Lucélia Campelo de Albuquerque Moraes

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” UNESP - INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU

Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada

Alterações Imunológicas e histopatológicas na sepse experimental:

Contribuição da TSST-1

Lucélia Campelo de Albuquerque Moraes

Botucatu – SP

2008

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Lucélia Campelo de Albuquerque Moraes

Alterações Imunológicas e histopatológicas na sepse experimental:

Contribuição da TSST-1

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista para obtenção do título de Mestre.

Botucatu – SP

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Dedicatória

A minha querida família

Sem dúvida, em especial minha mãe, meus avós, peças fundamentais, que do início ao fim colocaram as pedras no meu muro, não só solidificaram a minha vontade como também minha coragem de sempre lutar pelos ideais que tracei: vocês nunca me abandonaram, e sempre foram as armas pra minha vitória.

Desde o meu nascimento até aqui, nas inúmeras batalhas sempre tive o principal alicerce: família.

Sem vocês não seria possível eu ter chegado aqui, sem suas palavras de consolo, na voz encorajadora quando tudo parecia perdido, nas orações que sempre foram feitas, e nas atitudes que diminuía o sofrimento da distância, na mão que jamais se fechou e na porta que sempre se abriu pra receber-me, nas decisões mais difíceis da minha vida, e neste novo momento que me realizo devo tudo a vocês.

Portanto, só poderia dedicá-los o fruto do nosso esforço: o presente trabalho. Pai mesmo distante nunca te esquecerei!!!

Lizomar e Manuel Jazony e José. Tudo devo a vós!!!

Adriano

Esposo, amigo e companheiro, não tenho palavras pra descrever tudo o que significas pra mim...faltam palavras!

Sempre ao meu lado apoiando, dando forças, quando estas estavam escassas, nas adversidades. Hoje estamos juntos e sem dúvida eu não teria conseguido sem você.

Você me transmite o sentimento mais nobre que o ser humano pode ter: O amor e a gratidão. Na alegria e na tristeza, na saúde e na doença, até que a morte nos separe! Amo-te para sempre!

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A Professora Dr

a.

_{Alexandrina Sartori,}

Precisaria de inúmeras páginas para citar as vezes que nos encontramos, não apenas como orientadora-educadora e profissional que transparece, mas como mãe. Porque não falar dos alunos que nas dificuldades (como eu) buscam o seu colo. No decorrer deste desafio, estiveste sempre presente de alguma forma mesmo longe observando e até dando “ broncas” valiosas. Mas que contribuíram para minha trajetória.

Homenagens, frases poéticas, certamente farão parte do seu dia-a-dia, mas quero de forma especial relembrar a pessoa maravilhosa que você é, a importância do seu ofício e mais, a tua grande importância em minha vida até a concretização dos meus sonhos. De você veio o voto de confiança e a força para jamais desistir do caminho por mim escolhido.

Este poema é apenas uma forma de demonstrar minha gratidão! Ser Professor

Ser transmissor de verdades, De inverdades...

Ser cultivador de amor,

De amizades. Ser convicto de acertos, De erros.

Ser construtor de seres, De vidas.

Ser edificador.

Movido por impulsos, por razão, por emoção. De sentimentos profundos,

Que carrega no peito o orgulho de educar. Que armazena o conhecer,

Que guarda no coração, o pesar De valores essenciais Para a felicidade dos “seus”. Ser conquistador de almas. Ser lutador,

Que enfrenta agruras,

Mas prossegue, vai adiante realizando sonhos, Buscando se auto-realizar,

Atingir sua plenitude humana. Possuidor de potencialidades. Da fraqueza, sempre surge a força Fazendo-o guerreiro.

Ser de incalculável sabedoria,

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Agradec

Agradeciiiimentos

mentos

Ao Deus Amigo e fiel que sempre enxugou minhas lágrimas e me ajudou a recomeçar. “’ Distante de ti Senhor não posso viver não vale a pena existir”.’ Distante de ti Senhor não posso viver não vale a pena existir”.’ Distante de ti Senhor não posso viver não vale a pena existir”. ’ Distante de ti Senhor não posso viver não vale a pena existir”.

A família pelo apoio incondicional, incluo aqui nesta família, a família Oliveira, mesmo indiretamente sempre contribuíram de inúmeras formas pelo meu sucesso.

A Profa_Dra_{Alexandrina Sartori pela orientação dada ao longo do curso e pelo voto de confiança dado a}

mim para seguir, persistir e jamais desistir. Sem dúvida sem seu apoio o caminho ficaria árduo, mas com tua sabedoria soube conduzir da melhor forma possível este projeto.

A Profa _{Maria de Lourdes, minha co-orientadora sempre atenciosa, obrigada pela ajuda do início ao fim do}

trabalho, e a colaboração também dos colegas do laboratório de Microbiologia pela ajuda sempre que possível.

Aos funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia por toda a orientação dada nas etapas de execução deste projeto.

Aos colegas de Laboratório, Thaís, Sofia, pela paciência, generosidade, e a colaboração, mesmo ausentes, vocês sempre fizeram parte da minha caminhada na pós-graduação.

Ao amigo Douglas, grande incentivador nesta jornada, pelo tempo de convivência no qual passamos a nos conhecer, a minha gratidão pela ajuda indispensável até aqui.

Aos amigos, companheiros de trabalho do Laboratório de Análises Clínicas – HC- FMB, a compreensão, a generosidade, os momentos de desabafos, e também os preciosos conhecimentos transmitidos a minha pessoa, durante o tempo permanecido ao vosso lado. Não poderia deixar de registrar aqui, sem menosprezar os outros, mas devo citar; Claudia Hecker pela caminhada trabalhando juntas e pela compreensão quando precisava de sua ajuda para estudar nos momentos de “folga” no trabalho, A Eneida, amiga sempre disposta a ajudar. Nelci, Cristina , Beth, Clóvis e Mical vocês são especiais para mim.

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A Equipe de plantonistas com a qual passei uma boa parte das minhas noites e sempre pedia um tempinho para estudar, não conheci melhor exemplo de equipe e companheirismo, e pela compreensão quando o meu cansaço era nítido, pelas sopas tomadas nas madrugadas frias. (saudades)

Aos funcionários da Citologia e Microbiologia, grandes apoiodores na minha meta, que foram importantes neste percurso profissional e estudantil,

A Dra_{Adriana Polachinni do Valle não poderia deixar de agradecer, incentivo, pela contribuição dada para}

execução de algumas etapas do projeto, o apoio foi primordial para o resultado.

.As amigas “:Fernandas”, que saudades, o apoio, as conversas, e todos os esforços para ajudar-me.

Ao amigo Magno por todo o conhecimento transmitido, disponibilidade e tamanha dedicação quando necessitei, só tenho a lhe dizer o meu muito Obrigado!

Aos colegas do Departamento de Patologia, Rita e Laura, que arrumava um jeitinho genuinamente brasileiro para facilitar as minhas pesquisas;

A vó de “coração”, Isabel, pelos cafezinhos feitos, todas as manhãs que chegava do plantão, bom demais! Mesmo sem saber, suas sabias palavras jamais serão esquecidas: “Estude, pois o maior bem que podes estar carregando consigo é o conhecimento”.

Ao Prof. Ricardo Peres, o primeiro educador a saber da minha vontade de continuar os estudos, pelo tempo disponível para ensinar-me.

Aos Professores Luiz e Crisleide por me agüentarem nestes últimos seis meses, grandes colaboradores para o meu crescimento como professora.

A Profa_{. Roze Mirian Saldanha, pelo esforço em contribuir de alguma forma, sendo este esforço boa parte}

dele revertido em compreensão. A confiança depositada para iniciar minha carreira de professora. Esta conquista também é sua! Quando não tinha dias, noites e feriados para pedir sua ajuda. Sempre grata a Instituição Sei – Facider que me acolheu e hoje faz parte de minha história!

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Aos funcionários da Pós-graduação de Biologia Geral e Aplicada, pela orientação dada quando necessária, e também pela paciência.

Aos colegas da Pós-graduação que de alguma forma contribuíram para o término deste projeto.

Ao Departamento de Parasitologia pela disponibilidade de equipamentos quando necessário para realizar algumas etapas.

Ao ciclo Botucatu permito assim citar, que junto com este projeto vai ficando apenas na lembrança de muitos amigos conquistados, muitas dificuldades, mas também muitas vitórias, momentos esses que sempre serão lembrados com carinho.

A todos vocês: Obrigado!Obrigado!Obrigado!Obrigado!

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“Nenhuma mente que se abre para uma nova

idéia voltará a ter seu tamanho original.”

Albert Einstein

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RESUMO

Staphylococcus aureus é uma bactéria patogênica frequentemente isolada em hospitais e infecções adquiridas na comunidade. S. aureus produz diversas toxinas as quais tem importante papel no estabelecimento e manutenção da infecção. Toxina 1 da síndrome do choque tóxico é um superantígeno produzido por S. aureus e está envolvido com o choque tóxico caracterizada por febre, rash, descamação e hipotensão. TSST-1 se liga diretamente com a molécula de MHC II, presente na célula apresentadora de antígeno, e no receptor de célula T, em determinadas regiões de V beta. Subseqüentemente induz proliferação de células T e uma incontrolável resposta de citocinas pró-inflamatórias incluindo IL-1, IL-2, IL-6, INF-γ e TNF-α. Os objetivos específicos do projeto proposto foram: isolar e identificar cepas de S. aureus produtora e não produtora de TSST-1 a partir de isolados clínicos e comparar a gravidade da infecção por S. aureus TSST-1+ e TSST-1- em camundongos BALB⁄c. Cepas de S. aureus foram testadas quanto à presença do gene para TSST-1 por PCR e produção de toxina por reação de aglutinação reversa. Destas cepas duas foram selecionadas, uma produtora e outra não produtora de TSST-1, e foram utilizadas nos protocolos experimentais. Camundongos BALB⁄c (4 a 6 semanas de idade) foram infectados com TSST-1+ e TSST-1- por via intra-peritoneal. Vinte quatro horas após os animais foram sacrificados e as seguintes análises foram realizadas: hemograma, dosagem de INF-gama sérico (ELISA), carga bacteriana por determinação de unidades formadoras de colônias no sangue, baço, fígado, rim e pulmão. Também foi realizada análise histopatológica de vários órgãos. Não foram observadas diferenças significativas no hemograma e na carga bacteriana dos dois grupos avaliados. Entretanto, os animais inoculados com S. aureus TSST-1+ apresentaram níveis significativamente mais elevados de INF-gama sérico. Além disto, neste grupo foram observadas alterações histopatológicas caracterizadas por inflamação intersticial difusa nos pulmões e destruição acentuada da arquitetura esplênica, as quais não foram observadas no grupo infectado com S. aureus TSST-1- , níveis significativos de IFN-γ sérico e diminuição acentuada de leucócitos. Os resultados obtidos com a utilização de sobrenadante e de TSST-1 purificada permitiram sugerir que as alterações histopatológica mais acentuadas e os níveis mais elevados de IFN-γ foram causados pela produção da toxina pelo S.aureus.

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ABSTRACT

Staphylococcus aureus is a frequently isolated bacterial pathogen in hospital and community- acquired infections. S. aureus produces several exotoxins that play important roles in establishing and maintaining infections. Toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1), a pyrogenic toxin superantigen produced by pathogenic strains of S. aureus, is best known for its involvement in toxic shock syndrome, which manifests as fever, rash, desquamation and hypotension. TSST-1 can directly bind to class II molecules on antigen – presenting cells and to T cell receptors bearing specific Vβ elements. This subsequently leads to a massive proliferation of T cells and uncontrolled release of proinflammatory cytokines, including interleukin (IL)-1, IL-2, IL-6, IFN-γ and TNF-α. In this study we compared IFN-γ seric levels and the bacterial load in different organs in mice infected with TSST-1+ and TSST-1- S. aureus strains.

BALB/c male mice were infected with TSST-1+ or TSST-1- S. aureus strains by i.p. route. Control groups were injected with PBS or purified TSST-1 (2µg/0,5ml). Twenty four hours later, the animals were submitted to euthanasia and blood collected by heart puncture for hemoculture in BHI agar and IFN-γ quantification by ELISA. Spleen, liver, lung and kidney were collected, homogenized and plated in BHI agar for bacterial load determination. Higher IFN-γ levels were detected in mice infected with TSST-1+ S. aureus strain and in mice injected with the purified toxin, 60 and 120 pg/ml, respectively. In contrast, animals injected with TSST-1- strain presented lower sericIFN-γ levels (10 pg/ml). A high bacterial load was present in all organs tested with no statistical difference between animals infected with TSST-1+ and TSST-1- strains.

Experimental sepsis caused by TSST-1+ S. aureus resulted in higher IFN-γ seric levels than sepsis triggered by TSST-1- S. aureus.

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SUMÁRIO

1. Introdução ... 14

1.1 Staphylococcus aureus: características gerais e infecções ... 14

1.2 Resposta imune nas infecções por Staphylococcus aureus ... 16

1.3 Superantígenos ... 17 1.4 Sepse ... 22 2.1 Objetivo Geral ... 25 2.2 Objetivos específicos ... 25 3.Material e Métodos ... 26 3.1. Animais ... 26

3.2. Isolamento de cepas de S.aureus ... 26

3.3 Obtenção de sobrenadantes de culturas de S.aureus ... 26

3.4 Detecção de TSST-1 pelo Método de Aglutinação de Látex (RPLA) ... 27

3.5 Detecção do gene que codifica a TSST-1 ... 28

3.5.1 Extração de DNA... 28

3.5.2 Amplificação do DNA por PCR ... 28

3.5.3 Visualização dos produtos amplificados ... 29

3.6 Determinação de dose causadora de sepse ... 29

3.7 Leucograma ... 30

3.8 IFN-γ sérico ... 30

3.9 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) ... 31

3.10 Análise histopatológica de pulmão e baço ... 32

4. Protocolos e resultados ... 33

4.1 Protocolo Experimental I ... 33

4.1.1 Resultados Protocolo I ... 35

4.2 Protocolo Experimental II ... 36

4.2.1 Resultados Protocolo II ... 37

4.3 Protocolo Experimental III ... 39

4.3.1 Resultados Protocolo III ... 40

4.4 Protocolo Experimental IV ... 44 4.4.1 Resultados Protocolo IV ... 45 4.5 Protocolo Experimental V ... 50 4.5.1 Resultados Protocolo V ... 51 5. Discussão ... 55 6. Conclusão ... 62 7. Referências Bibliográficas ... 63 8. Anexos ... 73

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Lista de Abreviaturas µg: micrograma µL : microlitro µm : micrometro AB: estreptoavidina-peroxidase Ag : antígeno (85A, 85B)

ANOVA: análise de variância

APC : célula apresentadora de antígeno ATCC: coleção americana de tipos de culturas BSA : soro albumina bovina

CD : marcadores de superfície DNA: ácido desoxirribunucleico DO : densidade óptica

ELISA: ensaio imunoenzimático

EDTA : ácido etilenodiamino tetra-acético H2SO4 : ácido sulfúrico

HE: hematoxilina eosina IFN-γ: interferon gama

Ig: imunoglobulina

IL: interleucina-4, 5, 6, 10, 13... Kda: kilodalton

LPS: Lipopolissacarídeo

mm: milimetro

ETA: enterotoxinas A,B ,D...

M: molar

MHC: complexo principal de histocompatibilidade mL: mililitro

OPD: orto-fenilenodiamina

PBS : solução salina tamponada com fostato PCR: polymerase chain reaction

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RNA: ácido ribonucléico rpm: rotações por minuto

RPLA: aglutinação reversa passiva de látex RIA: radioimunoensaio

RPMI: meio líquido para cultura de células (Roswell Park Memorial Institute) Sags: Superantigenos

S.aureus: Staphylococcus aureus S. schleiferi: Staphylococcus schleiferi S. coagulans: Staphylococcus coagulans S. intermedius: Staphylococcus intermedius S. hyicus: Staphylococcus hyicus

S. delphin: Staphylococcus delphini:

SIRS: síndrome da resposta inflamatória sistemica Tγδ: célula T gama delta

TB: tuberculose

TCR: receptor para antígeno em célula T

TE: tampão tris-EDTA

Th: linfócito T auxiliar de fenótipo 0, 1 ou 2 TNFα: fator de necrose tumoral alfa

Treg: Célula T regulatória

TSST-1: Toxina 1 da síndrome do choque tóxico UFC: unidade formadora de colônia

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1.

1. 1. Introdução

Introdução

1.1 Staphylococcus aureus: características gerais e infecções

Membros do gênero Staphylococcus são cocos Gram-positivos, medindo 0,5 a 1,5 µm de diâmetro, que se apresentam isolados ou em arranjos irregulares lembrando cachos de uva. São imóveis, não formadores de esporos, catalase positivos e a maioria das espécies é anaeróbia facultativa (Kloos e Bannerman, 1995).

O gênero Staphylococcus é composto de 40 espécies, sendo a maioria deles coagulase-negativa; a síntese da coagulase só ocorre no S.aureus, S, schleiferi subsp. coagulans, S. intermedius, S. hyicus e S. delphini, (Trülzsch et al., 2002; Bannerman, 2003). Esses microrganismos encontram-se amplamente distribuídos na natureza, sendo principalmente encontrados na pele e nas membranas mucosas de alguns mamíferos e outros animais. Algumas espécies estafilocócicas demonstram preferência por certos habitats em seus hospedeiros, sendo que o S. aureus prefere as narinas, especialmente em adultos humanos (Kloos e Bannerman, 1995).

Os estafilococos geralmente mantêm uma relação benigna ou simbiótica com seus hospedeiros. Contudo, se a barreira cutânea for rompida por trauma ou pela presença de agentes estranhos, esses microrganismos podem atingir outros tecidos e proliferar-se, apresentando um comportamento patogênico (Koneman et al., 1997). O S. aureus é a espécie mais importante, sendo agente de uma grande variedade de infecções. As infecções nosocomiais têm sido as principais causas de morbidade e mortalidade. Tais infecções são, freqüentemente, agudas e piogênicas e, se não tratadas, podem causar bacteremia envolvendo vários órgãos. As infecções mais comuns incluem furúnculos, celulite, impetigo e sítios de ferida cirúrgica. Algumas das infecções mais graves são a bacteremia, pneumonia, osteomielite, endocardite aguda, miocardite, meningite, e abscesso nos músculos, trato genitourinário, sistema nervoso central e vários órgãos intra-abdominais (Bergdoll, 1991; Bannerman et al., 2003).

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O S. aureus produz uma ampla variedade de toxinas, que podem ser divididas em dois grupos, as toxinas que induzem à lise, denominadas hemolisinas citotóxicas, as quais são capazes de produzir lesão diretamente na membrana externa das células alvo (Freer e Arbuthnott, 1983), e também as chamadas toxinas superantigênicas, que não possuem ação lítica direta, mas que podem produzir lesão através da superprodução de citocinas por células T e macrófagos ativados (Dinges et al., 2000; Michelin e Carlos, 2003). Quatro toxinas citolíticas são produzidas, incluindo-se a toxina alfa (α), beta (β), delta (δ) e a gama (λ). Essas toxinas também foram descritas como hemolisinas, com base em sua capacidade de lisar hemácias, mas como sua atividade biológica não é restrita às hemácias, introduziu-se o termo toxina citolítica (Bernheimer, 1974). As toxinas estafilocócicas, denominadas superantígenos, são classificadas antigenicamente em toxina 1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1) e em enterotoxinas. Através da produção desses superantígenos desencadeiam uma série de efeitos tóxicos, como a síndrome do choque tóxico, as intoxicações alimentares e diversas alterações do sistema imune (Dinges et al., 2000; Michelin e Carlos 2003).

A patogenicidade desta espécie deve-se tanto à absorção dessas toxinas pré-formadas, quanto à poderosa capacidade invasiva que leva às bacteremias e abscessos disseminados em todos os órgãos. A partir de qualquer foco esses microrganismos podem propagar-se através dos linfáticos e da corrente sanguínea para outras partes do corpo (Koneman et al, 1997). Alguns fatores do hospedeiro predispõem as infecções por esses microrganismos, dentre eles, idade, grau de nutrição, doenças crônicas de base, cateteres intravenosos ou fatores comportamentais como uso de drogas intravenosas por viciados e tempo prolongado de hospitalização (Koneman, 1997; Bannerman et al., 2003). A infecção e propagação por contato assumem maior importância nos hospitais, onde grande parte da equipe e dos pacientes abriga cepas resistentes no nariz e na pele (Kloos e Bannerman, 1995).

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1.2 Resposta imune nas infecções por Staphylococcus aureus

Após transpor as barreiras físicas do organismo, tais como pele e mucosas, o S. aureus vai enfrentar inicialmente a imunidade inata e depois a imunidade específica. A infecção com S. aureus estimula uma resposta inflamatória acentuada envolvendo a migração de neutrófilos e macrófagos para o sítio da infecção. Estas células tentam internalizar e destruir estas bactérias com o auxílio de anticorpos específicos e componentes do sistema complemento presentes no soro (Foster, 2005). A resposta imune específica ocorre quando a bactéria e seus produtos são internalizados pelos macrófagos e outras células apresentadoras de antígenos e transportados aos linfonodos regionais ou baço, onde células B são estimuladas a se diferenciar em plasmócitos e secretar anticorpos. Estes anticorpos podem neutralizar as toxinas liberadas e também facilitar o processo de fagocitose destas bactérias por opsonização (Foster, 2005). Anticorpos contra S. aureus estão presentes em praticamente todos os indivíduos humanos e existem relatos mostrando também que os títulos de anticorpos específicos aumentam após infecção (Dryla., et al, 2005). Entretanto, os anticorpos e a memória imunológica parecem ser insuficientes para prevenir infecções subseqüentes por esta bactéria.

A qual pode sobreviver dentro de células do hospedeiro em um estado “semi-dormente” denominado variante de colônia pequena (Von Eiff et al., 2002). Uma resposta imune celular é necessária para eliminar as células infectadas com esta variante. Pouco se sabe sobre a contribuição da imunidade celular no controle das infecções crônicas causadas por S. aureus (Von Eiff et al., 2002).

Apesar de ser combatido por uma série de mecanismos imunológicos, tanto não específicos quanto específicos, o S. aureus dispõe de uma série de mecanismos de escape que permite evasão às defesas do organismo. Os principais mecanismos de evasão descritos incluem: inibição de quimiotaxia de neutrófilos (Murdoch et al, 2000); liberação de toxinas que matam os leucócitos (Montoya & Gouaux, 2003); resistência à fagocitose (Palmqvist et al., 2002); inativação do sistema complemento (Rooijakkers et al., 2005) e liberação de moléculas imunomoduladoras as quais podem determinar imunossupressão (Foster, 2005). Entre as moléculas imunomoduladoras se destacam os superantígenos que serão descritos a seguir.

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1.3 Superantígenos

Superantígenos são polipeptídeos pequenos, não glicosilados, com peso molecular entre 20-30.000 daltons (Novick et al., 2003). Cada toxina é produzida inicialmente como uma proteína precursora contendo uma seqüência sinal amino-terminal a qual é clivada quando a molécula é liberada pela célula bacteriana.

Os antígenos convencionais ativam um pequeno número de linfócitos, ou seja, somente aqueles que possuem receptores específicos para o antígeno. Já os superantígenos (SAgs), como o nome sugere, são capazes de estimular um grande número de linfócitos, independentemente de suas especificidades. Os SAgs têm a habilidade de ligação em ambos, na molécula de histocompatibilidade de classe II (MHC II) e no receptor para antígeno das células T (TCR) (Hermann et al., 1991). Esta interação resulta em uma liberação maciça de citocinas que é a principal causa das doenças humanas associadas aos SAgs (Proft & Fraser, 2003). Entretanto, outras propriedades dos SAgs as quais não estão relacionadas com a superantigenicidade tais como: inflamação local, vômitos e potencialização da atividade do lipopolissacarídeo (LPS) estão presentes nestas moléculas e podem também contribuir para o desencadeamento da doença (Proft & Fraser, 2003).

Como foi dito anteriormente, o S. aureus produz uma grande variedade de exoproteínas que contribuem para sua habilidade de colonizar os tecidos e também para seu envolvimento em várias doenças nos hospedeiros mamíferos. Quase todas as cepas desta bactéria secretam enzimas as quais têm como função a liberação de nutrientes a partir do tecido local destruído e, portanto, de sustentar o crescimento bacteriano. Algumas cepas também produzem uma ou mais exoproteínas, incluindo as enterotoxinas (SEA, SEB, SECn, SED, SEG, SHE e SEI), a toxina 1 associada ao choque tóxico (TSST-1), toxinas esfoliativas (ETA e ETB) e a leucocidina (Dinges et al., 2000).

Diferentes cepas de S. aureus produzem diferentes combinações de toxinas superantigênicas. Cepas que não produzem determinada toxina também não possuem o gene correspondente. As primeiras observações relacionadas com este fenômeno envolveram as enterotoxinas A (SEA) e D (SED) as quais são codificadas por pró-fago e plasmídio, respectivamente (Betley & Mekalanos, 1985, Bayles & Iandolo, 1989). Mais recentemente foram identificados uma série de elementos cromossômicos pequenos (15-20 kb) que codificam SAgs e estão localizados em

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posições específicas do genoma e sua mobilidade elevada se deve a determinados fagos estafilocóccicos. Estes elementos são denominados ilhas de patogenicidade estafilocóccica (Novick, 2003). Os genes que codificam a toxina do choque tóxico e as enterotoxinas B, C, K e L são todos carreados por este tipo de elemento genético móvel. Várias destas ilhas de patogenicidade já foram seqüenciadas e seus mapas genéticos já se encontram disponibilizados na literatura. Detalhes da freqüência de transferência destes elementos, bem como dos mecanismos pelos quais estes elementos são capturados do genoma bacteriano, induzidos a se replicar e encapsulados por certos fagos são descritos em revisão relativamente recente (Novick, 2003).

Diferentes metodologias são utilizadas para caracterizar a presença destas moléculas em amostras de alimentos ou material oriundo de pacientes infectados. Um grande número de métodos sorológicos foi proposto para a detecção de enterotoxinas em alimentos e em meios de cultura, desde o reconhecimento de que estas moléculas eram dotadas de imunogenicidade (Bergdoll, 1990). Os métodos de imunodifusão em ágar foram os primeiros a serem desenvolvidos, aplicando-se a difusão simples unidimensional, difusão dupla, técnica de microlâmina e difusão em tubo capilar (Bergdoll, 1990). Entretanto, percentuais significativos de linhagens toxigênicas produzem concentrações de 1 ng/ml ou menos, estando portanto, abaixo dos níveis detectáveis pelos métodos de difusão em ágar (Kokan & Bergdoll, 1987). Para resolver este problema foram desenvolvidos métodos de hemaglutinação reversa passiva (RPHA), aglutinação de látex (RPLA), radioimunoensaio (RIA) e ensaio imunoenzimático (ELISA) que apresentaram sensibilidade bem maior, variando de 1-0,1 ng/ml (Bergdoll, 1990, Park & Szabo, 1986). As metodologias sorológicas mais empregadas são a RPLA e o ELISA.

Com o desenvolvimento da biologia molecular, algumas técnicas têm sido propostas para a detecção do gene responsável pela produção das toxinas. Atualmente, a PCR (Polymerase Chain Reaction), é um dos métodos mais utilizados, pois permite a identificação de genes responsáveis pela produção de enterotoxinas com alta sensibilidade e especificidade.

A técnica de PCR, contudo, permite a detecção de genes contidos nas linhagens independentes de sua expressão, pois mesmo o gene estando presente

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no microrganismo, ele pode não estar ativo. O progresso dos métodos genotípicos oferece ainda a possibilidade de detectar a seqüência de RNA mensageiro responsável pela expressão da enterotoxina alvo, utilizando a técnica de RT-PCR. A presença da seqüência de mRNA que codifica a síntese da toxina não deixa dúvidas quanto ao potencial tóxico do microrganismo (Dinges et al., 2000).

Além destas técnicas que permitem identificar a presença do SAg, do seu gene ou do mRNA correspondente, existem metodologias que permitem a purificação da proteína a partir de culturas de S. aureus. Um dos procedimentos mais simples que pode ser empregado foi descrito por Dinges et al., 2000. Resumidamente, os microrganismos são cultivados em meio adequado até a fase estacionária com aeração elevada; 37°C e pH 7-8. As culturas são então tratadas com etanol a 4°C para precipitação das toxinas. Após solubilização em água livre de LPS, o material é submetido a uma focalização isoelétrica, primeiramente em gradiente de pH 3 a 10 e depois então em um gradiente mais estreito que inclua o ponto isoelétrico (pI) da toxina. A toxina presente no gel é removida por diálise. Esta metodologia permite a obtenção de 1 a 20 mg de SAg por litro, dependendo da toxina.

Para entender o mecanismo e a intensidade da interação entre os SAgs e o sistema imunológico é importante relembrar, primeiro, como os antígenos convencionais são reconhecidos pelos linfócitos Th (T helper). Inicialmente os antígenos protéicos são internalizados e quebrados no interior dos fagolisossomas das células apresentadoras de antígenos (APC) (Unanue & Cerottini, 1989). Estes peptídeos são conduzidos para a superfície da APC através de vesículas. No caminho em direção à superfície celular, estas vesículas encontram outras vesículas contendo moléculas de MHC classe II oriundas do retículo endoplasmático. Após fusão entre os dois tipos de vesículas, os peptídeos se encaixam nas fendas das moléculas de MHC classe II e as vesículas se fundem com a membrana plasmática da célula, expondo desta forma os complexos (MHC classe II & peptídeo) na superfície das APC. Células T específicas, ou seja, contendo receptores específicos para este peptídeo (TCR), vão reconhecer esta associação MHC peptídeo, sofrer expansão clonal e montar, portanto, a resposta imune específica. A grande maioria dos linfócitos T possui TCR constituídos por duas cadeias (α e β), as quais possuem um domínio constante e um domínio variável. A especificidade dos linfócitos T é determinada pelos domínios variáveis. Cada clone de linfócito T é gerado pela

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combinação, durante a geração do repertório no timo, de cinco regiões variáveis do TCR. A habilidade do repertório de células T de reconhecer muitas associações MHC peptídeos deve-se à existência de vários segmentos gênicos Vα e Vβ na linhagem germinativa. Estes segmentos podem sofrer diferentes recombinações genéticas constituindo uma unidade contígua a qual formará os diferentes TCRs. (Hemalatha, 2004).

Pode-se dizer que os SAgs interagem com as células T e as APCs de uma forma distinta daquela utilizada pelos antígenos convencionais. Os SAgs interagem diretamente com a região Vβ do TCR e com a molécula de classe II do MHC independentemente da especificidade do TCR. Desta forma, a apresentação seguida de estimulação das células T não requer processamento prévio e também não é um fenômeno restrito pelo MHC (Labrecque et al., 1993). Essa interação resulta em grande ativação do sistema imunológico: linfócitos T são ativados e entram em processo de proliferação, enquanto que as duas populações celulares começam a produzir elevadas quantidades de citocinas (Llewelyn & Cohen, 2002). A quantidade de linfócitos T envolvidos varia de acordo com a identidade do SAg mas em alguns casos até 30% do repertório de células T pode ser ativado (Foster et al., 2005). Além deste complexo trimolecular (SAg-MHCII-TCRvβ), outros elementos tais como fatores co-estimulatórios e moléculas de adesão participam ativamente neste processo (See & Chow, 1992).

Em função do que se conhece atualmente, se acredita que o resultado inicial da estimulação primária com SAgs é uma resposta polarizada Th1, caracterizada pela produção de grandes quantidades de citocinas tais como IL-2, IFN-γ, TNF-α, TNF-β, IL-12 e IL-18 (Cameron et al., 2001). O principal papel protetor de cada uma destas citocinas na resposta imune bem como os principais efeitos que exercem durante a patogênese associada aos quadros causados por SAgs, estão delineados na tabela 1.

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Citocinas Patogênese Papel na proteção imune

IL-2 Proliferação de células T

(estimulação primária) Inibição da produção de IL-2 (estimulação repetida) Deleção clonal por Apoptose (estimulação repetida)

Citocina mitogênica para células T

IFN-γγγγ Pré-ativação para produção

de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1, IL-6)

Citocina típica de resposta Th1

TNF-αααα Altos níveis séricos

desencadeiam choque ou colapso vascular, coagulação intravascular disseminada e distúrbios metabólicos tais como hipoglicemia.

Principal mediador da resposta inflamatória aguda

IL-12 Papel controverso nas

patologias associadas aos SAgs; prima T para produção de IFN-γ mas também aumenta síntese de IL-10 (citocina anti-inflamatória).

Prima células T para produção de INF-γ.

IL-18 Papel não estabelecido para

patologias associadas aos SAgs.

Induz produção de IFN-γ por células Th1, sozinha ou em sinergia com IL-12.

Tabela 1- Efeitos biológicos principais das citocinas Th1 na imunidade protetora e na patogênese associada aos SAgs.

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1.4 Sepse

Os termos infecção e sepse são geralmente utilizados de forma independente, no entanto, a terminologia acaba simplificando uma relação complexa. O termo infecção está relacionado à presença de agente agressor em uma localização (tecido, cavidade ou fluido corporal) normalmente estéril, e o termo sepse está relacionado à conseqüente manifestação do hospedeiro, i.e., à reação inflamatória desencadeada frente à infecção grave. Por isso, a distinção entre os dois não é fácil, pois todo processo infeccioso desencadeia uma resposta do hospedeiro, e cada indivíduo apresenta um tipo de reação com magnitude diferente frente a determinado insulto (Bone et al., 1991). A palavra sepse tem origem grega e significa "putrefação" (Bone et al., 1991). No entanto, atualmente aplica-se este termo sempre que existe uma resposta sistêmica do doente a diversas agressões, e têm manifestações clínicas, hemodinâmicas, bioquímicas e inflamatórias características. Ela não é resultado apenas de infecções, mas pode ser desencadeada por outros estímulos, os quais têm em comum a capacidade de estimular uma resposta imunológica por parte do hospedeiro. Em resposta, o hospedeiro ativa diversas cascatas biológicas, tais como a inflamatória, o sistema coagulação/fibrinólise. As ativações destas vias biológicas têm um papel primordial na fisiopatologia da sepse e disfunção de órgãos. Para tentar uniformizar a terminologia e definir conceitos, Bone et al., 1991 organizou uma conferência de consensos em 1991 (Tillet e Francis, 1991). Pela primeira vez apareceu o termo "Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS)", e alerta-se para o fato da sepse e choque séptico serem resultado de respostas descontroladas à infecção. Quando esta complexa cascata imunológica funciona de forma harmoniosa e equilibrada, constituem um mecanismo primordial de defesa do homem contra a invasão de microrganismos. As citocinas produzidas pelo hospedeiro são as responsáveis pela modulação, ativação e inibição da cascata imunológica. As citocinas pró-inflamatórias mais estudadas são: TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8. A IL-10 destaca-se pelo seu efeito anti-inflamatório. Desta forma, sempre que uma toxina (ex. endotoxina) invade o hospedeiro essa é reconhecida pelos macrófagos, os quais liberam TNF-α e IL-1. Estes dois mediadores pró-inflamatórios vão ser responsáveis por uma série de fenômenos em cascata que incluem a adesão de neutrófilos ao endotélio, a ativação da coagulação e do complemento, assim como

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a liberação de outros mediadores pró-inflamatórios (IL-1, IL-8, TNF, fator ativador das plaquetas, prostaglandinas, leucotrienos, radicais derivados do oxigênio e proteases) (Gabay et al., 1996). Simultaneamente são também liberados fatores essencialmente antiinflamatórios, como a IL-6 e IL-10, que inibem a atividade macrofágica e linfocitária, diminuem a produção de TNF, e estimulam a resposta de fase aguda e a produção de imunoglobulinas. O termo Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) foi proposto para descrever a reação inflamatória desencadeada pelo organismo frente a qualquer agressão infecciosa ou não-infecciosa. (Brandtzaeg et al., 1996). Infecção é um fenômeno microbiano caracterizado por resposta inflamatória à presença de microrganismos ou à invasão dos tecidos normalmente estéreis. Bacteremia é a presença de bactérias viáveis no sangue. Sugeriu-se eliminar o termo septicemia, pois, existem vários significados diferentes na literatura médica. Sepse é a resposta inflamatória sistêmica do organismo frente ao estímulo infeccioso, e inclui a presença de dois ou mais de alguns critérios clínicos para o diagnóstico (Christman et al., 1991). Sepse grave significa sepse associada à disfunção orgânica, hipotensão ou hipoperfusão. Perfusão anormal inclui acidose lática, oligúria ou alteração aguda do estado mental (Heard et al., 1993). Hipotensão induzida por sepse é a presença de pressão arterial sistólica menor que 90 mmHg ou a redução de 40 mmHg ou mais da pressão arterial sistólica de base, na presença de hipotensão de causa infecciosa (Brun-Buisson et al., 2000). O Choque séptico é caracterizado por sepse com hipotensão arterial persistente, mesmo depois de adequada reposição volêmica, associado com a redução da perfusão, acidose lática, oligúria e alteração do estado mental. Síndrome de disfunção de múltiplos órgãos e sistemas se refere à presença de função orgânica alterada em pacientes gravemente doentes cuja homeostase não pode ser mantida sem intervenção (Zeni et al., 1997). Existem alguns marcadores importantes para identificação de um quadro de sepse dentre eles inclui-se a febre considera por Rangel-Fraust et al., 1995 o mais grave. No entanto, o aparecimento de febre não significa necessariamente uma catástrofe, mas é um sinal de alerta que deve ser investigado. Apesar de a febre ser um dos parâmetros mais freqüentemente medidos, continua a existir discussão sobre qual é temperatura "normal". No trabalho de Wunderlich et al.,1971, era considerada febre, temperatura axilar de 38°C. No estudo mais recente considerava-se febre a temperatura oral de 37,2°C de manhã e 37,8°C à tarde (Mackowiak et al., 1992).

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Apesar destas imprecisões, a definição adaptada de febre é temperatura > 38 (American College of Chest Physician, 1992). Na febre, devido aos pirogênios circulantes (IL-1, IL-6 e TNF), o hipotálamo regula a temperatura para um nível superior, pelo qual o organismo aumenta a produção de calor (Saper et al., 1997). Este fenômeno é distinto da hipertermia, pois nesta perde-se o controle de temperatura corporal (Simon et al., 1993). Apesar de não se saber qual o papel da febre na sepse, também não está demonstrado que seja benéfico para o doente diminuir a temperatura, por meios farmacológicos ou outros. Por outro lado não existe correlação entre o nível de temperatura e a gravidade da infecção (Clarke et al., 1991). Alguns relatos mostram que a febre alta e calafrios podem estar associados a situações menores, como uma cistite, e por outro lado temperaturas pouco elevadas, normais ou mesmo a hipotermia podem estar associadas a infecções gravíssimas, como uma peritonite. Apesar disto à temperatura continua a ser incluída como um parâmetro a monitorar (Rangel-Frausto et al., 1995), sendo pouco sensível no diagnóstico da sepse. O seu desaparecimento com a instituição de terapêutica adequada é um dos critérios de "cura" se usarmos o SIRS para definir sepse (Yentis et al. 1999). Tal como a febre à contagem dos leucócitos também é um critério de SIRS (Pittet et al., 1999) e também é um dos parâmetros mais requisitados para a monitoração da sepse. Do aspecto hematológico, a leucocitose significa um aumento do número de leucócitos circulantes acima de 10 a 11 x 109/L, e neutrofilia significa cerca de 75 a 80% do total. A leucocitose com neutrofilia aparece com freqüência associada a infecções bacterianas. A neutrofilia e o aparecimento de formas jovens ("band cells") são conseqüências da ação do fator de crescimento granulocitário liberado em resposta a endotoxina e outros mediadores bacterianos. (Povoa et al., 1998).

O racional do presente trabalho partiu das seguintes considerações: o S. aureus é frequentemente associado com quadros de sepse; a patofisiologia da sepse, inclui entre outros fenômenos, a contribuição de citocinas; e alguns isolados de S.aureus produtores de toxinas superantigênicas que, entre outras características são potentes produtoras de TSST-1. Dentro deste contexto, pressupomos que o quadro de sepse experimental causado por S.aureus produtor de TSST-1 seria mais grave do que o quadro associado com a cepa não produtora da toxina.

(25)

2.

2. 2. Objetivos

Objetivos

2.1 Objetivo Geral

O objetivo geral deste projeto é avaliar a relevância da TSST-1 para as alterações histopatológicas e imunológicas observadas na sepse experimental.

2.2 Objetivos específicos

Isolar e identificar cepas de S. aureus produtoras e não produtoras de TSST-1 a partir de isolados clínicos

Comparar a gravidade da infecção causada por S. aureus TSST-1 + e TSST-1- em camundongos BALB/c

Comparar o efeito in vivo de sobrenadantes de S. aureus TSST-1+ e TSST-1 -.

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3.Material e Métodos

3.1. Animais

Foram utilizados camundongos BALB/c machos adultos com 4 - 6 semanas de idade provenientes do Biotério do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências da UNESP - Botucatu. As condições de manutenção e manipulação dos animais foram aprovadas pela Comissão de Ética em Experimentação Animal. Protocolo n°50/06 –CEEA. (em Anexo)

3.2. Isolamento de cepas de S.aureus

Os isolados obtidos a partir de amostras clínicas foram semeados em ágar sangue e corados pelo método de Gram com intuito de determinar sua pureza e avaliar sua morfologia e coloração especifica. Após a confirmação dessas características, as linhagens foram submetidas às provas de catalase e coagulase. O gênero Staphylococcus foi diferenciado do Micrococcus, com base na prova de oxidação e fermentação da glicose e pela resistência a bacitracina (0,04U) indicada pela ausência de halo de inibição ou formação de halo de até 9 mm e pela sensibilidade à furazolidona (100µg) caracterizada por halos de inibição de 15 a 35 mm de diâmetro (Baker, 1984).

3.3 Obtenção de sobrenadantes de culturas de S.aureus

Para a obtenção de sobrenadante de S.aureus enriquecido em Toxina 1 da Síndrome do Choque Tóxico (TSST-1) foi utilizada a técnica de produção de toxinas pelo método de saco de diálise de Donnelly et al. (1967). Com este objetivo, sacos de diálise (Difco) de 30 a 40 cm foram previamente lavados em água destilada,

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amarrados em uma das extremidades e a seguir preenchidos com 50 ml de caldo BHI em concentração dupla e amarrados na outra extremidade. Os sacos assim preparados foram colocados em erlenmeyers de 250 ml para adotarem a forma de U no fundo do frasco. Em seguida, os sacos foram autoclavados durante 15 min a 121°C e posteriormente, volumes de 18,0 ml de tampão fosfato 0,02 M, pH 7,2 em 0,9% de NaCl foram inoculados com uma alçada das amostras de estafilococos previamente cultivadas em 5,0 ml de caldo BHI a 37oC por 18 h. Estas misturas foram então transferidas para os erlenmeyers contendo os sacos os quais foram incubados a 37°C por 24 h com agitação de 130 rpm. Após o período de incubação, as culturas foram centrifugadas a 8.000 x g / 4°C, por 10 min. Os sobrenadantes de cultura foram inativados por 15 minutos à 100ºC. Antes da inoculação dos animais, os sobrenadantes foram avaliados quanto à presença da TSST-1 pelo teste de aglutinação por látex. Os sobrenadantes obtidos foram conservados a -20°C até seu uso.

3.4 Detecção de TSST-1 pelo Método de Aglutinação de Látex (RPLA)

A detecção desse produto extracelular foi realizada pelo método da aglutinação reversa passiva de látex (RPLA), segundo Shingaki et al. (1981).

Para a realização dos testes utilizou-se o kit RPLA-TD940 (Oxoid Diagnostic Reagents) para a detecção da toxina do choque tóxico (TSST-1). Para essa finalidade, nos poços de microplaca com fundo em V, foram colocados 25µl dos sobrenadantes obtidos conforme item acima, filtrado previamente em membrana Millipore 8-µm para evitar a ocorrência de reações inespecíficas. A seguir, foram adicionados 25µl do látex sensibilizado com anticorpo anti-TSST-1. A TSST-1 padrão foi utilizada como controle positivo e as reações inespecíficas foram analisadas adicionando-se 25 µl do sobrenandante em 25 µl do látex controle. As placas assim preparadas foram cobertas com celofane e os reagentes homogeneizados em micromixer por 3 min. Após incubação durante 20 a 24 h em temperatura ambiente, os resultados foram registrados com o auxílio de uma lupa e iluminação. A formação de um botão róseo foi interpretado como resultado negativo.

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3.5 Detecção do gene que codifica a TSST-1

3.5.1 Extração de DNA

O DNA foi extraído a partir de linhagens de Staphylococcus cultivadas em ágar sangue e inoculadas individualmente em caldo Infusão de Cérebro e Coração e incubadas a 37oC por 24 h.

Para a extração foi utilizado o Kit GFX (Amersham Pharmacia Biotech) que consiste na digestão inicial das células de estafilococos com lisozima (10 mg/ml) e proteinase K (20 mg/ml). A seguir 500 µl da solução de extração foi adicionada à mistura e esta centrifugada a 10.000 x g por 4 min. Em seguida o sobrenadante foi transferido para a coluna GFX e centrifugado a 5.000 x g por 1 min. O líquido coletado foi descartado e 500 µl de solução de extração adicionando-se novamente à coluna. Após a centrifugação e descarte do líquido coletado, 500 µl da solução de lavagem, adicionou-se à coluna e esta submetida à centrifugação a 20.000 x g por 3 min. A seguir, a coluna foi transferida para um tubo de 1,5 ml e 200 µl de água Milli Q aquecida a 70 o C e utilizada para a eluição.

3.5.2 Amplificação do DNA por PCR

As reações de PCR foram realizadas em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml em volumes totais de 50 µl contendo 20 pmol de cada primer (tabela 1), 2,5 U de Taq DNA polimerase, 200 µM de desoxiribonucleotídeos trifosfatados, 20 mM de Tris-HCl (pH 8,4), 0,75 mM de MgCl2 e 5 µl da amostra. Em todas as reações realizadas foi utilizado um controle negativo, através da substituição do ácido nucléico por água. A incubação foi realizada em Termociclador PTC-100 MJ Research empregando os parâmetros descritos por Johnson et al. (1991) com algumas modificações propostas por Cunha et al. (2006) que consistiram de: um primeiro ciclo a 94 oC por quatro minutos, desnaturação a 94 oC por 2 min, anelamento dos primers a 55 oC e extensão a 72 oC por um minuto e 30 segundos, seguido por um segundo ciclo de desnaturação a 94 oC por 2 min, anelamento dos primers a 53 oCe extensão a 72ºC por um minuto e 30 segundos. No terceiro ciclo a

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temperatura de anelamento foi reduzida para 51oC seguido por mais 37 ciclos de desnaturação a 94 oC por 2 min, anelamento dos primers a 51 oC e extensão a 72 oC por um minuto e 30 segundos. Após completar os 40 ciclos, os tubos foram incubados a 72oC por sete minutos antes de resfriar à 4oC.

Função Nome Seqüência de nucleotídeos 5’a 3’ Alvo

Primer TSST1 ATG GCA GCA TCA GCT TGA TA TSST-1

Primer TSST2 TTT CCA ATA ACC ACC CGT TT TSST-1

Tabela 2: Oligonucleotídeos para a detecção do gene tst. Fonte: JOHNSON et al., 1991.

3.5.3 Visualização dos produtos amplificados

A eficiência das amplificações foi monitorada por eletroforese da reação em gel de agarose 2% preparado em tampão 1,0 X TBE e corado com Brometo de Etídeo. O tamanho dos produtos amplificados foi comparado com o padrão de 50 e 100 kbp e posteriormente fotografados sob transiluminação UV.

3.6 Determinação de dose causadora de sepse

Através do experimento piloto, estabelecemos que doses próximas a 2.10 7 UFC eram capazes de desencadear quadros sépticos caracterizados por hipotermia presença da bactéria no sangue e disseminação para vários órgãos. Estes

resultados são similares aos descritos por Tarkowski et al, 2001.

O desenvolvimento de sepse nos animais inoculados com diferentes concentrações de S. aureus foi determinado seguindo estes critérios: Neutrofilia, hipo ou hipertemia (< 35,6 C ou, > que 38,4 C, respectivamente).

A temperatura retal foi avaliada através de um termômetro específico para uso em roedores de pequeno porte

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3.7 Leucograma

Camundongos normais, infectados ou inoculados com sobrenadantes ou toxina purificada, foram sangrados pelo plexo retro-orbital após diferentes períodos. O sangue foi colocado em eppendorf contendo EDTA para contagem total de leucócitos em câmara de Neubauer. Amostra de sangue coletada sem heparina foi colocada sobre lâmina (esfregaço sanguíneo) para contagem diferencial de leucócitos. Contagem total de leucócitos: 10 µl das amostras de sangue com heparina foram diluídos em líquido de Turk (1:20) e, aproximadamente 5µl desta diluição foram colocados em câmara de Neubauer e as células contadas em microscópio ótico (aumento 20x). Os resultados foram expressos por mm3 de sangue.

A Contagem diferencial de leucócito foi realizada a partir de uma gota de sangue colocada sobre uma lâmina de microscopia. Após secagem a temperatura ambiente, foi adicionada Eosina/Azul de metileno (segundo Leishman) por 10 minutos e logo após água destilada (pH 7,0) por mais 10 minutos. As lâminas secaram a temperatura ambiente e a contagem foi realizada em microscópio ótico (aumento 50x). Foram contadas 100 células e determinou-se a proporção de linfócitos, monócitos e PMN.

3.8 IFN-γγγγ sérico

Os níveis de IFN-γ foram avaliados através de ensaio imunoenzimático (ELISA), com anticorpos monoclonais específicos para IFN-γ murino. As seguintes etapas foram realizadas:

1) Revestimento da placa com anti-IFN-γ (AN18) em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 (100µl/well) na concentração 0,5µg/ml, seguido de incubação overnight a 4°C.

2) Lavagem 4 vezes com PBS/ tween 20 (0,5%) com um volume de 200µL/well. 3) Bloqueio dos sítios livres por adição de 200 uL/well de PBS tween/leite desnatado em pó 5%. Incubação a 37°C por 1 hora ou a 4°C overnight.

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4) Lavagem 4 vezes com PBS/tween 20 (0,5%) com volume de 200µL/well.

5) Adição das amostras: adição de 100µL de meio completo no poço blank ou curva de IFN-γ recombinante murino diluído em meio completo. Incubação por 1 hora a 37°C.

6) Lavagem 4 vezes com PBS/tween 20 (0,5%) com um volume de 200µL/well. 7) Adição de100µL/well do anticorpo anti IFN-γ murino conjugado com biotina. Incubação por 1 hora a 37°C.

8) Lavagem 4 vezes com PBS/tween 20 (0,5%) com um volume de 200µL/well. 9) Adição de 100µL do conjugado avidina peroxidase diluído em PBS tween/albumina 1% (1:10. 000). Incubação por 1 hora a 37°C.

10) Lavagem 4 vezes com PBS tween 20 (0,5%) com volume de 200µL/well e a adição de 100µL/well do substrato H202 +OPD)

12) Adição de 50µL de H2SO4 4N para finalizar a reação e realiza-se a leitura em absorbâncias de 492nm.

3.9 Unidades Formadoras de Colônias (UFC)

O grau de crescimento bacteriano no sangue, pulmão, fígado, baço e rim foram determinados pelo número de UFC presentes nestes tecidos 24 horas após a infecção. Foram coletados 0,5 ml de sangue e diretamente espalhado na superfície da placa de petri estéril com auxílio de alça de Drigalski. A contagem do número de unidades formadoras de colônias foi feita 24-48 horas após incubação a 37º C.

Regiões pré-definidas de cada órgão (pulmão, fígado, baço e rim), como foram utilizadas para determinação do número de UFC/g. Os referidos fragmentos de tecidos foram pesados e homegeneizados com 1 ml de salina estéril e plaqueados em ágar sangue. Foi feito um plaqueamento piloto para determinação do volume do homogeneizado adequado para o plaqueamento e determinação de UFC/g de tecido. A contagem do número de UFC/g foi feita 24-48 horas após incubação a 37º C. Estas análises foram pré-definidas como mostra o esquema subseqüente.

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3.10 Análise histopatológica de pulmão e baço

Regiões pré-definidas de cada órgão (pulmão e baço), como esquematizado abaixo, foram coletadas dos animais dos grupos infectados (24 horas após) ou injetado com sobrenadantes (6 horas após). Os tecidos foram fixados por 24 horas em tampão de Millonig (10% formaldeído – Sigma ST. Louis, MO, USA; 1,86% de fosfato de potássio monobásico e 0,42% de hidróxido de sódio – Merck, Montreal, Canadá, pH = 7,4). As amostras fixadas foram desidratadas em séries de etanol e inclusas em resina de metacrilato glicol (kit Leica de histosina). Cortes histológicos com 3µm de espessura foram corados com hematoxilina – eosina (HE) e analisados comparativamente quanto à destruição tecidual, necrose, proliferação celular, apoptose e presença de infiltrado inflamatório.

3.11 Análise estatística

Os dados obtidos foram analisados empregando-se o programa Graph Pad Software (San Diego, CA, USA, 1993). Os resultados foram avaliados por análise de variância (ANOVA), não paramétrica, por meio de comparações múltiplas pelo método de Kruskal-Wallis, seguida pelo teste de Dunn. Valores com p<0,05 foram considerados significativos.

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4. Protocolos e resultados

4.1 Protocolo Experimental I

Objetivos: Selecionar e caracterizar as duas cepas de S. aureus: A cepa produtora e a não produtora de toxina da síndrome do choque tóxico (TSST-1).

Cepas selecionadas: TSST-1 + (S-70) TSST-1 - (S-193)

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c d

Figura 1- Determinação das características das cepas utilizadas. a) presença do gene tst por PCR, b) produção da toxina TSST-1 por ARPL, c ) avaliação da hemólise d) detecção da hemolisina delta.

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4.1.1 Resultados Protocolo I

A seleção das duas cepas foi iniciada pela determinação da presença do gene tst que codifica a TSST-1. Como mostrado na Figura 1a, 5 cepas, entre as 10 testadas, possuíam o gene tst o que foi constatado pela presença de uma banda no gel correspondente a 350bp que é o tamanho do fragmento amplificado pelo primers específicos. As cepas portadoras do gene tst foram cultivadas em meio ágar sangue e ágar BHI e o sobrenadante destas foram testadas quanto à presença da toxina. As diferentes cepas foram então avaliadas quanto ao desencadeamento de hemólise, por observação do halo hemolítico em ágar sangue e quanto à presença da hemolisina delta.

A produção da toxina delta é determinada pela técnica da hemólise sinergística, descrita por Herbert e Hancock, 1985. Uma cepa beta hemolítica S.aureus é semeada verticalmente e plaqueada em ágar sangue e, as amostras a serem testadas são colocadas perpendicularmente. As placas são incubadas em temperatura de 37°C por aproximadamente 20 horas em condições aeróbicas ideais, e em seguida incubadas em temperatura ambiente a 4 a 6 horas adicionais antes da análise. A formação de hemólise nas extremidades próxima ao S.aureus beta hemolíticos indica que as amostras de S.aureus analisadas são produtoras de toxina delta. As duas cepas escolhidas para a realização deste trabalho não produziam esta toxina.

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4.2 Protocolo Experimental II

Objetivo: Validar o modelo escolhido por determinação de alterações hematológicas, bacteremia, carga bacteriana em diferentes órgãos e determinação de IFN-γ sérico.

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4.2.1 Resultados Protocolo II

Camundongos BALB/c infectados com S. aureus [107] produtor de TSST-1 (S. aureus TSST-1+) desenvolveram, após vinte e quatro horas quadro típico de sepse experimental. A análise de parâmetros hematológicos demonstrou queda significativa no número de leucócitos totais, polimorfonucleares e linfócitos (Fig. 2 a, b e c). A presença de bactérias no sangue e a disseminação da mesma para diferentes tecidos foram confirmadas pela presença de número elevado de UFC (unidades formadoras de colônias) em homogenatos de baço e pulmão. (Fig. 2 d). Através de técnicas de ELISA foi detectado nível significativamente mais elevado de IFN-γ no sangue dos animais infectados em comparação com o grupo controle (Fig. 2 e).

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a 0 2 4 6 8 10 Controle TSST-1+ L e u c ó c it o s ( 1 0 6 c e ls /m L ) b c d e

Figura 2- Alterações hematológicas (Fig.a, b, c), disseminação para diferentes órgãos (Fig.d) e níveis de INF-γ sérico (Fig. e) em camundongos BALB/c infectados com S.aureus TSST-1+, TSST-1- e toxina purificada. Os dados representam a média e desvio padrão de grupos com 6 animais.

0 1 2 3 4 5 Controle TSST-1+ P M N ( 1 0 6 c e ls /m L ) 0 1 2 3 4 5 Controle TSST-1+ L in fó c ito s ( 1 0 6 c e ls /m l) 0 2 4 6 8 10

Baço Figado Pulmão Rim Sangue

U F C (l o g 1 0 ) 0 50 100 150 Controle TSST-1+ IN F -g a m a ( p g /m L )

*

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4.3 Protocolo Experimental III

Objetivo: Comparar a gravidade da sepse causada por S. aureus TSST-1+ e S. aureus TSST-1 -, vinte e quatro horas após infecção.

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4.3.1 Resultados Protocolo III

De forma geral os animais infectados com S.aureus, independentemente de a cepa ser ou não produtora de TSST-1 apresentaram um decréscimo no número total de leucócitos, PMN e linfócitos, mas não significativa quando comparado ao controle. Estas alterações podem ser observados nos gráficos 1a, 1b, 1c.

A inoculação de toxina purificada determinou aumento significativo de leucócitos totais e linfócitos quando comparado com a TSST-1-. Na cepa de S. aureus determinaram bacteremia e disseminação de forma similar para os órgãos analisados: baço, fígado, pulmão e rim. Estes dados são mostrados no gráfico 3d. Os níveis séricos de INF-γ presente nos animais infectados com toxina purifica foram significativos quando comparados com o grupo controle e a cepa S.aureus na TSST-1-.(Fig.3e).

Na análise histopatólogica do baço o grupo infectado com S.aureus TSST-1+ apresentou regiões com proliferação celular (regiões demarcadas com setas como mostram a (fig. B1 e B2) em aumento de 100x e 400x. O grupo infectado com S.aureus TSST-1- também apresentou regiões com discreta proliferação celular e apoptose. (Fig. C1 e C2 demarcadas com setas 1 e 2 respectivamente) quando comparado ao controle (Fig. A1 e A2).

Na histopalogia do pulmão do grupo infectado com S.aureus TSST-1+ observou-se proliferação celular, (Fig.B1 e B2) nos dois aumentos, tanto de 100x como de 400x observa-se focos de hemorragia e infiltrado de células, caracterizando inflamação. Entretanto, o grupo infectado com S.aureus TSST-1- apresentou-se aparentemente nos aumentos de 100x e 400x histologia pulmonar preservada. (Fig.C1 e C2)

(41)

0 1 2 3 4 5

Controle TSST-1+ TSST-1- Toxina purif.

L in fó c it o s ( 1 0 6 c e ls /m L ) a c b c d e

Figura 3 – Alterações hematológicas (Fig.a, b, c), disseminação para diferentes órgãos (Fig.d) e níveis de INF-γ sérico (Fig. e) em camundongos BALB/c infectados com S.aureus TSST-1+, TSST-1- e toxina purificada. Os dados representam a média e desvio padrão de grupos com 6 animais.

0 50 100 150 200 250

IN F - g a m a ( p g /m L ) 0 2 4 6 8 10

L e u c ó c it o s ( 1 0 6 c e ls /m L ) 0 2 4 6 8 10

Baço Figado Pulmão Rim Sangue

U F C lo g 1 0 TSST-1+ TSST-1-0 50 100 150 200 250

IN F - g a m a ( p g /m L ) p < 0,05 p < 0,05 p < 0,05 p < 0,05

(42)

Figura 4 - Análise histopatólogica do baço. Na figura estão esquematizadas (A1 e A2) grupo controle, (B1 e B2) grupo infectado com S.aureus TSST-1+, (C1 e C2) grupo S.aureus TSST-1-, 24 horas após infecção em aumento de 100x e 400x respectivamente. Fotomicrografias com coloração Hematoxilina-Eosina (HE), 1 1 2 2

B1

B2

C1

C2

A1

A2

(43)

Figura 5 - Análise histopatólogica do pulmão. Nas figuras são mostradas (A1 e A2) grupo controle, (B1 e B2) grupo infectado com S.aureus TSST-1+, (C1 E C2) grupo S.aureus TSST-1-, 24 horas após infecção em aumento de 100x e 400x respectivamente.

Fotomicrografias de cortes corados com Hematoxilina-Eosina (HE).

B2

B1

(44)

4.4 Protocolo Experimental IV

Objetivo: Comparar a gravidade da infecção causada por S.aureus TSST-1+ e S.aureus TSST-1- em períodos mais precoces da infecção (3 e 6 horas).

(45)

4.4.1 Resultados Protocolo IV

De forma geral, ocorreu decréscimo no número total de leucócitos, PMN e linfócitos nos animais infectados, independentemente da cepa ser ou não produtora de TSST-1. Esta queda foi similar nos dois períodos de avaliação (3 e 6 horas) após a infecção. Por outro lado em comparação com a toxina purificada ocorreu diminuição significativa em 6 horas quando comparado ao grupo controle.

Foram detectadas diferenças importantes entre os níveis de IFN-γ, tanto entre as cepas TSST-1+ e TSST-1-, quanto entre os dois períodos nos quais foram feitas as avaliações (3 e 6 horas). Níveis elevados de IFN-γ foram detectados nos animais inoculados com S.aureus TSST-1+, mas não nos animais injetados com S.aureus TSST-1-. Além disto, os níveis de IFN-γ foram mais elevados no período de 6 horas comparativamente com o período de 3 horas. Como esperado níveis de toxina foram detectados 3 e 6 horas após inoculação de toxina purificada. Os resultados referentes aos níveis de IFN-γ são mostrados na Fig.6d.

A análise histopatológica do baço está documentada na Figura 7. Nos animais infectados com S.aureus TSST-1+ podem ser observados, após 6 horas regiões com focos de hemorragia (Fig. B1), e ainda áreas com necrose na Fig. B2. Estas alterações são mais facilmente visualizadas nas regiões apontadas com as setas. Nos animais infectados com S.aureus TSST-1- podem ser observados áreas de congestão e discreta proliferação celular identificadas pelas setas 1 e 2 (Fig. C1 e C2). O baço do grupo com a toxina purificada apresentou regiões com intensa proliferação celular as quais podem ser identificadas pelas setas nas figuras D1 e D2. Na fig. D2 pode se observar concomitante proliferação celular e áreas de necrose.

Na histologia do pulmão o grupo infectado com S.aureus TSST-1+ apresenta campos hemorrágicos (aumento de 100x), já aumento de 400x podem ser observados áreas com proliferação celular e lesão na parede alveolar, como mostrado na Fig. B2 setas 1 e 2. O grupo infectado com S.aureus TSST-1 -apresenta o tecido pulmonar normal, tanto no aumento de 100x quanto no de 400x (Fig.C1 e C2).