Nanopartículas redox-responsivas de copolímero em bloco à base de açúcares para aplicação na terapia fotodinâmica

RELATÓRIO TÉCNICO FINAL

DOUTORADO SANDUÍCHE NO EXTERIOR – PROGRAMA CAPES/PrInt Processo - 88887.335852/2019-00

Edital nº 41/2017

Nanopartículas redox-responsivas de copolímero em bloco à

base de açúcares para aplicação na terapia fotodinâmica

Bolsista: Patrícia Regina Ebani Orientador no Brasil: Prof. Dr. Marcos Antonio Villetti Orientador no exterior: Prof. Dr. Redouane Borsali

LOCAL DE EXECUÇÃO DO PROJETO: Université Grenoble Alpes - UGA

Centre de Recherches sur les Macromolécules Végétales - CERMAV Gières – France

1. Introdução e Objetivos

A fototerapia, incluindo a terapia fotodinâmica (TFD) e a terapia fototérmica (TFT), é uma abordagem minimamente invasiva e clinicamente aprovada para a terapia do câncer devido à sua elevada eficiência terapêutica e efeitos secundários mínimos (ZHU, CHENG, CHEN, & PU, 2018). Enquanto a TFT converte a energia do fóton em calor para danificar células nocivas, a TFD envolve a excitação de espécies químicas fotossensibilizadoras a partir de radiação de na região do visível para produzir espécies reativas e citotóxicas de oxigênio, como o oxigênio singleto (1_O

2), que têm um tempo de meia vida

curto em sistemas biológicos e, consequentemente, um raio de ação inferior a 0,02 µm (JOHANM & KRISTIAN, 1991). Entre os fotossensibilizadores mais utilizados na TFD, a ftalocianina (Fc) e os seus derivados, como o fotossensibilizador de segunda geração ftalocianina de zinco (II) (ZnFc), atraíram a atenção porque apresentam uma forte absorção na região espectral entre 600 e 800 nm, região suficientemente energética para gerar 1_O

2 e

frequentemente conhecida como janela ótica do tecido devido à elevada penetração pela pele, podendo chegar à 10 mm de profundidade (AGOSTINIS et al., 2011; LO, SALOME, PANDEY, & NG, 2019). As aplicações terapêuticas das Fc's geralmente são limitadas pela agregação e biodisponibilidade reduzida, decorrentes da baixa solubilidade em meios biológico-aquosos. Para contornar estes problemas, novas estratégias, principalmente em sistemas de administração medicamentosa, vêm sendo relatadas para melhorar a solubilidade das Fc's (DUMOULIN, DURMUS, AHSEN, & NYOKONG, 2010). Sistemas nanoestruturados como as nanopartículas poliméricas (NP’s) ou nanocarreadores (NC’s) têm o potencial de aumentar solubilidade, a biodisponibilidade e a estabilidade dos compostos porfirínicos em meios biológicos. Além disso, promovem uma liberação controlada e seletiva nos tecidos-alvos (JIA & JIA, 2012). Neste contexto, as nanoestruturas auto-organizadas (tipicamente micelas esféricas e vesículas) de copolímeros em bloco (CPB), constituídos de um bloco de polímero hidrofóbico sintético covalentemente ligado a um bloco de oligossacarídeo hidrofílico (BORSALI & HALILA, 2014; CALDAS et al., 2020; MAZZARINO et al., 2015; MODOLON, OTSUKA, MINATTI, BORSALI, & HALILA, 2012) que respondem a estímulos

externos e apresentam uma estrutura linear simples e um design sintético versátil, são uma classe atraente para o encapsulamento de fármacos como a ZnFc para o tratamento do câncer (THAMBI & LEE, 2019). As NP’s de copolímeros em bloco apresentam propriedades únicas tais como i) baixa concentração crítica de agregação, que permite que estas NP’s sejam retidas por mais tempo na corrente sanguínea; ii) promovem a encapsulação de fármacos hidrofóbicos e/ou hidrofílicos; iii) apresentam morfologia e tamanho controlados, dependentes da estrutura do CPB; iv) são redox-responsivos, pois apresentam um controle espacial e temporal da ativação e liberação de droga, a partir de estímulos exógenos ou endógenos, tais como, pH, temperatura, luz, ambiente redox, enzimas, etc.

Frequentemente para a síntese de CPB’s à base de açúcares utilizam-se reações do tipo “click” com o emprego de cobre como catalisador. Contudo, neste trabalho propomos uma nova rota de síntese do copolímero maltoheptaose-b-poliestireno (MH-b-PS), sem resíduos metálicos, seguindo recomendações de química verde. O CPB é composto de uma unidade de maltoheptaose (MH), que é um glucano linear solúvel em água, covalentemente ligada ao poliestireno (PS) através de um ligador redox-responsivo clivável. O copolímero MH-b-PS permite a formação de gliconanopartículas (GNP’s) micelares que respondem a estímulos oxidantes, como a N-bromosuccinimida - NBS, ou redutores, como a Glutationa - GSH,para a liberação do fármaco. As NP’s contendo um bloco de PS e um bloco hidrofílico como polietilenoglicol ou açúcares, são conhecidas por serem seguras e biocompatíveis (LOOS et al., 2014.; MOLUGU et al., 2006; SUNASEE et al., 2014) mesmo tendo um dos blocos sintéticos.

2. Seção experimental

2.1 Procedimento geral da síntese do CPB à base de açúcares A síntese descrita baseia-se em dois procedimentos essenciais, ou seja, a funcionalização orgânica dos polímeros hidrofóbicos e hidrofílicos e o acoplamento de ambos via reação “click”, Figura 1A e B.

2.3 Encapsulação do ZnPc

Figura 1. Esquema reacional de síntese do (A) blocos hidrofóbico (acima) e hidrofílico

(abaixo); (B) copolímero em bloco MH-b-PS e (C) Reação e produtos esperados após clivagem com agente redutor ou oxidante.

Ácido3-eimil)propanóico Rendimento: 85% (1) PS-bromomaleimida Poliestireno-OH NaCNBH3, 65° 2 h 2-amino-N-(2-mercaptoetil) benzamida (2) Maltoheptaose-SH Rendimento: 100% Maltoheptaose

B

A

C

Síntese do poliestireno com terminação bromaleimida (PS-Malei): 1 g (0,2 mmol) de (PS-OH, MW=5000) foi dissolvido em DCM (10 mL) seguido pela adição de ácido 3-(bromaleimil)propanóico (2 mmol) e uma quantidade catalítica de DMAP (0,1 mmol). A solução foi resfriada até 0o_{C e adicionou-se}

DCC (2 mmol). A mistura foi agitada durante 1 h e depois aquecida e deixada à 25ºC durante 16 h. Após a remoção do precipitado branco, o filtrado foi concentrado e o produto esperado (PS-Malei) foi obtido por precipitação em metanol frio (rendimento=85%).

Síntese da maltoheptaose com terminação redutora de tiol-funcionalizado(MH-SH): Maltoheptaose (115 mg, 0,1 mmol), (1 mmol) e NaCNBH3 (188 mg, 3 mmol) foram dissolvidos em 3 mL de uma mistura de

DMSO/AcOH (7/3 v/v). Foi adicionado DL-dithiothreitol (1 mmol) para evitar a oxidação. A mistura foi agitada a 65°C durante 1 h. A conversão foi verificada por cromatografia em camada delgada (TLC) (ACN/H2O 3/1 v/v). Após reação

completa, o produto bruto foi obtido por precipitação em ACN, e centrifugado a 9500 rpm. Após 3 lavagens, o produto MH-SH foi obtido como um sólido branco após liofilização.

Reação de acoplamento para a obtenção do copolímero em bloco à base de açúcar (MH-b-PS): PS-Malei (0,13 mmol, 680 mg) e MH-SH (0,156 mmol, 208 mg) foram dissolvidos em 5 mL de DMF sob argônio (Ar). Depois de adicionar N,N-diisopropililamina (0,13 mmol, 16,6 mg) à solução, a mistura foi agitada à 25°C durante 3 h. A solução apresenta uma cor castanha escura instantaneamente. O copolímero dibloco foi então obtido por precipitação com MeOH/H2O (8/2 v/v), filtração e lavagem com a mesma mistura de solvente. O

sólido foi finalmente seco sob vácuo para produzir o correspondente MH-b-PS como um sólido preto. Os produtos obtidos foram caracterizados por RMN 1_H,

MS, MALDI-TOF MS, UV Vis, fluorescência e GPC e podem ser encontrados no apêndice.

2.2 Preparação das nanopartículas

Inicialmente, uma quantidade bem definida de MH-b-PS (1 ou 3 mg) foi dissolvida em 1,0 g de uma mistura de solventes [THF/água 4,5:1 (m/m)] e agitados durante 2 h a 500 rpm. Em seguida, as NP’s foram preparadas seguindo dois métodos diferentes. Método A (nanoprecipitação padrão): 1 g da solução de CPB foi lentamente adicionada gota a gota a 40 g de água destilada usando uma pipeta de Pasteur durante 15 s sob agitação magnética (500 rpm). Método B (nanoprecipitação inversa): 40 g de água destilada foram lentamente adicionadas a 1 g de solução de CPB usando uma pipeta de Pasteur durante 10 min sob agitação. Subsequentemente, as suspensões obtidas pelos dois métodos, A e B, foram agitadas durante 1,5 h em temperatura ambiente. Os filtrados foram concentrados até 4 g por evaporação sob pressão reduzida à 35ºC. O esquema simplificado de preparação das GNP@ZnFc está apresentado na Figura 2.

Figura 2. Ilustração esquemática do procedimento de auto-organização do MH-b-PS

pelos métodos A e B.

A encapsulação do fármaco foi realizada através da nanoprecipitação do MH-b-PS (método B) na presença da ZnFc. Primeiramente, 1 ou 3 mg de MH-b-MH-b-PS foram dissolvidos em 1 g de uma mistura de solventes [THF/água 4,5:1 (m/m)] e deixados em agitação magnética durante 2 h à 500 rpm. Após, 1 g de solução de ZnFc 0,025 mM (em THF) foi adicionado a um frasco contendo a solução copolimérica e a mistura foi agitada por 30 min. Após, 40 g de água destilada foram lentamente adicionadas à esta solução e a suspensão foi

Suspensão Coloidal Poliestireno Maltoheptaose Solução de MH-b-PS

agitada durante 2 h e filtrada através de um filtro de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofílico com tamanho de poro 0,45 μm. O filtrado foi concentrados até 4 g por evaporação sob pressão reduzida à 35ºC.

2.3 Caracterização físico-química das nanopartículas

As NP’s sintetizadas foram caracterizadas por espalhamento de luz dinâmico (DLS), nanotracking analysis (NTA), microscopias eletrônicas de varredura (MEV) e de transmissão (MET), e espectroscopia na região do visível (UV Vis).

2.4 Quantificação do conteúdo de fármaco encapsulado

A eficiência de encapsulamento (EE) e o conteúdo total do fármaco (CT) foram estimados após a determinação da concentração de ZnFc nas suspensões de NP’s por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), de acordo com o método descrito por Teixeira e colaboradores (TEIXEIRA et al., 2011). Foi utilizando um instrumento Ultimate 3000 (Thermofischer) com uma temperatura controlada de 30ºC. A coluna analítica utilizada foi a Nucleodur 100-5 C18 (Macherey-Nagel) com uma pré-coluna. A fase móvel consiste numa mistura de metanol/acetona/dimetilformamida (90:5:15, v/v/v) bombeada a 1 mL.min-1_{. As concentração de ZnFc em THF utilizadas para a curva de}

calibração foram de 0,001; 0,005; 0,01; 0,025; 0,04; 0,05; 0,075 e 0,1 mM e o volume da injeção foi de 30 µL. O eluente da coluna foi monitorado com um detector UV-Vis no comprimento de onda de 342, 602, 637 e 675 nm (apêndice, Figs 19 e 20). A EE% foi estimada como sendo a diferença entre a concentração total de ZnFC ([ZnFc]Total) encontrada nas suspensões de NP’s

após a sua completa dissolução em THF e a concentração de ZnFC encontrada no filtrado ([ZnFc]Filtrado) (filtro PTFE, 0,45 µM) após secagem sob

vácuo e solubilizado em THF, Equação 1. O CT foi estimado comparando-se a [ZnFc]Total encontrada nas suspensões coloidais com a [ZnFc] adicionada às

Eficiência de Encapsulamento (EE%): 100 − ((ZnFcTotal − ZnFcFiltrado

ZnFcTotal ) ∗ 100)

Conteúdo Total do fármaco (CT%) = 100 − ((ZnFcadicionado − ZnFcTotal

ZnFcAdicionado ) ∗ 100)

3. Resultados

3.1 Obtenção e caracterização do copolímero em bloco

A partir dos resultados de RMN 1_{H, espectrometria de massas, GPC e}

outras técnicas, a síntese dos intermediários e do CPB foi alcançada com sucesso. O gráfico de RMN DE 1_{H do CPB está mostrado na Figura 3A, onde}

podemos identificar os dois blocos presentes (MH e PS). Pela análise do RMN

1_{H do bloco hidrofílico funcionalizado, MH-SH (Figura 2 do apêndice), podemos}

constatar a presença dos picos característicos da maltoheptaose (entre 3,5 e 4,5 ppm), bem como os picos que surgem após a funcionalização com a benzamida (entre 6,5 e 7,5 ppm para hidrogênios presentes no anel aromático e entre 2,5 e 3,5 ppm para os hidrogênios metilênicos vizinhos ao grupamento tiol final).

Figura 3. (A) RMN 1_{H do CPB e (B) espectro de fluorescência (emissão) dos blocos}

funcionalizados e do CPB sobrepostos.

(1)

(2)

A)

Em relação ao bloco hidrofóbico, os espectros de RMN 1_{H (Figura 3 do}

Apêndice) indicam os picos característicos do PS-Malei (entre 1 e 2,5 ppm os hidrogênios metínicos e metilenicos da cadeia linear terminal do PS e entre 6,5 e 7 os hidrogênios do anel aromático), bem como os picos originários da funcionalização com a bromomaleimida (entre 3,5 e 4 pm). Dados da RMN 1_H

do CPB apresenta características dos blocos constituintes e do acoplamento realizado pela reação “click”. No espectro de massas do bloco hidrofílico MH-SH (Figura 1 do Apêndice) verifica-se o pico de 1333 m/z o qual concordam com análises de GPC. Em relação ao bloco hidrofóbico, PS-Malei, análises de MALDI-TOF mostram um pico de 5500 m/z, sugerindo uma massa de 5 KDa dessa unidade, concordando com análises de GPC (Figura 8 do apêndice). O espectro de fluorescência dos produtos obtidos, Figura 3B, evidencia que houve a reação de acoplamento devido ao aparecimento de picos em 419 nm inexistentes no bloco hidrofóbico e um outro em 496 devido a presença do PS no copolímero em bloco.

3.2 Auto-organização do copolímero redox-responsivo

Mesmo em soluções diluídas, ao dissolver um copolímero anfifílico haverá uma associação organizada espontânea das cadeias poliméricas em estruturas com forma, simetria e composição bem definidas. Está bem estabelecido que os copolímeros em bloco são considerados surfactantes macromoleculares devido especificamente à esta propriedade, pois após estarem auto-organizados formam partículas sólidas com uma morfologia persistente e com isso podem ser analisadas ex situ após secagem por técnicas de microscopia como, AFM, MEV, MET, etc. No processo de formação das micelas poliméricas em água, o bloco hidrofílico (MH) é orientado para a formação do revestimento das NP’s (camada externa) enquanto que o bloco hidrofóbico, PS, é protegido do ambiente externo formando o núcleo micelar, que serve como um microambiente ideal para o encapsulamento de agentes ativos de caráter hidrofóbico, como o ZnFc. O bloco em contato com o solvente, maltoheptaose, serve como interface estabilizadora entre o núcleo hidrofóbico e o ambiente externo, aquoso. Para formar estas nanoestruturas foi utilizado o Método Fessi (Fessi, Puisieux, Devissaguet, Ammoury, & Benita,

1989), que consiste em uma nanoprecipitação (padrão e inversa) do CPB em NP’s micelares. É importante ressaltar que encontrar uma mistura de solventes polares e apolares é essencial para a completa dissolução dos CPB’s, pois para a utilização do método de Fessi é necessário inicialmente a dissolução completa do copolímero na mistura de solvente, obtendo-se moléculas de cadeias únicas antes da precipitação no solvente seletivo, por isso análises de intensidades de luz espalhada de amostras com a mesma quantidade de polímero em diferentes frações de THF e H2O foram realizadas e os gráficos

referentes podem ser visualizados no apêndice (Figuras 12 e 13). Os resultados deste experimento revelam que para as duas concentração de copolímeros utilizadas (1 e 3 mg g-1_{) a menor intensidade de luz espalhada}

ocorreu para a mistura de THF/H2O de 4,5:0,5 (m/m), indicando que nesta

mistura de solvente temos cadeias únicas de copolímeros, ou seja, a melhor mistura para a completa dissolução do copolímero. Sendo assim, o CPB MH-b-PS foi inicialmente dissolvido na mistura de THF/H2O (4,5:0,5 (m/m)), e logo

após as NP’s foram formadas a partir da adição de H2O (não-solvente do bloco

PS) ao CPB (Método B) ou do CPB em água (método A). Finalmente, o THF e o excesso de H2O são removidos durante a concentração da suspensão por

rotoevaporação sob vácuo à 35ºC.

3.3 Caracterização das nanopartículas sem fármaco por espalhamento de luz

As NP’s formadas em suspensão foram inicialmente caracterizadas por DLS para verificar a polidispersidade, homogenidade, mas principalmente para análise do tamanho dos raios hidrodinâmicos em diferentes ângulos de espalhamento de luz. A Figura 4 mostra a função de autocorrelação (g(2) _{- 1) e}

a distribuição do tempo de relaxamento obtido por nanoprecipitação padrão (Método A) e nanoprecipitação inversa (Método B), utilizando em ambos a mesma concentração de copolímero (1 mg.g-1_{) na fase orgânica.}

Figura 4. Função de autocorrelação DLS (g(2) _{- 1) medida a 30 - 120° e distribuição do}

tempo de relaxamento das suspensões aquosas de MH-b-PS obtidas pelo (A) método A e (B) método B.

A distribuição do tempo de relaxamento do sistema obtida pelo método A mostrou um pico ligeiramente alargado com um pequeno pico em tempos de relaxamento mais elevados para alguns ângulos de espalhamento, enquanto que a obtida pelo método B mostrou um único pico estreito para todos os ângulos de espalhamento. Os raios hidrodinâmicos médios (Rh) das NP’s formadas pelos dois métodos foram calculados a partir do coeficiente de difusão (D) (utilizando a relação Stokes-Einstein), os quais foram determinados a partir da inclinação do gráfico das frequência de relaxamento (1/τ) versus o quadrado do módulo vetorial de onda (q2_{) (Figura 5). As freqüências de}

relaxação foram obtidas pelo “fit” das curvas de autocorrelação utilizando-se o método CONTIN. Os resultados obtidos indicam que o método mais eficiente de síntese é o de nanoprecipitação inversa, método B, pois apresenta maior linearidade entre a frequência de relaxação e o ângulo de espalhamento medido. Os valores são de Rh obtidos foram 20,4 e 90,8 nm para as nanopartículas obtidas pelos métodos A e B, respectivamente.

Figura 5. Dependência da frequência de relaxação (1/τ) no módulo vetorial de onda

quadrada (q2_{) das suspensões aquosas de MH-b-PS obtidas pelos métodos (A) A e}

(B) B.

3.4 Análise de tamanho das nanopartículas sem fármaco a partir de nanotracking

A distribuição de tamanho analisada utilizando o NTA revelou um amplo pico entre 5 a 12 nm em relação ao Rh para as NP’s obtidas pelo método A, Figura 6A, enquanto que para as nanopartículas obtidas pelo método B o gráfico de distribuição do raio hidrodinâmico das NP’s mostra um pico mais estreito em 85 nm, Figura 6B. Avaliando os valores obtidos pelo NTA, os raios médios obtidos foram ligeiramente inferiores aos obtidos pelo DLS, nos dois métodos de síntese. De acordo com Filipe e colaboradores (FILIPE, HAWE, & JISKOOT, 2010) esta alteração pode ser explicada porque as distribuições de tamanho obtidas por DLS consistem em distribuições de massa, enquanto que as obtidas por NTA são distribuições numéricas.

Figura 6. Distribuição dimensional determinada por medições de NTA das suspensões

Além disso, as distribuições de tamanho obtidas pelo NTA são de tamanhos maiores em relação à DLS, devido à elevada contribuição de algumas partículas de grandes dimensões para a dispersão global.

3.5 Caracterização das nanopartículas sem fármaco a partir de microscopia

As análises por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET) das NP’s sem fármaco (NP em branco) Figura 7 foram realizadas com o objetivo de confirmar o tamanho médio destas, tal como o relatado pelas técnicas de DLS e NTA, uma vez que de acordo com a literatura é aconselhável utilizar diferentes tipos de metodologias para este fim, bem como analisar a morfologia das NP’s de MH-b-PS. Os resultados indicam valores médios de diâmetros de 25 e 180 nm para as NP’s sintetizadas a partir dos métodos A e B, respectivamente. As microscopias foram também realizadas para verificar a presença de agregados ou outras formas de instabilidade nas soluções coloidais, como podemos verificar na Figura 7B, onde as partículas começam a se agregar. A análise foi realizada considerando um aumento de até 20.000x (método B) e os resultados foram comparados com os dados obtidos por DLS e NTA. Em ambos os sistemas estudados, foram obtidas NP’s esféricas, comportamento semelhante foi apresentado por OTSUKA e colaboradores (OTSUKA et al., 2013) que obtiveram suspensões esféricas em meios aquosos, a partir de MH-b-PS. NP’s de quitosana e poli-ε-caprolactona de mesma morfologia também foram obtidas no encapsulamento da ZnFc (DEPRÁ et al., 2016).

Figura 7. Imagens microscópicas dos sistemas constituídos de CPB’s (nanopartículas

sem o fármaco); (A) e (B) MEV das NPs obtidas pelo método A; (C) e (D) MEV de NPs obtidas pelo método B; (E) e (F) MET das NPs obtidas pelo método B.

3.6 Caracterização e quantificação de fármaco presente nas GNP@ZnFc

Os ensaios de encapsulação do fármaco hidrofóbico, ZnFc, também foram avaliados em duas concentrações de copolímero na fase orgânica (1 e 3 mg.g-1_{), e evidentemente, foram realizados pelo método B, que apresentou-se}

como sendo o melhor para a síntese de NPs sem a inserção do fármaco, como

5µM 30 µM 4µM 5 µM 200 nm 500 nm

A

B

C

D

E

F

já mencionado. A suspensão aquosa resultante foi caracterizada por espectroscopia UV-Vis, DLS, NTA, e microscopias MEV e MET. De acordo com os dados extraídos do DLS, Figura 8, e do NTA (Figura 17 do apêndice), a distribuição de tamanho das partículas apresenta populações com raios relativamente maiores do que as NP’s obtidas de forma idêntica, entretanto sem o ZnFc, com valores médios de Rh de 101 nm (Figura 8C).

Figura 8. Função de autocorrelação DLS (g(2)_{-1) e distribuição do tempo de}

relaxamento medidos de 30 - 130° para as GNP@ZnFc constituídas de (A) 1 mg.g-1 _de

MH-b-PS (B) 3 mg.g-1 _{de MH-b-PS;e gráfico da dependência da frequência de}

relaxamento (1/τ) no módulo vetorial de onda quadrada (q2_{) das GNP@ZnFc de (C) 1}

mg.g-1 _{de MH-b-PS (D) 3 mg.g}-1 _{de MH-b-PS.}

Para a NP mais concentrada, ou seja, 3 mg.g-1 _{os valores de Rh’s encontrados}

são de 124 e 125 nm para DLS e NTA, respectivamente, (Apêndice, Figura 18) e com a inserção do ZnFc tornam-se 139 nm (Figura 8D) e 130 nm para NTA, respectivamente. Os resultados obtidos pelas microscopias, à semelhança dos resultados de DLS e NTA, também mostram um aumento no Rh médio das

A B

NP’s quando o fármaco ativo, ZnFc, é encapsulado. As microscopias das GNP@ZnFc estão apresentadas na Figura 9, e mostram diâmetros médios de 200 e 300 nm (Rh de 100 e 150 nm) para as NP’s obtidas pelo método B nas duas concentrações de CPB avaliadas.

Figura 9. Imagens microscópicas dos sistemas CPB@ZnFc obtidos pelo método B; (A) MET CPB 1 mg.g-1 _{e (B) MEV CPB 1 mg.g}-1_{; (C) MET CPB 3}

mg.g-1 _{e (D) MEV CPB 3 mg.g}-1_.

A partir de análises de HPLC foi possível quantificar o fármaco presente nas suspensões e também a eficiência de encapsulamento, ou seja, o quanto do fármaco inicialmente adicionado na fase de síntese das nanopartículas está ocupando o núcleo micelar, os resultados estão apresentados na Tabela 1 e mostram que a nanopartícula mais concentrada tem um percentual de 74% de CT e 97% de EE, valores considerados relativamente elevados, indicando que a quantidade de ZnFc carreada pela nanopartículas é suficiente alta para gerar oxigênio singleto e com isso ser utilizada como fotossensibilizador na terapia fotodinâmica.

A

C

NP – 1 mg.g-1 MH-b-PS

Conteúdo Total de ZnFc (CT) Eficiência de Encapsulação (EE)

I 0,5504 55,04 % I 81,54 II 64,08% II 70,49% Média 59,92% Média 76,02% NP – 3 mg.g-1 MH-b-PS I 70,48% I 97,16% II 77,56% II 96,13% Média 74,02% Média 96,64%

4. Conclusão

Nanopartículas copoliméricas redox-responsivas inéditas, com morfologia esférica, com baixos índices de polidispersão, e sem a utilização de metal como catalisador na síntese de acoplamento entre os blocos constituintes, foram preparadas com sucesso através da metodologia de nanoprecipitação inversa. A auto-organização em água foi um método versátil para encapsular o fármaco hidrofóbico ZnFc pois a eficiência de encapsulamento nas NP’s foi suficientemente alta para ser aplicada como fotosensibilizador na TFD. Os diâmetros dos NP’s carregadas com ZnFc foram aumentados na presença do fármaco. Análises de DLS indicam NP’s de Rh entre 20,4 e 139 nm, dependendo do método e da concentração do copolímero utilizada. MEV e MET forneceram informações sobre morfologia e o NTA foi utilizado como técnica complementar. Este trabalho teve como proposta utilizar procedimentos de química verde, baseando-se em NP’s para liberação de fármaco hidrofóbico em células nocivas, ultrapassando os problemas relacionadas a baixa solubilidade da ZnFc e da distribuição do fármaco nos organismos. As NP’s desenvolvidas podem servir como ferramentas auspiciosas para aplicação em células alvo cancerígenas.

Tabela 1. Valores de EE (%) e de CT (%) das NP’s

É importante ressaltar que análises de clivagem (oxidativa e redutiva) mencionadas não foram demonstradas nos resultados, pois devido à pandemia ocasionada pelo Covid-19, o trabalho não pode ser concluído. Entretanto, análises preliminares foram realizadas para identificar fatores como concentração, temperatura, tempo e serão feitas por mim conforme a disposição do equipamento (DLS) na UFSM, ou no caso contrário, pelos técnicos do CERMAV, na UGA. Análises de liberação do fármaco e ensaios de fototerapia serão igualmente feitas na UFSM no laboratório onde trabalho na UFSM, o laboratório de espectroscopia e polímeros (LEPOL).

5. Referências bibliográficas

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6. Trabalhos Futuros

6.1 Clivagem REDOX – MH-b-PS

A ruptura das ligações que unem os dois blocos no CPB será avaliada através da adição de agentes oxidantes (NBS) e redutores (GSH) em ambiente de temperatura controlada e em concentrações intra e extracelular, no caso da clivagem redutiva.

Clivagem redutiva: Solução aquosa de GSH reduzida (10 µM - 20 mM) será adicionada à 0,1 mL da suspensão coloidal para dar uma concentração final de 0,1 mg.mL-1 _{de NP’s. Para verificar a clivagem do CPB utilizando GSH, os}

tamanhos das NP’s em função do tempo serão analisados por DLS na temperatura de 37°C.

Clivagem oxidativa: Uma solução de NBS 15 mM (THF/H2O (4,5:1 (m/m) +

0,1% ácido trifluoroacético) em H2O, será adicionada à 1 mL de dispersão de

do CPB utilizando NBS, os tamanhos das NP’s em função do tempo serão medidos por DLS na temperatura de 37°C.

6.2 Avaliação da atividade fotodinâmica

Numa experiência típica da fotodegradação DPBF, 1,75 mL de 80 µM de DPBF em DMSO será misturado com 1,45 mL de DMSO e 0,3 mL de NP’s contendo ZnFc. Na presença de um fotossensibilizador de substância e irradiação com laser em 660 nm, o DPBF reage com 1_O

2, formando um

peróxido instável que se decompõe em 1,2-dibenzoílbenzeno (DBB), Esquema 1. A captura de 1_O

2 baseia-se na diminuição da absorção no comprimento de

onda máximo do DPBF, especificamente 417 nm, uma vez que o produto final da reação fotoquímica é uma dicetona incolor que não absorve nesta região do espectro.

Esquema 1. Captura de 1_O

2 por reação com DPBF

A constante cinética da fotodegradação de DPBF (k) será determinada pela aplicação do modelo cinético do modelo pseudo-primeira ordem (Equação 3) e o rendimento quântico de 1_O

2 (ΦΔ) foi calculado pela Equação 4.

ln (A0

At) = kt

onde A0 e At são a absorção DPBF em tempo zero e no tempo variável t,

respectivamente;

Φ_∆= Φ_∆Std k kstd Istd I onde IStd I = 1− 10−AStd 1− 10−A

E Φ_∆Std (0,67) é o rendimento quântico de oxigênio padrão (ZnPc em DMSO) k e kstd _{são constantes cinéticas de fotodegradação das nanopartículas}

carregadas de ZnFc e ZnFc livre (padrão), respectivamente. O I e Istd _{são a}

intensidade absorvida no comprimento de onda de irradiação para as nanoparticulas carregadas de ZnFc e livre, respectivamente.

(4)

APÊNDICE

1. Caracterização dos blocos MH-SH e PS-Malei e do copolímero MH-b-PS.

Figura 1. Espectro de massa para o bloco hidrofílico MH-SH.

Figura 2. 1_{H RMN do bloco hidrofílico MH-SH.}

600 800 1000 1200 1400 1333.5[M+H]+ 686.32+ I ( a.u .) m/z 1355.5[M+Na]+

Figura 3. 1_{H RMN do bloco hidrofóbico PS-Malei.} 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm 7.38 142.61 1.99 4.00 202.10

1

2

3

5

4

1+2

4+5

3

aromático

CDCl

Figura 5. MALDI-TOF MS do polímero hidrofóbico não funcionalizado.

Figura 6. MALDI-TOF MS do bloco PS-Maleimida.

Figura 7. MALDI-TOF MS do copolímero em bloco MH-b-PS.

[PS5KMalei +Na]+ 5582.83

[PS5KMalei-b-Mal +H]+

Figura 8. Caracterização por GPC (DMF) do bloco PS-Malei e do copolímero

MH-b-PS.

Figura 9. Caracterização por UV-Vis (DMF) dos blocos PS-Malei, MH-SH e do copolímero

MH-b-PS. 14,5 15,0 15,5 16,0 16,5 17,0 17,5 18,0 18,5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 M_n = 7516 PDI = 1.11 RI intens ity (a.u.)

Retention time (min) PSMalei

PS-b-Mal

M_n = 5803 PDI = 1.09

Figura 10. Caracterização por Fluorescência (emissão) dos blocos hidrofóbicos e

hidrofílicos e do copolímero em bloco MH-b-PS.

Figura 11. Caracterização por GPC (DMF) dos blocos hidrofóbico PS-OH vermelho) e do

copolímero em bloco MH-b-PS (Azul) com os seus devidos tempos de retenção.

PS-b-MH 20,12 min

PS-OH 23,41 min

2. Identificação da melhor mistura de solventes para o copolímero MH-b-PS.

Figura 12. Gráfico das intensidades reais obtidas por DLS (90º, 180s) para amostras de 1

mg de MH-b-PS em 1 g de THF ou mistura com H2O (100, 90 e 80% de THF). As amostras

com menos de 70% de THF mostraram-se pouco solúveis ou insolúveis.

Figura 13. Gráfico das intensidades reais obtidas por DLS (90º, 180s) para amostras de 3

mg de MH-b-PS em 1 g de THF ou mistura com H2O (100, 90 e 80% de THF). As amostras

3. Caracterização das nanopartículas formadas.

Figura 14. Espectro UV-Vis sobreposto do polímero MH-b-PS e da NP (B1) formada com os

o copolímero.

Figura 15. Microscopia MEB da nanopartícula branca formada pelo copolímero

1E-3 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 116 - 129 nm 18 - 29 nm Time (ms) 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 B3 - [PS - b - Mal] 3 mg.g-1 _{en 90% THF - 40 - 120}0

Figura 16. Função de autocorrelação DLS (g(2)_{-1) e distribuição do tempo de}

relaxamento medidos de 40 - 120° sem fármaco (esquerda) e gráfico da dependência da frequência de relaxamento (1/τ) no módulo vetorial de onda quadrada para as NP’s constituídas de CPB (3 mg).

Figura 17. Distribuição dimensional determinada por medições de NTA das suspensões aquosas de 3 mg de MH-b-PS obtidas pelo método B.

1,00E+014 2,00E+014 3,00E+014 4,00E+014 5,00E+014 200 400 600 800 1000 1200 q2 _(m-2₎ 1/   s -1) B3 90 - [PS - b - Mal] 3 mg.g-1 _{en 90% THF - 40 - 120}0 D = 1,9685 x 10-12 _m2 _s-1 R_h = 124 nm R2 _{= 0,998} 1 10 100 1000 0,0 2,0x105 4,0x105 6,0x105 8,0x105 1,0x106 1,2x106 1,4x106 1,6x106 Con ce nt ratio n (x10 6 p artic les / mL ) Hydrodynamic Radius (nm) 125 nm

Figura 18. Distribuição dimensional determinada por medições de NTA das

suspensões aquosas de 3 mg de MH-b-PS carregadas com ZnFc.

4. Eficiência de encapsulamento (EE) e Conteúdo total de fármaco (CT).

Figura 19. Espectro UV Vis de solução de [ZnPc]THF 0,05 mM evidenciando os

comprimentos de onda utilizados na curva de calibração em HPLC para cálculo de eficiência de encapsulamento (EE%) e conteúdo total de fármaco (CT).

Figura 20. Dependência linear entre área (detector UV Vis em 675 nm) versus [ZnFc]