Variantes de sequência não patogênicas

De acordo com as análises in sílico e com a classificação proposta pelo grupo InSiGHT, das variantes de ponto encontradas no gene MSH2, verificamos que 5 são alterações não patogênicas, uma vez que não comprometem a função de reparo da proteína.

Identificamos a variante c.23C>T (p.T8M) em heterozigose em dois pacientes – GGC 1094 e SL009. Esta variante já foi previamente descrita por diversos estudos em diferentes populações mundiais (MANGOLD et al., 2005; WANG et al., 2005; SPAEPEN et al., 2006), porém não foram realizados estudos funcionais e nem a utilização de amostras controles para definir a patogenicidade da variante. As análises in sílico relativas ao efeito da substituição do

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aminoácido na função da proteína, utilizando-se os programas SIFT e Pmut, e de acordo com o grupo InSiGHT classificaram esta variante como sendo benigna. Porém, de acordo com o programa PolyPhen-2, os resultados foram contraditórios: o modelo de predição HumDiv a classificou como sendo possivelmente danosa, enquanto o modelo HumVar a classificou como benigna. Sabendo-se que o modelo de predição HumVar é utilizado preferencialmente para o diagnóstico de doenças Mendelianas, utilizamos a classificação proposta por este modelo, uma vez que a Síndrome de Lynch se encaixa nesta descrição de doença. Embora as predições in

sílico tenham classificado esta variante como benigna, esta avaliação deve ser realizada com

cautela, uma vez que a alteração encontra-se em um domínio importante da proteína (mismatch

binding), que é responsável pela interação inespecífica da proteína MSH2 com a fita de DNA

(WARREN et al., 2007). Além disso, o paciente GGC 1094 apresenta perda das proteínas MSH2 e MSH6 e o paciente SL009 apresenta perda de MSH6, mostrando que algum fenômeno está regulando a estabilidade destas proteínas e consequentemente, afetando a atividade de reparo das mesmas. Portanto, análises funcionais, estudos de caso-controle e de co-segragação ajudariam a esclarecer se a variante p.T8M é realmente benigna ou um fator causal para a Síndrome de Lynch.

A variante sinônima (p.L191L) foi identificada no éxon 3 do gene MSH2 em apenas um paciente – SL001. Esta alteração ocorre no domínio conector da proteína MSH2 e foi descrita anteriormente na literatura como polimorfismo não patogênico (FERRINGTON et al., 1998).

A transição c.965G>A (G322D) foi identificada em três pacientes em heterozigose (3, 10, GGC 1107), através dos sequenciamentos de Sanger e de nova geração, e é um polimorfismo não patogênico já conhecido, descrito em diversos estudos (SPAEPEN et al., 2006; OLLILA et al., 2008; DOMINGUEZ-VALENTIN et al., 2011; PASTRELLO et al., 2011; THOMPSON et al., 2012). Em um estudo funcional desenvolvido na Suíça (OLLILA et

al.,2008), os autores demonstraram que a variante G322D consegue se coexpressar com a

proteína MSH6 e mantem sua afinidade de ligação pelo mismatch de forma similar à proteína MSH2 selvagem (WT), porém apresenta uma pequena redução na liberação do mismatch após interação com a molécula de ATP. As análises in sílico realizadas foram contraditórias, pois o programa SIFT a classificou como patogênica e todos os outros, inclusive o InSiGHT, a classificaram como benigna. Mesmo assim, esta variante é considerada benigna, uma vez que mantém sua atividade de reparo intacta e sozinha não é suficiente para causar defeitos no sistema de reparo MMR (OLLILA et al., 2008). Em todos os três pacientes portadores da variante, as quatro proteínas estudadas estavam presentes.

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A alteração c.-118T>C foi identificada na região promotora do gene MSH2 em 7 pacientes em heterozigose e em 1 paciente em homozigose. É um polimorfismo conhecido, já descrito na literatura e considerado não patogênico por vários autores (SHIN et al., 2002; JUNG

et al., 2006; CHRISTENSEN et al., 2008). De acordo com o banco de dados TRANSFAC, as

sequências contendo os alelos selvagem (T) e variante (C) são possíveis sítios de ligação para diversos fatores de transcrição em diferentes organismos vertebrados. A sequência contendo o alelo T serve como sítio de ligação para diferentes fatores, como por exemplo, o mais estudado - CCAAT-binding, já a sequência contendo o alelo variante C é possível sítio de ligação para os fatores NF-1 e LBP-1. Em um estudo realizado no Canadá (MRKONJIC et al.,2007), os autores observaram que esta variante está associada com uma forte história familiar de CCR em pacientes mulheres, e isto pode ser explicado pelo fato de esse polimorfismo estar localizado em um sítio de ligação ao fator de transcrição CAAT- binding (também conhecido como NF-Y ou CBF), que é um conhecido elemento responsivo ao estrogênio, que além de regular positivamente a transcrição do gene MSH2 e aumentar a atividade de reparo do sistema MMR em células endometriais (MIYAMOTO et al., 2006), apresenta um efeito protetivo em CCR, uma vez reduz o risco de desenvolvimento de tumores MSI-H (SLATTERY et al., 2001). Além disso, a substituição T>C leva a mudança de um sítio de NF-Y para um sítio de ligação ao fator de transcrição AP-1. Iwahashi e colaboradores (1998) observaram através do ensaio do gene repórter da luciferase que existe uma pequena diferença na atividade transcricional entre estes dois alelos, sugerindo que os elementos AP-1 e CCAAT-binding, não estão associados com a regulação da expressão do gene MSH2. Porém, um estudo realizado por Humbert e colaboradores (2003) mostrou que o fator AP-1 regula positivamente a expressão de MSH2, e desempenha um papel crucial na resposta celular à agentes genotóxicos. Em relação aos outros fatores de transcrição, não há nenhum dado na literatura mostrando a associação destes com a expressão do gene MSH2.

Outra variante identificada nesse estudo foi c.211+9C>G no íntron 1 do gene MSH2. Ela foi encontrada em 21 pacientes em heterozigose e em 9 pacientes em homozigose. Trata-se de um polimorfismo já descrito na literatura (KIM et al., 2004; WANG et al., 2005), porém sua patogenicidade é contraditória, pois, apesar de o grupo InSiGHT (banco de dado LOVD) classifica-la como benigna, em alguns estudos, ela foi associada ao risco de desenvolvimento de várias neoplasias (SANGUANSIN et al., 2006). Em um estudo realizado na Índia (SRIVASTAVA et al., 2010), os autores observaram que indivíduos homozigotos para o alelo IVS1+9C apresentavam um risco maior em desenvolver carcinoma de vesícula biliar. Já em outro estudo desenvolvido por Marra e colaboradores (2001), demonstrou que células

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linfoblásticas carregando a variante MSH2 IVS1+9C>G eram significantemente mais tolerantes a agentes metilantes em comparação com células MSH2 selvagens e, consequentemente, apresentavam uma diminuição na eficiência de reparo. Por ser um polimorfismo que ocorre no íntron e não altera a estrutura da proteína, acreditamos se tratar de uma variante que possivelmente pode contribuir para a pré-disposição de apenas alguns tipos tumorais, porém, mais estudos de associação devem ser realizados em diferentes populações para confirmar a classificação desta variante.