Cromatografia. Fundamentos, Instrumentação e Aplicações. Martha Adaime (UFSM)

Cromatografia

Fundamentos, Instrumentação e Aplicações

Martha Adaime

(UFSM)

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Departamento de Química

Programa de Pós Graduação em Química

Programa

Fundamentos Gerais da Cromatografia - Fundamentos e Classificação Geral

- Principais mecanismos de separação

- Principais Parâmetros Cromatográficos: t_R, n, Rs, α e relação entre eles

Cromatografia Gasosa (GC)

•Fundamentos Teóricos;

•Instrumentação (Injetores, Colunas e Fases Estacionárias, Fase móvel, Detectores) •Aplicações;

•Estado da Arte e Tendências.

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

•Fundamentos Teóricos;

•Modos de Separação: adsorção, partição, troca iônica, exclusão;

•Instrumentação (Bombas, Injetores, Colunas e Fases Estacionárias, Fase móvel, Principais Detectores);

•Aplicações;

•Estado da Arte e Tendências.

Cromatografia Acoplada à Espectrometria de Massas

•GC-MS/MS •LC-MS/MS

Por que usar CROMATOGRAFIA ? ? ?

HISTÓRICO

M. TSWEET (1903): Separação de misturas de

pigmentos vegetais em colunas recheadas com

adsorventes sólidos e solventes variados.

éter de petróleo CaCO₃ mistura de pigmentos pigmentos separados

Cromatografia =

kroma [cor] + graph [escrever]

Princípio Básico

Separação de misturas por interação diferencial dos seus

componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou

sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

Classificação da Cromatografia

Cromatografia

Planar

Coluna

FM Líquida

C.Camada

Delgada

C.Papel

FM Gasosa

FM Líquida

C. Gasosa

CCC

CLAE

CCC-Cromatografia em Coluna Clássica.

Cromatógrafo a Gás

1

2

3

4

6

5

1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.

2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.

3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.

4 - Detector.

5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

Fase Estacionária

• Sólida

- é constituída por adsorventes sólidos (pó),

tais como Sílica, Alumina, Carvão ativo, Zeólitos

sintéticos, etc.

A base para a separação, neste caso, é a

Adsorção

.

• Líquida

-

é constituída por uma película delgada (de

líquidos orgânicos de alto ponto de ebulição) que

impregnam o sólido (pó) inerte ou a parede interna

da coluna capilar.

A base para a separação, neste caso, é a

Partição

da amostra dentro ou fora da película líquida, devido

a solubilidade seletiva dos compostos

.

Fase Móvel

Gasosa - Na Cromatografia Gasosa a Fase Móvel é o

próprio Gás de Arraste cuja função é transportar os

analitos através do Sistema (Injetor /Coluna

/Detector).

Os principais Gases de Arraste são o Hélio,

Nitrogênio, Hidrogênio e o Argônio.

Líquida – Na Cromatografia Líquida emprega-se uma

mistura de solventes, denominada Eluente, como Fase

Móvel. Os principais são: metanol, acetonitrila e água.

Mecanismos da Cromatografia

apolar

Fluxo

polar

polar

Fluxo

Mecanismos da Cromatografia

TEORIA BÁSICA

Constante de Distribuição, K

Ocorre um equilíbrio de distribuição do

analito entre a FE e a FM.

 

 

A

A

K



K

= Constante de Distribuição

[A]

= concentração do analito na FE

[A]

= concentração do analito na FM

MENOR RETENÇÃO !!!

Volatilidade

_[A]

TEORIA BÁSICA

Quantificação da Eficiência

Cada “estágio” de equilíbrio é

chamado de

PRATO TEÓRICO

Coluna mais

eficiente

t

w

n

Número de pratos teóricos (n)

n = 16 (t

/ w

)

n = segmento da coluna onde se atinge um equilíbrio entre

fase móvel, estacionária e analito

quanto > n



> rendimento da coluna (picos mais finos)

Injeção

Tempo de Retenção / Largura Pico

t

= tempo de retenção

t

= tempo de volume morto

w

= largura da base

Injeção

Tempo

t

Seletividade

(



)



= k

´/k

´



= posição relativa de 2 picos

Ideal:



> 1

Tempo

Resolução (Rs

)

Rs = 2 (t

– t

)

_{/ w}

b1 +

w

Rs = separação real dos picos

Rs = 0 (sem separação),

Rs = 1 (separação parcial),

Rs = 1.5 (separação na linha base)

Injeção _{W W}

t

Tempo

A migração um analito pela

coluna provoca

inevitavelmente o

alargamento da sua banda.

TEMPO

Efeitos do alargamento excessivo de picos:

Separação deficiente de analitos

com retenções próximas

Picos mais largos e menos

intensos = menor detectabilidade

EFICIÊNCIA: Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

INTRODUÇÃO A

CROMATOGRAFIA GASOSA

Martha Adaime

Depto de Química-CCNE

CROMATOGRAFIA GASOSA

Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

Misturas cujos constituintes sejam

VOLÁTEIS

(=“evaporáveis”)

(para uma substância qualquer poder ser

“arrastada” por um fluxo de um gás ela

deve ser dissolver pelo menos parcialmente

-nesse gás)

DE FORMA GERAL:

CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 o_{C e que termicamente estáveis.}

O Cromatógrafo a Gás

1

2

3

4

6

5

1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.

2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.

3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.

4 - Detector.

5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

INSTRUMENTAÇÃO

Gás de Arraste

Fase Móvel em CG:

NÃO

interage com a amostra - apenas a

carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como

GÁS DE ARRASTE

Requisitos

:

INERTE

Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou

superfícies do instrumento.

PURO

Deve ser isento de impurezas que possam degradar a

fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos:

oxida / hidroliza algumas FE incompatíveis com DCE

Curvas de Van Deemter para diferentes Gases de Arraste

Velocidade linear média (cm/seg) u

He

H

N

FASE MÓVEL ou Gás de Arraste

Requisitos

:

CUSTO

Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.

COMPATÍVEL COM DETECTOR

Cada detector demanda um

gás de arraste específico para melhor funcionamento.

CUSTO PUREZA A B C

A

= 99,995 % (4.5)

B

= 99,999 % (5.0)

C

= 99,9999 % (6.0)

LINHA DE GÁS

Componentes necessários à linha de gás:

controladores de vazão / pressão de gás

dispositivos para purificação de gás (“traps”)

1

2

3

4

5

6

2 - Regulador de Pressão Primário

3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás 4 - Regulador de Pressão Secundário

5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo) 6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)

Dispositivos de Injeção de Amostra

Os dispositivos para injeção (

INJETORES

ou

VAPORIZADORES

) devem prover meios de introdução

INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

Injeção instantânea:

Injeção lenta:

t = 0

t = x

Injeção

Split

(com Divisão)

Considerando a geometria dos injetores split-splitless, a razão de divisão

normalmente é ajustada variando-se a vazão total de entrada de gás de arraste:

CONTROLE DE

VAZÃO TOTAL

Deve ser regulado até o SR desejado

CONTROLE DE PRESSÃO

Altera pressãovazão na coluna (NÃO DEVE SER MODIFICADA VISANDO REGULAGEM DE SR !!!!!)

Injetor “on-column” Convencional

1

2

3

4

1 - Septo (silicone)

2 - Alimentação de gás de arraste)

3 - Bloco metálico aquecido

Injeção “on-column” de líquidos

2

3

1 - Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna.

2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna.

3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.

1

Parâmetros de Injeção

TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição

Regra Geral:

T

= 50

C

acima da temperatura de

ebulição do componente menos volátil

VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra

COLUNA

empacotada  = 3,2 mm (1_/ 4”) 0,1 ml ... 50 mL 0,2 L ... 20 L capilar  = 0,25 mm 0,01 L ... 3 L 0,001 ml ... 0,1 mL

Microsseringas para Injeção

LÍQUIDOS

Capacidades típicas: 1, 5 e 10



L

êmbolo

corpo (pirex)

agulha (inox 316)

Microseringa de 10

Microseringa de 1

guia

êmbolo (fio de aço soldado ao guia) agulha

Colunas: Definições Básicas

INSTRUMENTAÇÃO

Colunas: Definições Básicas

Coluna empacotada e capilar.

Empacotadas analíticas: - Aço inoxidável; - 1 – 4 mm (d.i.) - 1 – 3 m Capilares: - Sílica fundida; - Poliimida; -  0,32 mm (d.i.) - 10 – 100 m 35

TEORIA BÁSICA

Quantificação da Eficiência

ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H)

“Tamanho” de cada

estágio de equilíbrio

Valores típicos de H e N:

Capilares, L = 30 m

Empacotadas, L = 2 m

Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como

(L = comprimento da coluna)

Temperatura da Coluna

PRESSÃO DE VAPOR

(p

_).

p

0

= f

Estrutura química

do analito

Temperatura

da coluna

Temperatura

da

coluna

Pressão

de

vapor

Velocidade

de

migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE

Temperatura da Coluna

TEMPERA

TURA

DA

Programação Linear de Temperatura

Misturas complexas (constituintes com volatilidades

muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

T

BAIXA:

T

ALTA:

Programação Linear de Temperatura

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:

TEM PERA TURA

T

T

R

Programação Linear de Temperatura

Possíveis problemas associados à PLT:

VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE

A viscosidade

de um gás aumenta com a temperatura.

viscosidade

vazão

DERIVA

(“DRIFT”) NA LINHA DE BASE

Devido ao aumento

de volatilização de FE líquida

FASES ESTACIONÁRIAS

LÍQUIDOS

Depositados sobre a superfície de: só-lidos porosos inertes

(colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas

capilares)

Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente

ela é:

Entrecruzada

Quimicamente ligadas

FASES ESTACIONÁRIAS

SELETIVA

Deve interagir diferencialmente com os

componentes da amostra.

A FE deve ter características tanto quanto possível próximas das

FE Seletiva: separação

adequada dos

constituintes da

amostra

FE pouco Seletiva: má

resolução mesmo com

coluna de boa eficiência

FASES ESTACIONÁRIAS

Substituintes Nomes Comerciais Observações

- - SE-30 OV-1 OV-101 SP-2100 mais apolares da série pouco seletivas

carborano ? - Dexsil 300GC similar a PDMS

estável até > 400oC fenil 5 % - SE-52 SE-54 OV-3 OV-5

OV-73

pouco polar

cianopropil 7% fenil 7% OV-1701 SPB-7 CP-Sil 19CB moderadamente polar

fenil 50 % - OV-17 SP-2250 HP-50+ SPB-50

moderadamente polar retém aromáticos

trifluoropropil 50% - OV-210 QF-1 moderadamente polar retém compostos carbonílicos

cianopropil 50% fenil 50% OV-225 SP-2300 CP-Sil 43CB

polar

retem doadores de elétrons

cianopropil 100% - SP-2340 SP-2330 Silar-9 CP altamente polar

Diferenças entre FE de composição similar provenientes

de fornecedores diferentes:

pureza

,

viscosidade

.

FASES ESTACIONÁRIAS

Famílias de FE Líquidas

Separação de pesticidas - FE = 100 % PDMS

Gás de Arraste: He @ 35 cm min-1 _{Detector: FID}

FASES ESTACIONÁRIAS

Famílias de FE Líquidas

Separação de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone

1 - piridina 2 - 2-metilpiridina 3 - 2,6-dimetilpiridina 4 - 2-etilpiridina 5 - 3-metilpiridina 6 - 4-metilpiridina 3 min Coluna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m) T_COL: 110 o_{C (isotérmico)}

Gás de Arraste: N₂ at 16 cm min-1 _{Detector: FID}

FASES ESTACIONÁRIAS

Famílias de FE Líquidas

Separação de fenóis - FE = fenilmetilsilicones

50% Ph

50% Me

5% Ph

95% Me

FASES ESTACIONÁRIAS

FE Quirais

Separação de isômeros óticos:

FÁRMACOS

PRODUTOS BIOLÓGICOS

Propriedades físico-químicas de isômeros óticos são MUITO SIMILARES

FE convencionais não interagem diferencialmente com isômeros óticos

Separação de misturas de isômeros óticos só é possível

com FE oticamente ativas =

FE Quirais

ANÁLISE QUALITATIVA

Conceitos Gerais

Fontes de Informações Qualitativas

RETENÇÃO

DETECÇÃO

substâncias eluídas

Identificação individual das espécies contidas na amostra

Determinação da identidade da amostra propriamente dita

Aplicações

Qualitativas de

ANÁLISE QUALITATIVA

Tempos de Retenção

t’

_R

= f

Interações analito / FE

Pressão de vapor do analito

Condições operacionais (T

, F

...)

Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de

um analito é uma constante

AMOSTRA

PADRÃO

ANÁLISE QUALITATIVA

Tempos de Retenção

Identificação por t’

é muito pouco confiável:

Dependência com F

e T

Variações nestas condições

afetam sensivelmente os t’

VARIAÇÃO DE  1% NO t’_R

D

D

Sobrecarga na coluna

Aumento excessivo na massa de

material eluido deforma o pico cromatográfico e altera o seu t

MAS

ANÁLISE QUALITATIVA

Tempos de Retenção

Comparação de t’

usando dopagem (“spiking”) da amostra com

o analito suspeito: aumento da confiabilidade de identificação.

DETECTORES

Definições Gerais

Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à

quantidade eluida de um analito

~ 60 detectores já usados em CG

~ 15 equipam cromatógrafos comerciais

4 respondem pela maior parte das aplicações

DCT TCD Detector por Condutividade Térmica DIC FID Detector por Ionização em Chama DCE ECD Detector por Captura de EM MS Detector Espectrométrico de

INSTRUMENTAÇÃO

Detectores

Mais Importantes:

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE

OU

Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (

OU

)

Variação da condutividade térmica do gás de arraste.

DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC

OU

REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO

Registradores XY

Integradores

Computadores

DETECTORES

Detector por Condutividade Térmica

PRINCÍPIO

Variação na condutividade térmica do gás quando da

eluição de um analito.

1

2

3

5

4

i

1Bloco metálico (aço)

2Entrada de gás de arraste

3Saída de gás de arraste

4Filamento metálico (liga W-Re) aquecido

5Alimentação de corrente elétrica para aquecimento do filamento

DCT: Aplicações

Coluna: CP Sil 5CB (50 m x 0,32 mm x 5 µm)

Gás de Arraste: He, 3 ml min-1

T

:

4

Detector:

DCT

1 N₂ 2 CH₄

3 CO₂ 4 n-C₂

5 NH₃ 6 n-C₃

7 i-C₄ 8 n-C₄

Separação de Gases e Hidrocarbonetos

:

Detector por Ionização em Chama

O efluente da coluna é misturado com H₂ e

O₂ e queimado. Como numa chama de H₂ +

O₂ não existem íons, ela não conduz corrente elétrica.

Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a

Detector por Captura de Eletrons

Um fluxo contínuo de eletrons lentos é estabelecido entre um anôdo (fonte radioativa

b -emissora) e um catodo.

Na passagem de uma substância eletrofílica alguns eletrons são absorvidos, resultando uma supressão de corrente elétrica.

Características Operacionais do DCE

SENSIBILIDADE :

QMD = 0,01 pg a 1 pg (organoclorados),

10 fg Lindano (C

H

)



-ECD HP-6890

DCE: Aplicações

Contaminantes em ar atmosférico - detecção paralela DIC + DCE

DIC

DCE

1, 2, 3 - Hidrocarbonetos aromáticos

4, 5, 6 - Hidrocarbonetos clorados

DETECTORES

Parâmetros Básicos de Desempenho

QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL

Massa de um analito que gera um pico

com altura igual a três vezes o nível de ruído

SINAL (S)

RUÍDO (N)

= 3 S

N

RUÍDO

Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se

origina da amostra

Fontes de Ruído

Contaminantes nos gases

DETECTORES

Parâmetros Básicos de Desempenho

LIMITE DE DETEÇÃO Quantidade de analito que gera um pico com S/N = 3 e w_b = 1 unidade de tempo

Mesmo detector, nível de ruído e massa de analito MAS diferentes larguras de base:

w

QMD = f

Detector (sinal gerado, ruído)

Largura do pico cromatográfico

Definindo limite de detecção como:

LD é independente da eficiência do sistema cromatográfico !

[QMD] = massa (ng, pg ...) [LD] = massa / tempo (ng.s-1_{, pg.s}-1 _...) 63

DETECTORES

Classificação

Detector Tipo Gases Seletividade Faixa

Detecção

Faixa Dinâmica

Ionizaçao de Chama (FID)

Fluxo de Massa _{Hidrogenio e ar} Maioria dos compostos organicos.

100 pg 107

Condutividade Térmica TCD

Concentração _{Referencia Universal} 1 ng 107 Captura de

Eletrons ECD

Concentraçao Make-up Haletos, nitratos, nitrilas, peroxidos , anidridos, organometalicos. 50 fg 105 Nitrogenio-fosforo (NPD) Fluxo de Massa

Hidrogenio e ar Nitrogenio, fosforos 10 pg 10

6

Fotometrico de Chama (FPD)

Fluxo de Massa Hidrogenio e ar possivelmente oxigenio

Sulforados, fosforados, tin, boro, arsenico, germânio, selenio, cromo

100 pg 103

Fotoionizaçao (PID)

Concentração Make-up Alifaticos, aromaticos, cetonas, esteres, aldeidos, aminas,

heterociclicos, organosulforados, alguns organometalicos

2 pg 107

Condutividade Eletrolitica

Fluxo de Massa Hidrogenio ,

ANÁLISE QUALITATIVA

Métodos de Detecção Qualitativos

Cromatografia Gasosa com Deteção

Espectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho

(CG-EIV)

Cromatografia Gasosa com Deteção

Espectrométrica de Massas (CG-EM)

Cromatografia Gasosa com Deteção

Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)

Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de

identificação baseadas em retenção

ANÁLISE QUALITATIVA

Espectrometria de Massas

1

ABCDE + e



ABCDE

.

+ 2 e

-2

ABCDE

.



AB

.

+ CDE

ABCDE

.



AB

+ CDE

.

ABCDE

.



A

+ BCDE

.

3

ABUNDÂNCI

ANÁLISE QUALITATIVA

Espectrômetro de Massas

1

2

3

4

1 Câmara de Ionização Eletrons gerados por um filamento aquecido bombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) são repelidos pelo eletrodo positivo e conduzidos ao separador magnético.

2 Saída de Vácuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vácuo (natm).

3 Separador Magnético A ação do campo magnético deixa apenas íons com determinada razão Massa / Carga atravessar esta área do equipamento.

4 Detector Uma válvula fotomultiplicadora ou um fotodiodo gera um sinal elétrico proporcional ao

ANÁLISE QUALITATIVA

Espectro de Massas

ANÁLISE QUALITATIVA

CG-EM: TIC x SIM

Aroma de polpa industrializada de cajá após extração por SPME

TIC

SIM (m/z = 149)

(ftalatos: plastificante)

DETECTORES CG