UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE TECNOLOGIA E CIÊNCIAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL
Prática no1: ESPECTROFOTOMETRIA
1 – Teoria:
A absorção seletiva da radiação por muitas substâncias é utilizada para a sua determinação quantitativa. Essa é a base das dosagens espectrofotométricas.
A intensidade da radiação transmitida por uma solução amostra pode ser medida (por comparação com uma solução de referência) em um aparelho que consiste basicamente das seguintes partes: fonte luminosa, monocromador, cubetas e detector – o espectrofotômetro.
Utiliza)se em espectrofotometria uma quantidade denominada Absorbância (Abs), relacionada à intensidade de radiação absorvida pela solução e que é definida pela relação:
0
log
= , sendo
0
denominado Transmitância (T).
A absorbância (Abs) de uma solução é proporcional à concentração da solução (C) e à distância (d) percorrida pelo feixe luminoso através da solução segundo a Lei de :
= , onde é o coeficiente de extinção, absorção ou absortividade e corresponde à absorbância de uma solução de concentração unitária, por unidade de distância percorrida.
2 ) Objetivo:
)Treinamento na utilização de técnicas espectrofotométricas.
)Elaborar uma curva padrão para determinação da concentração de leveduras numa solução aquosa.
3 ) Material:
)Anotar todo material utilizado.
4 ) Procedimento:
)Preparar uma suspensão de fermento biológico contendo 15 g de fermento em 100 mL de água destilada.
)Diluir a suspensão em 1/50, 1/100, 1/200, 1/250 e 1/500 em balões volumétricos.
)Ler as absorbâncias das suspensões diluídas em espectrofotômetro a 570nm, zerando o aparelho com água destilada.
5 ) Resultados:
Construir a curva padrão de Absorbância 570nm X Concentração de leveduras (g/L) e calcular o coeficiente de absorção ou absortividade (Não esquecer a unidade).
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Prática no2: PODER REDUTOR DOS GLICÍDIOS
1 ) Teoria:
Os glicídios que possuem em sua estrutura umahidroxila heterosídica (OH do carbono anomérico) livre apresentam poder redutor. Metais como Cu2+, Ag+, Bi3+ e Hg2+ e ainda substâncias orgânicas como o ácido dinitrossalicílico (DNS) são reduzidos em meio alcalino por glicídios. O poder redutor é uma propriedade muito utilizada para determinação quali e quantitativas de açúcares.
2 ) Objetivo:
)Avaliar o poder redutor dos seguintes glicídios: glicose (G), frutose (F), sacarose (S), maltose (M) e lactose (L).
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
)Reagentes: Reativos de , de , de e solução de DNS.
)Soluções de glicose (1%), frutose (1%), sacarose (2%), maltose (2%) e lactose (2%).
4 ) Procedimento:
)Preparar 4 séries, uma para cada reagente, de 6 tubos de ensaio. Marcar os tubos de cada série com as iniciais dos açúcares avaliados e mais o branco (B).
)Adicionar à 1ª série 1mL de reativo de , à 2ª série 1mL do reativo de , à 3ª série 1mL de reativo de e à 4ª série 1mL de DNS.
)Aquecer os tubos com os reativos em banho)maria em ebulição ) uma série de cada vez. )Adicionar aos tubos marcados com B 1mL de água destilada e aos demais 1mL das respectivas soluções de açúcares.
)Prosseguir com o aquecimento.
)Verificar a formação de precipitado, mudança de cor ou formação de espelho prata.
5 ) Resultados:
Elaborar uma tabela indicando os glicídios que apresentam poder redutor frente aos diferentes reagentes:
+ = reação positiva ) = reação negativa
Anotar todas as alterações ocorridas.
6 ) Relatório:
Prática no3: DOSAGEM DE GLICÍDIOS REDUTORES (GR) – MÉTODO DE NELSON
1 ) Teoria:
O método de Nelson é um método espectrofotométrico que tem como base a redução do cobre em meio alcalino (reativo de Fehling), seguido da formação de um complexo azul de Cu+ com molibdato de amônio (técnica colorimétrica de Somogyi). É um método bastante sensível, sendo a intensidade da coloração azul diretamente proporcional à quantidade de glicídio redutor. 2 ) Objetivo:
) Elaborar uma curva padrão para determinação da concentração de glicídios redutores presentes numa amostra.
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
)Reagentes: Nelson A, Nelson B e Nelson C – anotar a composição. )Solução padrão de glicose (1%)
4 ) Procedimento:
a)Preparar uma solução padrão de glicose de 20mg/100ml.
b)Adicionar aos tubos de ! 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 ml da solução padrão de glicose de 20mg/100ml e completarpara 1mlcom água destilada.
c)Adicionar em cada tubo 1ml da mistura dos reagentes Nelson A e Nelson B (24 ml de Nelson A + 1,0 ml de Nelson B).
d)Aquecer em banho)maria em ebulição por 20 minutos. e)Resfriar os tubos em água corrente.
f)Adicionar 1,0 ml do reagente Nelson C e agitar até parar de espumar.
g)Completar o volume para 25 ml com água destilada (usar a marcação do tubo) e homogeneizar.
h)Ler as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540nm, zerando o aparelho com o branco (0 ml da solução padrão de glicose de 20 mg/100 ml).
" # $ %& $'
a)Diluir o caldo de cana nas proporções 1:50, 1:100 e 1:250. b)Adicionar aos tubos de ! 1 ml de cada caldo diluído. c)Utilizar os procedimentos de c até h descritos no item 4.1. 5 ) Resultados:
)Elaborar uma tabela com os dados de [glicose] e as respectivas Absorbâncias em 540nm. )Construir a curva padrão de Absorbância 540nm X Concentração de glicose (mg/ml), incluir a equação da curva e o coeficiente de correlação (r2).
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Prática no4: DOSAGEM DE GLICÍDIOS REDUTORES TOTAIS (GRT)
1 ) Teoria:
A determinação de glicídios redutores totais (GRT) envolve primeiramente uma hidrólise ácida dos oligossacarídeos em monossacarídeos que apresentem poder redutor, e posterior determinação dos glicídios redutores (GR) pelo método de Nelson.
2 ) Objetivo:
Determinar a concentração de GR e GRT presentes no caldo de cana de açúcar e a concentração de GRT na solução padrão de sacarose.
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados. )Reagentes: Nelson A, Nelson B e Nelson C.
)Solução padrão de sacarose (20 %) e caldo de cana de açúcar. 4 ) Procedimento:
( ) *
a)Colocar em + de 250 mL, 20 mL de amostra e 30 mL de água destilada. b)Levar a banho)maria na temperatura de 65ºC.
c)Atingida a temperatura acima adicionar 10 ml de HCl 6,2M e homogeneizar. d)Retirar o erlenmeyer do banho e aguardar 30 minutos.
e)Transferir o hidrolisado para um balão de 500 mL e completar o volume.
f)Pipetar 10 ml da solução do hidrolisado e colocar em balão de 500 mL, neutralizar com 2,0 ml de NaOH 0,62M e completar o volume a 500 mL.
g)Proceder à determinação de GR.
" # $ %&
a)Diluir o caldo de cana na proporção de 1:100.
b)Adicionar aos tubos de ! 1 mL de cada amostra (duplicata) e 1 mL de água destilada (branco).
c) Adicionar em cada tubo 1ml da mistura dos reagentes Nelson A e Nelson B (24 mL de Nelson A + 1,0 mL de Nelson B).
d)Aquecer em banho)maria em ebulição por 20 minutos. e)Resfriar os tubos em água corrente.
f)Adicionar 1,0 mL do reagente Nelson C e agitar até parar de espumar. g)Completar o volume para 25 mL com água destilada e homogeneizar.
h)Ler as absorvâncias das soluções em espectrofotômetro a 540nm, zerando o aparelho com o branco.
5 ) Resultados (usar a curva padrão da 3ª prática):
Prática no5: DETERMINAÇÃO DOS ÍNDICES DE SAPONIFICAÇÃO E ACIDEZ
1)Índice de Saponificação (I.S.):
É o número de mg de hidróxido de potássio (KOH) necessário para neutralizar os ácidos graxos resultantes da hidrólise de 1g de gordura ou óleo. É inversamente proporcional ao peso molecular médio dos resíduos de ácidos graxos.
2 ) Objetivo:
)Determinar o índice de saponificação de duas amostras de óleo de dendê e no biodiesel.
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
)Reagentes: Solução alcoólica de hidróxido de potássio a 4%, solução alcoólica de fenolftaleína a 1% e ácido clorídrico 0,5 N.
4 ) Procedimento:
a)Pesar 2g de amostra em um frasco + de 250 mL.
b)Adicionar 20 mL de solução alcoólica de hidróxido de potássio a 4%. c)Adaptar o + a um condensador de refluxo.
d)Aquecer até ebulição branda por 30 minutos.
e)Resfriar, adicionar 2 gotas de fenolftaleína e titular com HClM 0,5 até que a coloração rósea desapareça.
f)Realizar um ensaio em branco em outro frasco + sem amostra(item b ao e). 5 ) Resultados:
Elaborar uma tabela com os resultados da titulação. Calcular o índice de saponificação para as amostras. I.S. = (Vb ) Va) MHClx PMKOH
m
onde: Vb = volume de HCl gasto na titulação do branco (L) Va = volume de HCl gasto na titulação da amostra (L) MHCl= molaridade do HCl (mol/L)
PMKOH= massa molar do KOH (56000 mg)
m = massa da amostra (g)
1)Índice de Acidez (I.A.):
É o número de mg de hidróxido de potássio (KOH) necessário para neutralizar os ácidos graxos livres presentes em 1g de amostra. Este índice revela o estado de conservação do óleo. A decomposição de óleo e gorduras é acelerada por aquecimento e pela luz, sendo acompanhada pela formação de ácido graxo livre.
2 ) Objetivo:
)Determinar o índice de acidez de duas amostras de óleo de dendê.
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
)Reagentes: Solução de éter etílico)álcool etílico (2:1) neutra, solução alcoólica de fenolftaleína a 1% e hidróxido de sódio 0,05 N.
4 ) Procedimento:
a)Pesar 2g de amostra em um frasco + de 250 mL.
b)Adicionar 25 mL de solução de éter etílico)álcool etílico neutra e homogeneizar. c)Adicionar 2 gotas de fenolftaleína e titular com NaOH 0,05 N até coloração rósea.
5 ) Resultados:
Elaborar uma tabela com os resultados da titulação. Calcular o índice de acidez para as amostras. I.A. = Va x NNaOHx MMKOH
m
onde: Va = volume de NaOH gasto na titulação da amostra (L) NNaOH= normalidade do NaOH (mol/L)
MMKOH= massa molar do KOH (56000 mg)
m = massa da amostra (g)
Prática no6: CURVA DE TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS
1 ) Teoria:
Os aminoácidos apresentam)se na forma dipolar iônica (ou zwitteriônica), com propriedades anfotéricas em função dos seus grupamentos –NH2 ()NH3+) e , –
COOH ()COO)).
A adição de massa equivalente de um ácido forte (HCl) ao aminoácido fará com que ele se apresente na forma protonada. A titulação potenciométrica utilizando uma base forte (NaOH) permite determinar os pKs dos grupamentos COOH e NH2e o ponto isoelétrico (pI).
2 ) Objetivo:
)Construir a curva de titulação do aminoácido alanina.
)Determinar os pKs dos grupamentos COOH e NH2, e o ponto isoelétrico (pI) da alanina.
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados. )Reagentes: NaOH 0,1M e HCl 0,1M.
4 ) Procedimento:
)Pesar 2 mmoles de alanina em um becher de forma alta de 100 mL. )Adicionar quantidade equivalente de HCl 0,1M.
)Calibrar o eletrodo.
)Proceder à titulação potenciométrica da alanina utilizando 40 mL NaOH 0,1M. )Adicionar 1 mL de NaOH 0,1M de cada vez e anotar o pH após estabilizar a leitura.
5 ) Resultados:
Elaborar uma tabela com os resultados da titulação.
6 ) Relatório:
Construir a curva de titulação da alanina (pH x equivalentes).
Determinar no gráfico os pKs dos grupamentos COOH e NH2, e calcular o ponto
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Prática no7: CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASEÍNA EM FUNÇÃO DO pH
1 ) Teoria:
As proteínas têm sua solubilidade altamente influenciada pelo pH. Isto se deve ao caráter anfotérico desses compostos, por apresentarem em suas moléculas resíduos de aminoácidos com cargas elétrica distintas. O pH de menor solubilidade de uma proteína localiza)se no seu ponto isoelétrico (pI), uma vez que a força de repulsão entre as moléculas é menor. A solubilidade aumenta quando o pH desloca)se para valores inferiores ou superiores ao pI da proteína.
2 ) Objetivo:
)Verificar a influência do pH na solubilidade de uma proteína.
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
)Reagentes: Solução de caseína 0,3g/100 mL em acetato de sódio 0,1M. Ácido acético 0,1 M
Ácido acético 1,0 M
4 ) Procedimento:
)Numerar 8 tubos de ensaio e proceder de acordo com o quadro abaixo:
Tubo B 1 2 3 4 5 6 7
Água (mL) 5,0 4,4 4,3 4,0 3,5 2,5 0,5 3,9 Ac. Acético 0,1 M (mL) ) 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0 ) Ac. Acético 1,0 M (mL) ) ) ) ) ) ) ) 0,6 pH (calcular)
Abs (ler em 570 nm)
)Adicionar 0,5 mL da solução de caseína em acetato de sódio nos tubos 1 até 7 e ler a turbidez em 570 nm.
5 ) Resultados:
Calcular o pH teórico de cada tubo usando a equação de Henderson)Hasselbach. Construir um gráfico do inverso da turbidez (1/Abs 570 nm) X pH.
Prática no8: DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
1 ) Teoria:
O biureto é o composto formado pelo aquecimento da uréia à 180oC. Quando o biureto é colocado em presença de CuSO4, em meio alcalino, obtém)se um complexo de coloração azul.
Este mesmo tipo de reação colorida ocorre entre substâncias c/ duas carbonilas ligadas diretamente ou através de um átomo de nitrogênio ou carbono, peptídios (mínimo 2 ligações peptídicas) e proteínas com o CuSO4, conservando o nome de reação do biureto. Esta reação é
muito utilizada na dosagem proteínas em materiais biológicos, uma vez que a intensidade da cor depende exclusivamente da concentração da proteína, já que as ligações peptídicas aparecem com a mesma freqüência por grama do material a ser analisado.
2 ) Objetivo:
)Dosagem de proteínas por espectrofotometria. 3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
)Reagentes/soluções: Reagente do biureto)CuSO4em solução alcalina
Solução padrão de caseína 10 mg/mL, em NaOH 0,1M.
Soluções de extrato de leveduras A e B, e de proteína de soja, em NaOH 0,1M. 4 ) Procedimento:
)Seguir o protocolo abaixo utilizando a solução padrão de caseína: Tubo Solução de caseína (mL) H2O (mL) Reagente
biureto (mL)
Abs (ler em 550 nm)
Br 0 1,0 5,0
1 0,2 0,8 5,0
2 0,4 0,6 5,0
3 0,6 0,4 5,0
4 0,8 0,2 5,0
5 1,0 0 5,0
A 1,0 mL da sol. ext. de leveduras novo 5,0 B 1,0 mL da sol. ext. de leveduras velho 5,0 C 1,0 mL da sol. de proteína de soja. 5,0
)Após a adição dos reagentes, agitar e aguardar 30 minutos à temperatura ambiente. )Ler as absorbâncias a 550 nm, usando o tubo Br como branco.
5 ) Resultados:
Construir a curva padrão de Absorbância 550nm X Concentração de proteínas (mg/mL), incluir a equação da curva e o coeficiente de correlação (r2).
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Prática no9: AÇÃO ENZIMÁTICA – INFLUÊNCIA DO TEMPO
1 ) Teoria:
A influência do tempo sobre a velocidade de uma reação enzimática será verificada com a utilização da enzima invertase, que catalisa a conversão (hidrólise) da sacarose (glicídio não redutor) em quantidades idênticas de glicose e frutose (glicídios com poder redutor). Através do emprego do método de dosagem de glicídios redutores pelo DNS (ácido 3,5 dinitro salicílico) é possível quantificar os açúcares formados no hidrolisado.
2 ) Objetivo:
)Determinar a velocidade de reação e calcular a atividade da preparação enzimática.
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados. )Reagentes/soluções:
Solução de sacarose 0,5M em tampão de acetato 0,05M, pH 4,7.
Solução de enzima obtida por extração com NaCl de fermento biológico. Reagente do DNS (ácido 3,5 dinitro salicílico em meio alcalino).
Solução padrão de glicose 5,0 µmoles/mL em tampão de acetato 0,05M, pH 4,7.
4 ) Procedimento:
4.1) Obtenção da enzima invertase:
a) Pesar 15 g de fermento biológico + 15 g de NaCl. b) Misturar os dois sólidos por 10 minutos.
c) Centrifugar a mistura por 20 minutos (≅2500 rpm).
d) Recolher o sobrenadante e diluir na proporção de 1:250 com água destilada.
4.2) Curva padrão de glicose
a) Adicionar aos tubos de ! 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mL da solução padrão de glicose 5,0 µmoles/mL e completarpara 1,0 mLcom água destilada.
b) Adicionar em cada tubo 1,0 mL do reagente do DNS. c) Aquecer em banho)maria por 5 minutos.
d) Resfriar os tubos em água corrente.
e) Completar o volume para 12,5 mL com água destilada (usar a marcação do tubo) e homogeneizar.
f) Ler as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540 nm, zerando o aparelho com o branco (0 ml da solução padrão de glicose 5,0 µmoles/mL).
4.3)Influência do tempo de reação (T=ambiente).
e) Utilizar os procedimentos de d até f descritos no item 4.2.
5) Resultados:
) Construir a curva padrão de Absorbância 540nm X Concentração de glicose (µmol/mL), incluir a equação da curva e o (r2).
) Elaborar uma tabela com os dados de produto formado (µmol/mL) e os respectivos tempos de reação.
) Construir um gráfico de produto formado (µmol/mL) X tempo (min).
) Calcular a velocidade inicial da reação, isto é quando P/ t é constante. Explicar a importância da determinação da velocidade inicial da reação.
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Prática no10: AÇÃO ENZIMÁTICA – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA
1 ) Teoria:
A temperatura altera a velocidade de uma reação enzimática exercendo influência na constante de velocidade. Entretanto, como a enzima é uma proteína, a elevação da temperatura tende a provocar a desnaturação da mesma, com perda de atividade.
2 ) Objetivo:
)Verificar a influência do fator Temperatura na atividade da enzima.
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados. )Reagentes/soluções:
Solução de sacarose 0,45M em tampão de acetato 0,05M, pH 4,7.
Solução de enzima obtida por extração com NaCl de fermento biológico. Reagente do DNS (ácido 3,5 dinitro salicílico em meio alcalino).
4 ) Procedimento:
a) Marcar 5 tubos de ! com as temperaturas a serem avaliados (0oC, Ambiente, 50oC e 100oC) e o branco (B).
b) Adicionar em cada tubo 0,5 mL da solução de sacarose 0,45M e no branco 1,0 mL de água destilada.
c) Em seguida, adicionar 0,5 mL da solução da enzima (exceto no branco) e, imediatamente, colocar os tubos nos respectivos banhos: 0oC – banho de gelo, Ambiente – medir qual a temperatura, 50oC – banho térmico a 50oC e 100oC – água fervente.
d) Após exatamente 10 minutos retirar os tubos dos respectivos banhos e adicionar em cada tubo 1,0 mL do reagente do DNS, inclusive no branco.
e) Aquecer em banho)maria em ebulição por 5 minutos. f) Resfriar os tubos em água corrente.
g) Completar o volume para 12,5 mL com água destilada (usar a marcação do tubo) e homogeneizar.
h) Ler as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540 nm, zerando o aparelho com o branco (1,0 mL de água destilada).
5) Resultados:
) Elaborar uma tabela com os dados de temperatura (oC), absorbância a 540 nm, produto formado (µmol/mL) e velocidade da reação (µmol/mL.min.).
) Construir um gráfico de velocidade de reação (µmol/mL.min) X Temperatura (oC) e analisar o gráfico.
Prática no11: AÇÃO ENZIMÁTICA – Influência da Concentração de Substrato
1 ) Teoria:
Se aumentarmos a concentração do substrato ([S]) tal que [S]>[Sn)1]...>[S3]>[S2]>[S1],
verificamos que as velocidades iniciais vão aumentando. Quanto maior [S] mais lentamente este aumento ocorre, até que mais nenhum aumento é observado. Isto quer dizer que atingimos [ES] máxima, e a enzima está totalmente saturada pelo seu substrato.
2 ) Objetivo:
)Verificar a influência do fator concentração de substrato sobre a velocidade inicial de uma reação enzimática.
3 ) Material:
)Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados. )Reagentes/soluções:
Solução de sacarose 1,0M; 0,5M; 0,2M; 0,1M; 0,05M; 0,02M e 0,01M em tampão de acetato 0,05M, pH 4,7.
Solução de enzima obtida por extração com NaCl de fermento biológico. Reagente do DNS (ácido 3,5 dinitro salicílico em meio alcalino).
4 ) Procedimento:
a) Marcar 8 tubos de ! com as concentrações de sacarose a serem avaliadas (1,0M; 0,5M; 0,2M; 0,1M; 0,05M; 0,02M e 0,01M) e o branco (B).
b) Adicionar em cada tubo 0,5 mL das respectivas soluções de sacarose e no branco 0,5 mL de água destilada.
c) Em seguida, adicionar 0,5 mL da solução da enzima e imediatamente disparar o cronômetro.
d) Após exatamente 10 minutos adicionar em cada tubo 1,0 mL do reagente do DNS, inclusive no branco.
e) Aquecer em banho)maria em ebulição por 5 minutos. f) Resfriar os tubos em água corrente.
g) Completar o volume para 12,5 mL com água destilada (usar a marcação do tubo) e homogeneizar.
h) Ler as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540 nm, zerando o aparelho com o branco (0,5 mL de água destilada).
5) Resultados:
) Elaborar uma tabela com os dados de concentração de substrato ) [S], absorbância a 540 nm, produto formado (µmol/mL), velocidade da reação )V (µmol/mL.min.), 1/[S] e 1/V.
) Construir um gráfico de velocidade de reação )V (µmol/mL.min) X concentração de substrato ) [S] e analisar o gráfico.
