
O defeito ósseo é considerado crítico quando o mesmo não é preenchido completamente por tecido ósseo. Em tíbias de ratos, defeitos iguais ou superiores a 2 milímetros de diâmetro são considerado críticos.1,16-17 Assim nessa pesquisa, foi avaliado o processo de reparo ósseo em defeitos críticos, criados cirurgicamente em tíbias de ratas com 2 milímetros de diâmetro.
Vários estudos já foram realizados e relatam que o LASER é capaz de contribuir para a aceleração do processo de reparo ósseo. No entanto, não há um consenso na literatura sobre ao protocolo de aplicação do LASER de baixa intensidade (Apêndice A).
Alguns autores propõem o uso do LASER de baixa intensidade com a finalidade favorecer o reparo ósseo em tíbias de ratos, com uma aplicação no pós-operatório imediato e continuada com intervalos de 48 horas até completar 12 sessões ou até o período final do experimento, obtendo com essa terapia resultados positivos, isto é, reparo ósseo acelerado em relação aos grupos sem o tratamento com LASER.1,10,12,15,17
Em contrapartida, Riso et al.19 (2010), avaliaram a influência da LASER terapia no reparo ósseo, as aplicações foram padronizadas a cada 24 horas, totalizando 12 sessões, com intervalo de um dia após seis sessões consecutivas. Nesse estudo, evidenciou que o LASER de baixa potência não influenciou o processo de reparo ósseo. Todavia, Fernandes et al.14 (2013), realizaram o mesmo padrão de aplicação de LASER e concluíram que houve uma aceleração na regeneração óssea.
Marques et al.20 (2014) compararam dois protocolos de aplicação do LASER de baixa intensidade, para regeneração óssea:(1) aplicação transcutânea do LASER na região do defeito ósseo com intervalos de 48 horas por 15 dias; e (2) três sessões de LASER terapia, sendo a primeira no pós-operatório imediato, a segunda e a terceira transcutâneas, com
5 Discussão 30
intervalos de 48 e 120 horas do final do procedimento cirúrgico. Concluindo que no segundo protocolo, a formação óssea foi precoce em relação ao primeiro.
O protocolo de aplicação com sessão única no pós-operatório imediato, foi descrito por Perussi et al.13 (2012) e Garcia et al.3 (2013), com resultados positivos no processo de reparo ósseo.
Nesse estudo, corroborando com a pesquisa anterior, sugeriu-se a LASER terapia em uma única sessão no pós-operatório imediato, em defeitos críticos em tíbias de ratas, com a finalidade de avaliar a efetividade da aplicação única de LASER, por meio da análise histomorfométrica. Para a aplicação do LASER de baixa intensidade foram escolhidos oito pontos ao redor do defeito ósseo e um ponto central, e a aplicação foi realizada nesses pontos em contato direto com o tecido ósseo. Esse protocolo foi proposto principalmente pra reduzir o desconforto do paciente, visto que é um único atendimento.
Os resultados encontrados nesse estudo demonstraram que no GL, houve uma maior formação óssea comparando-o com o GC, no período de 14 dias. O defeito criado cirurgicamente no GL está completamente preenchido por tecido ósseo maduro, diferente do que é observado no GC, no qual nota-se a presença de tecido conjuntivo e tecido ósseo neoformado, no período de 28 dias, confirmando que o defeito de 2mm é critico para tíbia de ratos, por não haver completa formação óssea no defeito. Esses resultados corroboram com o encontrado na literatura, com o mesmo protocolo de aplicação de LASER, porém realizado em calvária de ratos.3
Embora os resultados desta pesquisa tenham sido encorajadores, novos estudos estão sendo realizados para avaliar o comportamento imunoistoquímico da LASER terapia em sessão única, e assim comprovar os benefícios.
6 Conclusão 32
6 CONCLUSÃO
Baseado nos resultados deste estudo pode-se concluir que apenas com uma aplicação do LASER de baixa intensidade (LLLT) no pós-operatório imediato, foi capaz de acelerar o processo de reparo ósseo e aumentar a área de tecido ósseo neoformado.
Portanto, o LASER de baixa intensidade pode ser indicado como uma ferramenta auxiliar na prática clínica para o tratamento de reparo ósseo e para um período pós-operatório mais confortável e mais rápido processo de regeneração óssea.
Referências 34
REFERÊNCIAS*
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20. Marques L, Holgado LA, Francischone LA, Ximenez JPB, Okamoto R, Kinoshita A. New LLLT protocol to speed up the bone healingprocess-histometric and
Apêndice 37
APÊNDICE A - DESCRIÇÃO DOS PRINCIPAIS ESTUDOS RELACIONADOS A PROCESSO DE REPARO ÓSSEO EM TÍBIAS DE RATOS E TERAPIA COM
Anexo 39
ANEXO A - CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NA EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL
