UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO PRÓ-REITORIA DE GRADUAÇÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE BIOTECNOLOGIA
ALLEN KARLOS GOMES DOS SANTOS
ANÁLISE DA ATIVIDADE in silico E in vitro DA QUERCETINA CONTRA Trypanosoma cruzi
MOSSORÓ
2019
ALLEN KARLOS GOMES DOS SANTOS
ANÁLISE DA ATIVIDADE in silico E in vitro DA QUERCETINA CONTRA Trypanosoma cruzi
Monografia apresentada a Universidade Federal Rural do Semi-Árido como requisito para obtenção do título de Bacharel em Biotecnologia.
Orientador: Taffarel Melo Torres, Prof. M.Sc.
MOSSORÓ
2019
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Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Bibliotecas
da Universidade Federal Rural do Semi-Árido, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
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ALLEN KARLOS GOMES DOS SANTOS
ANÁLISE DA ATIVIDADE in silico E in vitro DA QUERCETINA CONTRA Trypanosoma cruzi
Monografia apresentada a Universidade Federal Rural do Semi-Árido como requisito para obtenção do título de Bacharel em Biotecnologia.
Defendida em: 14/08/2019.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
Taffarel Melo Torres, Prof. M. Sc. (UFERSA) Presidente
_________________________________________
Ana Carla Diógenes Suassuna Bezerra, Profª. Drª. (UFERSA) Membro Examinador
_________________________________________
Lívio Carvalho de Figueirêdo, Prof. Dr. (UFERSA) Membro Examinador
In Memoriam de Janeo Franklin Tavares dos Santos, amado irmão.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, principalmente, a meus pais: a minha mãe, Maria Salete Ferreira Gomes, e meu pai, Carlos Alberto dos Santos, por permitirem que meu sonho se tornasse realidade mesmo diante de todas as dificuldades.
Agradeço ao meu Orientador, Taffarel Melo Torres, por ser meu guia na Ciência e na vida, sempre me indicando as melhores trilhas a percorrer.
Agradeço a Jamille Ferreira por ser meu farol e meu fio de esperança em momentos de trevas.
Agradeço aos meus colegas de trabalho, Débora, Dyonatan, Maria Júlia e Stephany, por sempre serem meu braço direito quando necessitava de auxílio. Aos meus amigos, Igor, Jessica, Leonardo, Letícia, Lucas Davi, Lucas Rabelo e Milena por serem meus companheiros nessa difícil jornada.
Agradeço a todos os meus amigos de Fortaleza (Alyson, Beatriz, Davi, Everton, Flávio, Lucas Emanuel, Pedro Paulo, Raul e Yuri) por serem a melhor companhia nos momentos de descontração e desabafo.
Por fim, agradeço a todos que não foram mencionados, mas contribuíram de alguma forma na minha formação.
Excelsior!
“A coisa mais misericordiosa do mundo, acho eu, é a incapacidade da mente humana correlacionar tudo que ela contém. Vivemos em uma plácida ilha de ignorância em meio a mares tenebrosos de infinidade, e não estávamos destinados a chegar longe. As ciências, cada uma puxando para seu próprio lado, nos causaram poucos danos até agora, mas algum dia a junção das peças do conhecimento disperso descortinará visões tão terríveis da realidade e de nossa pavorosa posição dentro dela que só nos restará enlouquecer com a revelação ou fugir da iluminação mortal para a paz e a segurança de uma nova idade das trevas.”
H.P. Lovecraft, O Chamado de Cthulhu
RESUMO
O presente estudo propôs analisar a atividade in silico e in vitro da Quercetina contra Trypanosoma cruzi, parasito causador da Doença de Chagas, e especificamente os focos são:
analisar in silico os mecanismos de interação da Quercetina com enzimas GAPDH e Arginase de T. cruzi; analisar in vitro o efeito da aplicação da Quercetina sobre T. cruzi em sua fase epimastigota; estimar a concentração inibitória de 50% da Quercetina para T. cruzi em sua fase epimastigota. A primeira linha de pesquisa a ser estabelecida foi a aplicação do fármaco in vitro.
Dessa forma, com o fármaco Quercetina obtido, iniciou-se os testes pilotos de atividade contra T. cruzi. Este fármaco, apresenta-se na forma de um pó cristalino de cor amarelada e, após aplicação em cultura de parasitos em meio LIT (Liver Infusion Tryptose), notou-se que a quercetina é praticamente insolúvel em água, formando grande presença de precipitado. Testes de diluição da Quercetina foram ministrados utilizando diferentes concentrações de PEG 400.
As concentrações de 1, 2 e 4% exibiram boa atuação na solubilização e biodisponibilidade do fármaco. Dessa forma, pode-se obter os valores de IC50 da Quercetina e diferentes formulações de grupos controle contendo Benzonidazol. A Quercetina (IC50 = 1,627 mM) mostrou-se menos eficiente em causar a morte de T. cruzi em relação aos grupos controle, contudo ainda possui potencial para ser inclusa no portifólio de compostos a serem utilizados no tratamento da Doença de Chagas. As análises in silico e docking mostraram que a Quercetina apresenta afinidade pelo sítio de ligação da GAPDH e provavelmente impede a ligação do NAD+, um cofator necessário para a atividade enzimática; e afinidade pelo sítio ligação do Mn2+ e da L- arginina em Arginase, provavelmente impedindo a atividade catalítica da enzima.
Palavras-chave: Doença de Chagas, Ancoragem Molecular, Reposicionamento de fármaco.
ABSTRACT
The present study aimed to analyze the in silico and in vitro activity of Quercetin against Trypanosoma cruzi, Chagas disease parasite, and specifically the focus are: to analyze in silico the mechanisms of interaction of Quercetin with T. cruzi GAPDH and Arginase enzymes; to analyze in vitro the effect of Quercetin application on T. cruzi in its epimastigote phase; to estimate the inhibitory concentration of 50% of Quercetin for T. cruzi in its epimastigote phase.
The first line of research to be established was the application of the drug in vitro. Thus, with the drug Quercetin obtained, pilot activity tests against T. cruzi began. This drug is in the form of a yellowish crystalline powder and, after application on parasite culture in LIT (Liver Infusion Tryptose) medium, it was noted that quercetin is practically insoluble in water, forming a large presence of precipitate. Quercetin dilution tests were conducted using different concentrations of PEG 400. Concentrations of 1, 2, and 4% exhibited good drug solubilization and bioavailability. Thus, Quercetin IC50 values and different control group formulations containing Benznidazole can be obtained. Quercetin (IC50 = 1.627 mM) was less efficient in causing T. cruzi death than control groups, but still has the potential to be included in the portfolio of compounds to be used in the treatment of Chagas disease. In silico and docking analysis showed that Quercetin exhibits affinity for the GAPDH binding site and probably prevent binding of NAD+, a cofactor necessary for enzymatic activity; and affinity for the binding site of Mn2+ and L-arginine in Arginase, probably preventing the catalytic activity of the enzyme.
Keywords: Chagas Disease, Molecular Docking, Drug repositioning.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo evolutivo de Trypanosoma cruzi……….22 Figura 2 – Representação esquemática do fármaco Benzonidazol………25 Figura 3 – Representação esquemática do fármaco Nifurtimox………26 Figura 4 – Citotoxicidade de Espécies Reativas de Oxigênio e nitrogênio contra Trypanosoma cruzi………..30 Figura 5 – Representação esquemática das vias metabólicas dependentes de
Arginase-1 e Óxido Nítrico Sintase 2………...31 Figura 6 – Representação esquemática do fármaco Quercetina………32 Figura 7 – Arginase de L. (L.) amazonensis com estruturas ancoradas de quercetina……….33 Figura 8 – Exemplificação de organização dos fármacos em placa de 96 poços……37 Figura 9 – IC50 dos grupos controle e tratamento para T. cruzi gerados a partir do software GraphPad Prism v.8.2.0……….44 Figura 10 – Ancoragem de Quercetina e NAD+ em GAPDH de T. cruzi………48 Figura 11 – Qualidade dos aminoácidos de XP_817254.1 de acordo com a semelhança local prevista para o alvo obtido através do software SWISS-MODEL…51 Figura 12 – Gráfico de Ramachandran obtido através do software SWISS-
MODEL………...52 Figura 13 – Gráfico de comparação com estruturas não redundantes submetidas no PDB obtido através do software SWISS-MODEL………...53 Figura 14 – Ancoragem de Quercetina em Arginase de T. cruzi……….54
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Efeito do Polietilenoglicol (PEG) 400 nas concentrações de 0 (Controle),
1, 2 e 4% em culturas de Trypanosoma
cruzi………...41 Gráfico 2 – Comparação da atividade dos fármacos Benzonidazol e Quercetina em
diferentes concentrações, na presença ou ausência de reagentes de diluição (PEG e DMSO) em culturas de Trypanosoma cruzi………….42
LISTA DE MAPAS
Mapa 1 – Distribuição Geográfica da Doença de Chagas no mundo………...20
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Dimensões da caixa da Quercetina em GAPDH de T. cruzi utilizando o software Chimera v. 1.13.1………..39 Quadro 2 – Dimensões da caixa do NAD+ em GAPDH de T. cruzi utilizando o software Chimera v. 1.13.1………..39 Quadro 3 – Dimensões da caixa da Quercetina em Arginase (XP_817254.1) de T.
cruzi utilizando o software AutoDock Vina v. 1.1.2……….40 Quadro 4 – Resultado do docking da Quercetina em GAPDH de T. cruzi utilizando o software Chimera v. 1.13.1………..46 Quadro 5 – Resultado do docking do NAD+ em GAPDH de T. cruzi utilizando o software Chimera v. 1.13.1………..47 Quadro 6 – Dados do resultado de predição do software I-TASSER para a sequência de Arginase………..50 Quadro 7 – Resultados obtidos referentes às estruturas de Arginase utilizando MolProbity v. 4.4……….50 Quadro 8 – Resultado do docking da Quercetina em Arginase (XP_817254.1) de Trypanosoma cruzi utilizando o software AutoDock Vina v. 1.1.2……..53
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Mudanças na mortalidade, prevalência e incidência por transmissão vetorial da Doença de Chagas em 21 países endêmicos da América Latina, nos anos de 1990, 2000, 2006 e 2010………...21 Tabela 2 – Dados do resultado do alinhamento local no programa BLAST para a sequência de Arginase………..49
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ala Alanina
Arg Arginina
Asn Asparagina
Asp Ácido Aspártico
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BNZ Benzonidazol
Ca2+ Íon Cálcio
CADD Desenho de Medicamentos Auxiliado por Computador CAMD Desenho Molecular Assistido por Computador
CCC Cardiopatia Chagásica Crônica DMSO Dimetilsulfóxido
DR Reposicionamento de Fármacos
ECG Eletrocardiograma
ERO Espécie Reativa de Oxigênio
GAPDH Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase
Gln Glutamina
Glu Ácido Glutâmico
FDA Food and Drug Administration FCI Forma Crônica Indeterminada H2O2 Peróxido de Hidrogênio IC50 Concentração Inibitória 50%
Ile Isoleucina
iNOX Óxido Nítrico Sintase Induzível
K+ Íon Potássio
LIT Liver Infusion Tryptose L. amazonensis Leishmania amazonensis L. donovani Leishmania donovani
Mg2+ Íon Magnésio
Mn2+ Íon Manganês
Na+ Íon Sódio
NAD+ Dinucleótido de Nicotinamida e Adenina NCBI National Center for Biotechnology Information
NFX Nifurtimox
NO Óxido Nítrico
NOS2 Óxido Nítrico Sintase 2
NTR I Nitroredutase Tripanossomal Tipo I O2- Ânion Superóxido
OMS Organização Mundial da Saúde
PDB Protein Data Bank
PEG Polietilenoglicol
PME Particle-Mesh Ewald
Pro Prolina
QUE Quercetina
RMSD Desvio Quadrático Médio RMFD Flutuação Quadrática Média
Ser Serina
Sinan Sistema de Informação de Agravos de Notificação SBDD Desenho de Fármacos Baseados em Estrutura
Thr Treonina
Tyr Tirosina
T. infestans Triatoma infestans T. cruzi Trypanosoma cruzi
UFERSA Universidade Federal Rural do Semi-Árido
Val Valina
LISTA DE SÍMBOLOS
@ Arroba
© Copyright
® Marca registrada
µ Micro
% Porcentagem
$ Cifrão
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ………. 18
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ………... 20
2.1 Doença de Chagas ……….……… 20
2.2 Ciclo de Vida Parasitária ………. 21
2.3 Fases da Doença de Chagas ….……… 22
2.3.1 Fase Aguda ………. 22
2.3.2 Fase Crônica ………... 23
2.4 Tratamentos ……….. 23
2.4.1 Forma Crônica Indeterminada ……… 23
2.4.2 Cardiopatia Chagásica Crônica ……….. 24
2.4.3 Forma Digestiva Chagásica ……….... 24
2.4.4 Antiparasitário …………..……….. 24
2.4.4.1 Benzonidazol ..………..……….. 24
2.4.4.2 Nifurtimox ……....……….. 25
2.4.5 Transplante ………. 26
2.5 Novas Abordagens ……… 26
2.5.1 Desenho de Fármacos ...……….. 27
2.5.2 Reposicionamento de Fármaco ….………... 28
2.6 Estresse Celular ………. 28
2.6.1 Resposta Celular ………. 28
2.6.2 Estresse Oxidativo ………... 29
2.6.3 Mecanismo Antioxidante de T. cruzi ……….. 29
2.7 Quercetina ………. 31
3 OBJETIVOS DA PESQUISA ………. 35
3.1 Objetivo Geral ……….. 35
3.2 Objetivos Específicos ……… 35
4 MATERIAIS E MÉTODOS …...……… 36
4.1 Cultivo e Manutenção dos Parasitos ……… 36
4.2 Ensaio de Diluição ………. 36
4.3 Aplicação da Quercetina ………... 37
4.4 Montagem in silico e Ancoragem ………. 38
4.5 Análises Estatísticas ……….. 40
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ……….. 41
5.1 Ensaio de Diluição ………. 41
5.2 Viabilidade Parasitária ………. 43
5.3 Análises in silico ………. 46
5.3.1 GAPDH ………... 46
5.3.2 Arginase ……….. 49
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ………... 55
REFERÊNCIAS ……… 56
18
1 INTRODUÇÃO
A Tripanossomíase Americana, popularmente chamada de Doença de Chagas, é uma antropozoonose causada pelo hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Considerada uma Doença Tropical Negligenciada, a Doença de Chagas é endêmica em 21 países das Américas, atingindo desde o México até Argentina e Chile. Segundo a OMS (Organização Mundial de Saúde), existem cerca de 6 a 7 milhões de pessoas infectadas em todo o mundo, sendo a maioria na América Latina (DIAS et al., 2016).
A transmissão primária em humanos e outros vertebrados é causada pelo contato da pele ou mucosas com fezes e urina de insetos hematófagos da família Reduviidae, subfamília Triatominae, contaminados por T. cruzi (DNDI, 2018). Os insetos vetores crescem e multiplicam-se em fendas das paredes, buracos em telhados, debaixo ou atrás de móveis, quadros e outros pontos das residências, principalmente de barro e tijolo cru, além de telhados de palha ou junco. São insetos hematófagos, de hábitos noturnos e geralmente realizam repasto sanguíneo na região da face, pois é mais acessível durante o sono por permanecer descoberta.
Diante disso, esses animais são comumente chamados de “barbeiros” (DE REZENDE e RASSI, 2008).
Além do mecanismo clássico de transmissão vetorial, as outras formas de transmissão são por transfusão sanguínea, transplante de órgãos, bem como transmissões congênitas, orais e acidentais (SOUZA, 2013). A transmissão por via oral é considerada também como mecanismo primário, em especial no ciclo silvestre, pois é ocasionada pela ingestão de alimentos contaminados com fezes e urina (BRENER et al., 2000).
Com o controle da transmissão vetorial da Doença de Chagas no Brasil por seu principal vetor, Triatoma infestans (T. infestans), a transmissão oral de T. cruzi vem ampliando a sua relevância epidemiológica, em especial nos contextos da Região Amazônica. O Ministério da Saúde contabilizou 112 surtos no território nacional entre 2005 e 2013, envolvendo em sua totalidade 35 municípios da Região Amazônica. A fonte provável de infecção foi a ingestão de alimentos contaminados com T. cruzi, entre eles: açaí, bacaba, jaci (coquinho), caldo de cana e palmito de babaçu (DIAS et al., 2016).
Após a invasão, os parasitos adentram na corrente circulatória e podem atingir outras células de qualquer tecido ou órgão para cumprir novo ciclo celular. Em seguida, a fase inicial da Doença de Chagas pode ocorrer de forma assintomática ou oligossintomática devido ao número reduzido de parasitos invasores. As principais manifestações sistêmicas na fase aguda são febre, mal-estar, taquicardia, linfadenopatia, esplenomegalia, hepatomegalia e edema. Na
19
fase crônica a sintomatologia torna-se mais grave: o paciente apresenta lesões no coração, no sistema digestório e no sistema nervoso central e periférico (SOUZA, 2013).
Apenas dois medicamentos são voltados ao tratamento da Doença de Chagas: o Benzonidazol e o Nifurtimox. Contudo, um das grandes limitações desses medicamentos é sua ineficácia na eliminação de parasitos durante a fase crônica da doença, além de apresentarem diversos efeitos adversos, que envolvem desde manifestações digestivas a alterações psicológicas (SOUZA, 2013). Portanto, o desenvolvimento e utilização de novos fármacos faz- se necessário para ampliar o portifólio de compostos a serem utilizados durante as diversas fases do tratamento.
Desse modo, o objetivo do presente estudo consistiu em aplicar um composto promissor, a Quercetina, em culturas de T. cruzi, avaliando seus efeitos in vitro e in silico, de forma a verificar se este fármaco possui potencial para causar a morte do parasita.
20
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Doença de Chagas
O protozoário e a Doença de Chagas foram descobertos e descritos pelo cientista Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas. O pesquisador, em 1909, identificou o agente etiológico, T.
cruzi, sua biologia no hospedeiro vertebrado e invertebrado, seus reservatórios e diversos aspectos da patogenia e sintomatologia pertinentes a fase aguda da doença (NEVES et al., 2016).
A Doença de Chagas representa uma condição infecciosa (com fase aguda ou crônica) classificada como enfermidade negligenciada pela OMS. A distribuição espacial da doença é limitada primariamente ao continente americano por conta da presença de, aproximadamente, 140 espécies do inseto vetor (Triatominae, Hemiptera, Reduviidae), dessa forma, sendo intitulada “tripanossomíase americana”. Entretanto, gradualmente a doença está alcançado países não endêmicos, mediante o deslocamento de pessoas infectadas e por meio de outros mecanismos de transmissão, como resultado do intenso processo de migração internacional (Mapa 1) (DIAS et al., 2016).
Mapa 1. Distribuição Geográfica da Doença de Chagas no mundo.
Países Endêmicos
Países Não-endêmicos, mas presente
Fonte: Adaptado de DNDI, 2018.
21
A OMS estima em aproximadamente 6 a 7 milhões o número de pessoas infectadas em todo o mundo, a maioria na América Latina. Estimativas recentes para 21 países latino- americanos, com base em dados até 2010 (Tabela 1), indicam 5.742.167 pessoas infectadas por T. cruzi, onde se destacam a Argentina (1.505.235), o Brasil (1.156.821) e o México (876.458), seguidos da Bolívia (607.186) (DIAS et al., 2016).
Tabela 1. Mudanças na mortalidade, prevalência e incidência por transmissão vetorial da Doença de Chagas em 21 países endêmicos da América Latina, nos anos de 1990, 2000, 2006 e 2010.
Parâmetros - estimativas 1990 2000 2006 2010 Número de mortes/ano >45.000 21.000 12.500 12.000 Número de pessoas infectadas 30.000.000 18.000.000 15.000.000 5.742.167 Casos novos/ano - transmissão
vetorial
700.000 200.000 41.200 29.925
População total sob risco 100.000.000 40.000.000 28.000.000 70.199.360
Fonte: DIAS et al., 2016.
2.2 Ciclo de Vida Parasitária
O ciclo biológico no hospedeiro vertebrado é estabelecido pelas formas amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas interagindo com as células do hospedeiro, entretanto, apenas as formas epimastigotas não são capazes de nelas se desenvolver e multiplicar. O ciclo de vida detalhado está descrito na Figura 1 (NEVES et al., 2016).
No entanto, de acordo com dados de anos recentes do Sinan (Sistema de Informação de Agravos de Notificação, de 2000 a 2013), verificou-se que a forma de transmissão oral foi a mais frequente em todos os anos (1.081, 68,9%), seguida pela transmissão vetorial em 100 casos (6,4%). Esta mudança nos padrões epidemiológicos de transmissão da Doença de Chagas no país também tem sido gerada como resultado das ações de controle empreendidas há quatro décadas, acompanhadas por importantes mudanças ambientais, demográficas, econômicas e sociais, além da maior concentração da população em áreas urbanas (DIAS et al., 2016).
22
Figura 1. Ciclo evolutivo de Trypanosoma cruzi: (1) Um inseto vetor triatomíneo infectado ao alimenta-se de sangue, elimina pelas fezes e urina, tripomastigotas próximo do local da picada. Os tripomastigotas entram no hospedeiro através do ferimento da picada ou por mucosas intactas. (2) Dentro do hospedeiro, os tripomastigotas invadem células próximas ao ponto de entrada onde diferenciam-se nas formas intracelulares, os amastigotas. (3) Os amastigotas multiplicam-se por divisão binária. (4) Então diferenciam-se em tripomastigotas e são liberados na circulação sanguínea. Os tripomastigotas infectam células de uma grande variedade de tecidos e transformam- se em amastigotas intracelulares, num ciclo infectante contínuo. (5) O triatomíneo infecta-se ao ingerir sangue de um hospedeiro vertebrado contendo parasitos circulantes. (6) Os tripomastigotas ingeridos transformam-se em epimastigotas no intestino médio do vetor. (7) Multiplicando-se por divisão binária. (8) No intestino posterior o parasito se diferencia na forma infectante, o tripomastigota metacíclico.
Fonte: Adaptado de CDC, 2019.
2.3 Fases da Doença de Chagas
2.3.1 Fase Aguda
Após a infecção pelo T. cruzi no hospedeiro, a fase inicial pode ocorrer de forma assintomática ou oligossintomática devido ao número reduzido de parasitos invasores. As principais manifestações sistêmicas na fase aguda são febre, mal-estar, taquicardia, linfadenopatia, esplenomegalia, hepatomegalia e edema (SOUZA, 2013).
23
2.3.2 Fase Crônica
A fase crônica pode levar de 10 a 30 anos para se manifestar e sua sintomatologia é mais grave: o paciente apresenta lesões no coração, no sistema digestório e no sistema nervoso central e periférico (SOUZA, 2013).
No entanto, anteriormente, muitos pacientes apresentam uma Fase Indeterminada, também chamada Latente ou Pré-Clínica. Nesse estágio a pessoa não apresenta manifestações clínicas da doença, como ausência de sinais e sintomas, exames radiográficos normais do tórax, esôfago e cólon, assim como o eletrocardiograma (ECG); enquanto seus testes parasitológicos e sorológicos são positivos (SOUZA, 2013).
A forma cardíaca é a manifestação da Doença de Chagas crônica mais grave e frequente, desenvolvendo-se entre 20% a 30% dos pacientes sintomáticos na fase aguda. Apresenta os seguintes sintomas: arritmia, falência cardíaca, tromboembolia (sistêmica ou pulmonar) e cardiomegalia. A forma digestiva é caracterizada por alterações nas funções motora de secreção e absorção do trato gastrointestinal, causando a formação de megaesôfago e megacólon. Esta forma se manifesta em cerca de 10% a 15% dos pacientes sintomáticos. Há também a forma cardiodigestiva (associação entre formas cardíacas e digestivas), porém sua prevalência é em geral desconhecida ou muito baixa (SOUZA, 2013).
2.4 Tratamentos
2.4.1 Forma Crônica Indeterminada
A Forma Crônica Indeterminada (FCI) tem particular relevância, por ser a forma clínica de maior prevalência na Doença de Chagas, além do evidente caráter benigno e do baixo potencial evolutivo em curto e médio prazos (SOUZA, 2013).
O tratamento antiparasitário específico é indicado para todos os casos com FCI.
Enquanto o ECG estiver normal, o prognóstico dos casos com Doença de Chagas na FCI é semelhante ao da população geral, sendo que a realização desse exame de maneira seriada pode detectar a evolução para a forma cardíaca (DIAS et al., 2016).
24
2.4.2 Cardiopatia Chagásica Crônica
A Cardiopatia Chagásica Crônica (CCC) é a forma clínica sintomática mais prevalente da Doença de Chagas, responsável pela elevada carga de morbimortalidade, com grande impacto social e médico-trabalhista (DIAS et al., 2016).
O manejo farmacológico da cardiopatia chagásica aguda é semelhante ao proposto para o tratamento da insuficiência cardíaca em miocardites agudas de outras etiologias, sendo baseado na utilização rotineira da combinação de três tipos de fármacos: diuréticos, inibidores da enzima de conversão da angiotensina ou bloqueadores do receptor AT1 da angiotensina II e betabloqueadores, sempre associados ao tratamento específico da infecção por T. cruzi com benzonidazol ou nifurtimox (DIAS et al., 2016).
2.4.3 Forma Digestiva Chagásica
A forma digestiva da Doença de Chagas, mesmo afetando diversos órgãos do trato gastrointestinal, manifesta-se, do ponto de vista prático, pelo acometimento do esôfago e do intestino grosso, levando ao aparecimento de megaesôfago e megacólon, respectivamente (SOUZA, 2013). Sendo o tratamento realizado mediante aplicação de medicamentos para controle do aparelho digestivo, lavagens ou cirurgia (DIAS et al., 2016).
2.4.4 Antiparasitário
Dois medicamentos são utilizados no tratamento parasitário da Doença de Chagas: o Benzonidazol (BNZ) e o Nifurtimox (NFZ). Contudo, mesmo sendo utilizados há cerca de 50 anos, alguns dos seus mecanismos de ação foram elucidados recentemente (SOUZA, 2013).
2.4.4.1 Benzonidazol
O Benzonidazol [N-benzil-2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)acetamida] (Figura 2), o medicamento mais utilizado no Brasil é, na verdade, um pró-fármaco que requer ativação por nitroredutase tripanossomal tipo I (NTR I), uma enzima encontrada em alguns parasitos protozoários, mas não em humanos (KEENAN e CHAPLIN, 2015). Entretanto, outras investigações indicaram que o principal impacto metabólico do BNZ foi para a via glutationa (e tripanotiona), de tal forma que sua ligação covalente com tióis de baixo peso molecular, bem
25
como com tióis proteicos foi o principal modo de ação do fármaco contra T. cruzi (TROCHINE et al. 2014).
Figura 2. Representação esquemática do fármaco Benzonidazol.
Fonte: MANDELL et al., 2015.
Uma alta porcentagem de pacientes com infecções agudas responde com sucesso ao BNZ, especialmente crianças que toleram o fármaco muito melhor do que os adultos. A eficácia clínica do BNZ em pacientes crônicos é controversa, e estudos de comparação entre laboratórios são dificultados por diferenças técnicas, altas taxas de reinfecção em áreas endêmicas e a natureza heterogênea do parasito (KEENAN e CHAPLIN, 2015).
Considerando todos esses aspectos, o BNZ ainda é considerado seguro para o tratamento de pacientes chagásicos crônicos, visto que nenhuma morte foi atribuída ao seu uso, e os benefícios do tratamento para reduzir a carga parasitária e prevenir a progressão para doença crônica em estágio avançado são defendidos (KEENAN e CHAPLIN, 2015). No entanto, a alta incidência de efeitos colaterais, como hipersensibilidade (dermatite, edema generalizado, aumento de gânglios e dores musculares e articulares) depressão da medula óssea e polineuropatia periférica; exige controle com o uso de diferentes medicamentos: anti- histamínicos, corticosteroides, entre outros (SOUZA, 2013).
2.4.4.2 Nifurtimox
O Nifurtimox (Figura 3), ou [(E)-N-(3-metil-1,1-dioxo-1,4-tiazinan-4-il)- 1-(5- nitrofuran-2-il)metanimina] é um nitrofurano que envolve a produção de um radical livre nitro- aniônico, que na presença de oxigênio impede a capacidade do parasito de desintoxicar os radicais livres (COURA e BORGES-PEREIRA, 2012). Dentre seus efeitos colaterais, os
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gastrointestinais ocorrem em até 70% dos pacientes, e incluem anorexia, perda de peso, dores de barriga, diarreia, náuseas e vômitos; além de causar efeitos tóxicos neurológicos, como irritabilidade, insônia, desorientação e tremores (BERN, 2015). Atualmente o NFZ é utilizado predominantemente na América Central (SOUZA, 2013).
Figura 3. Representação esquemática do fármaco Nifurtimox.
Fonte: MANDELL et al., 2015.
2.4.5 Transplante
Como não há tratamento capaz de reverter a evolução da doença o transplante cardíaco torna-se a única opção. Entretanto, o transplante do coração é um procedimento de alto custo econômico e alto índice de fracasso, não sendo uma opção acessível a todos os pacientes (DINARDI et al., 2015).
2.5 Novas Abordagens
Devido ao quadro atual de medicamentos voltados ao tratamento de pacientes chagásicos (principalmente em casos crônicos) há necessidade evidente do desenvolvimento de novos fármacos que demonstrem melhor eficiência, além de uma menor quantidade e gravidade de efeitos colaterais, o que muitas vezes provoca o abandono do tratamento pelo paciente (DNDI, 2018).
Nesse contexto, novas abordagens estão sendo investigadas, como inibidores da enzima conversora de angiotensina, bloqueadores dos receptores beta-alfa-adrenérgicos, espironolactona, digital, compostos diuréticos, alopurinol, amiodarona e dronedarona, auranofina, quercetina, SQ109, entre outros (SOUZA, 2013). Os compostos citados anteriormente podem atingir vias essenciais para manutenção da vida do parasito como:
bloqueio de canais iônicos (como nos canais de K+, Na+ e Ca2+) (ZHANG et al., 2016);
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diminuição da produção de ácido úrico (BRENER et al., 2000); potencial interno da membrana plasmática e mitocondrial (Δψm) (VEIGA-SANTOS et al., 2015); assim como interferência na síntese de ergosterol (SOUZA, 2013).
2.5.1 Desenho de Fármacos
A partir dos anos 80, o uso de computadores foi estendido do manuseio de dados para contribuir na descoberta e desenvolvimento de medicamentos. O uso de computadores no campo da pesquisa farmacêutica é tipicamente designado como Desenho de Medicamentos Auxiliado por Computador (Computer-Aided Drug Design - CADD); também conhecido como Desenho Molecular Assistido por Computador (Computer-Assisted Molecular Design - CAMD). Os métodos de CADD surgiram como uma ferramenta eficaz para descobertas de fármacos (HASSAN BAIG et al., 2016).
O desenho racional de fármacos é uma abordagem geral que utiliza a técnica de estrutura proteica, na qual a descoberta de um ligante pode ser conduzida por casualidade, rastreio ou teoria racional. Esta técnica se tornou amplamente utilizada para diminuir o número de potenciais compostos medicinais de uma grande biblioteca, prevendo quais serão inativos e ativos. Dessa forma, esse método requer um custo e um tempo substancialmente menor para triagem de alta taxa de transferência sem comprometer a qualidade da descoberta (VAN ANTWERPEN e ZOUAOUI BOUDJELTIA, 2015).
A associação de ligantes ao receptor pode ocorrer por meio de interações hidrofóbicas, eletrostáticas e pontes de hidrogênio. Existem dois tipos principais de técnicas de desenho de fármacos: Desenho de Fármacos Baseados em Estrutura (Stucture-Based Drug Design - SBDD), usado quando as estruturas tridimensionais das proteínas alvo estão disponíveis; e Desenho de Fármacos Baseado em Ligantes (Ligand-Based Drug Design - LBDD), empregado nos casos em que as estruturas são desconhecidas (HASSAN BAIG et al., 2016).
O CADD apresenta as diversas vantagens na descoberta de medicamentos como economia de custos; tempo de inserção no mercado, pois o poder preditivo do CADD facilita a seleção de candidatos mais promissores, evitando, que tempo seja desperdiçado em compostos sem saída; melhor visão, um dos benefícios intangíveis de CADD é o profundo conhecimento que os pesquisadores adquirir em interações dos receptores de fármacos (HASSAN BAIG et al., 2016).
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2.5.2 Reposicionamento de Fármaco
A pesquisa e o desenvolvimento de fármacos é um processo complicado, dispendioso e caro. Geralmente, são necessários de 10 a 15 anos de pesquisa e de 0,8 a 1,5 bilhões de dólares para levar uma fármaco do conceito abstrato ao produto comercializado. Todos os anos, aproximadamente 90% dos medicamentos falham durante as avaliações do Food and Drug Administration (FDA), impedindo seu uso na terapia real (LOTFI SHAHREZA et al., 2017).
Nesse contexto, o Reposicionamento de Fármacos (Drug Repositioning - DR) busca descobrir novos usos para os medicamentos existentes, com segurança humana estabelecida e demonstrada. O DR é aplicado principalmente para encontrar novos usos para medicamentos existentes ou com falha, que estabeleceram perfis de segurança e farmacocinéticos. A vantagem da abordagem de reposicionamento é que esta ultrapassa muitos dos testes de pré-aprovação essenciais para compostos terapêuticos recentemente desenvolvidos. Esse processo pode encurtar o ciclo de desenvolvimento do fármaco para até 3 anos para um medicamento reposicionado (LOTFI SHAHREZA et al., 2017).
2.6 Estresse Celular
Existem muitos tipos diferentes de estresse e a resposta que uma célula tem para lidar com essas condições dependerá do tipo e do nível de injúria. Assim, respostas de defesa tais como a resposta ao choque térmico, distúrbios mecânicos, drogas, infecções, entre outros, medeiam um aumento na atividade de proteínas acompanhantes que aumenta a capacidade de dobragem da proteína da célula, neutralizando assim o estresse e promovendo a sobrevivência da célula. Dessa forma, a capacidade adaptativa de uma célula determina seu destino (MENNA- BARRETO, 2019).
2.6.1 Resposta Celular
Após a exposição ao estresse celular, a homeostase fisiológica está alterada.
Dependendo do tipo de estresse celular e sua gravidade, a resposta da célula pode ser múltipla:
diferentes mecanismos de defesa e estratégias de preservação podem ser montados. Logo, se o estímulo de estresse não ultrapassa um certo limite, a célula pode lidar com ele montando uma resposta celular protetora apropriada, que garanta a sobrevivência da célula. Contudo, se o agente estressante é muito potente, a incapacidade de ativar ou manter uma resposta protetora
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resulta na ativação de cascatas de sinalização de estresse que eventualmente alimentam os caminhos da morte celular (FULDA et al., 2010).
2.6.2 Estresse Oxidativo
A sobrevivência celular requer proporções apropriadas de oxigênio molecular e vários antioxidantes. O estresse oxidativo ocorre quando há um distúrbio no equilíbrio entre pró- oxidante e antioxidante tem sido implicado em vários processos biológicos e patológicos.
Embora a maioria dos eventos oxidativos possa ser superada pelas defesas naturais da célula, o desequilíbrio pode resultar em morte celular apoptótica ou necrótica (FULDA et al., 2010).
Produtos reativos de oxigênio estão entre as ameaças mais potentes e onipresentes enfrentadas pelas células. Estes incluem EROs (Espécies Reativas de Oxigênio) tais como o ânion superóxido (O2• −
), peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio singlete, radical hidroxilo (OH•), radical peróxi, bem como o óxido nítrico (NO•) que pode reagir com O2• − para formar peroxinitrito (ONOO−) (Figura 4) (BURTON e JAUNIAUX, 2011).
2.6.3 Mecanismo Antioxidante de T. cruzi
As defesas antioxidantes em T. cruzi dependem de um sistema sofisticado de vias ligadas nas quais os equivalentes redutores do NADPH (derivados da via das pentoses fosfato) são administrados a uma variedade de sistemas de desintoxicação enzimática através do ditiol tripanotiona [T(SH)2, N1,N8-bisglutationilpermidina] e a tioredoxina homóloga triparedoxina (TXN; Figura 4). A tripanotiona é sintetizada em duas etapas sequenciais em que duas moléculas de glutationa (GSH) são ligadas covalentemente aos grupos NH2 terminais da espermidina por uma única enzima citosólica chamada T. cruzi tripanotiona sintetase (TcTS) (PIACENZA et al., 2013).
Cinco peroxidases distintas foram identificadas em T. cruzi, diferindo em sua localização subcelular e especificidade do substrato. A glutationa peroxidase-I (TcGPXI, localizada no citosol e glicossoma) e a TcGPXII (localizada no retículo endoplasmático) conferem resistência a hidroperóxidos hidro e lipídicos, respectivamente, e utilizam GSH e/ou TXN como substratos redutores. Além destas, T. cruzi contém quatro superóxidos dismutase de ferro (FeSODs) que desintoxicam o O2 gerado no citosol (TcSODB1), glicossomas (TcSODB1-2) e mitocôndrias (TcSODA e C) (PIACENZA et al., 2013).
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Figura 4. Citotoxicidade de Espécies Reativas de Oxigênio e nitrogênio contra Trypanosoma cruzi. O ânion peroxinitrito (ONOO−), formado a partir da reação controlada por difusão entre •NO e radical superóxido (O2•−), está em equilíbrio com o ácido peroxinitrito (ONOOH). A citotoxicidade do peroxinitrito pode surgir pela reação direta via oxidação de dois elétrons, bem como por radicais derivados secundários via processos de oxidação de um elétron. As oxidações de dois elétrons incluem a reação com tióis de baixo peso molecular [RSH, T(SH)2], levando aos correspondentes derivados sulfênicos (R-SOH) e dissulfeto (R-SS-R, TS2). As vias radicais dependem (i) da homólise da ONOOH para os radicais dióxido de nitrogênio (•NO2) e hidroxila (•OH); (ii) a reação de ONOO− com dióxido de carbono (CO2) que produz carbonato (CO3•−) e •NO2 radicais; e (iii) a reação de ONOO− com centros de metal de transição (Me) produzindo •NO2 e o correspondente complexo oxo-metálico (Me=O). A relevância quantitativa das diferentes vias de reação em compartimentos específicos de células / tecido foi analisada em outro lugar. •NO2, CO3•−, •OH e Me=O podem oxidar a proteína tirosina no radical tirosil (•Tyr) e cisteína em radicais tiílo (R-S•). Os radicais tirosilo ou dimerizam para formar 3,3’-di-tirosina ou na presença de
•NO2 reagem para formar proteína-3-nitrotirosina. Os radicais tiílicos podem formar dissulfuretos mistos ou reagir com o O2 para produzir estados de oxidação mais elevados do enxofre (respectivamente ácidos R-SO2H, R-SO3H sulfínico e sulfônico). Diferentes alvos parasitos para •NO, O2•−, ONOO− e seus radicais secundários derivados foram identificados no T. cruzi, incluindo a inibição da citocromo c oxidase, aconitase, enzimas das vias metabólicas [succinato desidrogenase e NADH-fumarato redutase], superóxido dismutase de ferro mitocondrial (FeSODA) e Ca2+-ATPase.
Fonte: Adaptado de PIACENZA et al., 2013.
Succinato DH NADH-Fumarato RED
Citocromo c oxidase Aconitase Ca2+-ATPase
FeSODA
Modificações nitroxidativas Proteína, DNA, lipídios
Vias de radicais
Oxidações de dois elétrons
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A Arginase também é uma enzima essencial para o parasito evitar o estresse oxidativo.
Ela direciona o consumo de L-arginina para a síntese de poliaminas, evitando o seu uso na produção de NO (Figura 5). As poliaminas (agmatina, putrescina, espermidina e espermina) são aminas alifáticas de baixo peso molecular que são amplamente distribuídas entre as espécies e servem às funções durante a proliferação celular, diferenciação e síntese de macromoléculas (PELUFFO et al., 2004).
Fonte: Adaptado de BRONTE eZANOVELLO, 2005.
2.7 Quercetina
A Quercetina [2-(3,4-dihidroxifenil)-3,5,7-trihidroxicromen-4-ona] (Figura 6) é um composto flavonóide polifenólico mais comum presente nas plantas, e pode ser absorvido pelos seres humanos. Ela possui uma ampla gama de efeitos biológicos relatados, incluindo atividade antioxidante, anti-hipertensiva, antiinflamatória, antimicrobiana e antiprotozoária (FONSECA- SILVA et al., 2011), embora o mecanismo molecular de ação da Quercetina ainda não tenha sido demonstrado, é sabido que pode induzir a produção de ânion superóxido (O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e outras EROs.
Figura 5. Representação esquemática das vias metabólicas dependentes de Arginase-1 e Óxido Nítrico Sintase 2.
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Figura 6. Representação esquemática do fármaco Quercetina.
Fonte: ANDRES et al., 2018.
Em testes in vitro, a Quercetina exibiu efeito antileishmanial sobre promastigotas de Leishmania amazonensis (L. amazonensis) devido à geração de EROs e à interrupção da função mitocondrial do parasito de maneira dose-dependente, tempo-dependente a partir das 48 horas de tratamento e com inibição máxima do crescimento observada às 96 horas. O IC50 para a Quercetina às 48 horas foi de 31,4 mM (FONSECA-SILVA et al., 2011). No estudo de Tasdemir e colaboradores (2006), seis flavonóides (luteolina, luteolina-7-O-glicosídeo, 3- hidroxiflavona, fisetina, quercetina e miricetina) foram testados in vivo com camundongos BALB/c infectados com a Leishmania donovani (L. donovani cepa HU3). Apenas a Quercetina mostrou alguma atividade in vivo inibindo a infecção em 15,3%, enquanto todos os outros flavonóides foram completamente inativos. Em contrapartida, a Quercetina exigiu uma IC50
maior que 30 µg/mL contra T. cruzi.
A Quercetina também mostrou a ação descrita sob a enzima Arginase recombinante de Leishmania (Leishmania) amazonensis por da Silva e colaboradores (2012), sendo o valor de IC50 igual a 3,8 µM. Segundo da Silva e colaboradores (2012), a Quercetina é um inibidor misto tendo potencial de atuar de forma competitiva ou não. A análise de ancoragem desses flavonóis sugere que o grupo catecol dos três compostos interage com a Ácido Aspártico 129 (Asp129), que está envolvido na formação de pontes metálicas para os cofatores MnA2+ e MnB2+ no sítio ativo da Arginase (Figura 7). Estes resultados ajudam a elucidar o mecanismo de ação dos flavonóides leishmanicidas e oferecem novas perspectivas para o desenho de fármacos contra a infecção por Leishmania com base nas interações entre Arginase e flavonas.
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Fonte: DA SILVA et al., 2012.
A Quercetina está entre os compostos de produtos naturais previamente testados contra a forma tripomastigota do T. cruzi, com valores de IC50 de 771 µM. O valor de IC50 obtido de quercetina para inibição de GAPDH (Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase) de T. cruzi é de 142 µM (FREITAS et al., 2009).
Entretanto, segundo Andres e colaboradores (2018) verificaram em estudos de toxicidade crônica da Quercetina por via oral em ratos revelaram alguns efeitos adversos, como pesos corporais reduzidos, pesos de órgãos relativos, como rins e fígado, elevados em ambos os sexos.
Ao realizar a histopatologia renal, confirmou-se a exacerbação da nefropatia crônica progressiva, a indução de hiperplasia renal e o aumento de tumores renais nos grupos de dose média e alta de ratos machos. A nefropatia já foi aumentada pela alta dose de quercetina em investigações interinas de 6 e 15 meses. Os autores sugeriram que o desenvolvimento do tumor renal pode estar associado ou pode ser uma consequência da nefropatia crônica progressiva que ocorre apenas em ratos machos, provavelmente com pouca ou nenhuma relevância para a extrapolação para humanos (ANDRES et al., 2018). Contudo, a Quercetina aparenta ter a capacidade de exacerbar os efeitos adversos apenas em rins pré-lesados.
Além disso, especialmente nas doses elevadas de Quercetina, foi encontrada pigmentação amarelo-acastanhada no estômago glandular e no intestino, principalmente no intestino delgado, que poderia ser causada pelo próprio composto ou por um dos seus
Figura 7. Arginase de L. (L.) amazonensis com estruturas ancoradas de quercetina. Os átomos de manganês são representados por esferas de magenta.
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metabólitos, visto que o fármaco apresenta-se na forma de um pó cristalino de cor amarelada (ANDRES et al., 2018).
Considerando o exposto, o projeto tem como foco aplicar a Quercetina em culturas de epimastigotas de T. cruzi e avaliar in vitro o efeito do composto na sobrevivência do parasita, além de realizar um estudo in silico sobre os mecanismos de ligação do composto nas enzimas Arginase e GAPDH de T. cruzi.
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3 OBJETIVOS DA PESQUISA
3.1 Objetivo Geral
Analisar a atividade in silico e in vitro da Quercetina contra Trypanosoma cruzi em sua fase epimastigota.
3.2 Objetivos Específicos
● Desenvolver um protocolo de diluição para a Quercetina, de forma que o diluente não cause a morte do parasito;
● Analisar in vitro o efeito da aplicação da Quercetina sobre T. cruzi em sua fase epimastigota;
● Estimar a concentração inibitória de 50% da Quercetina para T. cruzi em sua fase epimastigota;
● Analisar in silico os mecanismos de interação da Quercetina com enzimas GAPDH e Arginase de T. cruzi.
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4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Cultivo e Manutenção dos Parasitos
As culturas de diferentes cepas de T. cruzi foram mantidas com meio LIT (Liver Infusion Tryptose) em tubos graduados do tipo Falcon com capacidade para 50 mL. O meio de cultura foi suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e 10 mL de antibiótico formado por penicilina/estreptomicina 100 U/mL (CAMAROO et al., 1964; RIBEIRO, 2010).
A manutenção e repique da cultura foi realizada quinzenalmente e visa manter os parasitos em fase log (exponencial ou de crescimento), ideais para execução do experimento e aplicação do tratamento.
4.2 Ensaio de Diluição
O potencial do Polietilenoglicol 400 (PEG 400) em diluir o fármaco foi testado em três diferentes concentrações: 1%, 2% e 4%. O PEG 400 foi aplicado diretamente às culturas nas respectivas concentrações para que as mesmas estabilizassem e fossem contabilizadas na fase log. As culturas foram mantidas em crescimento por pelo menos 15 dias na presença das concentrações de PEG 400. Em seguida, foram realizadas três passagens de meio visando aclimatar os parasitos.
De acordo com a porcentagem de pureza pode-se obter a osmolaridade teórica do PEG 400 para as diferentes concentrações utilizadas no presente trabalho. Primeiramente, foi calculada a concentração de PEG 400 provinda de fábrica, onde a Massa Molar média do PEG são 400g/mol e o volume da solução é de 1 litro:
M=m/MM·V M=9965/400·V M=24,9125 mol/L
Desse modo, a partir de uma relação simples se obtem a molaridade para 1% dessa solução:
99,65% ― 24,9125 mol/L 1% ― x
x = 0,25 mol/L
(1.1) (1.2) (1.3)
(2.1) (2.2)
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Por fim, de acordo com Schiller e colaboradores (1988), a medida que a molaridade do PEG 400 se altera na solução, sua osmolaridade muda de forma proporcional:
0,12 mol/L ― 120 mOsm/L 0,25 mol/L ― y
y = 250 mOsm/L
A viabilidade dos parasitos foi avaliada prévia e posteriormente a aplicação da Quercetina (SIGMA-ALDRICH) e, realizada contagem manual via câmara de Neubauer espelhada, para verificar se o PEG 400 apresenta atividade citotóxica. Desse modo, apenas parasitos viáveis (que exibem movimentação mínima) foram contabilizados.
4.3 Aplicação da Quercetina
Diante dos resultados obtidos a partir do Ensaio de Diluição, a análise da atividade da Quercetina in vitro contra o T. cruzi foi realizada em uma placa de 96 poços (Figura 8).
Figura 8. Exemplificação de organização dos fármacos em placa de 96 poços.
Fonte: Acervo pessoal.
De acordo com a literatura, a Quercetina possui potencial para inibir a Arginase (DA SILVA et al., 2012) e a GAPDH (FREITAS et al., 2009). Portanto, para o processo de inibição do crescimento parasitário foram estruturados quatro grupos: (1) um grupo controle negativo, (3.1) (3.2)
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onde não houve presença de nenhum tratamento, apenas houve diluição em meio LIT numa proporção de 1:10 para a contagem de parasitos viáveis em microscópio de campo claro; (2) o segundo grupo consistiu em um controle positivo, neste caso o Benzonidazol e 10% DMSO, fármaco amplamente aplicado no tratamento atual da Doença de Chagas; (3) o tratamento realizado com Quercetina em PEG 400 a 1% e; (4) tratamento com Benzonidazol e PEG 400 a 1%, visando controlar o experimento para fins comparativos.
Os grupos tratados foram divididos em cinco subgrupos com a premissa de diferentes concentrações dos fármacos testados: 2,0 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM e 0,125 mM (TASDEMIR et al., 2006). Da mesma forma, a viabilidade dos parasitos foi avaliada mediante contagem câmara de Neubauer espelhada. Apenas parasitos viáveis (que exibem movimentação mínima) foram contabilizados. Todos os dados foram coletados após 36 horas da aplicação dos tratamentos.
4.4 Montagem in silico e Ancoragem
Para realizar a montagem in silico das estruturas tridimensionais proteicas da GAPDH e da Arginase, foram utilizadas como base as sequências proteicas depositadas no PDB (Protein Data Bank - https://www.rcsb.org/).
A GAPDH de T. cruzi foi obtida a partir da estrutura depositada no banco de dados do PDB com o código 1K3T. Essa proteína se apresenta como um homotetrâmero onde as cadeias são representadas por uma entidade única de sequência de 359 aminoácidos. Esta estrutura foi submetida a um procedimento de remoção dos ligantes contidos na estrutura cristalizada. Com esta proteina final, foram realizados os ensaios de ancoragem molecular. A Ancoragem (Docking) utilizando a estrutura do ligante Quercetina às proteínas para estabelecer um complexo, a partir dos programas AutoDock Vina v. 1.1.2 (TROTT e OLSON, 2010) e UCSF CHIMERA v. 1.13.1 (PETTERSEN et al., 2004).
Essa estrutura da GAPDH foi utilizada para realizar a ancoragem da estrutura da Quercetina (PubChem 5280343). Os parâmetros para o docking da Quercetina estão descritos no Quadro 1.
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Quadro 1. Dimensões da caixa da Quercetina em GAPDH de T. cruzi utilizando o software Chimera v.1.13.1.
Caixa para Docking
Centro X Centro Y Centro Z
2.47113 -13.6553 28.8202
Dimensões X (Å) Dimensões Y (Å) Dimensões Z (Å)
38.3918 20.7101 17.0166
Da mesma forma, a GAPDH foi utilizada para realizar a ancoragem da estrutura do NAD+ (Dinucleótido de Nicotinamida e Adenina) do banco de dados PDB. Os parâmetros para o docking do NAD+ encontram-se descritos no Quadro 2.
Quadro 2. Dimensões da caixa do NAD+ em GAPDH de T. cruzi utilizando o software Chimera v. 1.13.1.
Caixa para Docking
Centro X Centro Y Centro Z
2.43634 -16.007 29.0966
Dimensões X (Å) Dimensões Y (Å) Dimensões Z (Å)
38.1326 17.1314 17.9807
No caso da estrutura de Arginase, parte da estrutura estava ausente do banco de dados do PDB, de código 2A0M. As regiões ausentes correspondiam a porções N-terminal da posição 1 até a posição 5 e o C-terminal da posição 303 até a posição 308. Considerando esta informação, foi realizada uma busca por sequências de proteinas de Arginase, a fim de obter a sequência completa, para isso foi utilizado o BLAST (KORF et al., 2003). A sequência completa XP_817254.1 foi identificada e submetida a modelagem das regiões N-terminal e C- terminal. Estas regiões foram obtidas na estrutura final usando o programa I-TASSER (YANG et al., 2015). As estruturas finais com melhor qualidade aferidas no programa MolProbity (CHEN et al., 2010) dentro do servidor do SWISS-MODEL (WATERHOUSE et al., 2018), e em seguida foram submetidas ao procedimento de ancoragem. Os parâmetros para o docking da Quercetina em Arginase estão descritos no Quadro 3.
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Quadro 3. Dimensões da caixa da Quercetina em Arginase (XP_817254.1) de T. cruzi utilizando o software AutoDock Vina v. 1.1.2.
Caixa para Docking
Centro X Centro Y Centro Z
76.463 56.187 55.408
Dimensões X (Å) Dimensões Y (Å) Dimensões Z (Å)
28.5 20.25 23.25
O ensaio de ancoragem foi realizado e visualizado com o auxílio do software UCSF CHIMERA v. 1.13.1 e PyMOL (DELANO et al., 2002). Foram estabelecidos padrões para construção da caixa de ancoragem para ambas as proteínas. A visualização dos sítios de interação foram visualizadas em um sistema 2D utilizando o software LigPlot v. 4.5.3 (WALLACE et al., 1995).
4.5 Análises Estatísticas
Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados obtidos foram incluídos em planilha eletrônica e gráficos fabricados a partir destes valores. Os dados foram submetidos ao teste de Shapiro-Wilk, um teste de normalidade para verificar se os mesmos são paramétricos ou não-paramétricos. Para realizar a comparação entre os grupos foi aplicado o teste ANOVA associado ao pós-teste T de Tukey aos dados, uma vez que os dados apresentaram-se paramétricos. Todos os dados foram analisados considerando o nível de significância igual a 5% (α=0,05).
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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Ensaio de Diluição
A Quercetina apresenta-se na forma de um pó cristalino, de cor amarelada e é praticamente insolúvel. O NaOH 1M (50 mg/mL) eleva sua solubilidade e é solúvel em 24 mg/mL de DMSO, de acordo com dados do fabricante. Contudo, o Hidróxido de Sódio (NaOH) corresponde a uma base forte, e poderia tornar o meio muito alcalino, causando a morte do parasito e levando a resultados falsos positivos, enquanto que 24 mg/mL (correspondente a aproximadamente 0,3 M) de DMSO é uma concentração tóxica para o T. cruzi (CEVALLOS et al., 2017).
O Polietilenoglicol (PEG) 400 mostrou-se como uma alternativa para a resolução da problemática da diluição. O PEG é o polímero formado a partir do etileno glicol. É uma substância frequentemente usada como marcador não absorvível em estudos de fisiologia gastrointestinal. Apresenta alta disponibilidade, capacidade de ser medida em fluidos biológicos, falta de toxicidade e absorção minúscula (quando polímeros de peso molecular mais alto são usados) tornam-na uma substância marcadora quase ideal (SCHILLER et al., 1988).
No entanto, uma das atividades adversas do PEG é sua capacidade de alterar a osmolaridade do meio no qual está inserido. Para o PEG, a crescente osmolalidade de acordo com suas moléculas de maior peso molecular não é devido ao tamanho grande dessas moléculas, mas está relacionada, pelo menos em parte, à massa de PEG ou ao número de subunidades de etilenoglicol presentes em uma dada molalidade, ou ambos. Dessa forma, o aumento da osmolaridade em PEG 400 ocorre de forma linear (SCHILLER et al., 1988). Dessa forma, compreende-se que para a cada 1% de concentração de PEG 400 adicionado aumenta-se 250 mOsm/L do meio.
O meio LIT apresenta uma osmolaridade média de 300 mOsm/L, promovendo um meio isosmótico para os parasitos. Entretanto, T. cruzi é posto em estresse hiperosmótico quando está a partir de 650 mOsm/L (LI et al., 2011). Segundo os mesmos autores, em poucos minutos de estresse hiperosmótico, há uma diminuição na produção de amônio e acúmulo de aminoácidos, que depois se estabilizam em concentrações mais altas do que aquelas sob condições isosmóticas.
Em contraste com o que acontece com células de mamíferos, quando as culturas epimastigotas são submetidas a estresse hiperosmótico, os parasitos encolhem drasticamente, não recuperando significativamente seu volume normal, sugerindo que não há absorção
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inorgânica imediata de íons e água. Apesar do aumento inicial da força iônica intracelular, eles se adaptam bem a essas condições, sendo virtualmente indistinguíveis em termos de motilidade de células controle mantidas em tampão isosmótico. Após a adaptação, fica evidente também o arredondamento das células (LI et al., 2011).
O Gráfico 1 mostra a comparação entre culturas na presença de diferentes concentrações de PEG. Nota-se que não há diferença entre o grupo controle e as diferentes concentrações de PEG. Além disso, todas as concentrações de PEG foram eficientes na diluição da Quercetina (dados não mostrados), portanto, qualquer uma delas poderia ser utilizada no ensaio de Viabilidade Parasitária. Segundo Dwi e colaboradores (2018), a solubilidade e a dissolução in vitro do fármaco ocorrem devido às interações físicas entre Quercetina e PEG. Estas envolvem forças de ligação fracas, como a ligação de hidrogênio entre os grupos funcionais de quercetina e o grupo O-H do polímero.
Gráfico 1. Efeito do Polietilenoglicol (PEG) 400 nas concentrações de 0 (Controle), 1, 2 e 4% em culturas de Trypanosoma cruzi. Barras de erros acima das colunas indicam Desvio Padrão. Letras indicam significância estatística, calculada por meio de uma ANOVA associada ao pós-teste de Tukey (α = 0,05), onde letras iguais representam os grupos que não diferem estatísticamente.
a
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Desse modo, a cultura contendo PEG a 1% foi selecionada, devido às baixas concentrações do polímero terem menores chances de causar algum prejuízo aos parasitos, e mantendo o meio próximo da concentração isosmótica (300 mOsm/L) e abaixo da concentração considerada hiperosmótica (650 mOsm/L), sendo estimada a osmolaridade do meio em 550 mOsm/L.
5.2 Viabilidade Parasitária
O resultado da aplicação dos fármacos e contagem após 36 horas de atividade é mostrado no Gráfico 2.
Gráfico 2. Comparação da atividade dos fármacos Benzonidazol e Quercetina em diferentes concentrações, na presença ou ausência de reagentes de diluição (PEG e DMSO) em culturas de Trypanosoma cruzi. Barras de erros acima das colunas indicam Desvio Padrão. Letras indicam significância estatística, calculada pela ANOVA associada ao pós-teste T de tukey (α = 0,05), entre diferentes tratamentos na mesma concentração dos fármacos, onde letras iguais representam os grupos que não diferem estatísticamente. Pontos sem indicação de significânica estatística, apresentaram valores absolutos e médios iguas a zero.
A partir dos dados anteriores, foram gerados os gráficos referentes a IC50 para cada um dos respectivos grupos (Figura 9).
A A
BC B C
A B
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Figura 9. IC50 dos grupos controle e tratamento para T. cruzi gerados a partir do software GraphPad Prism v.8.2.0.
A. IC50 para o Benzonidazol com DMSO 10%. B. IC50 para o Benzonidazol juntamente de PEG 1% e DMSO 10%.
C. IC50 para a Quercetina juntamente de PEG 1% e DMSO 10%.
De acordo com o Gráficos da Figura 9 e o Gráfico 2, as IC50 dos fármacos contra T.
cruzi foi, de forma crescente, da combinação do Benzonidazol, PEG 1% e DMSO 10% (IC50 = 0,9746 mM); apenas Benzonidazol e DMSO 10% (IC50 = 1,219 mM) e; a combinação de Quercetina, PEG 1% e DMSO 10% (IC50 = 1,627 mM). Portanto, por apresentar uma IC50
menor, a utilização de BNZ+PEG 1%+DMSO 10% requer uma menor quantidade do fármaco para atingir a Concentração de Inibição do parasito.
O BNZ é extensivamente metabolizado em várias moléculas quando entra em T. cruzi.
Estas moléculas incluem produtos de redução e adutos covalentes com tióis de baixo peso molecular e outras moléculas pequenas onde, a ligação covalente de BNZ com tióis de baixo peso molecular, bem como com tióis proteicos, é uma causa primária da toxicidade do fármaco contra T. cruzi (TROCHINE et al., 2014). Desse modo, por apresentar um amplo espectro de
B A
C
