ANA CAROLINA DALMASO
EXCREÇÃO ENDÓGENA DE DERIVADOS DE PURINAS EM NOVILHAS NELORE
CUIABÁ-MT 2014
ANA CAROLINA DALMASO
EXCREÇÃO ENDÓGENA DE DERIVADOS DE PURINAS EM NOVILHAS NELORE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para obtenção do título de mestre em Zootecnia.
Área de Concentração: Zootecnia
Orientador: Prof. Douglas dos Santos Pina Coorientador: Prof. Dr. Dalton Henrique Pereira
CUIABÁ-MT 2014
D148e Dalmaso, Ana Carolina.
Excreção endógena de derivados de purinas em novilhas Nelore / Ana Carolina Dalmaso. -- 2014.
51 f. ; 30 cm.
Orientador(a): Prof°. Dr. Douglas dos Santos Pina
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso, Programa de Pós Graduação em Ciência Animal , Área de concentração:
Nutrição de Ruminantes, Cuiabá, 2014.
Inclui bibliografia
1. Proteína. 2. Ruminal. 3. Urina. I. Título.
CDU 636.2.085.1
AUTORIZO A REPRODUÇÀO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha Catalográfica elaborada por Carolina Alves Rabelo CRB1/2238
DEDICATÓRIA
A Deus por tudo que me proporciona na vida.
À minha mãe e meu pai, os quais amo muito, pelo exemplo de vida.
A meus irmãos por tudo que me ajudaram até hoje.
Ao meu namorado por todo o companheirismo e confiança.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por permitir que concluísse esta caminhada. Por ter me dado uma família maravilhosa e amigos sinceros.
Aos meus pais, Kátia e Adalberto, e aos meus irmãos, Rafa e Vini, pelo carinho, compreensão e ensinamento. E por terem acima de tudo acreditado em mim.
Ao Fabricio, meu namorado, por ter me ajudado a acreditado que eu era capaz, por todos os conselhos, carinho e compreensão que me deste. Por ter compartilhado bons e maus momentos ao meu lado.
As minhas queridas amigas Luana, Jackeline, Raquel, por nunca medirem esforços para me apoiar em todas as decisões.
À minha querida Josi e sua família, por sempre me apoiarem e me incentivarem.
Aos amigos da família (Maria, Gerson, Preto, Ana, Fabiola, Rodrigo, Márcia, Leandro) que juntamente sempre me apoiaram.
Aos meus queridos amigos e companheiros (Angela, Camila, Karina, Laura, Verônica, Meeg, Claudio, Wanderson, Amorésio, Gilcler, Fagton, Larissa’s, Lisandro, Lucien, Vitor, Daiane, Mérik, Pedro “Japa”, Carol, em especial a “Nykita” que está sempre me socorrendo) de mestrado em Ciência Animal da UFMT. Muitíssimo obrigada por tudo. Vocês fazem parte da minha vida! Nunca vou esquecê-los!!
À querida Elaine pelos momentos de ajuda e paciência.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, pela oportunidade e ajuda.
Aos professores que desempenharam com dedicação as aulas ministradas.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Douglas dos Santos Pina, pela orientação, amizade, compreensão, apoio e ensinamento.
Ao coorientador e examinadores da banca, pela orientação, apoio e ensinamento.
À CAPES, pela confiança em proporcionar a bolsa de estudo.
A todos que contribuíram para que este trabalho fosse concluído com sucesso.
Gostaria de agradecer também a todos aqueles que estiveram ao meu lado, Muito Obrigada!!
“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam muito nem sofrem
muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem a vitoria, nem derrota.” (Theodore Roosevelt)
RESUMO
DALMASO, A. C. Excreção endógena de derivados de purinas em novilhas nelore. 2014.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, 2014.
Objetivou-se com este trabalho avaliar a excreção endógena de derivados de purinas (0,147, 0,170, 0,190, 0,236, 0,301, 0,365, 0,385, 0,405, 0,455-0,489 mmol kg-1de PC0.75) e seu efeito sobre a estimativa da síntese ruminal de nitrogênio microbiano (SRNM), usando dados de três experimentos realizados com novilhas da raça Nelore. A SRNM, também, foi estimada utilizando a concentração de bases purinas (BP) na digesta de abomaso como padrão de comparação. Os valores médios para SRNM considerando a excreção UDP, variaram de 33,36 a 51,72g dia -1, com um erro padrão (EP) de 8,00 g dia-1, e o valor médio estimado usando BP no abomaso foi de 41,14g dia-1, com um EP de 5,50 g dia-1. O uso da excreção UDP como marcador para estimar a SRNM em ruminantes, fornece estimativas que são, em geral, semelhantes aos valores estimados utilizando procedimentos in vivo. A síntese de nitrogênio microbiano ruminal, baseada na excreção urinária de derivados de purinas, é determinada de forma mais adequada com o modelo X = [Y – (0.301 × BW0.75)] × 0.80-1 e SRNM = X × 70 × (0.93 × 0.137 × 1000)-1.
Palavras-Chave: Não-invasivo, Proteína, Ruminal, Urina.
ABSTRACT
DALMASO, A. C. Endogenous purine derivatives excretion in Nellore heifers. 2014.
Dissertação (Mestrado em Zootecnia), Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, 2014.
This work aimed to evaluate the endogenous UPD excretion (0.147, 0.170, 0.190, 0.236, 0.301, 0.365, 0.385, 0.405, 0.455 to 0.489 mmol kg-1of BW0.75) reported in the literature and your effect on the estimative of ruminal microbial nitrogen synthesis (RMNS), using data from three experiments conducted with Nellore heifers. The RMNS also was estimate using purine bases (PB) concentration in abomasum digesta as standard to comparison. The mean values to RMNS estimate considering the UPD excretion range from 33.36 to 51.72g day -1 with a standard error (SE) of 8.00g day-1, and the mean value estimated using abomasum PB was 41.14g day-1 with a SE of 5.50g day-1. The use of UPD as markers to estimate the microbial protein supply, in ruminant animals, does appear to provide estimates that are, in general, consistent with values estimates using standard in vivo procedures. In conclusion, the ruminal microbial nitrogen synthesis, based on urinary purine derivatives excretion, is determined more adequately using the model X = [Y – (0.301 × BW0.75)] × 0.80-1 and RMNS = X × 70 × (0.93 × 0.137 × 1000)-1.
Keywords: Non-invasive. Protein. Ruminal. Urine.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
2.REVISÃO DE LITERATURA ... 4
2.1 Síntese microbiana ruminal ... 4
2.2. Bases Purinas ... 6
2.3. Derivados de Purinas ... 7
2.4. Catabolismo de Purinas ... 8
2.5. Metabolismo das Purinas nos Ruminantes ... 9
2.6 Derivados de Purinas de Origem Endógena ... 10
2.7. Determinação do Volume Urinário ... 11
3.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA ... 14
ENDOGENOUS PURINE DERIVATIVES EXCRETION IN NELLORE HEIFERS ... 19
1.0 INTRODUCTION ... 21
2.0 MATERIALS AND METHODS ... 22
2.1 Animals and management ... 22
2.2 Urinary PD excretion and MN synthesis ... 23
2.3 Abomasal and Ruminal Samples ... 25
2.4. Statistical design and analysis ... 25
3.0. RESULTS AND DISCUSSION ... 26
4.0. CONCLUSION ... 33
5.0. ACKNOWLEDGEMENTS... 33
6.0. REFERENCES ... 33
ÍNDICE DE TABELA
Tabela 1. Ruminal microbial nitrogen synthesis estimate by different models and evaluated by Akaike information criteria and mean square prediction error partition. ... 28
Tabela 2. Ruminal microbial nitrogen synthesis estimate by different models and evaluated by fit of simple linear regression models. ... 30
ÍNDICE DE FIGURA
Figura 1 - Linear relationships (dashed line) between microbial nitrogen syntheses estimated by abomasum PB and by UPD excretion. ... 32
1. INTRODUÇÃO
Os ruminantes, com expressiva atividade fermentativa pré-gástrica, evoluíram há 14 milhões de anos e seu sucesso no processo evolutivo têm sido atribuído à existência da relação simbiótica com os microrganismos ruminais, onde os animais contribuem com o alimento e o habitat, enquanto os microrganismos fornecem ácidos graxos voláteis e aminoácidos formados a partir de substratos que não seriam aproveitados (fibra e nitrogênio não protéico) pelo animal hospedeiro (VALADARES FILHO e PINA, 2006).
Observações qualitativas da presença de microrganismos e de ácidos graxos voláteis no rúmen já eram realizadas ao longo do século XIX, mas apenas no início da década de 40, pesquisadores da Universidade de Cambridge realizaram os primeiros estudos quantitativos da produção de ácidos graxos voláteis. Depois de identificada sua importância para o hospedeiro, iniciaram-se estudos relacionados aos microrganismos ruminais (HOBSON e STEWART, 1997).
Os ruminantes recebem de 40 a 80% das necessidades diárias de aminoácido oriundo do fluxo de proteína microbiana para o intestino e este por sua vez, pode ser afetado por diferentes fatores (SNIFFEN e ROBINSON, 1987), destacando-se: pH, taxa de passagem, nível de consumo, frequência de alimentação, qualidade da forragem, tamanho de partícula, relação volumoso:concentrado e suprimento de proteína degradada no rúmen (HOOVER e STOKES, 1991).
Alta produção microbiana diminui a necessidade de suplementação com proteína dietética não degradada no rúmen, o que torna desejável sua maximização. A proteína microbiana pode suprir entre 50 e 100% da proteína metabolizável exigida para bovinos de corte (NRC, 1996). Uma quantificação adequada da eficiência microbiana é necessária para uma correta formulação de dietas balanceadas em proteína metabolizável para bovinos e para o desenvolvimento de modelos dinâmicos que se apliquem às condições brasileiras de forma a permitir a obtenção de predições mais acuradas da síntese microbiana ruminal.
A ausência de método simples e preciso para estimar a produção de proteína microbiana tem sido limitante ao progresso no entendimento da síntese de proteína microbiana (CHEN e GOMES, 1992). Métodos “in vivo” utilizam indicadores microbianos exógenos (15N) ou endógenos (bases purinas), necessitando do fluxo de N-RNA presente no abomaso e da relação N-RNA:N-total nas bactérias isoladas do rúmen, determinados em animais fistulados no abomaso ou duodeno e no rúmen (BARBOSA, 2011).
A necessidade de desenvolvimento de técnicas não invasivas na experimentação animal favoreceu a utilização da excreção de derivados de purinas (DP) na urina para a determinação da produção de proteína microbiana, como alternativa às determinações utilizando animais fistulados, entretanto, permanecem desafios a serem elucidados. Segundo BRODERICK e MERCHEN (1992), vários indicadores microbianos têm sido utilizados, cada qual com suas vantagens e limitações.
O uso dos DP como indicador para estimar a síntese microbiana no rúmen foi primeiramente proposto por BLAXTER e MARTIN em 1962. TOPPS e ELLIOTT (1967) foram os primeiros a demonstrar que a excreção urinária de alantoína estava relacionada com a concentração de ácidos nucléicos no rúmen de carneiros alimentados com diferentes níveis de energia e também foram os primeiros a utilizar o termo “derivados de purinas”.
Pesquisas recentes (OJEDA, et al., 2005; PINA, et al, 2009; PINA, et al., 2010;
BEZERRA, et al., 2010; BARBOSA, 2011) confirmam a relação entre o fluxo duodenal de bases purinas e a excreção urinária de DP. Assim, o fluxo de N microbiano pode ser calculado a partir das quantidades de purinas absorvidas, que são estimadas a partir da excreção urinaria dos DP (CHEN e GOMES, 1992).
Os nucleotídeos de purinas são catabolizados e sintetizados a partir da síntese de novo e da recuperação de derivados pré-formados. Este ciclo é um processo contínuo no tecido animal. Durante esse processo, uma pequena porção das purinas recicladas são decompostas:
alantoína, ácido úrico, xantina e hipoxantina, os quais são excretados na urina. Essa fração de DP, que são derivadas do metabolismo dos tecidos do animal é chamada “endógena” (CHEN e ORSKOV, 2003).
Inicialmente, a excreção endógena foi estimada em animais em jejum, os resultados obtidos foram variados (32-208 µmol de alantoína / kg PC0,75, em ovinos), o que resultou em algumas críticas sobre o efeito do jejum prolongado em relação a atividade metabólica do animal e a taxa de degradação de ácidos nucléicos (CHEN e ORSKOV, 2003). ORSKOV et al. (1979) desenvolveram uma técnica de “nutrição intragástrica”, permitindo estudar a excreção endógena sem afetar a nutrição do animal. Com essa técnica, a fermentação microbiana ruminal é eliminada, mas a nutrição do animal é mantida pelo fornecimento de nutrientes supridos como ácidos graxos voláteis e caseína, infundidos continuamente no rúmen e no abomaso, respectivamente.
A existência de uma fração endógena nos DP excretados foi confirmada em diversos experimentos, utilizando diferentes metodologias, e mostrou-se variável. Valores, em
mmol/kg PC0,75 de 0,259 a 0,530 para vacas lactantes foram citados por GONZALLEZ- RONQUILLO et al. (2003), que encontraram média de 0,512 em vacas em diferentes estágios de lactação. ORELLANA BOERO et al. (2001) estimaram menores excreções endógenas em vacas secas (0,236 mmol/kg PC0,75) em relação aos citados para vacas em lactação. Em novilhos ou novilhas, VERBIC et al. (1990), FUJIHARA et al. (1987) e GIESECKE et al.
(1994), encontraram médias de 0,365; 0,455 e 0,489 mmol/kg PC0,75, respectivamente.
BECKERS e THÉWIS (1994) relataram média de 0,531 mmol/kg PC0,75 em touros Belgian Blue. As diferenças entre as observações encontradas na literatura são atribuídas à utilização de diferentes técnicas e a possíveis variações no metabolismo dos ácidos nucléicos em animais em diferentes estádios fisiológicos (crescimento, lactação, gestação e mantença).
Com relação ao grupo genético, têm sido reportadas diferenças na excreção urinária de DP entre Bos taurus e Bos indicus. PIMPA et al. (2001), extrapolando o consumo de bases purinas ao nível zero de ingestão, encontraram excreção de DP endógena de 0,147 mmol/kg PC0,75 em bovinos Kedah-Kelantan (Bos indicus), enquanto OSUJI et al. (1996) relataram excreção endógena de DP de 0,170 mmol/kg PC0,75 em bovinos Zebu (Bos indicus) mantidos em jejum. Segundo CHEN e ORSKOV (2003), para animais zebuínos devem ser considerados valores de DP endógeno inferiores (0,147 mmol/kg PC0,75) aos 0,385 mmol/kg PC0,75 sugeridos por estes autores para animais taurinos.
A mensuração dessa fração endógena é um importante parâmetro para modelar a excreção total de DP, a qual subsequentemente será utilizada para estimar a síntese microbiana ruminal. Dessa forma, de modo a evitar subsequentes sub ou superestimação da produção microbiana ruminal e aumentar o conhecimento sobre este assunto, faz-se necessário a avaliação de estudos sobre a determinação da fração e a adequação dos valores reportados na literatura e sua utilização em condições nacionais.
Neste contexto, a modelagem e a simulação surgem como ferramentas importantes, pelas facilidades operacionais da microinformática e pela capacidade de sintetizar observações científicas, culminando com informações fundamentais para tomada de decisões, pelos segmentos envolvidos na nutrição de ruminantes. De acordo com BARBOSA e ASSIS (1999), vários modelos de simulação têm sido desenvolvidos em diferentes países e instituições de ensino, pesquisa e desenvolvimento, com enfoques variados abrangendo aspectos específicos de determinada área do conhecimento científico e tecnológico. Esses autores relataram que, no Brasil, os modelos de simulação, apesar de ser uma ferramenta poderosa e de baixo custo, comparativamente à experimentação física, têm sido pouco
utilizados. Além disso, a maioria dos modelos (CNCPS, NRC, AFRC) utilizados no Brasil são gerados com dados obtidos em condições de clima temperado, com diferentes estratégias de alimentação e composição de dietas. Dessa forma, é essencial o desenvolvimento de modelos gerados com dados obtidos em condições nacionais de forma a melhorar a predição e a acurácia das estimativas em relação às produzidas pelos atuais modelos.
Assim, objetivou-se com este estudo avaliar a excreção endógena de derivados de purinas e seu efeito sobre a estimativa da síntese ruminal de nitrogênio microbiano, usando dados de três experimentos realizados com novilhas da raça Nelore.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Síntese microbiana ruminal
Quantidades adequadas de proteína degradável no rúmen (PDR) são necessárias para ótima eficiência de síntese microbiana (NRC, 2001). Para que a síntese de proteína microbiana não seja prejudicada, é necessário, além da disponibilidade de N em quantidades suficientes, o sincronismo com a disponibilidade energética no rúmen.
Na nutrição protéica de ruminantes, é fundamental a estimativa acurada da síntese de proteína microbiana ruminal e de sua contribuição em aminoácidos digestíveis para o animal.
A síntese de proteína microbiana no rúmen supre de 60 a 85% das exigências para manutenção, crescimento, gestação e lactação em ruminantes (DALY et al., 2001;
TIMMERMNAS Jr. et al., 2000). Uma estratégia de alimentação voltada para a maximização da fermentação ruminal pode aumentar o consumo de matéria seca (MS) como também permitir o uso eficiente da PDR. A produção de proteína microbiana é diretamente relacionada à quantidade de carboidratos fermentescíveis, de PDR (ERASMUS, 1999) e de minerais (MACKIE e THERION, 1984).
Muitas técnicas usadas para mensurar o fluxo de N-microbiano requerem animais preparados cirurgicamente. Em consequência disso, tem havido interesse crescente no desenvolvimento de técnicas não invasivas. A excreção de derivados de purinas pode constituir um método simples, não invasivo para estimar a produção de proteína microbiana.
As exigências de proteína dos ruminantes são atendidas pelos aminoácidos absorvidos no intestino delgado, sendo estes provenientes, principalmente, da proteína microbiana sintetizada no rúmen, da proteína de origem alimentar não degradada no rúmen e da proteína
endógena. Para atender as exigências de proteína metabolizável dos ruminantes é necessário conhecer a quantidade de proteína microbiana que chega diariamente ao intestino delgado (VALADARES et al., 1997). A proteína microbiana que alcança o intestino delgado depende da eficiência de produção microbiana e do fluxo microbiano (CAVALCANTE et al., 2006).
A quantidade e qualidade da proteína que chega ao intestino delgado são moduladas pelos efeitos combinados de degradação e síntese no rúmen. Considerando que os aminoácidos representam aproximadamente 80% da proteína bruta microbiana (PBmic), os cálculos do valor biológico da PBmic sugerem que o valor das proteínas verdadeiras presentes nesta fração é quase 100% (OWENS e ZINN, 1988). Quando o valor biológico da proteína da dieta é baixo, a proteína que chega ao intestino delgado é complementada pela ação microbiana, pelo fato da fonte dietética ser modificada, havendo uma compensação pela síntese de proteína microbiana (OWENS e ZINN, 1988; SILVA et al., 2005). No entanto, quando é elevado o valor biológico da proteína da dieta, a degradação microbiana que ocorre no rúmen pode reduzir esse valor biológico, pois em dietas altamente protéicas, a proteína excedente é transformada em amônia, que é absorvida e perdida como uréia na urina (OWENS e ZINN, 1988; VAN SOEST, 1994). Por esta razão diz-se que ação microbiana modifica e reduz a quantidade de proteína que chega ao intestino.
No rúmen a amônia é convertida em compostos nitrogenados para manter o metabolismo dos microrganismos e seu hospedeiro. Os microrganismos do rúmen têm grande importância como fonte de nitrogênio (N) para a síntese de proteínas. As principais fontes de N para síntese protéica consistem tanto da proteína da dieta como em nitrogênio não protéico (NNP) e, N reciclado para ser reutilizado no rúmen (OWENS e ZINN, 1988). A importância do metabolismo de nitrogênio no rúmen se deve às alterações qualitativas e quantitativas dos aminoácidos das proteínas ingeridas (SILVA et al., 2005).
Para a estimativa do aporte de N-microbiano se tem utilizado diversas técnicas baseadas no uso de diferentes marcadores ou indicadores microbianos. Os marcadores microbianos podem ser divididos em dois grandes grupos: os internos (são constituintes das células microbianas e por isso não necessitam ser administrados aos animais experimentais) são eles: ácido diaminopimélico – DAPA, ácidos nucléicos – purinas e pirimidinas, ácido aminoetilfosfônico – AEPA e externos (administrados aos animais para que sejam incorporados pelos microrganismos ruminais e formem parte de suas estruturas) são eles:
isótopos radioativos, 15N, 35S para marcação de proteínas e 32P para marcação de fosfolipídios
(BRODERICK e MERCHEN, 1992; BARBOSA et al., 2006, VALADARES FILHO et al., 2006).
O uso dos derivados de purinas como indicador para estimar a síntese microbiana no rúmen foi proposto por BLAXTER e MARTIN em 1962. TOPPS e ELLIOTT em 1967, demonstraram que existia uma correlação positiva entre a quantidade de alantoína e ácido úrico excretados na urina e o fluxo de ácidos nucléicos no duodeno (FUJIHARA, 1987;
SANDOVAL-CASTRO e HERRERA-GOMES, 1999; VALADARES FILHO et al., 2007).
Na década de 1990 ocorreram maiores progressos no estabelecimento de um método relacionado à excreção de DP e a produção microbiana (MAYES et al., 1995).
As pesquisas no decorrer dos anos confirmaram a relação entre o fluxo duodenal de bases purínicas e a excreção urinária de derivados de purinas (CHEN et al., 1990;
BALCELLS et al., 1991; GIESECKE et al., 1994; PEREZ et al., 1996; GONZALEZ- RONQUILLO et al., 2003; MOORBY et al., 2006). Então, assumiu-se que a absorção de purinas estaria condicionada à quantidade de proteína microbiana sintetizadas no rúmen, a qual poderia ser estimada a partir da excreção urinária de derivados de purinas: alantoína, ácido úrico, xantina e hipoxantina (GIESECKE et al., 1994).
Nos ruminantes, uma substancial proporção da proteína da dieta é fermentada no rúmen e degradada a subprodutos que são utilizados para a síntese de proteína microbiana. A proteína que será disponível para digestão e absorção no intestino delgado provém da proteína alimentar não degradada e principalmente da proteína microbiana (HUTTON et al., 1971;
RUSSEL, et al., 1992). Por exemplo, em animais que consomem basicamente forragens, a proteína microbiana responde, em média, por 59% da proteína que chega ao intestino delgado, pois nessas dietas há muito pouca participação de proteína não degradável (CLARK et al., 1992).
Assim, a quantificação da síntese de proteína microbiana é necessária devido à grande importância que os microrganismos bacterianos possuem na digestão e degradação da fibra além de conferir ao animal proteína microbiana de alto valor nutricional.
2.2. Bases Purinas
As bases purinas (BP) são os ácidos nucléicos presentes no RNA e DNA de todos os seres vivos. Os ruminantes podem ingerir quantidades apreciáveis de ácidos nucléicos da dieta além dos sintetizados pela população microbiana no retículo-rúmen. Os ácidos nucléicos da
dieta e seus derivados são rapidamente degradáveis no rúmen e não irão contribuir significativamente para o total de ácidos nucléicos que chegam ao duodeno (MCALLAN, 1982). BRODERICK e MERCHEN (1992) destacam que não há nenhum marcador completamente adequado, as estimativas obtidas são relativas e não absolutas. Contudo, os autores indicam as purinas totais como um robusto marcador microbiano.
A maior limitação para estimar proteína microbiana no duodeno é a necessidade de amostras de rúmen para determinação de um padrão bacteriano, esta amostra necessita ser representativa do total da população bacteriana. No ambiente ruminal estão presentes diferentes cepas de bactérias em diferentes fases de crescimento além de protozoários e outras espécies de microorganismos. A dificuldade de amostragem está no fato de necessitar percentagens similares entre estas espécies e os diferentes estágios de crescimento, (OBISPO e DEHORITY, 1999).
Para estimativas de fluxo o mais comumente utilizado são cânulas duodenais simples em formato T que permitem coletas pontuais da digesta duodenal. Para quantificar o total da digesta é necessária a utilização de um marcador de fluxo.
O fluxo pode ser estimado através de marcadores internos que na verdade são componentes indigestíveis do alimento. Este método baseia-se no fato de que, à medida que o alimento transita pelo trato gastrintestinal, a concentração desses constituintes amplia-se progressivamente pela remoção de outros componentes por digestão e absorção.
2.3. Derivados de Purinas
A excreção de derivados de purinas (DP) na urina (por exemplo, alantoína e ácido úrico, xantina e hipoxantina) representa uma alternativa de técnica simples e não invasiva suportada pelo princípio de que a excreção urinária dos DP provém de ácidos nucléicos que fluem do rúmen (GONZALEZ-RONQUILLO et al., 2004). Embora esta seja uma técnica relativamente simples, para sua execução é necessária a coleta total de urina.
Para o uso do método indireto, muitos parâmetros devem ser definidos entre as espécies: recuperação urinária das bases purinas absorvidas, excreção endógena de DP e atividade da xantina oxidase (XO) no intestino, fígado e plasma (OJEDA et al., 2005).
Os ácidos nucléicos que deixam o rúmen são essencialmente de origem microbiana.
Isto ocorre porque os alimentos dos ruminantes possuem um baixo conteúdo de purinas e a maior parte deles sofre extensiva degradação no rúmen como resultado da fermentação
microbiana. No intestino delgado, os nucleotídeos das purinas são hidrolisados em purinas, nucleosídeos e bases livres e ambas as formas podem ser absorvidas. Os nucleosídeos purínicos e as bases livres absorvidas nos intestinos estão sujeitas a degradação bem como a utilização pela mucosa intestinal. Os ácidos nucléicos das purinas absorvidas são degradados e excretados pela urina em seus derivados, hipoxantina, xantina, ácido úrico e alantoína (CHEN e GOMES, 1992).
2.4. Catabolismo de Purinas
Hipoxantina, xantina, ácido úrico e alantoína são os produtos finais do catabolismo das purinas, em ruminantes, são excretados na urina e no leite, e coletivamente são conhecidos como derivados de purinas (SANDOVAL-CASTRO e HERRERA-GOMES, 1999).
Os derivados de purinas excretados são originados de três possíveis fontes: bases purínicas de microrganismos ruminais; purinas dietéticas e, purinas de origem endógena, esta última fonte resulta do metabolismo tecidual dos animais. Contudo os derivados de purinas em ruminantes são provenientes principalmente dos ácidos nucléicos de microrganismos ruminais que fluem e são digeridos e absorvidos no duodeno (BARBOSA, 2009). A partir de diversos estudos foram considerados que ácidos nucléicos de origem alimentar são degradados no rúmen, por esta razão quase não contribuem na excreção urinária dos derivados de purinas. Embora, PEREZ et al. (1996) relataram que derivados de purinas podem ter origem de purinas dietéticas que escapam da digestão ruminal, o fluxo destas purinas depende da natureza da d
Absorvidos estes ácidos nucléicos são degradados e excretados na urina como seus derivados (hipoxantina, xantina, ácido úrico e alantoína). A excreção dos derivados de purinas está diretamente relacionada à absorção de purinas. Com o conhecimento da razão Npurina:
N-total na biomassa microbiana, a absorção de N-microbiano pode ser calculado a partir da quantidade de purina absorvida que é estimada a partir da excreção urinária de derivados de purina (CHEN e GOMES, 1992).
Os dois nucleotídeos purínicos originais dos ácidos nucléicos são adenosina 5’- monofosfato (AMP), também chamado de adenilato e guanosina 5’-monofosfato (GMP), ou guanilato. Estes nucleotídeos contêm, respectivamente, adenina e guanina. Os nucleotídeos das purinas são degradados e o grupo fosfato é perdido. O adenilato produz adenosina, que
pode ser deaminado a inosina por ação catalítica de uma hidrolase, a adenosina deaminase (adenosina + H2O + inosina + NH3). A inosina por ação de uma fosforilase perde a pentose e gera a hipoxantina e a D-ribose (inosina + Pi-hipoxantina + ribose-1-fosfato) (NELSON e COX, 2002). As oxidações da hipoxantina para xantina e de xantina para ácido úrico são catalisadas por uma mesma enzima, a xantina oxidase (XO), uma flavoproteína contendo ferro e molibdênio (CHEN e GOMES, 1992).
O metabolismo do guanilato também produz ácido úrico (uma substância que contém o anel purina intacto) como produto final. O GMP é hidrolisado, produzindo o nucleosídeo guanosina, que é clivado em guanina pela ação da enzima nucleosídeo fosforilase (guanosina + Pi-guanina + ribose-1-fosfato). A guanina é deaminada produzindo a xantina, que é convertida em ácido úrico. A transformação da guanina em xantina é responsabilidade da guanina deaminase que catalisa a deaminação hidrolítica (guanina + H2O + xantina + NH3) (NELSON e COX, 2002).
2.5. Metabolismo das Purinas nos Ruminantes
Os microrganismos ruminais são ricos em ácidos nucléicos: cerca de 18% do N total estão presentes nos ácidos nucléicos, sendo que, destes, 11% estão nas purinas (VALADARES FILHO et al., 2007). Os ácidos nucléicos microbianos fluem para o intestino delgado juntamente com a digesta ruminal e são submetidos à digestão extensiva no intestino delgado. No intestino, os nucleotídeos purínicos são hidrolisados em nucleosídeos e bases livres. Ambas as formas podem ser absorvidas no intestino. A digestibilidade de ácidos nucléicos é acima de 85% (CHEN e GOMES, 1992), sendo que o valor mais comumente usado nesta técnica é de 91% (CHEN et al., 1990).
Existem diferenças entre as diversas espécies animais. Em bovinos, há uma maior atividade da enzima XO na mucosa intestinal, que converte praticamente todas as purinas absorvidas em alantoína. O resultado é que a alantoína é absorvida pelo fígado não é utilizado pelo animal para incorporação à ácidos nucléicos teciduais. Em ovinos, a atividade da XO é baixa e por isso, as purinas absorvidas podem entrar inalteradas no fígado e ser disponibilizado para incorporação pelos ácidos nucléicos teciduais, este processo é conhecido como “salvação” ou recuperação. Ambas as vias de recuperação e degradação enzimática são muito ativas e competem pelos substratos. Assim, as purinas que não foram incorporados aos ácidos nucléicos teciduais são completamente convertidas aos seus metabólitos e produtos
finais, hipoxantina, xantina, ácido úrico e alantoína (CHEN e GOMES, 1992; RENNÓ et al., 2000).
2.6 Derivados de Purinas de Origem Endógena
Os derivados de purinas que entram na circulação sanguínea podem também ser provenientes da degradação de ácidos nucléicos teciduais, esta fração é chamada de “derivado de purina endógena”. A excreção de derivados de purinas endógena é três vezes maior em bovinos que ovinos em relação ao peso corporal (CHEN et al., 1990). Ovinos, caprinos, suínos e humanos são muito similares na proporção da excreção endógena quando relacionado ao peso corporal. A diferença em distribuição tecidual de XO pode ser a razão para as diferenças entre estas espécies (CHEN e GOMES, 1992). A fração endógena também não é constante entre as espécies e dentro das espécies (CHEN et al., 1990; ORELLANA BOERO et al., 2001). Bovinos têm alta atividade de XO na maioria dos tecidos, incluindo o sangue, enquanto os ovinos têm baixa atividade de XO na maioria dos tecidos e nenhuma no sangue. A alta atividade de XO direcionará mais purinas para a degradação (CHEN et al., 1990; CHEN e GOMES, 1992).
Inicialmente, a excreção endógena foi estimada em animais em jejum, obtendo-se resultados variados (32-208 µmol de alantoína/kg PC0,75, em ovinos), o que resultou em algumas críticas sobre o efeito do jejum prolongado em relação à atividade metabólica do animal e a taxa de degradação de ácidos nucléicos (CHEN e ORSKOV, 2003). A medida da intensidade da excreção endógena tem sido feita com auxílio da técnica de infusão intragástrica ou técnica de substituição da digesta que entra no intestino delgado (CHEN e GOMES, 1992). Com esta técnica, a fermentação microbiana é eliminada, mas a nutrição do animal é mantida pelo fornecimento de nutrientes como ácidos graxos voláteis e caseína, infundidos continuamente no rúmen e no abomaso, respectivamente (VALADARES FILHO et al., 2007). Essa técnica apresentou resultados menos variáveis (165-209 µmol de derivados de purinas/Kg PC0,75, em ovinos) em relação à anterior, sendo que CHEN et al. (1990) sugeriram valores de 168 µmol/Kg PC0,75 para ovinos e 514 µmol/ Kg PC0,75 para bovinos. A existência de uma fração endógena nos derivados de purinas excretados foi confirmada em diversos experimentos, utilizando diferentes metodologias, e mostrou-se variável. Valores, em µmol/Kg PC0,75, de 259 a 530 para vacas lactantes foram citados por GONZALEZ- RONQUILLO et al. (2003), que encontraram média de 512 para vacas em diferentes estágios
de lactação. ORELLANA BOERO et al. (2001) estimaram menores valores de excreções endógenas em vacas secas (23 µmol/Kg PC0,75) em relação aqueles citados para vacas em lactação. Em novilhos ou novilhas, FUJIHARA et al. (1987) e GIESECKE et al. (1994), encontraram médias de 455 e 489 µmol/ kg PC0,75, respectivamente. As diferenças entre as observações encontradas na literatura são provavelmente pela utilização de diferentes técnicas e a possíveis variações no metabolismo dos ácidos nucléicos em animais em diferentes estádios fisiológicos (crescimento, lactação, gestação e mantença).
Quando se usa a excreção urinária de derivados de purinas para calcular a quantidade de purina exógena absorvida pelo animal, precisa-se corrigir para a contribuição de derivados de purinas de origem endógena. Em ovinos, devido a alta taxa de recuperação das purinas exógenas, a contribuição endógena é reduzida e pode ser metabolizada a praticamente zero.
A resposta da curva de excreção de derivados de purinas X absorção de purina não é linear (CHEN et al., 1990). Em bovinos, desde que as purinas exógenas não estão disponíveis para utilização pelo animal, a perda de purinas endógenas deve ser substituída pela síntese de novo. Como um resultado, há sempre uma contribuição endógena para excreção total na urina. A resposta da curva de excreção de derivados de purinas X purinas absorvidas é linear.
E está claro que há necessidade de se usar equações diferentes para as diversas espécies animais para que seja possível calcular a absorção de purina por meio da excreção urinária de derivados de purinas (CHEN e GOMES, 1992).
Os derivados de purinas, tanto de origem endógena quanto exógena são absorvidos para o sangue rapidamente. Sendo que a rota primária para o destino dos produtos finais do metabolismo das purinas é a excreção urinária. A alantoína, ácido úrico, xantina e hipoxantina estão presentes na urina de ovinos, mas somente a alantoína e ácido úrico estão presentes na urina de bovinos (CHEN e GOMES, 1992). Alguns dos derivados de purinas no sangue também estão disponíveis para excreção por rotas não renais, como pela secreção, saliva e secreção do leite.
2.7. Determinação do Volume Urinário
Para reduzir erros atribuídos a variações na produção urinária, as coletas de urina deveriam ser feitas durante pelo menos cinco dias (CHEN e GOMES, 1992). Entretanto, de acordo com FLEMING et al. (1991), um período de coleta com duração de 24 horas poderia ser representativo da produção urinária. VALADARES et al. (1997) sugeriram que amostras
representativas de urina poderiam ser obtidas também durante um período de 24 horas de coleta.
Além da utilização do método não invasivo para medir a produção de proteína microbiana utilizando coletas de urina com duração de 24 horas, outro grande avanço é a possibilidade de se estimar o volume urinário com uma única amostra de urina, denominada amostra spot, geralmente obtida quatro horas após a alimentação, possibilitando a utilização deste método em situações a campo e facilitando as coletas (VALADARES et al., 1999).
A creatinina é formada no músculo pela remoção de água da creatina-fosfato, originada do metabolismo do tecido muscular (HARPER et al., 1982). A molécula de creatina-fosfato é degradada espontaneamente a taxas relativamente constantes formando a creatinina. A creatinina é um metabólito do qual o organismo já não necessita, não sendo utilizada para formação de novas moléculas, sendo, portanto, excretada pelos rins. A produção diária de creatinina e, por conseguinte, a excreção de creatinina é dependente da massa muscular e, portanto, proporcional ao peso corporal do animal (KOREN, 2000). Assim, uma vez determinada à excreção diária de creatinina em função do peso corporal do animal e considerando a concentração urinária desta constante ao longo do dia, pode-se estimar o volume urinário excretado diariamente a partir da concentração de creatinina em uma amostra de urina coletada de um animal com peso corporal conhecido.
A excreção de creatinina é relativamente constante em função do peso corporal pelo fato de ser pouco ou não afetado por fatores dietéticos. Essa determinação torna possível a simplificação de métodos que requerem a coleta total de urina. Utilizando-se a concentração de creatinina na urina como indicador da produção urinária, pode-se estimar a excreção urinária dos derivados de purina e de outros compostos nitrogenados (CHEN et al., 1995;
RENNÓ et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2001; SILVA et al., 2001; RENNÓ et al,. 2003).
Entretanto, como a creatinina é sintetizada no tecido muscular e a proporção de tecidos em animais em desenvolvimento é variável, a excreção diária de creatinina, expressa em função do peso corporal do animal, pode ser diferente em animais de idade ou peso corporal distinto.
A relação DP/creatinina é correlacionada com a ingestão de alimentos e com o fluxo intestinal de purinas microbianas, podendo, dessa forma, ser utilizada como indicador para estimar o fluxo intestinal de nitrogênio microbiano. Contudo, a relação direta entre a [DP] / [creatinina] pode somente ser comparada dentro do mesmo animal ou entre animais do mesmo peso corporal, desde que, a excreção diária de creatinina na urina é uma função do peso corporal (CHEN e ORSKOV, 2003). Segundo VALADARES et al. (1999), a coleta
“spot” de urina para quantificar o volume de urina e a produção de N microbiano, baseado na excreção de creatinina, apresentou-se semelhante à coleta total de urina.
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ENDOGENOUS PURINE DERIVATIVES EXCRETION IN NELLORE HEIFERS 1
ABSTRACT: This work aimed to evaluate the endogenous UPD excretion (0.147, 0.170, 0.190, 0.236, 0.301, 0.365, 0.385, 0.405, 0.455 to 0.489 mmol kg-1of BW0.75) reported in the literature and your effect on the estimative of RMNS, using data from three experiments conducted with Nellore heifers. The RMNS also was estimate using purine bases (PB) concentration in abomasum digesta as standard to comparison. The mean values to RMNS estimate considering the UPD excretion ranged from 33.36 to 51.72g day -1 with a standard error (SE) of 8.00g day-1, and the mean value estimated using abomasum PB was 41.14g day-1 with a SE of 5.50g day-1. The use of UPD as markers to estimate the microbial protein supply, in ruminant animals, does appear to provide estimates that are, in general, consistent with values estimates using standard in vivo procedures. In conclusion, the ruminal microbial nitrogen synthesis, based on urinary purine derivatives excretion, is determined more adequately using the model X = [Y – (0.301 × BW0.75)] × 0.80-1 and RMNS = X × 70 × (0.93 × 0.137 × 1000)-1.
Keywords: Non-invasive. Protein. Ruminal. Urine.
EXCREÇÃO ENDÓGENA DE DERIVADOS DE PURINAS EM NOVIHAS NELORE
RESUMO: Objetivou-se com este trabalho avaliar a excreção urinária endógena derivados de purinas (0,147; 0,170; 0,190; 0,236; 0,301; 0,365; 0,385; 0,405; 0,455 e 0,489 mmol kg-1de PC0,75) e seu efeito sobre a estimativa da SRNM, usando dados de três experimentos realizados com novilhas da raça Nelore. A SRNM, também, foi estimada utilizando a concentração de bases purinas (BP) na digesta de abomaso como padrão de comparação. Os valores médios para SRNM considerando a excreção UDP, variaram de 33,36 a 51,72g dia -1, com um erro padrão (EP) de 8,00g dia-1, e o valor médio estimado usando BP no abomaso foi de 41,14g dia-1, com um EP de 5,50g dia-1. O uso da excreção UDP como marcador para estimar a SRNM em ruminantes, fornece estimativas que são, em geral, semelhantes aos valores estimados utilizando procedimentos in vivo. Em conclusão, a síntese de nitrogênio microbiano ruminal, baseada na excreção urinária de derivados de purinas, é determinada de forma mais adequada com o modelo X = [Y – (0,301 × BW0.75)] × 0,80-1 e MN = X × 70 × (0,93 × 0,137 × 1000)-1.
Palavras-Chave: Não-invasivo. Proteína. Ruminal. Urina.
