Biorremediação de ambientes contaminados por petróleo e derivados

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Alexandre Soares Rosado

Unidade de Ecologia microbiana e biotecnologia do Petróleo do polo de Biotecnologia BIOINOVAR

-UFRJ

13 de setembro de 2013 -UERJ

Biorremediação de ambientes contaminados por petróleo e derivados

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Origem do Petróleo

 O petróleo é originado de grandes deposições fósseis, é uma

mistura bastante complexa de compostos orgânicos e com um alto conteúdo de energia.

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Tipos de hidrocarbonetos encontrados no

Petróleo)

• Fração saturada – Parafinas ( n-alcanos, alcanos ramificados) e Naftenos ( cicloalcanos)

• Fração insaturada (aromáticos, oleofinas, diolefinas e acetilênicos)

• Compostos não hidrocarbônicos, como os ácidos naftênicos e sulfurados

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Os efeitos tóxicos imediatos

Os efeitos crônicos da poluição com petróleo são pouco conhecidos.

Moléculas de baixa massa molecular

Moléculas de alta massa molecular

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Efeitos carcinogênicos e

citogenéticos de longo prazo

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Petróleo

 A principal fonte de energia do planeta, de distribuíção não homogênea entre os países e um recurso não-renovável

A sociedade atual é extremamente dependente da utilização de petróleo para o seu desenvolvimento.

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 O Petróleo se tornou provavelmente a mais importante substância negociada entre países e corporações levando a guerras, massacres e extermínios.

 Crise do petróleo na década de 1970  A Primeira Guerra do Golfo

 Diferentes guerras entre os países árabes, inclusive a Guerra Irã-Iraque  A luta pela independência da Chechênia

 Guerra Iraque-Estados Unidos (Invasão do Iraque)

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FONTES DE POLUIÇÃO DE HIDROCARBONETOS NO MAR

Esgoto Industrial e Urbano 62%

Navios não Petroleiros 15%

Fonte Natural 10%

Operação de Petroleiros 7% Acidentes com Petroleiros 3% Exploração & Produção 2% Terminais / Refinarias 1%

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Biodegradação

 Utilização de hidrocarbonetos por microrganismos: ZoBell, 1946, observou a capacidade degradativa de bactérias pertencentes a 30 gêneros

 Ampla distribuição na natureza.

 Utilização dependente da natureza química e das condições ambientais.

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Ataque inicial por oxigenases

O₂ O₂

Degradação por vias periféricas Ciclo TCA CO₂ H₂O PO₄3- SO₄2- Fe3+ Biomassa celular Multiplicação NH₄= HIDROCARBONETOS O₂

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http://www.miamisci.org/microbes/images/soil-bacteria.gif http://archive.globe.gov/sda/tg97/soil/img/big/forest_soil.jpg http://www.umcpegypt.umd.edu/img/dna2.jpg http://earthstar2000.com/ebay/microtube.jpg http://www.bio.ic.ac.uk/research/rhac/Gel020706-3.gif http://www.stanford.edu/group/CFRL/chromatogram.jpg http://plantbio.berkeley.edu/~volkman/courses/dendrogram.gif http://www.santarosa.edu/lifesciences/ensatree.gif DIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA MICROBIANA PROMOVENDO SUSTENTABILIDADE”

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O que

procuramos?

Estudos sobre a diversidade e

Bioprospecção microbiana

Uso de “ Tecnologias Limpas”

Aplicação

de ações que levem ao desenvolvimento sustentável

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Estratégias de Remediação



Quantidade do contaminante



Características do ambiente

Seleção

Tecnologias mais

adequadas

•Melhor relação custo-benefício •Tempo de tratamento

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Biorremediação Processo Promissor

Aceitação

•Agências

Reguladoras

•Opinião pública

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Técnica de remediação Euro/m3 Incineração Ex-situ 785 Aterro Ex-situ 231 Lavagem/Trat. térm. 226-229 Fitorremediação 122 (22-222) Imobilização In/Ex-Situ 112-139 Air Sparging/Bomb. Trat. 91-71

Biorremediação-Landfarming 62-73

Muros reativos/de contenção 50-55

Atenuação natural monitorada 20

Fonte: www.cordis.lu (junho, 2006)

Custos de técnicas de remediação Países (11) da CEE

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Bioestimulação

Bioaumento

Correção de fatores e/ou adição de nutrientes específicos para garantir a quantidade e a qualidade da

microbiota nativa

Adição de linhagens microbianas

compatíveis com o local contaminado

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Manguezais no Brasil:

Também conhecidos como florestas de mangue ou simplesmente mangues, estes ecossistemas costeiros, situam-se na faixa tropical e subtropical do mundo. No Brasil, estes ambientes distribuem-se ao longo da costa desde o Estado do Amapá até Santa Catarina, perfazendo uma área total de 25.000 Km2 (Vergara-Filho, 1993).

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Avaliação de diferentes estratégias para biorremediação de manguezais

 I. Avaliação Pré-tratamento

 II. Experimento de microcosmo  III. Experimento Piloto

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Amostra de manguezal

Análise físico-química

Análise textural

Análise microbiológica

Análise da profundidade de penetração do óleo e potencial Redox

Técnicas convencionais Isolamento e Contagem de

Rizosfera e sedimentos

Caracterização dos isolados e Potencial de biodegradação

Seleção dos isolados degradadores

Técnicas Moleculares Rizosfera e sedimentos

Biblioteca de clones Perfil genético da comunidade

microbiana (PCR/DGGE)

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Planejamento fatorial

Microcosmos

Sem a planta Com a planta

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Experimento Piloto

Químico (TPH, óleo residual) Monitoramento Físico químico

Toxicológico _Ecológico

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Diagnóstico do ambiente

Portão

Efluente

3m 3m 3m

Amostra composta controle 1

Amostra composta controle 2

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0 20 40 60 80 100 120 Gama proteobacteria alpha proteobacteria delta proteobacteria beta proteobacteria Gama proteobacteria alpha proteobacteria delta proteobacteria beta proteobacteria

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a b

c d

e

Bacteria (a); Pseudomonas

(b); Actinobacteria (c);

Betaproteobacteria (d) and;

Alphaproteobacteria (e). O manguezal é representado por nove pontos (1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C)

e o manguezal de

referência é representado pela sigla “cab”. S e R

indicam amostras de

sedimento ou rizosfera, respectivamente.

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log CFU/ml

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Amostras Contagem

(NMP de mo. Deg.de óleo/ 100mL) R ctr 23 X 102 R3A 43 X 102 R3B 24 X 103 R3C 21 X 103 R2A 23 X 102 R2B 23 X 102 R2C 93 X 102 R1A 23 X 102 R1B < 3 X 102 R1C 15 X 102 S ctr < 3 X 102 S1 comp. 4 X 10 2 S2 comp. 9 X 10 2 S3 comp. 2,3 X 10 3 A B C D E F 1 2 3 4

Isolamento e caracterização de microrganismos degradadores de óleo

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Inoculação das estirpes degradadoras em meio BH líquido acrescido de óleo a 0,1% para

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Compostos alvo (µg/l,

ppb) Controle Estirpe R1C -2A % de degradação n C10 825,02 21,09 97,44 n C11 1186,84 5,6 99,52 n C12 1401,15 3,25 99,77 n C13 1954,97 40,58 97,92 n C14 2211,94 47,21 97,86 n C15 2471,63 3,1 99,88 n C16 2452,62 1,68 99,93 n C17 3220,89 28,75 99,1 n C18 1961,78 50,58 97,42 n C19 1631,63 1,1 99,93 n C20 1440,83 1,6 99,99 n C21 1388,57 5,61 99,59 n C22 1193,70 8,05 99,32 n C23 1123,38 10,74 99,04 n C24 1046,75 18,62 98,22 n C25 1040,54 2,42 99,77 n C26 849,03 31,54 96,28 n C27 783,62 2,45 99,7 n C28 550,06 16,09 97,07 n C29 480,66 15,37 96,8 n C30 376,32 18,83 95 n C31 526,44 31,52 94 n C32 383,55 27,80 92,75 n C33 288,29 22,84 92,07 n C34 185,65 12,67 93,17 n C35 144,77 9,72 93,28 n C36 114,29 14,40 87,4 Total 333.521,8 1.287,56 99,61

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Montagem do Consórcio

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Produção e plantio das mudas

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Experimento de biorremediação – Campo e Viveiro

Crescimento Vegetal

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Fisiologia Vegetal

Taxa de atividade fotossintética das mudas no viveiro e no manguezal

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Produção de pigmentos pelas mudas no viveiro e no campo

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Taxa de atividade

fotossintética das mudas do campo e no viveiro

submetidas aos diferentes tratamentos de

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Análises microbiológicas Sedimento

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Análises microbiológicas Rizosfera

Campo –Antes da inoculação e 3 meses após inoculação

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Viveiro – 3 meses após inoculação

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Campo – 6 meses após inoculação

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Conclusões, Considerações finais e Recomendações

O projeto intitulado “Avaliação de diferentes

estratégias para biorremediação de manguezais”

contribuiu de maneira bastante abrangente para guiar futuros estudos de biorremediação de manguezais.

Além de ter contribuído com um extenso levantamento acerca da diversidade microbiana de um manguezal brasileiro, esse trabalho pioneiro, utilizou pela primeira vez diferentes estratégias de biorremediação in situ em manguezal brasileiro e técnicas moleculares de monitoramento microbiano.

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Esse é o primeiro estudo a realizar esse tipo de mapeamento e correlação entre a diversidade microbiana (utilizando-se métodos convencionais e moleculares) e a estrutura heterogênea química de manguezais, demonstrando que essa diversidade corresponde às variações químicas de diferentes nichos dentro de um mesmo ambiente.

“DNA Barcoding”

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Montagem do consórcio bacteriano de degradação de óleo a ser aplicado nos

experimentos de biorremediação

Nesse ponto, a equipe se deparou com um dos desafios desse projeto; Montar uma estratégia que permitisse a manutenção do consórcio microbiano e do fertilizante (Bioestímulo) em campo ao longo do tempo, sem que houvesse uma “lavagem” desses inóculos devido à ação da maré.

Solução encontrada-Fertilizantes: Fertilizantes de liberação lenta, enterrados no sedimento contido

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Solução desenvolvida – Consórcio: As bactérias do consórcio foram “encapsuladas” em uma matriz que além de permitir a manutenção física das bactérias no campo, permitiu ainda a liberação desses organismos gradativamente.

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Dessa forma, desenvolvemos e utilizamos uma

estratégia utilizando os microrganismos e

fertilizantes associados às mudas do replantio, garantindo não apenas a manutenção dos inóculos em campo como ainda o estabelecimento desses nas rizosferas das mudas.

Assim, além da aplicação na degradação do óleo no sedimento, as próprias mudas puderam utilizar esses inóculos, que por sua vez permitiram um melhor e mais rápido desenvolvimento das plantas.

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Segundo obstáculo

A grande heterogeneidade da distribuição do óleo em manguezais (não permite uma avaliação clara dos resultados das análises de HTP e HPA)

Nossa recomendação é que em estudos de biorremediação de manguezais outros parâmetros sejam levados em conta para

avaliar a recuperação do ambiente, entre eles, o uso de indicadores biológicos de

recuperação como a diversidade microbiana e as respostas vegetais.

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Microrganismos já são propostos na literatura como excelentes indicadores de alterações e recuperação ambiental;

Quanto aos vegetais, eles são uma das bases do ecossistema manguezal. Dessa forma, havendo recuperação das espécies vegetais em manguezais, outros organismos tendem a retornar a esse ambiente e todo o ecossistema tende a se reestruturar e recuperar.

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O monitoramento microbiológico e do desenvolvimento de plantas revelou o eficiente estabelecimento dos inóculos através da observação das alterações dos perfis microbianos de áreas sob diferentes tratamentos (microrganismos indicadores de alterações, no caso, dos tipos de tratamento estabelecidos);

O tratamento de Bioestímulo + Bioaumento proporcionou melhor desenvolvimento das espécies vegetais (tanto L. racemosa quanto R. mangle).

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Resultado...

Estimulo no crescimento das plantas, degradação de hidrocarbonetos, manutenção da microbiota nativa

=

Recuperação do ambiente sem causar impactos secundários EMM

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Agradecimentos:

Raquel Peixoto, Norma

Rumjanek, Andrew Macrae, Heitor Coutinho

Flavia Freitas, Gina Vasques,

Staffan Kjellberg

Fábio Mota & Lucy Seldin