Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
Tatiane de Pinho Pastor
Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados
para a Síndrome de Lynch
Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira
Rio de Janeiro Setembro 2014
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Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
Tatiane de Pinho Pastor
Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados
para a Síndrome de Lynch
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Oncologia do Instituto Nacional de Câncer José de Alencar Gomes da Silva como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Oncologia
Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira
Rio de Janeiro Setembro 2014
iii P293v Pastor, Tatiane de Pinho.
Variantes de seqüência no gene MSH2 em pacientes selecionados para a Síndrome de Lynch. / Tatiane de Pinho Pastor. – Rio de Janeiro, 2014.
xviii, 94 f.: il. color.
Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, 2014.
Orientador: Miguel Ângelo Martins Moreira.
1. Neoplasias Colorretais Hereditárias sem Polipose. 2. Gene MSH2. 3. Síndrome de Lynch. I. Moreira, Miguel Ângelo Martins. II. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. III. Título.
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Pós-Graduação em Oncologia
Tatiane de Pinho Pastor
Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados
para a Síndrome de Lynch
Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira Aprovada em:
EXAMINADORES:
Dr. Marcelo Alex de Carvalho – Presidente Drª. Tatiana de Almeida Simão
Drª. Cláudia Vitória de Moura Gallo Drª. Cynthia Chester Cardoso – Suplente I Dr. Fernando Regla Vargas – Suplente II
Rio de Janeiro Setembro 2014
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Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a
Síndrome de Lynch
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Tatiane de Pinho Pastor
A Síndrome de Lynch (SL) ou Câncer Colorretal Hereditário Não-Poliposo (HNPCC) é uma doença autossômica dominante associada a mutações na linhagem germinativa nos genes do Sistema
Mismatch Repair (MMR) de reparo do DNA e é responsável por aproximadamente 5% de todos os
casos de câncer colorretal (CCR). A maioria das mutações ocorre nos genes MSH2 (50%) e MLH1 (40%), e gera uma proteína truncada e não funcional. Mais de 513 alterações diferentes nos genes de reparo foram relatadas, sendo que 10% das encontradas no gene MSH2 envolvem a substituição de um aminoácido. O sistema de reparo MMR corrige erros de pareamento base\base, além de inserções e deleções que ocorrem durante a síntese do DNA, melhorando a fidelidade do mecanismo de replicação, além de estar envolvido nos processos de recombinação, na geração da diversidade imune e na resposta celular a danos específicos ao DNA. A inativação mutacional dos genes MMR leva a um reparo insuficiente do DNA e ao desenvolvimento de tumores caracterizados pelos altos níveis MSI. Os pacientes com SL frequentemente desenvolvem câncer colorretal em uma idade precoce, além de possuírem um risco aumentado de desenvolver tumores extracolônicos. O principal objetivo desse estudo foi identificar variantes de sequência no gene MSH2 em pacientes selecionados para Síndrome de Lynch de acordo com os critérios de Amsterdam ou Bethesda modificados, avaliando a sensibilidade e especificidade dos mesmos para a presença de mutação. E para isso, foram selecionados candidatos provenientes de quatro centros clínicos e desses pacientes foram obtidos o sangue periférico para isolamento do DNA genômico. Os éxons do gene MSH2 foram amplificados e sequenciados através dos sequenciamentos automático de Sanger e sequenciamento de nova geração (NGS), além do sequenciamento da região promotora, para a identificação de mutações na linhagem germinativa. A partir da análise de variações de ponto no gene MSH2, identificamos um total de 6 variantes patogênicas ou potencialmente patogênicas (c. 388_389delCA; c.1046C>G; c.1738_1741delGAAA; c.2021G>A; c.2078G>A; c.2152C>T, sendo essa última em quatro pacientes), representando 46.1% das variantes identificadas neste estudo em 9 pacientes, sendo que 6 preenchiam os critérios de Amsterdam e 3 preenchiam os critérios de Bethesda, mostrando que os critérios de diagnóstico clínico são mais sensíveis e específicos para identificar a presença mutações patogênicas no gene MSH2. Além disso, identificamos também 3 variantes novas, sendo que duas delas (c.1738_1741delGAAA; c.2078G>A) foram classificadas como sendo patogênicas e uma não pode ser classificada (c.-185 C>A). Obtivemos uma frequência total de variantes missense de 55.5%, seguido de 22.2% de mutações frameshift, 11.1% de mutações
nonsense e 11.1% de alterações sinônimas, além de alterações na região promotora e de íntron,
mostrando que o espectro de variantes do gene MSH2 é bastante heterogêneo, englobando diferentes tipos de alterações.
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Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a
Síndrome de Lynch
ABSTRACT
Dissertação de Mestrado
Tatiane de Pinho Pastor
Lynch syndrome (SL) or Colorectal Cancer Hereditary nonpolyposis (HNPCC) is an autosomal dominant disease associated with germline mutations in the MMR genes of the DNA repair system and it is responsible for approximately 5% of all cases of colorectal cancer (CCR). Most of the mutations occur in the MSH2 (50%) and MLH1 genes (40%), and generates a truncated, nonfunctional protein. More than 513 different changes in repair genes have been reported, and 10% of those mutations can be found in the MSH2 gene causing substitution of one amino acid. The repair system MMR corrects mismatched nucleotides, insertions and deletions that occur during DNA synthesis, improving the fidelity of replication mechanism and it is also involved in the process of recombination in the generation of immune diversity and specific cellular response to DNA damage. Mutational inactivation of MMR genes leads to insufficient DNA repair and the development of tumors characterized by high levels of MSI. SL patients often develop colorectal cancer at an early age, and they also have an increased risk of developing extra colonic tumors. The main objective of this study was to identify sequence variants in the MSH2 gene in selected patients for Lynch syndrome according to the criteria of Amsterdam or modified Bethesda, assessing the sensitivity and specificity for the presence of the mutation. And for that, candidates from four clinical centers were selected, and genomic DNA were obtained from peripheral blood. TheMSH2
exons and promoter region were amplified by PCR and sequenced by automatic DNA Sanger-sequencing and by Next Generation Sequencing. From the analysis of variations in the extent of
MSH2 gene, we identified a total of 6 variants pathogenic or potentially pathogenic (c.
388_389delCA; c.1046C> G; c.1738_1741delGAAA; c.2021G> A, c.2078G> A; c .2152C> T, the latter being in four patients), representing 46.1% of the variants identified in this study in 9 patients, 6 fulfilled the Amsterdam criteria and three met the criteria of Bethesda, showing that the criteria for clinical diagnosis are more sensitive and specific for the presence of pathogenic mutations in the MSH2 gene. In addition, we identified three new variants, two of which (c.1738_1741delGAAA; c.2078G> A) were classified as pathogenic and one could not be classified (C-185 C> A). In the present study, we obtained an overall frequency of 55.5% missense variants, followed by 22.2% frameshift mutations, 11.1% nonsense mutations of and 11.1% of silent changes, and alterations in the promoter region and intron, showing that the spectrum of variants of the MSH2 gene is very heterogeneous, encompassing different types of changes.
vii
Este trabalho foi realizado na Divisão de Genética da Coordenação de Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer José de Alencar Gomes da Silva, sob Orientação do Dr. Miguel Ângelo, e contou com apoio Financeiro da FAPERJ, CNPq e INCT-Câncer.
viii AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todas as pessoas que de alguma forma foram importantes para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu orientador Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira pelos ensinamentos e direcionamentos que conduzem a minha formação profissional e que acrescentaram muito no desenvolvimento deste projeto.
A toda minha família, em especial meus pais, minhas irmãs e meus sobrinhos, pelo estímulo constante nessa jornada, sempre me incentivando a continuar os meus estudos. Agradeço também por toda a orientação que me deram durante a vida, e por me ajudarem a enfrentar os obstáculos e transformações que a vida impõe.
Ao Thiago, por sempre estar ao meu lado nos momentos alegres e por me incentivar nos momentos difíceis.
A todos os centros participantes deste projeto, em especial a Dra. Patrícia Prolla, por estar sempre disposta a ajudar e a colaborar com qualquer coisa.
Gostaria de agradecer aos companheiros do laboratório, pela grande ajuda no dia-a-dia e, principalmente, pelos nossos momentos de descontração. Um agradecimento especial à Shay, Ayslan, Carol, Karla e Albert por todo auxílio durante os experimentos.
As minhas amigas da faculdade, Kélvia e Bia, um muitíssimo obrigada. Mesmo nos encontrando tão pouco, saibam que sempre serão minhas amigas e que podem contar comigo quando quiser!
Aos pacientes participantes, sem os quais este trabalho não teria sido realizado, e aos seus familiares, por entenderem a importância das investigações genéticas.
ix LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Adenina
ADP Difosfato de Adenosina AP-1 Proteína Ativadora 1 ATP Trifosfato de Adenosina
APC Gene da Polipose Adenomatosa Familiar APAF Polipose Adenomatosa Familiar Atenuada ATR Gene da Ataxia Telangiectasia
BRAF V-Raf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B
BER Reparo por excisão de bases
C Citosina
º C Grau Celsius
CIN Instabilidade Cromossômica CIMP Fenótipo metilador de ilhas CpG
CpG Regiões do DNA onde os nucleotídeos citosina e guanina ocorrem um ao lado do outro
CCR Câncer Colorretal
dNTP Desoxirribonucleotídeo Fosfatado DAB Diaminobenzidina
dsSNP Banco de dados de polimorfismos de nucleotídeos únicos EDTA Ácido Triacético Diamino Etileno
EPCAM Epithelial Cell Adhesion Molecule
EXO1 Gene da exonuclease 1 F Forward ou senso
FAP Polipose Adenomatosa Familiar FCCTX Câncer colorretal familial tipo X
G Guanina
HCPA Hospital das Clínicas de Porto Alegre HNPCC Câncer Colorretal Hereditário Não Poliposo HR Reparo por recombinação homóloga H3BO3 Ácido bórico
IHQ Imunohistoquímica
x
InSiGHT International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumors
IDLs Loops de inserção/deleção
JPS Síndrome da Polipose Juvenil Familiar K-ras Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
LBP-1 Proteína líder tipo B1 MLH Homólogo de MutL MSH Homólogo de MutS
MMR Reparo de Erros de Pareamento MLH1 Human MutL Homolog 1
MSH2 Human MutS Homolog 2
MSH3 Human MutS Homolog 3 MSH6 Human MutS Homolog 6 MSI Instabilidade de microssatélites
MSI-H Instabilidade de microssatélites de alto grau MSI-L Instabilidade de microssatélites de baixo grau MSS Ausência de instabilidade de microssatélitess MAPK Proteínas quinases ativadas por mitógenos MYH MutY human homologue (E.coli)
MgCl2 Cloreto de Magnésio NaOH Hidróxido de sódio
NGS Sequenciamento de nova geração NER Reparo por excisão de nucleotídeos NHEJ Reparo por recombinação não-homóloga
NF-1 Fator de transcrição, também conhecido como proteína de ligação ao elemento TGGCA
NF-E4 Nuclear Factor Erythroid 4
pb Pares de Base
PMS2 Postmeiotic Segregation Increased 2
PMS1 Postmeiotic Segregation increased 1
PJS Síndrome de Peutz-Jeghers PI3K Fosfatidilinositol-3-Cinase
PCNA Antígeno nuclear de células em proliferação P Braço curto de um cromossomo
xi q Braço longo de um cromossomo R reverse ou anti-senso
RER Fenótipo de erro de replicação RFC Human replication factor C
SL Síndrome de Lynch STK11 Serine/threonine kinase 11 SP-1 Stimulating Protein 1 SUS Sistema Único de Saúde
T Timina
TP53 Proteína tumoral 53
TGF-β Transforming growth factor beta
UV Variante não classificada
UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul Uvr DNA Helicase II
xii LISTA DE FIGURAS
1.1. A evolução do câncer ... 2
1.2. Estimativa de incidência do câncer Colorretal para o ano de 2014 ... 3
1.3. Modelo Adenoma – Carcinoma ... 4
1.4. Vias moleculares para o desenvolvimento de CCR com MSI ... 5
1.5. Diagnósticos diferenciais para o CCR ...8
1.6. Abordagens de diagnóstico laboratorial da SL em pacientes com CCR ... 13
1.7. Espectro mutacional dos genes MMR ... 14
1.8. Diferentes funções das proteínas de reparo MMR ... 16
1.9. MMR em eucariotos ... 18
1.10. Localização do gene MSH2 no cromossomo 2 ... 18
1.11. Modelo estrutural do heterodímero MutSα ... 19
1.12. Região promotora do gene MSH2 ... 20
3.1. Fragmento de 571 pb amplificado ... 29
4.1. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 1 A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.23 C>T ... 38
4.2. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 3. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.573C>T... 39
4.3. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 3. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.388_389del CA ... 40
4.4. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 6. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.1046 C>G ... 40
4.5. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR no éxon 6. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.965 G>A ... 41
4.6. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2021 G>A ... 42
4.7. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2152 C>T ... 44
xiii
4.8. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com
a alteração c.2078 G>A ... 44 4.9. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR
do éxon 11. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com
a alteração c.1738_1741del GAAA ... 45 4.10. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da
região promotora de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.-118 T>C em heterozigose.
C) Sequência com a alteração c.-118 T>C em homozigose ... 46 4.11. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da
região promotora de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2.
B) Alteração c.-185 C>A em heterozigose ... 47 4.12. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR
no íntron 1. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração a alteração c.211+9 C>G em heterozigose. C) Sequência
xiv LISTA DE QUADROS
I.I. Critérios de Amsterdam I ...10
I.II. Critérios de Amsterdam II ...11
I.III. Critérios de Bethesda modificados ... 11
LISTA DE TABELAS Tabela 3.1. Reagentes utilizados na reação de PCR e concentração utilizada para cada reação ... 26
Tabela 3.2. Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos éxons 1 a 16 do gene MSH2 ... 27
Tabela 3.3. Oligonucleotídeos utilizados para amplificar a região promotora do gene MSH2 ... 28
Tabela 3.4. Oligonucleotídeos e condições de ciclagem utilizados no sequenciamento de nova geração para amplificar o éxon 5 do gene MSH2, para o paciente 3... 33
Tabela 4.1. Variantes de sequência identificadas nos 53 pacientes selecionados para Síndrome de Lynch ... 37
Tabela 4.2. Classificação da patogenicidade da variante T8M por análises in sílico ... 39
Tabela 4.3. Classificação da patogenicidade da variante P349R por análises in sílico ... 41
Tabela 4.4. Classificação da patogenicidade da variante G322D por análises in sílico ... 42
Tabela 4.5. Classificação da patogenicidade da variante G674D por análises in sílico ... 43
Tabela 4.6. Classificação da patogenicidade da variante C693Y por análises in sílico ... 45
Tabela 4.7. Classificação da variante c.-118 T>C ... 46
Tabela 4.8. Classificação da variante c211+9 C>G ... 48
Tabela 4.9. Média de cobertura base-base dos 16 amplicons para os pacientes 3 e GGC 1108 ... 48
xv
Tabela 4.10. Resumo das alterações encontradas no Paciente 3 através do
Sequenciamento de nova geração ... 49 Tabela 4.11. Resumo das alterações encontradas no Paciente GGC 1108 através do
Sequenciamento de nova geração ... 50 Tabela 5.1. Resumo das variantes identificadas pelo sequenciamento de Sanger
e de nova geração no gene MSH2 e suas classificações de acordo
com o grupo InSiGHT e programas in sílico ... 51 Tabela 5.2. Características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com alteração
xvi SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Câncer Colorretal: Incidência e Desenvolvimento ... 1
1.2 Carcinogênese Colorretal ... 3
1.3 Padrões de CCR ... 6
1.4 Síndrome de Lynch ... 8
1.4.1 Características clínicas ... 9
1.4.2 Critérios de diagnóstico ... 10
1.4.3 Testes genéticos de rastreamento ... 12
1.4.4 Bases genéticas de SL ... 14
1.5 Vias de reparo de DNA ... 15
1.5.1 Sistema MMR ... 15
1.6 MSH2 ... 18
1.7 Estudos brasileiros sobre a SL ... 21
OBJETIVOS ... 22 2.1 Geral ... 22 2.2 Específicos ... 22 METODOLOGIA ... 23 3.1 Pacientes ... 23 3.2 Testes de rastreamento ... 24
3.2.1 Teste de Instabilidade de microssatélites (MSI) ... 24
3.2.2 Teste de Imunohistoquímica (IHQ) ... 24
3.3 Extração de DNA a partir de sangue periférico ... 25
3.4 Estimativas da concentração e da integridade do DNA ... 25
3.5 Amplificação do gene MSH2 ... 25
xvii
3.5.2 Região promotora do gene MSH2 ... 28
3.6 Avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados e do rendimento da reação ... 29
3.7 Purificação dos produtos da PCR ... 30
3.8 Sequenciamento Automático de Sanger ... 30
3.9 Ferramentas eletrônicas ... 31
3.9.1 Análise das variantes missense ... 31
3.9.2 Análise da região promotora ... 32
3.10 Sequenciamento de Nova Geração – por síntese ... 32
3.10.1 Preparação das bibliotecas ... 33
3.10.2 Geração dos clusters ... 34
3.10.3 Sequenciamento por síntese ... 34
3.10.4 Análise dos dados ... 34
RESULTADOS ... 35
4.1 Caracterização dos pacientes incluídos ... 35
4.2 Variantes identificadas através do Sequenciamento Automático de Sanger ... 36
4.2.1 Variantes identificadas nas regiões codificantes do gene MSH2 ... 36
4.2.2 Características das variantes encontradas nas regiões codificantes ... 38
4.2.3 Variantes identificadas na região promotora do gene MSH2 ... 45
4.2.4 Características das variantes encontradas na região promotora ... 46
4.2.5 Variante identificada no íntron 1 do gene MSH2 ... 47
4.3 Resultados do Sequenciamento de Nova Geração ... 48
4.3.1 Média das coberturas dos amplicons ... 48
xviii
DISCUSSÃO ... 51
5.1 Variantes de sequência patogênicas ou possivelmente patogênicas ... 52
5.2 Variantes de sequência não patogênicas ... 54
5.3 Variantes de sequência não patogênicas ou benignas ... 57
CONCLUSÕES ... 61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 63 ANEXOS ... 75 Anexo 1 ... 75 Anexo 2 ... 79 Anexo 3 ... 81 Anexo 4 ... 82 Anexo 5 ... 83 Anexo 6 ... 84 Anexo 7 ... 85 Anexo 8 ... 86 Anexo 9 ... 87 Anexo 10 ... 88 Anexo 11 ... 89 Anexo 12 ... 90 Anexo 13 ... 91
1 INTRODUÇÃO:
1.1 Câncer Colorretal: Incidência e Desenvolvimento
O câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 tipos diferentes de doenças que têm como característica comum o crescimento desordenado de células anormais com potencial invasivo e metastático. Sua origem se dá por condições multifatoriais, envolvendo fatores ambientais e hereditários, que podem agir em conjunto ou em sequência para promover o desenvolvimento e/ou a progressão tumoral (INCA, 2014).
O câncer é resultado de um processo de múltiplas etapas, nas quais ocorrem alterações genéticas e epigenéticas que levam ao surgimento de um clone de células com vantagens proliferativas sobre as demais (HANAHAN; WEINBERG, 2000). Trata-se de uma doença complexa e heterogênea tanto em nível celular quanto em molecular, como resultado de profundas alterações metabólicas em programas genéticos que controlam a proliferação, apoptose, diferenciação, interação célula-célula e interação célula-matriz extracelular.
As células tumorais podem apresentar múltiplas alterações genéticas, tais como deleções, inserções e translocações (SALK; FOX; LOEB, 2010), perda de heterozigosidade e instabilidade de microssatélites (FEARON, 2011). Estas alterações permitem que células normais escapem da sua regulação e passem a obter um fenótipo maligno, através da ativação de oncogenes e da inativação de genes supressores de tumor e genes de reparo do DNA (LIU; BODMER, 2005).
Diversas mudanças fisiológicas podem ocorrer no processo de tumorigênese, tais como: (i) autossuficiência em sinais de crescimento, levando a uma proliferação descontrolada; (ii) evasão da morte celular programada; (iii) capacidade replicativa ilimitada, uma vez que as células cancerosas possuem a enzima telomerase ativa, o que evita o encurtamento dos telômeros; (iv) indução da angiogênese, promovendo a vascularização tumoral; e (v) capacidade de invasão e metástase, possibilitando a formação de tumores secundários (Fig.,1.1). (HANAHAN; WEINBERG, 2011).
2
Figura 1.1. A evolução do câncer. Os danos no DNA que não foram reparados desencadeiam diversas
modificações que levam à formação de tumores e metástase. Adaptado de SALK et al., 2010.
O câncer representa uma das principais causas de morte no mundo e constitui, assim, um sério problema de saúde pública para países desenvolvidos e também para os em desenvolvimento. Em 2030, estima-se que ocorrerão 21,4 milhões de casos novos de câncer e 13,2 milhões de mortes por câncer, em consequência do crescimento e do envelhecimento da população (INCA, 2014).
O câncer colorretal (CCR), segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA), é o terceiro tipo de câncer mais comum no mundo em homens e o segundo mais comum nas mulheres. Mais da metade dos casos são provenientes de regiões mais desenvolvidas, porém mais recentemente, a incidência de CCR tem aumentado em áreas antes consideradas de baixo risco e acredita-se que isso se deva ao envelhecimento da população, à adoção de estilos de vida mais sedentários e ao consumo de dietas pouco saudáveis (FRANCO; FRANCO, 2005). Essa neoplasia é considerada de bom prognóstico se a doença for diagnosticada em estágios iniciais e apresenta uma sobrevida de aproximadamente 55%.
No Brasil, o CCR está entre as seis neoplasias malignas mais comuns sendo o terceiro em mortalidade no sexo masculino e o segundo no sexo feminino (desconsiderando os tumores de pele não-melanoma). Estimam-se, para 2014, 15.070 casos novos de câncer de cólon e reto em homens e 17.530 em mulheres (INCA, 2014) (Fig., 1.2).
DANOS NO DNA ANGIOGÊNES EVASÃO DA APOPTOSE INVASÃO MASSA TUMORAL METÁSTASE AUTOSSUFICIÊNCIA EM SINAIS DE CRESCIMENTO CAPACIDADE REPLICATIVA ILIMITADA ANGIOGÊNESE
3
Figura 1.2. Estimativa de incidência do câncer colorretal para o ano de2014 (Fonte: Instituto Nacional
de Câncer, 2014).
Entre os fatores de risco conhecidos para esta neoplasia estão a dieta (rica em gordura e com baixa ingestão de frutas, vegetais e cereais), o estilo de vida, a predisposição genética para doenças inflamatórias intestinais, a história familiar e a idade, visto que tanto a incidência quanto a mortalidade aumentam de maneira proporcional à idade (VAN DEN BRANDT; GOLDBOHM, 2006; GIL; CASALI, 2011). E os fatores protetores mais importantes são a atividade física (SAMAD et al., 2005) e o consumo de alimentos que contêm fibra, tais como: frutas, hortaliças (legumes e verduras) e cereais integrais (INCA, 2014).
1.2 Carcinogênese Colorretal
A carcinogênese colorretal é a melhor compreendida dentre as neoplasias humanas e se caracteriza pelo acúmulo de mutações e alterações epigenéticas em diversos genes associados ao câncer: supressores de tumor, oncogenes e genes de reparo de erros de pareamento do DNA (mismatch repair – MMR), resultando em expansão clonal e acarretando a formação de lesões neoplásicas benignas ou malignas (FUJIWARA et al., 1998). Além destas mutações, acredita-se que um fenótipo geneticamente instável acredita-seja necessário para o deacredita-senvolvimento do tumor (MARKOWITZ, 1999).
O desenvolvimento de tumores colorretais se dá de forma progressiva e envolve diferentes alterações que levam a uma transformação do epitélio colônico normal em adenomatoso intermediário e posteriormente em adenocarcinoma (modelo adenoma – carcinoma proposto por Fearon e Vogelstein) (GRADY; PRITCHARD, 2013) (Fig., 1.3).
4
Figura 1.3. Modelo Adenoma – Carcinoma. A carcinogênese colorretal está associada a três diferentes
vias de instabilidade. A via de instabilidade cromossômica (CIN) é caracterizada pela aquisição de mutações no gene supressor tumoral APC, levando à sua “downregulação”, frequentes mutações de ativação do oncogene K-RAS nos estágios iniciais da progressão tumoral, perda de heterozigosidade no cromossomo 18q nos estágios mais avançados e mutação no gene supressor de tumor TP53. Em contraste, tumores esporádicos com instasbilidade de microssatélites (MSI) frequentemente adquirem mutações no oncogene BRAF, associadas com a metilação do promotor do gene de reparo MLH1 e tumores associados com a Síndrome de Lynch, a MSI se dá por mutações em um dos genes do sistema de reparo MMR. A via do fenótipo metilador das ilhas CpG (CIMP) está associada com a hipermetilação de promotores gênicos onde se encontram a maioria das ilhas CpG. Adaptado de GRADY; PRITCHARD, 2013.
Três vias de instabilidade genômica e epigenética têm sido associadas com a carcinogênese colorretal: a via da instabilidade cromossômica (CIN), da instabilidade de microssatélites (MSI) e a via do fenótipo metilador das ilhas CpG (CIMP) (GRADY; PRITCHARD, 2013).
O fenótipo CIN é a forma mais comum de instabilidade genética, sendo associada a mais de 85% dos casos de câncer colorretal (GRADY; CARETHERS, 2008; IMAI; YAMAMOTO, 2008). É caracterizada pela presença de alterações cromossômicas numéricas, múltiplas alterações estruturais e o acúmulo de mutações somáticas em oncogenes como K-ras e genes supressores de tumor como APC e TP53 (IMAI; YAMAMOTO, 2008). Estudos mostram que instabilidade cromossômica promove a progressão tumoral através do aumento da diversidade clonal (GRADY, 2004) e é um marcador de pior prognóstico em CCR (POPAT et al., 2005; WALTHER et al., 2008). VIA CIN/MSS VIA MSI VIA CIMP INATIVAÇÃO DOS GENES MMR EPITÉLIO NORMAL EPITÉLIO DISPLÁSICO ADENOMA GRANDE ADENOMA PEQUENO CÂNCER CÂNCER METASTÁTICO APC K-RAS/ BRAF TP53 PERDA DE 18q
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A MSI ocorre em aproximadamente 15% dos casos de câncer colorretal e tumores com essa instabilidade apresentam um cariótipo normal e um melhor prognóstico quando comparados com tumores apresentando fenótipo CIN (POPAT et al., 2005; WALTHER et al., 2008). Esse fenótipo está associado com pequenas inserções e deleções em sequências repetitivas do genoma, conhecidas como microssatélites (IMAI; YAMAMOTO, 2008). Os mecanismos relacionados ao desenvolvimento deste fenótipo envolvem a inativação de genes da família MMR tanto por metilação do DNA como por mutações somáticas (GRADY, 2004) (Fig., 1.4). Indivíduos com câncer colorretal hereditário não-poliposo (HNPCC), também conhecido como Síndrome de Lynch (SL), desenvolvem câncer colorretal MSI+ devido a mutações na linhagem germinativa em um dos genes do sistema MMR. Em contraste, nos tumores colorretais esporádicos a MSI se dá pelo silenciamento do gene MLH1- um dos genes do sistema MMR - através da metilação do promotor (KANE et al., 1997).
Figura 1.4. Vias moleculares para o desenvolvimento de CCR com MSI. Adaptado de BOLAND;
GOEL, 2010.
SÍNDROME DE LYNCH CRC ESPORÁDICO
(CIMP POSITIVO)
IINATIVAÇÃO DOS GENES MMR
SEGUNDO HIT (MUTAÇÃO, DELEÇÃO E METILAÇÃO)
HIPERMETILAÇÃO DO GENE MLH1 DO GENE
MLH1 MUTAÇÕES GERMITATIVAS E
EPIMUTAÇÕES NOS GENES MMR
MSI
MUTAÇÃO NO GENE K-ras
MUTAÇÕES FRAMESHIFT EM GENES COM REPETIÇÕES
MICROSSATÉLITES OUTRAS MUTAÇÕES CÂNCER COLORRETAL METILAÇÃO NO DNA MUTAÇÃO NO GENE β- CATENINA
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Alguns estudos mostram que estas duas vias (CIN e MSI) não são mutualmente exclusivas, pois existem casos de CCR apresentando os dois fenótipos (CIN+/MSI+) (JONES
et al., 2005).
A instabilidade epigenética em CCR ocorre com a hipermetilação de promotores gênicos, onde se encontram a maioria das ilhas CpG e a hipometilação global do genoma. Aproximadamente 20% dos casos de CCR apresentam uma alta proporção de CpG com padrão de metilação aberrante. Os mecanismos associados a CIMP ainda não são bem compreendidos, mas alguns estudos sugerem uma associação entre a ativação do oncogene BRAF e a patogênese de CCR CIMP+ (WEISENBERGER et al., 2006; BARAULT et al., 2008).
Além das vias de instabilidade, o acúmulo de mutações em genes específicos e a consequente desregulação de vias de sinalização que controlam o desenvolvimento e a progressão tumoral, também são fundamentais para o entendimento da patogênese do câncer colorretal. As principais vias de sinalização associadas com o CCR são: a via Wnt/β-catenina, a via do TGF- β, a via MAPK e a via PI3K (SIENA et al., 2009; WALTHER et al., 2009). 1.3 Padrões de CCR
O CCR é uma doença que atinge indiscriminadamente homens e mulheres e geralmente, apresenta três padrões distintos: esporádico, hereditário e familial (Fig., 1.5).
A forma esporádica da doença, sem nenhuma predisposição hereditária ou familial, representa cerca de 80% dos casos de CCR (DANTAS et al., 2009), e é comum em pessoas com mais de 60 anos de idade. Nesses casos, os danos ao DNA são causados pela interação com fatores ambientais (exposição a substâncias carcinogênicas e radiações) ou pelos efeitos da idade, resultando numa instabilidade genômica através do acúmulo de múltiplas mutações somáticas em uma célula.
O CCR hereditário decorre principalmente da existência de uma mutação na linhagem germinativa em um gene de predisposição ao câncer. Os portadores herdam de um dos pais uma mutação deletéria, geralmente em um gene supressor de tumor. As síndromes hereditárias representam cerca de 10% de todos os casos de CCR, e nesse grupo, a síndrome mais comum é a SL, sendo responsável por aproximadamente 5% de todos os diagnósticos de CCR (LYNCH
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Outras síndromes hereditárias possuem um risco aumentado de desenvolver CCR, tais como a Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) e suas variantes (a FAP atenuada, a síndrome de Gardner e síndrome de Turcot), a síndrome de Peutz-Jeghers, a polipose associada ao gene
MYH, o CCR tipo X, entre outras.
A Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) é uma síndrome com herança autossômica dominante causada por mutações no gene supressor tumoral APC (Adenomatous Polyposis
Coli) em linhagens germinativas, tendo como principal característica clínica o surgimento de
múltiplos pólipos adenomatosos no cólon e/ou reto ainda na adolescência (LINDOR; GREENE,1998) além de uma variedade de lesões extracolônicas. A FAP é uma síndrome rara, sendo responsável por menos de 1% de todos os casos de CCR. Há ainda variantes da FAP, tais como a síndrome de Gardner, que inclui a polipose colônica e duodeno-gástrica, além do desenvolvimento de tumores desmóides e osteomas; a síndrome de Turcot, caracterizada pelo desenvolvimento de tumores no SNC além do fenótipo típico da FAP e a FAP atenuada (APAF), causada por mutações no gene APC em linhagens germinativas, sendo caracterizada pela presença de menos de 100 pólipos adenomatosos com surgimento numa idade mais tardia, aproximadamente 40 anos (SWATI; DENNIS, 2012).
A síndrome de Peutz-Jeghers (PJS) é causada por mutações no gene STK11 em linhagens germinativas, que apresenta múltiplas funções incluindo a regulação do ciclo celular, apoptose e polaridade celular. É caracterizada por lesões hipercrômicas palmares, plantares e de mucosas que coexistem com os pólipos intestinais do tipo hamartoma, além de uma alta taxa de tumores extracolônicos, incluindo tumores gástricos, de mama, pulmão, entre outros (BEGGS et al., 2010).
Há também a polipose associada ao gene MYH (também chamado de MutYH), que está envolvido no reparo de danos oxidativos no DNA. É uma síndrome autossômica recessiva, caracterizada por múltiplos pólipos adenomatosos que são os precursores mais comuns do CCR e também por pólipos serrilhados (SWATI; DENNIS, 2012). A síndrome da Polipose Juvenil Familiar (JPS) que é uma doença rara, caracterizada pela presença de múltiplos pólipos hamartomatosos juvenis localizados no cólon e reto, manifestando-se na infância (WANDERLEY et al., 2009).
O termo CCR Familial tipo X (FCCTX) foi proposto por Lindor et al em 2005 para descrever famílias que preenchiam o critério de Amsterdam I, mas apresentavam CCR com estabilidade de microssatélites (MSS). Os membros da família que preenchiam os critérios
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FCCTX apresentavam um risco aumentado de desenvolver CCR, porém o risco se tornava menor quando comparados com famílias com CCR apresentando um fenótipo de alta instabilidade de microssatélites (MSI-H). Famílias FCCTX apresentam um padrão de transmissão autossômico dominante mas as bases genéticas dessa síndrome ainda não foram estabelecidas (SWATI; DENNIS, 2012).
A terceira forma de CCR é o familial, que representa cerca de 10 a 20% de todos os casos de câncer colorretal (VETTORE; CABALLERO, 2004). Nas famílias afetadas, observam-se agregados de câncer que impedem a classificação desses casos como esporádicos, mas a distribuição e características desses tumores não seguem o padrão observado nas síndromes hereditárias. Nesse subgrupo de famílias, é encontrada uma associação entre fatores ambientais e genéticos ainda pouco conhecidos, incluindo polimorfismos específicos e mutações em genes de risco (ROCHA, 2005).
Figura 1.5. Diagnósticos diferenciais para o CCR. Adaptado de World Gastroenterology Organisation (WGO), 2007.
1.4 Síndrome de Lynch
A Síndrome de Lynch é uma doença genética autossômica dominante com penetrância de 80% causada por uma deficiência do sistema de reparo de malpareamento do DNA (Sistema MMR). Nessa síndrome, os indivíduos afetados herdam uma mutação em um dos alelos destes genes (mutação na linhagem germinativa), e uma mutação somática leva a inativação do outro
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alelo (SANTOS et al., 2012), com consequente acúmulo de erros na replicação do DNA, aumento da taxa de mutações e aceleração do processo carcinogênico.
Os primeiros relatos sobre a SL ocorreram em 1913, quando Warthin reportou pela primeira vez o caso de uma família com predisposição para desenvolver câncer gastrointestinal e ginecológico, sendo chamada de Família G e o seu pedigree foi usado como modelo para identificar outras famílias com fenótipo similar. Em 1966, Henry Lynch descreveu duas famílias (Família N e Família M) que apresentavam agregados tumorais similares, e atribuiu essa característica a uma “síndrome de câncer familial” de origem autossômica dominante. O termo Síndrome de Lynch foi criado em 1984 e foi subdividido em SL I e II para distinguir famílias com predisposição somente ao CCR daquelas com predisposição a tumores adicionais, respectivamente. (BOLAND; TRONCALE, 1984). Os primeiros dados moleculares da síndrome começaram a surgir em 1993, onde foram identificados dois loci de suscetibilidade ao câncer no cromossomo 2p, (PELTOMÄKI et al., 1993) e 3p (LINDBLOM et al., 1993). Inicialmente a alteração molecular observada nos pacientes com a Síndrome de Lynch foi chamada de fenótipo de erro de replicação (RER) e atualmente essa característica é chamada de instabilidade de microssatélites (MSI) (THIBODEAU; BREN; SCHAID, 1993; DE LA CHAPELLE et al.,2003). A associação entre a instabilidade de microssatélites em tumores colorretais e defeitos no sistema MMR foi feita através de estudos genéticos feitos em bactérias e leveduras (BOLAND, 2005).
1.4.1 Características clínicas
Os pacientes com SL frequentemente desenvolvem câncer colorretal em uma idade precoce (aproximadamente 45 anos), com predominância no cólon direito (proximal) (WEI et
al., 2011), além de possuírem um risco aumentado de desenvolver múltiplos tumores
sincrônicos (18% dos casos) ou metacrônicos (50% dos casos) e tumores extracolônicos, como, por exemplo, tumores de endométrio e, com menores ricos, carcinoma de intestino delgado, tumores no trato biliar, tumores urinários, câncer de ovário, tumores gástricos, câncer de estômago, tumores cerebrais e tumores de glândulas sebáceas (LYNCH; DE LA CHAPELLE, 2003).
Os tumores na SL têm como características histopatológicas o excesso de muco (carcinomas mucinosos), são pouco diferenciados, com células em anel de sinete e diploides. Apresentam um comportamento menos agressivo, com menor potencial metastático e melhor resposta à quimioterapia tendo assim melhor prognóstico do que os CCRs esporádicos e,
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possivelmente, isso se deve ao excesso de infiltrado linfocitário envolvendo a lesão (ALEXANDER et al., 2001; SMYRK et al., 2001).
Os indivíduos afetados não apresentam os múltiplos pólipos adenomatosos vistos na FAP, o que dificulta a identificação clínica dos portadores da doença (ROSSI, 2009).
1.4.2 Critérios de diagnóstico
A história familiar foi um dos primeiros métodos para identificar pacientes em risco (KASTRINOS; STOFFEL, 2014), já que estudos epidemiológicos mostraram que indivíduos com familiares de primeiro grau com CCR têm um risco maior em desenvolver a doença (COURA; ASHTON-PROLLA; PROLLA, 2005).
Em 1990, o International Collaborative Group on HNPCC (atualmente denominado
Intenational Society of Gastrointestinal Hereditary Tumors – InSiGHT) propôs a criação de
critérios para o diagnóstico clínico da síndrome (Critérios de Amsterdã I) (VASEN et al., 1991). Os critérios de Amsterdã I (Quadro I.I) levam em consideração a história familiar do paciente e a idade no diagnóstico, porém não incluem tumores extracolônicos, tornando-os extremamente restritivos. Por esses motivos, os critérios de Amsterdã I foram reformulados em 1999 para a inclusão de outros tumores (Critérios de Amsterdã II) (Quadro I.II).
Como nem todos os pacientes com mutações em linhagens germinativas nos genes MMR preenchem os critérios de Amsterdã, foram também estabelecidos critérios de suspeição para a síndrome (Critérios de Bethesda I e II), que são muito mais sensíveis e servem para identificar indivíduos candidatos a testes de rastreamento (SANTOS et al., 2012) (Quadro I.III).
Quadro I.I. Critérios de Amsterdam I.
I. Famílias com 3 casos de CCR em que 2 dos indivíduos afetados são parentes de 1º grau do terceiro;
II. Famílias com casos de CCR em no mínimo 2 gerações; III. Famílias com 1 caso de CCR <50 anos de idade; IV. Exclusão do diagnóstico de FAP.
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Quadro I.II. Critérios de Amsterdam II
Quadro I.III. Critérios de Bethesda Modificados
I. Três ou mais familiares com neoplasia associada à SL (CCR ou câncer de endométrio, intestino delgado, estômago, hepatobiliar, de pelve renal e ureter), sendo um parente de 1º grau dos outros dois;
II. Famílias com casos de CCR em no mínimo 2 gerações;
III. Famílias com 1 ou mais casos de CCR diagnosticados antes dos 50 anos de idade.
Pelo menos um dos seguintes critérios:
I. CCR diagnosticado antes dos 50 anos de idade;
II. Presença de CCR sincrônico ou metacrônico, ou outro tumor do espectro Lynch independentemente da idade;
III. CCR com histologia sugestiva de alta instabilidade de microssatélites antes dos 60 anos de idade;
IV. Probando com CCR e um ou mais familiares de 1º grau com tumor do espectro Lynch sendo um dos tumores diagnosticado antes dos 50 anos;
V. Probando com CCR e dois ou mais familiares de 1º ou 2º grau com tumores do espectro Lynch diagnosticados em qualquer idade.
12 1.4.3 Testes genéticos de rastreamento
Quando uma família preenche os critérios de Bethesda, existe indicação para realização de testes genéticos do tecido tumoral, como a análise de instabilidade de microssatélites (MSI) e o teste de imunohistoquímica (IHQ) (BURT et al., 2007). Se um ou ambos os testes derem positivo é necessária a realização de análise de mutação genética nos genes MMR.
O teste de MSI apresenta uma sensibilidade de quase 100% e é positivo mesmo nos casos em que a mutação nos genes MMR não é conhecida. No entanto, sua especificidade é baixa, já que a MSI não é exclusiva da SL (LIVING, 2008).
O procedimento padrão para análise e identificação da instabilidade de microssatélites proposto pelo InSiGHT, é o uso de cinco marcadores de microssatélites comparativamente entre o tecido normal e tumoral. Dois destes são repetições mononucleotídicas (BAT25 e BAT26) e os demais são repetições dinucleotídicas (D2S123, D5S346 e D17S250) (BOLAND et al., 1998). Baseado no número de marcadores apresentando instabilidade, os tumores são classificados em três grupos: alta instabilidade (MSI-H) para os que apresentam dois ou mais marcadores instáveis (≥30-40%); baixa instabilidade (MSI-L), para os com apenas um marcador instável (<30%); e estável (MSS) quando não apresenta nenhum marcador instável (KASTRINOS; STOFFEL, 2014). De forma a aumentar a sensibilidade e especificidade do teste, foram incluídos outros marcadores mononucleotídicos para detecção de MSI-H, como NR-21, NR-24, e MONO-27 (BACHER et al., 2004).
O teste de IHC usa anticorpos monoclonais produzidos contra as proteínas codificadas pelos vários genes do sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). A ausência de uma destas proteínas no tecido tumoral pode ser indicadora de uma mutação na linhagem germinativa. Porém, este teste pode gerar falsos positivo nos casos em que se têm proteínas truncadas e inativas, sendo reconhecidas de forma errônea pelos anticorpos (COURA; ASHTON-PROLLA; PROLLA, 2005).
A complementação da análise de genes MMR por sequenciamento completo das regiões codificantes para identificação de mutações pontuais é atualmente a abordagem mais completa para identificação de mutações e diagnóstico da SL (WAGNER et al., 2003; van der KLIFT et
al., 2005). Até recentemente, o sequenciamento de Sanger, ou de terminação de cadeia, foi o
método dominante e padrão ouro para o sequenciamento de DNA. Porém, o sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing - NGS) tem ganhado espaço, pois além
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sequenciar milhões de fragmentos de DNA ao mesmo tempo, apresenta uma redução impressionante no custo por megabase. Portanto, as tecnologias de sequenciamento de nova geração, incluindo o sequenciamento total do genoma e o sequenciamento das regiões exônicas, têm permitido a introdução de novas abordagens para facilitar a identificação de novos genes responsáveis pela predisposição de doenças humanas, incluindo o câncer (JURADO et al., 2014).
Uma combinação de abordagens de rastreamento para identificação do defeito MMR e diagnóstico de mutações em linhagens germinativas tem sido utilizada por muitos investigadores por ser considerada a abordagem mais custo-efetiva (PROLLA, 2010) (Fig., 1.6).
Figura 1.6. Abordagens de diagnóstico laboratorial da SL em pacientes com CCR. Adaptado de PROLLA, 2010. AVALIAÇÃO DO HEREDOGRAMA: SÍNDROME DE LYNCH CRITÉRIOS DE AMSTERDAM DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE HNPCC
QUAL GENE MMR MUTADO?
SEQUENCIAMENTO GENE (S) MMR SELECIONADO (S) IHQ IHQ CRITÉRIOS DE BETHESDA AUSÊNCIA PRESENÇA MSI POSITIVO NEGATIVO QUAL GENE MMR ALTERADO? METILAÇÃO
NÃO METILADO METILADO
ENCERRAR INVESTIGAÇÃO
14 1.4.5 Bases genéticas da SL
Apesar de sete genes terem sido associados com a SL (MSH2, MLH1, MSH6, PMS1,
PMS2, MLH3 e EXO1), a grande maioria dos pacientes com o fenótipo clínico apresenta
mutações em apenas quatro deles: MLH1 (mutL homolog 1) (40%), MSH2 (mutS homolog 2) (50%), MSH6 (mutS homolog 6) (7%) e PMS2 (postmeiotic increased 2) (3-5%) (GROVER et
al., 2009).
A inativação mutacional dos genes MMR leva a um reparo insuficiente do DNA e ao desenvolvimento de tumores caracterizados pelos altos níveis MSI, e esta é uma característica encontrada em mais de 95% dos CCRs associados à SL (NAGASAKA et al., 2010).
Mais de 513 alterações diferentes em genes MMR já foram descritas, entretanto, muitas vezes essas alterações são consideradas como variantes não classificadas (UV), pois suas consequências funcionais e clínicas são desconhecidas, não podendo ser facilmente classificadas como patogênicas ou neutras (BRYONY et al., 2012; STEINKE et al., 2013). (Fig., 1.7). Segundo Santos e colaboradores (2012), a maioria das mutações nos genes de reparo em pacientes com SL, gera uma proteína truncada e não funcional.
Figura 1.7. Espectro mutacional dos genes MMR. Adaptado de STEINKE et al., 2013. MSH2
15 1.5 Vias de reparo de DNA
A manutenção da integridade genômica e a adaptação a estresses genotóxicos são elementos fundamentais para garantir a sobrevivência de um organismo. O DNA pode sofrer alterações por diferentes agentes, tanto endógenos, causados por alterações espontâneas decorrentes da instabilidade das ligações químicas da molécula ou por alterações causadas por produtos do metabolismo celular, quanto exógenos, associados a fatores ambientais. Frente a estas lesões, uma complexa resposta celular é ativada com a finalidade de se preservar a estabilidade genômica. A resposta ao dano no DNA envolve a detecção do sítio lesionado, a amplificação do sinal através de uma cascata de proteína cinases e a ativação de uma série de efetores que promovem uma resposta celular específica (apoptose, parada do ciclo celular, senescência) (MÉNDEZ-ACUÑA et al., 2010)
As vias de reparo do DNA são responsáveis pelo processamento de diferentes tipos de dano e são essenciais para evitar o acúmulo de mutações e garantir a transmissão acurada da informação genética. Dependendo do tipo de lesão no DNA, diferentes proteínas são recrutadas para reconhecer e processar o dano. Existem cinco vias principais de reparo do DNA: (i) reparo por excisão de bases (ou BER, do inglês Base-Excision Repair) (ROBERTSON et al., 2009); (ii) reparo por excisão de nucleotídeos (ou NER, do inglês Nucleotide-Excision Repair) (NOUSPIKEL, 2009); (iii) reparo de erros de pareamento (ou MMR, do inglês Mismatch
Repair) (HSIEH; YAMANE, 2008); (iv) reparo por recombinação homóloga (ou HR, do inglês Homologous Recombination) (NOWOSIELSKA, 2007) e (v) reparo por recombinação
não-homóloga (ou NHEJ, do inglês Non-Homologous End Joining) (MAHANEY; MEEK; LEES-MILLER, 2009).
1.5.1 Sistema MMR
O sistema de reparo MMR é altamente conservado ao longo da evolução e é essencial para a estabilização do genoma tanto em procariotos quanto em eucariotos (SUNG-HOON; KIM; BAN, 2006). Este sistema corrige erros de pareamento base\base, além de inserções e deleções que ocorrem durante a síntese do DNA, melhorando a fidelidade do mecanismo de replicação (OLLILA et al., 2008), além de estar envolvido nos processos de recombinação, na geração da diversidade imune e na resposta celular a danos específicos ao DNA, como, por exemplo, danos causados por agentes alquilantes. (WARREN et al., 2007) (Fig., 1.8).
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Figura 1.8. Diferentes funções das proteínas de reparo MMR. Adaptado de SUNG-HOON et al., 2006.
O reparo de erros de pareamento consiste no reconhecimento da base mal pareada, causando distorção na dupla fita de DNA, excisão do segmento de DNA que contém o erro através da ação de exonucleases específicas e a síntese da região removida utilizando a fita parental como molde, através da ação das enzimas DNA polimerase e ligase (IYER et al., 2006).
O sistema MMR reconhece com eficiência a maioria dos erros, retirando-os do genoma recém-replicado. É necessário que haja uma coordenação entre o MMR e a replicação do DNA, para que seja feito o direcionamento do reparo à fita recém sintetizada (BOWERS et al., 2001).
Os primeiros estudos com os genes mismatch foram desenvolvidos na bactéria
Escherichia coli (E. coli), onde os componentes essenciais do sistema MMR – MutS, MutL,
MutH e Uvr – foram identificados pela primeira vez através de estudos genéticos de mutantes (COX; DEGNEN; SCHEPPE, 1972; WAGNER; MESELSON, 1976). O homodímero MutS liga-se de forma inespecífica à molécula de DNA em busca do mismatch. Quando o erro é reconhecido, a proteína perde afinidade pela molécula de ADP, sofre uma mudança conformacional que permite sua ligação ao homodímero MutL formando um complexo ternário dependente de ATP. A formação deste complexo estimula a atividade endonuclease do homodímero MutH, que se liga ao sítio GATC hemi-metilado na fita recém sintetizada e quebra a molécula de DNA tanto na posição 5´quanto na 3´do malpareamento. Além disso, há o
DIVERSIFICAÇÃO DE ANTICORPOS RESPOSTA A DANOS NO DNA REPARO DE ERROS NA REPLICAÇÃO REGULAÇÃO DA RECOMBINAÇÃO PROMOÇÃO DO CROSSING OVER MEIÓTICO PROTEÍNAS MMR
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recrutamento de helicases UvrD que se ligam na fita contendo a quebra e impedem que o DNA duplex se enrole, enquanto o reparo não é feito. Isso permite a ação de diferentes exonucleases, que digerem o DNA nas direções 5´- 3´ e 3´- 5´. A ação exonucleolítica acaba no momento em que o erro é removido. O reparo é corrigido pela DNA polimerase III e o processo é finalizado pela DNA ligase (JIRICNY, 2006).
A complexidade da via MMR nos organismos eucarióticos é maior que a encontrada em procariotos, de modo que há ainda muitas dúvidas quanto aos detalhes do processo de reparo. As poucas informações que se têm a respeito dos mecanismos MMR em eucariotos são derivadas, principalmente, de estudos feitos com DNA circular heteroduplex de extratos de células de mamíferos. Estes estudos indicam que a sequência de eventos que ocorrem durante o processo de reparo é ditada por interações entre diferentes proteínas e o DNA heteroduplex (MODRICH, 2006).
Todos os organismos eucarióticos, apresentam componentes homólogos dos complexos MutS (MSHs) e MutL (MLHs), porém, em contraste com os encontrados nas bactérias, os componentes eucarióticos funcionam como heterodímeros. Estudos feitos em levedura não encontraram similares aos complexos MutH e Uvr, indicando que provavelmente não existem homólogos para estas duas proteínas no genoma de eucariotos (HAFE; ROBERTSON, 2000).
Em eucariotos, os componentes do sistema MMR formam três subunidades proteicas principais: MutSα (MSH2 + MSH6), que reconhece os erros base/base e pequenos loops de inserção/deleção (IDLs) envolvendo um ou dois nucleotídeos, MutSβ (MSH2 + MSH3), que reconhece grandes IDLs e MutLα (MLH1 + PMS2), que age como um mediador entre o complexo MutS e as outras proteínas que participam do processo de reparo (PELTOMÄKI, 2003; EDELBROCK; KALIYAPERUMAL; WILLIAMS, 2012;) (Fig., 1.9).
As interações protéicas já documentadas nesse sistema incluem os seguintes pares de moléculas: MutSα – MutLα, MutSα – PCNA, MutSβ – PCNA, MutLα – PCNA, MutSα – ExoI, MutLα – ExoI, ExoI – PCNA e PCNA – polimerase δ. Com exceção das interações MutSα - ExoI e entre PCNA – polimerase δ, o significado destas outras interações no reparo de erros de pareamento ainda não foi estabelecido (MODRICH, 2006).
Em contraste com a E. coli, onde o reparo é direcionado pela ausência transitória de metilação na adenina presente no sítio GATC da fita recém-sintetizada (hemi-metilação), os
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sinais que direcionam o processo de reparo em eucariotos ainda não foram identificados (DA SILVA et al., 2009).
Figura 1.9. MMR em eucariotos. (A) O complexo MutSα (MSH2-MSH6) reconhece erros base/base,
além de pequenas alças de inserção e deleção durante a síntese de DNA. Esse processo necessita de mudança de ligação do ATP para o ADP pela proteína MSH2, seguido pelo recrutamento do complexo MutLα (MLH1-PMS2). (B) Nas etapas seguintes de excisão e ressíntese, tem sido sugerida a participação de diferentes proteínas como PCNA, DNA polimerase δ/ε, helicase I e exonuclease I para remover o mismatch da fita recém-sintetizada. (C) Já o complexo MutSβ (MSH2-MSH3), reconhece grandes alças de inserção e deleção (IDLs), seguido também, pelo recrutamento do complexo MutLα (MLH1-PMS2) para remoção do mismatch. Adapatado de BOLAND; GOEL, 2010.
1.6 MSH2
O gene MSH2 está localizado no braço curto do cromossomo 2 na posição 2p22-p21 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4436; National Center for Biotechnology Information, 2012), mais precisamente entre os pares de bases 47.630.262 – 47.710.359, e possui 16 éxons (http://www.med.mun.ca/MMRvariants/thegenes.aspx) (Fig., 1.10).
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A proteína MSH2 apresenta 934 aminoácidos e 5 domínios estruturais conservados: domínio 1 ou “mismatch binding” (1 – 124 resíduos de aminoácidos); domínio 2 ou “conector” (125 – 297 resíduos de aminoácidos); domínio 3 ou “lever” (300 – 456 e 554 – 619 resíduos de aminoácidos); domínio 4 ou “clamp” (457 – 553 resíduos de aminoácidos) e o domínio 5 ou ATPase (620 – 855 resíduos de aminoácidos) (WARREN et al., 2007; NEGUREANU; SALSBURY, 2012) (Fig., 1.11). Esta proteína é estabilizada através da interação com as proteínas MSH6 e MSH3, permitindo assim, que ela atue em substratos variados e vias diversas.
Figura 1.11. Modelo estrutural do heterodímero MutSα, mostrando o DNA (azul claro), domínio de
ligação (vermelho), domínio conector (amarelo), domínio lever (verde), domínio clamp (roxo) e domínio ATPase (azul escuro). Adapatado de NEGUREANU; SALSBURY, 2012.
O gene MSH2 é responsável por aproximadamente 50% das mutações conhecidas, associadas à SL. Dentro do espectro de mutações que são encontradas no gene: 10% são mutações que envolvem a substituição de um aminoácido, em alguns casos gerando uma proteína truncada e não funcional; 20% são grandes rearranjos gênicos, como deleções e duplicações além de alterações nos sítios de splicing e mutações sinônimas (RUMILLA et al., 2011). Alguns estudos mostram que o gene MSH2 também pode sofrer inativação através de alterações epigenéticas (NAGASAKA et al., 2010; RUMILLA et al., 2011) e mutações pontuais na região promotora (IWAHASHI et al., 1988).
20
Deleções na linhagem germinativa da região 3´ do gene EPCAM (Epithelial Cell
Adhesion Molecule), também conhecido como TACSTD1, localizado aproximadamente 16-Kb
acima do gene MSH2, tem sido associadas com a hipermetilação da região promotora desse gene de reparo, com consequente ausência da sua proteína. Esse mecanismo ocorre em aproximadamente 20% dos casos de CCR, em que há perda da proteína MSH2 sem que uma mutação na linhagem germinativa seja identificada (RUMILLA et al., 2011; BANSIDHAR; SILINSKY, 2012).
Segundo Iwahashi e colaboradores (1998), a região essencial para a atividade basal do promotor de MSH2 é composta por um fragmento contendo 282 pb, abrangendo desde o nucleotídeo -298 até o nucleotídeo -17. Esta região apresenta elementos de ativação em cis que servem como sítios de ligação para diferentes fatores de transcrição (Fig., 1.12).
Figura 1.12. Região promotora do gene MSH2: contendo 282 pb (-298 nt até -17 nt). As sequencias
sublinhadas representam os sítios de ligação para os diferentes tipos de fatores de transcrição. Na posição +1 está indicado o códon de início ATG.
Estudos genéticos e bioquímicos mostram que a proteína MSH2 é necessária para todos os tipos de reparo de malpareamento do DNA (SUNG-HOON; KIM; BAN, 2006), portanto, estudos sobre a incidência de mutações na linhagem germinativa nesse gene contribuirão para um melhor entendimento do impacto do diagnóstico para os pacientes e familiares com SL.
21 1.7 Estudos brasileiros sobre a SL
A SL é a síndrome hereditária mais comum na espécie humana, com incidência entre 1:2.000 e 1:660 indivíduos (DE LA CHAPELLE, 2005). Portanto, é fundamental que os pacientes em risco e seus familiares realizem programas de rastreamento.
São poucos os estudos no Brasil que descrevem o genótipo de indivíduos brasileiros com a SL, seja aqueles com critérios diagnósticos (Amsterdam) ou de suspeição (Bethesda) para a síndrome. A maioria dos estudos sobre a incidência e identificação de variantes genéticas nos genes do sistema MMR é de origem europeia, americana e asiática. O espectro mutacional desta síndrome é bastante variado, incluindo mutações “nonsense”, “frameshift” e predominantemente mutações “missense”. Entretanto, grandes rearranjos gênicos e variantes de sítios de splicing constituem <10% das alterações encontradas. Mutações fundadoras, também têm sido identificadas em diferentes populações, contribuindo significantemente para a predisposição da doença e direcionando os testes genéticos (DOMINGUEZ-VALENTIN et
al., 2013).
O primeiro estudo realizado no Brasil (ROSSI et al., 2002) com pacientes do Hospital AC Camargo, descreveu a frequência de mutações na linhagem germinativa nos genes de reparo
MLH1 e MSH2 em 25 famílias brasileiras preenchendo os critérios de Amsterdam e de
Bethesda. O mesmo grupo publicou em 2004 um estudo que relatava que os tumores extracolônicos mais frequentes em famílias brasileiras com SL eram o de endométrio em mulheres e o câncer gástrico em homens.
Outros estudos foram publicados a partir de outras Instituições brasileiras (COSSIO et
al., 2010; DA SILVA et al., 2010), também relacionando genótipo – fenótipo em pacientes
brasileiros com SL. Porém, os dados disponíveis se limitam ao estudo de mutações e características fenotípicas em pequenas séries de famílias com SL. A exata frequência de deficiência do sistema MMR e a prevalência de mutações na linhagem germinativa nos genes MMR não são conhecidas para famílias de diferentes regiões brasileiras (PROLLA, 2010).
22 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Identificar variantes de sequência no gene MSH2 em pacientes selecionados para Síndrome de Lynch de acordo com os critérios de Amsterdam ou Bethesda modificados, avaliando a sensibilidade e especificidade dos mesmos para a presença de mutação.
2.2 ESPECÍFICOS
Relacionar as alterações do gene MSH2 encontradas na população brasileira com as alterações já descritas na literatura para o gene;
Descrever o perfil de variações em MSH2 com respeito a sua associação com a Síndrome de Lynch: mutações nonsense, mutações missense, mutações sinônimas, polimorfismos e variações de valor diagnóstico desconhecido. Avaliar se as alterações encontradas no gene MSH2 são polimorfismos comuns na população, comparando com dados da literatura;
Avaliar a presença de diferentes mutações em diferentes centros de tratamento de câncer: INCA, HCPA, AC.Camargo e HUJJB.
Avaliar a utilização de sequenciamento de nova geração (NGS) como estratégia para identificação de variações em MSH2.
23 METODOLOGIA
3.1 Pacientes
Neste estudo foram incluídos 53 pacientes diagnosticados com câncer colorretal, sendo 31 (58,5%) do sexo feminino e 22 (41,5%) do sexo masculino. Os candidatos ao estudo foram selecionados a partir de quatro centros clínicos pertencentes a quatro regiões Brasileiras - todos hospitais públicos universitários e/ou centros de atendimento de pacientes do SUS: Instituto Nacional de Câncer (INCA) (Rio de Janeiro), Hospital AC Camargo (São Paulo), Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) (Rio Grande do Sul) e Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJJB) (Belém do Pará).
Foram recrutados 25 pacientes preenchendo critérios de Amsterdam e 28 pacientes preenchendo critérios de Bethesda modificados, todos não relacionados, e preenchendo os seguintes critérios de inclusão: indivíduos de ambos os sexos, que tenham sido diagnosticados com câncer colorretal, com história familial compatível com os critérios de Amsterdam I ou II ou com os critérios de Bethesda modificados, com idade superior a 18 anos, e aceitaram voluntariamente a participação no estudo e que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) específico de participação no estudo (Anexo 1). De cada paciente incluído foram obtidos os seguintes materiais: (a) bloco de parafina contendo tumor colorretal – a partir de peça cirúrgica e, se possível tecido colônico normal adjacente; (b) DNA genômico extraído de sangue periférico; (c) dados clínicos e (d) heredograma de no mínimo três gerações.
Todos os participantes da pesquisa foram recrutados a partir de consultas de aconselhamento genético e foram identificados mediante análise do heredograma. As amostras biológicas e cópia dos formulários foram remetidos ao centro coordenador do projeto (Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS) para posterior distribuição das informações aos demais centros participantes. O centro coordenador ficou responsável pela organização dos dados clínicos e pelos testes genéticos de instabilidade de microssatélites e de imunohistoquímica.
Este projeto faz parte de um projeto maior titulado: “Diagnóstico clínico e laboratorial da Síndrome de Lynch: um estudo de custo-efetividade e de viabilidade de implantação no SUS”, coordenado pela Drª Patrícia Ashton-Prolla da UFRGS.
