Rev. Pat. Trop. — (1): 4, 393-402, 1972
IMUNOLOGIA DA BLASTOMICOSE SUL AMERICANA -— Resultados preliminares na imunoprecipitação. *
WILLIAM BARBOSA *• JOANA ROSA MENDONÇA
LOPES DE OLIVEIRA "**
e RAQUELRESUMO
Estudamos soros de 24 pacientes, bem documentados, de blastomico-se sul americana.
De l a 12 amostras do mesmo so-ro foram testadas contra antígeno, extraído da forma leveduriforme do P. brasiliensis, em concentrações que variaram de 50 a 200 mg/ml, pela téc-nica de imunodifusão em suporte de agar a 2% e por imunoeletroforese em acetato de celulose e agarose a \%, Observamos o aparecimento de faixas de precipitação em número de l a 3 pela imunodifusão dupla e l a 4 faixas na zona do catódío na imu-noeletroforese. Não foram observa-das reações cruzaobserva-das com micoses profundas, comuns em nosso meio, nem falsa reação positiva em várias doenças, principalmente naquelas que clinicamente servem para diagnóstico diferencial de blastomicose sul ameri-cana, por se confundirem com ela, em nosso meio.
INTRODUÇÃO
A blastomicose sul americana de grande prevalência entre nós
adquire em Goiás, por condições desconhecidas, talvez ecológicas, de variação de cepas ou outras, aspectos clínicos inusitados. Fre-q u e n t e m ente observam-se em crianças e adultos jovens a for-ma linfático-abdominal, a forfor-ma disseminada aguda com lesões ósseas e menos comumente le-sões tegumentares de aspecto hanseniforme, quadros clínicos todos estes que se acompanham de alterações profundas do ele-troforegrama, algumas vezes se assemelhando a verdadeiras ga-mopatías parasitárias, isto quan-do se analisa apenas o perfil ele-troforético em papel de filtro (l, 2, 3, 4, 6).
Por outro lado, admite-sc ha-ver correlação entre as alterações eletroforéticas, evolução clínica da doença e presença de certos anticorpos no soro desses pacien-tes, dentre eles precipitinas (l,
6, 9).
• Trabalho realizado no Instituto de Patologia Tropical (1PT) da Universidade Federal de Goiás (UFGO), com auxílio da COPERCOPE.
'• Professor Titular do Departamento de Medicina Tropical do IPT/UFGO. •** Técnicos de Laboratório do IPT/UFGO.
.194 Rcv. |>ul. I r u p • - H): 4, ( l i i l i i l m i / l > i v r i i i l > i < > . MÍ72
Sabc-sc que as técnicas ilc Imu-nodifusão, seja a dupla dífunAo de Ouchtcrlony seja u imunoele-troforcsc de Grabar, têm sido aplicadas com êxito no estudo imunológico de diversas micoses; (7, 8, 17), ao contrário, essas téc-nicas têm sido pouco usadas no estudo da blastomicose sul ame-ricana; todavia os dados frag-mentários existentes (10, 13, 15, 16, 18) nos permitem supor que grande importância poderá de-sempenhar o emprego destes mé-todos no conhecimento da imu-nologia dessa doença. Com efei-to, cm mais de 80% dos casos estudados e, com diferentes téc-nicas de imunodifusão, foram de-monstrados, nos casos em ativida-de, anticorpos precipitantes (16, 18).
Por esses motivos, após obten-ção do antígeno, testamo-lo con-tra soros de pacientes de blasto-micose sul americana bem docu-mentados, diagnosticados p e l o exame direto. Nos experimentos preliminares, usamos proporções variáveis do antígeno e imune-soro. Inicialmente, trabalhamos com o antígeno inteiro contra so-ros inteiso-ros, isto é, sem diluí-los, depois contra soros diluídos a 1/2, 1/4 e 1/8.
Logo, experimentamos o antí-geno sem diluir e diluído nas mesmas proporções anteriores contra soros diluídos e concen-trados duas ou três vezes.
Os resultados nos induziram a trabalhar com o antígeno diluído a 1/4 contra soros inteiros na reação de prova.
i num incin dt- s u p ó r t e da i'H|HTÍim'Mlamos vários, bem como puni niuilise imuno-ddrolnréllcn.
Teslimius, Inmbóm. a especifi-cidade do iinlífliMin cunlra soros de víirius doenças.
Estudamos, preliminarmente ao azar, amostras de soros tle pacientes de blastomicose sul americana pela imunodifusão cm gel de agar (lonagar) a 2% c pela imunoeletroforese em aceta-to de celulose.
Logo depois passamos a estu-das evolutivamente soros de 30 pacientes em agarose a l e 2% por imunodifusão e por imunoele-troforese.
Pela análise imunoeletrofoTC-tica, buscamos caracterizar linhas antigênicas comuns a todas as formas clínicas, e, por ventura, alguma sugestiva de indicar maior gravidade, traduzir imuni-dade ou dar algum informe sobre o prognóstico.
Na suposição de que anticor-pos macro-molecularcs, do tipo IgM, pudessem aparecer durante fases de reagudização da doença ou em sua fase inicial primária, buscamos investigar a conotação das taxas de imunoeglobulinas IgG, IgA c IgM, principalmente da última, aos valores semi-qunn-titativos da reacão de imunopre-cipítação em gel e aos valorei do eletroforegrama. Em alguns so-ros estudamos o comportamento da imunodifusão antes e após ci-são pelo mercaptoetanol. Como outro método, fizemos absorção específica dos anticorpos por sa-turação do soro com antígeno
cê-W. HnrhoMi &. cols. — Imunologia ilu Hlasieniicosc Sul Americana. . . 395
lular c repetimos as dosagcns de imunoglobulinas. Fizemos, ainda, a absorção inespecífica de anti-corpos com soros anti IgG e IgM alternadamente, e, após, repeti-mos a prova de imunodifusão dos soros de B.S.A. contra o antíge-no celular.
Nesse estudo evolutivo da imu-nologia da B.S.A., observamos, paralelamente, o comportamento dos anticorpos fixadores do com-plemento pelas técnicas de Mal-taner e Maltancr e pela mícro-técnica de Fulton e Dumbell. Bem como tivemos o ensejo de aproveitar as formas levedurifor-mes do P. brasiliensis dislipidi-zado, na investigação de anticor-pos fluorescentes pela técnica in-díreta.
A finalidade deste trabalho é dar conta das observações preli-minares da reacão de imunopre-cipitação em gel de agar (lona-gar) a 2% e da análise imuno-eletroforética em acetato de ce-lulose dos soros de pacientes com blastomicose sul americana fei-tos com antígenos extraídos da fase leveduriforme do P. brasi-liemis.
MATERIAL E MÉTODOS A n t í g e n o : Culturas de três cepas de P. brasiliensis (P.b.) isoladas no Laboratório de Mi-cologia do Instituto de Patologia Tropical serviram, indiferente-mente, para o preparo do antí-geno. O P. b. foi cultivado em garrafas tipo Roux em agar Sa-bureau por três meses, a 37°. Verificamos, posteriormente, que
o antígeno ativo poderia ser ob-tido já no 15.° dia de crescimen-to.
P r e p a r o d o a n t í g e n o : Removeu-se, delicadamente, com espátula, da superfície do meio, a massa cultivada e colocou-se em salina tamponada, mertiola-tada, lavou-se por centrifuga-ções sucessivas de 4 a 6 vezes. Ressuspendeu-se o sedimento em salina e rompeu-se as células por congelamento e descongelamento sucessivos, agitando-se sempre, brandamente, cm agitador univer-sal à baixa temperatura com au-xílio de pérolas de vidro. Em se-guida, submeteu-se o material a homogenização cm Virtis sob ba-nho de gelo — 20.000 rotações por minuto durante uma hora — (verificamos, depois, ser dispen-sável esse passo). Liofilizamos o material. Pesamos o liofilizado c acrescentamos salina tamponada de modo a obter a concentração de 200 miligramas por ml. Agi-tamos bem e guardamos em ge-ladeira por 24 horas depois do que centrifugou-se em centrífuga refrigerada a 4° C — 20.000 r.pm. O sobrenadanle foi o antí-geno usado neste trabalho.
I m u n e - s o r o:s: a) Específ i-cos-soros de 24 casos de blasto-micose sul americana bem docu-mentada representados por 110 amostras, variáveis em número de l a 15 para cada paciente, co-lhidos durante os anos de 1971 e 1972, com intervalos de uma semana (durante o período de internação) e suas respectivas alí-quotas, guardadas em geladeira u
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4° C ou cm congelador a menos 20° C até o seu uso, foram usa-dos nesta investigação.
Esses soros foram testados in-teiros contra o antígeno diluído a 1/4, 43 amostras foram retes-tadas concentradas duas vezes contra a mesma diluição do antí-geno.
b) T e s t e m u n h a s : — Em-pregamos 110 soros, 33 de malá-ria, 40 de leishmaniose tegumen-tar americana, 16 de Pênfigo Fo-Háceo sul americano e 22 com vários diagnósticos, dentre esses, l de doença de "Jorge Lobo", 6 de Cromomicose e 5 de Esporo-tricose, todos foram testados sem diluir contra o antígeno diluído a
1/4.
Todos os soros, tanto os espe-cíficos como os testemunhas, pro-vieram de pacientes atendidos 110 Departamento de Medicina Tro-pical do Instituto de Patologia Tropical e foram conservados com preservativo (azida sódica ou mertiolato) a 4° C ou a me-nos 20° C em congelador até o uso.
T é c n i c a s i m u n o l ó g i -c a s: — Dos soros espe-cífi-cos foram dosadas as proteínas com-parativamente pelo método do biureto (11) e por refratometria (refratometro de ABBÉ) e feita eletroforese em acetato de celulo-se. Paralelamente foram determi-nadas as imunoglobinas pela téc-nica de imunodifusão radial re-versa (*).
A dupla difusão em gel de Agar (ionagar, foi feita pela téc-nica Ouchterlony em lâmina de
* Técnica introduzida pelo Dr. William
microscopia (14), e a imunoele-troforese foi efetuada em fita de acetato de celulose (cellogel). Corrida do soro durante l hora ou do antígeno por 20 min. a di-fusão posterior por 24 horas. As fitas e lâminas foram coradas pe-lo método do amido schwarz ou pela fucsina básica.
RESULTADOS
1. Eletroforese em acetato de celulose
1.1 — A eletroforese em ace-tato de celulose, embora houves-se sido realizada apenas na pri-meira amostra, de cada soro, ser-viu para demonstrar mais uma vez a hipergamaglobulinemia compatível com doença em att-vídade em 75% dos casos (1).
1.2 — A dosagem de imuno-globulina pela técnica radial re-versa, também dessas amostras, detectou aumento das taxas de IgG em 10 casos e aumentos de IgM em 15 casos.
2. Imunodifusão
2.1 — Em soros testemunhas de pacientes com outras doen-ças, nesse grupo constituído de 110 soros de pacientes, de várias etiologias, parasitárias, não en-contramos qualquer reação posi-tiva na imunoprecipitação.
2.2 —- Soros específicos de pacientes de blastomicose sul americana — nesse grupo, repre-sentado por 110 amostras de so-ros de 24 pacientes com
blasto-Ferreira Ayres em nosso Serviço.
o
Q
1'ig. ! — Observa-se na imunodifusão número de faixas variável de l a 3, com identidade total ou paidul em vários soros de B.S.A. contra antígeno da fase leveduriforme do P.b.
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micose sul americana, que foram estudados cm seis experimentos consecutivos, observamos que 23 pacientes apresentaram precipiti-nas circulantes detectáveis na imunoprecipitação, em uma fase qualquer de sua evolução.
Por outro lado, verificamos reações negativas em várias amos-tras de soros, colhidas durante a observação daqueles pacientes.
Em cinco amostras observamos que, quando negativas, após se-rem concentradas por duas ve-zes, tornaram-se postivas.
Encontramos amostras de so-ros, cujas alíquotas mantidas em diferentes condições de tempera-tura e conservação, deram resul-tados díspares.
Os arcos de precipitação varia-ram em número de l a 3, na de-pendência de soro testado,
inclu-sive no soro do mesmo paciente, em função da amostra, c mostra-ram anticorpos com identidade parcial ou total — Fig. l c 2.
Os protocolos dos experimen-tos com os resultados acham-se resumidos na tabela I.
3 . Imunoeletroforese
Na análise imunoeletroforéti-ca observamos o aparecimento de faixas em número variável de
l a 4, sempre no polo catódico. Mesmo cm alguns soros que de-ram apenas uma faixa de preci-pitação em agar, na dupla imu-nodifusão, constatamos o apare-cimento de duas ou três faixas pela imunoeletroforese em aceta-to de celulose. Porém, a maioria dos soros revelaram apenas uma faixa na imunoeletroforese.
j.jy. 2 — Na imunoclciroforese em agarose à esquerda, ou em ace-lalo (ccllogcl) à dircitu obscrva-se sempre no polo catódico faixa única no primeiro, c ale 4 faixas no 2.° (parecendo corresponder íis
TABELA I
Sinopse do estudo de soros de B . S . A . pela imunoprecipitação em gel com antígeno da fase leveduriforme do P. braãlíensis I . P . T . — UFGo. EXPERIMENTOS 1.° (Antígeno da l.a partida. l 50 mg/ ml) 2.o 3.0 4.° 5.° 6« (Antígeno da l.a partida. 50 mg/ ml) (Antígeno da l.a partida. 50 mg/ml) (Antígeno da 2.a partida. 50 mg/ ml) (Antígeno da 2.a partida. 50 mg/ml) (Antígeno da 2.a partida. 50 mg/ml) T O T A L N.° DE SOROS 12 7 14 16 12 10 24* N.° DE AMOSTRAS 30 16 36 43 41 18 110* RESULTADOS POSIT. NEGÀf. 19 13 30 34 39 17 152 11 3 6 9 2 1 32 OBSERVAÇÕES Soros inteiros
Soros inteiros. Repetidas amos-tras. 7 soros anteriores. Soros inteiros. 7 soros novos.
Soros inteiros (2 soros novos) Soros concentrados 2 vezes. 1
soro novo.
Soros inteiros (2 soros novos).
40(1 Rcv. l';il. Tiop. • - ( I ) : 4 -- Onluhro/Dezembro, 1972 COMENTÁRIOS
O estudo de soros de pacien-tes de B.S.A. pela imunodifusão em gel, demonstrou faixas de pre-cipitação isoladas ou múltiplas até 3, no decurso da doença em atividadc. Alguns soros só reagi-ram quando empregados sem di-luir, outros deram reações posi-tivas mesmo diluídas até 1/16. A correlação entre as precipitmas presentes c o seu teor será estu-dada em relação ao quadro clí-nico e a outros anticorpos pre-sentes, bem como, quanto ao teor de imunoglobulinas em próximo trabalho. Em verificação preli-minar, pareceu-nos que existe correlação entre os anticorpos presentes e o aumento de IgG, todavia, muitos pacientes apre-sentaram também aumento de IgM. Em pacientes cinicamente "curados' e observados a longo tempo, as reações de precipitinas foram negativas quando usamos os soros inteiros e o antígeno 1/4. Em alguns soros, antes po-sitivos, cujas amostras inteiras, (sem diluir) colhidas no período da evolução deram resultados ne-gativos, observamos que as rea-ções tornaram-se positivas, ao se concentrar os soros duas ou três vezes.
O sistema de precipitinas na blastomícose sul americana pa-rece muito específico, pois, não observamos nenhuma rcação fal-sa positiva, empregando soros de várias doenças em variadas centrações contra o antígeno con-centrado ou diluído. Não
consta-tamos, também, reações cruzadas com único soro da doença de "Jorge Lobo" disponível, estuda-do em variadas diluições e em vários suportes. Também não ob-servamos reações cruzadas com soros de Cromomicose e Esporo-tricose.
Infelizmente, não dispusemos de soros de pacientes de Histo-plasmose ou Blastomicose Nor-te Americana para Nor-testá-los. Co-mo aquela doença é rara em nos-so meio e essa última não ocorre, e já é conhecida a reação cruza-da entre elas e a doença de Lutz Almeida e como também fugia ao escopo deste trabalho, não es-tudamos a comunidade antigêni-ca desses sistemas.
As análises imunoeletroforéti-cas de soros de blastomicose em suporte de acetato de celulose, revelaram faixas, única ou múl-tiplas até 4 sempre no polo ca-tódico, parecendo traduzir iden-tificação com diversas sub-clas-ses de IgG.
Nesses experimentos iniciais nos ficou a impressão de que pela imunodifusão em gel, so-mos capazes de detectar preci-pitinas no soro de pacientes com blastomicose sul americana, tan-to em atividade clínica quantan-to sorológica, dependendo das quan-tidades ótimas que proporcionar-mos à reação. E, por outro lado, vislumbra-se a possibilidade de padronizar-se método semiquan-titativo muito útil para o estudo dessa doença. Parece-nos, con-tudo, que deve haver muitos cui-dados nas padronizações técnicas
W. Hiiihma .V ails. -- I j m i n o l o p i i i da Kluslcmic-osc Sul Americana 401
e no estudo, da cinética dos anti-corpos prccipitantes, para que se possa interpretar devidamente as reações.
IMMUNOLOGY OF BLASTO-M Y C O S I S . PRELIBLASTO-MINARY RESULTS WITH IMMUNO-PRECIP1TINS IN S O U T H AMERICAN
BLASTOMYCO-S1S
The será from 24 paticnts with South American blastomycosis have becn studied. 2 to 12 samples of the same scrum were tested by immunodiffusion in 2% agar and by immunoclcctrophorcsis on cel-lulose acetate and on 1% aga-rose against an antigen cxtracíed from the yeastlike organisms in concentrations varying from 50 to 200 mg/ ml. l to 3 bands of precipitation were observed by double immunodiffusion and l to 4 precipitant ares appeared near the cathode in immunoelectropho-resis. Neither cross-reaction wiih other mycoses nor false positive reactions were observed.
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