ATIVIDADE ANTIBIOBILME DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon martinii CONTRA Salmonella Typhimurium
Vanessa SCHUH1; Karine DALLA COSTA2, Marina Leda RIBEIROS2, Saskia BERGAMIN3, Janaina SCHUH2, Sheila Mello da SILVEIRA4;Alessandra Farias MILLEZI5.
1 Graduanda do curso de Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC, Bolsista CNPq; 2 Graduandas do curso de Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC; 3 Estudante do Curso Técnico em Alimentos Integrado ao Ensino Médio, Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC; 4 Co – orientadora, Docente do Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC; 5 Orientadora, Docente do Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC
Introdução
Os biofilmes podem ser definidos como formas de existência microbiana espacial e metabolicamente estruturadas em comunidades embebidas nas matrizes de substâncias poliméricas extracelulares, que liberam o exopolissacarídeo (EPS), imobilizando e protegendo as células. Sua formação provoca alterações fenotípicas nas células planctônicas, que podem ser descritas como estratégias de sobrevivência dos microrganismos em ambientes que estão sujeitos à condições adversas (CONSTERNON et al., 1999; NIKOLAEV, PLAKUNOV, 2007).
As bactérias são as que mais frequentemente produzem biofilme, ainda que algumas apresentem, naturalmente, maior aptidão que outras. Adesão de Salmonella a superfícies de indústrias de alimentos foi o primeiro relato publicado em relação à formação de biofilme por bactérias de origem alimentar (DUGUID, ANDERSON, CAMPBELL, 1966).
Atualmente busca-se o efetivo controle dos biofilmes bacterianos, principalmente em indústrias de alimentos, visto que são mais resistentes a agentes antimicrobianos do que células em estado planctônico e os problemas que causam, tais como a contaminação de alimentos por biotransferência, comprometendo a qualidade final do produto e diminuindo a vida útil de prateleira, podendo afetar a saúde do consumidor. Além disso, as contaminações resultam em consequentes perdas econômicas além da veiculação de toxinfecções alimentares.
Nessa busca por novos agentes antimicrobianos e antibiofilmes, o uso de óleos essenciais (OEs) tem demostrado ser uma alternativa efetiva para controlar o crescimento de bactérias. Os OEs são formados a partir de vias metabólicas secundárias de vegetais e podem ser definidos como misturas complexas de sustâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. Eles podem agir como antibacterianos e contra biofilmes e
recentemente, há considerável interesse no estudo de materiais vegetais como fontes de novos compostos para transformação em agentes antissépticos (MILLEZI et at., 2012, MILLEZI et al., 2013; NOSTRO et al, 2007).
Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi pesquisar a capacidade do antibiofilme do OE Cymbopogon martinii contra a bactéria Salmonella Typhimurium ATCC 14028.
Materiais e Métodos
As análises foram realizadas no laboratório de Microbiologia de Alimentos localizado no Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia, SC.
A bactéria utilizada neste estudo foi Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Para a formação de biofilme foi realizada a padronização dos inóculos em aproximadamente 108 CFU/mL (mediante curva de calibração). Os biofilmes foram inoculados em microplacas de polipropileno de 96 cavidades e incubados em shaker orbital (Tecnal, Brasil) a 37 ºC, agitação de 80 rpm, contendo os tratamentos com óleo e o controle positivo contendo apenas a suspensão bacteriana em meio TSB a 2x108 UFC/mL, sem óleo (MILLEZI et al., 2012).
Foram utilizadas as seguintes concentrações de OE de C. martinii: 0,20%, 0,38% e 0,78%, com base em de estudos anteriores (Millezi, 2013).
Após 24 horas, a biomassa dos biofilmes foi quantificada pela análise de Cristal Violeta (CV), de acordo com STEPANOVIC´ et al., (2000). As células aderidas foram fixadas com metanol 99% (15 min), coradas com cristal violeta (5 min), lavadas em água e, por último, foi adicionado ácido acético 33% para leitura a 630 nm em espectofotômetro Elisa (Biotek, USA).
Para quantificação das células viáveis (UFC), estas foram submetidas por 6 minutos ao banho ultrasson (Unique, Brasil). Procedeu-se à diluição seriada das amostras e plaqueamento em superfície de Ágar Triptona de Soja – TSA, utilizando a técnica de microgota. Após 24 horas de incubação realizou-se a contagem das células viáveis em biofilmes.
Para análise estatística utilizou-se ANOVA (Bonferroni), considerando significativo P<0,001. Os dados foram analisados usando o software Prisma (GrafPad Software).
Resultados e Discussão
Diversos mecanismos têm sido propostos para explicar a atividade antimicrobiana dos OEs. De modo geral, entende-se que a inibição do crescimento microbiano pelos OEs seja devida ao dano causado à integridade da membrana celular pelos componentes lipofílicos do OE, o que acaba por afetar a manutenção do pH celular e o equilíbrio de íons inorgânicos, causando danos à célula, diminuindo seu crescimento (PETER, 2004).
De acordo com a figura 1 houve redução significativa (P<0,001) das células viáveis em biofilme nas três concentrações utilizadas. A concentração de 0,38% foi a que obteve maior redução, sendo esta de 3,47 log10 UFC.cm-2.
Conforme mostra a Figura 2, Salmonella Typhimurium aderiu à superfície, mas não demostrou expressiva produção de biomassa. A redução foi significativa (P<0,001) nas concentrações 0,38% e 0,78%.
Figura 1 – Células viáveis em biofilme. Os valores são referentes à média de três repetições e as barras indicam o desvio padrão. *P < 0,001 de acordo com ANOVA.
Castelijn et al. (2013) também observaram a formação do biofilme de Salmonella spp.
em diferentes superfícies, onde várias cepas mostraram habilidade para formar biofilme em superfície de poliestireno.
Knowles et al. (2005) avaliaram a ação antimicrobiana do carvacol (componente ativo do orégano) em diferentes estágios do biofilme multiespécie desenvolvido por S. aureus e S.
Thphimurium e observaram redução de 3 Log UFC do biofilme de S. Typhimurium.
No presente estudo, houve redução das células viáveis (P<0,001). A maior redução ocorreu na concentração de 0,38% de OE, sendo esta de 3,47 log10 UFC.cm2. A diminuição da produção de biomassa também foi significativa (P<0,001) nas concentrações 0,38% e 0,78%.
Conclusões
A capacidade apresentada pelo OE de C.martinii em inibir o crescimento bacteriano permite que o mesmo seja utilizado na indústria de alimentos evitando o desenvolvimento de biofilmes em superfícies abióticas, sendo uma alternativa frente a microrganismos patogênicos, pois não apresentam risco de devolver resistência, sendo esta uma característica benéfica.
Figura 2 – Quantificação de biomassa. Os valores são referentes à média de três repetições e as barras indicam o desvio padrão. *P < 0, 001 de acordo com ANOVA.
Referências
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Agradecimentos: CNPQ e Instituto Federal Catarinense.
