UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
miRNAs em
Schistosoma mansoni
: biogênese,
predição, validação e alvos potenciais
AUTOR: Msc. MATHEUS DE SOUZA GOMES
________________________________________________________________________________
miRNAs em
Schistosoma mansoni
: biogênese,
predição, validação e alvos potenciais
________________________________________________________________________________Tese submetida ao programa de Pós-Graduação Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de doutor em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Molecular.
Autor: Msc. Matheus de Souza Gomes
Orientador: Profa. Dra. Renata Guerra de Sá Cota
Universidade Federal de Ouro Preto – Ouro Preto, Brasil Co-orientador: Prof. PhD. Charles Spillane
National University of Ireland - Galway, Irlanda
Catalogação: [email protected]
G631 Gomes, Matheus de Souza.
miRNAs em Schistosoma mansoni [manuscrito] : biogênese, predi ção , validação e alvos potenciais / Matheus de Souza Gomes. - 2012. XIV, 201 f. il.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Guerra de Sá Cota. Orientador: Charles Spillane.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto.Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas Biológicas em Ciên cias Biológicas.
Área de concentração: Biologia molecular.
1.Schistosoma mansoni - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular NUPEB/UFOP e Genetics and Biotechnolgy Lab, Centre for Chromosome Biology, National
Agradecimentos
A Deus;
Aos meus pais, Luiz e Rosânia, por serem meus exemplos de vida, humildade e persistência, sempre mostrando o caminho certo a trilhar e fazendo o bem;
À minhas queridas irmãs, Daniela e Júlia, pelo apoio e amor incondicionais, sempre mostrando um ombro amigo para me acolher.
Ao meu irmão Marcos pela grande amizade, amor, companheirismo e, sobretudo, por me ajudar e incentivar nos momentos mais difíceis.
Aos demais familiares, pelo carinho, preocupação e por me apoiarem sempre;
Ao meu amor Carol, minha esposa, pela dedicação, compreensão, auxílio e, sobretudo, por ter paciência e sabedoria, contribuindo imensuravelmente para realização deste trabalho;
A minha companheirinha, Sophia “Tica”, sempre alegre e disponível para momentos de lazer e distração.
À família da Carol, seus pais e sua irmã Clarissa pelo incentivo e em especial Dona Lili pela paciência e acolhimento, sendo importantes para finalização deste trabalho;
À Prof.a Dr.a Renata Guerra de Sá Cota, pelos ensinamentos práticos e teóricos, pelo exemplo de dedicação, profissionalismo e sobretudo por contribuir em minha formação como pesquisador e professor.
Ao professor Dr. Elio Hideo Babá, pelo exemplo de pesquisador e professor. Pelos ensinamentos na pesquisa e na vida. Por sempre se mostrar disposto a ajudar mesmo nos momentos mais difíceis.
Aos amigos da equipe do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular (LBBM) da UFOP que passaram e se fazem presentes, muito obrigado. Em especial a Roberta que me auxiliou diretamente no trabalho.
Ao Ezequiel pelo auxílio no trabalho e pelas boas risadas;
A professora Liana Janotti, por gentilmente fornecer junto ao moluscário os parasitos para a realização deste trabalho.
Ao moluscário do CPqRR em especial a Delza, Dilce e Sueleny pela disponibilização dos parasitos.
A todos do Laboratório de Imunoparasitologia da UFOP pelo grande suporte e auxílio científico, em especial ao professor Luis Carlos Crocco por sempre se mostrar disponível para ajudar.
A todos os professores do NUPEB, pela receptividade em seus Laboratórios;
A todos os amigos dos laboratórios do NUPEB pela saudável convivência contribuindo para a realização deste trabalho;
À Cida, secretária prestativa, atenciosa e alegre, sempre pronta para ajudar;
Às seguintes instituições que colaboraram com recursos financeiros para a realização deste trabalho: CNPq e FAPEMIG. Em especial a agência CAPES pelo provimento da bolsa de estudos no Brasil e a bolsa-sanduíche na Universidade Nacional da Irlanda – Galway (Processo no 1495-10-0).
À todos do laboratório de Genética e Biotecnologia da Universidade Nacional da Irlanda –
Em especial ao Mohan Kumar Muniyappa pelas discussões e auxílio científico, a Duygu Selcuklu pelos ensinamentos transmitidos, ao Mark Donoghue pelas dicas de Bioinformática e Elyze Ema pela troca de experiências.
Ao Professor Charles Spillane por me receber em seu laboratório, na Universidade Nacional da Irlanda, disponibilizando todos os recursos possíveis para meu aprendizado e crescimento como cientista.
“Todas as verdades são fáceis de entender, uma vez descobertas. O difícil é descobrí–las”.
SUMÁRIO
RESUMO ... I
ABSTRACT ... III
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ... V
LISTA DE FIGURAS ... VIII
LISTA DE TABELAS ... XVI
I. INTRODUÇÃO ... 1
I.1 Esquistossomose ... 2
I.1.1 Histórico ... 2
I.1.2 Distribuição geográfica... 3
I.1.2.1 Mundo ... 3
I.1.2.2 Brasil ... 4
1.2 O ciclo biológico de S. mansoni ... 5
I.3 Genômica e Transcriptômica de S. mansoni ... 8
I.4 Regulação da expressão gênica em S. mansoni ... 9
I.5 microRNAs ... 12
I.5.1 Histórico e Origem ... 12
I.5.2 Estratégias de Predição e Validação de miRNAs ... 15
I.5.3 Estratégias de Predição de Alvos de miRNAs... 17
II. OBJETIVOS... 19
II.1 Geral ... 20
II. 2 Específicos ... 20
III. Via de silenciamento gênico mediada por miRNAs em S. mansoni ... 21
III.1 Justificativa ... 22
III.2 Materiais e Métodos ... 23
III.2.1 Validação in silico... 23
III.2.1.1 Análise e localização da via de miRNA no genoma de S. mansoni ... 23
III.2.1.2 Alinhamento múltiplo de sequências e Análise filogenética ... 23
III.2.1.3 Análise de resíduos hidrofóbicos (Hydrophobic Cluster Analysis - HCA) ... 24
III.2.1.5 Predição da estrutura terciárias ... 24
III.2.2 Validação experimental ... 25
III.2.2.1 Parasitos ... 25
III.2.2.2 Análise da expressão gênica por qRT-PCR ... 27
III.2.2.2.1 Extração do RNA total ... 27
III.2.2.2.2 Oligonucleotídeos iniciadores (Primers) ... 28
III.2.2.2.3 RT-PCR... 28
III.2.2.2.4 Reação da PCR quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR) ... 28
III.2.2.2.5 Avaliação da curva de eficiência dos iniciadores ... 29
III.2.2.2.6 Verificação da qualidade dos amplicons... 30
III.2.2.2.7 Curva de dissociação dos amplicons ... 31
III.2.2.3 Validação dos iniciadores (Seqüenciamento) ... 32
III.2.2.3.1 Purificação do produto de PCR convencional ... 32
III.2.2.3.2 Freeze Squeze ... 32
III.2.2.3.3 Clonagem ... 33
III.2.2.3.3.1 Reação de Ligação ... 33
III.2.2.3.3.2 Preparo de células competentes ... 33
III.2.2.3.3.3 Transformação Bacteriana ... 33
III.2.2.3.3.4 PCR de Colônia... 34
III.2.2.3.3.5 Minipreparação ... 34
III.2.2.3.3.6 Sequenciamento ... 34
III.2.2.4 Análise Estatística ... 35
III.3 Resultados e Discussão ... 36
III.3.1 Análise in silico – Via de silenciamento gênico mediada por miRNAs ... 36
III.3.1.1 Anotação e localização no genoma de S. mansoni ... 36
III.3.1.1 Exportinas 1, 5 e T ... 40
III.3.1.2 Partner de Dicer e Drosha (RNAseIIIs) ... 42
III.3.1.3 FMR1 (Fragile-X mental retardation 1) ... 48
III.3.1.4 Tudor-SN (Tudor staphylococcal nuclease) ... 51
III.3.2 Análise da expressão gênica ... 57
III.3.3 Regulação pós-transcicional em S. mansoni ... 60
IV. Predição computacional de miRNAs em S. mansoni ... 63
IV.2 Materiais e Métodos ... 66
IV.2.1 Banco de dados de sequências de miRNAs e de S. mansoni ... 66
IV.2.2 Identificação de miRNAs maduros e seus precursores (pré-miRNAs) ... 66
IV.2.3 Identificação de miRNAs conservados ... 67
IV.2.4 Identificação de miRNAs não conservados ... 70
IV.2.5 Análise comparativa dos miRNAs identificados em S. mansoni ... 70
IV.2.6 Identificação de clusteres de miRNAs ... 71
IV.2.7 Conservação e Distribuição Filogenética dos miRNAs de S. mansoni ... 71
IV.2.8 Análises estatísticas e plotagem de gráficos ... 72
IV.3 Resultados e Discussão ... 73
IV.3.1 Identificação de miRNAs no genoma de S. mansoni ... 73
IV.3.2 Identificação e Caracterização dos miRNAs maduros ... 76
IV.3.3 Caracterização dos pré-miRNAs de S. mansoni ... 82
IV.3.4 Distribuição dos genes de miRNAs no genoma de S. mansoni ... 89
IV.3.5 Análise dos miRNAs conservados ... 93
IV.3.5.1 mir-190 de S. mansoni ... 94
IV.3.5.2 miRNA-8 de S. mansoni ... 96
IV.3.5.3 mir-10 de S. mansoni ... 98
IV.3.6 Duplicações dos miRNAs 71 e 2 em S. mansoni... 100
IV.3.7 Clusteres mir-71/2 e mir-71b/2 ... 103
V. Cluster Protostômio-específico mir-71/2 ... 106
V.1 Justificativa ... 107
V.2 Materiais e Métodos ... 109
V.2.1 Identificação dos miRNAs e regiões genômicas ... 109
V.2.2 Predição computacional dos genes de miRNAs clusterizados ... 109
V.2.3 Análise Comparativa dos miRNAs clusterizados em mir71/2... 111
V.2.4 Conservação evolutiva e Distribuição Filogenética dos miRNAs clustetrizados em mir71/2 ... 111
V.2.5 Implementação e plotagem dos gráficos ... 112
V.3 Resultados e Discussão ... 113
V.3.1 Predição do cluster mir-71/2 ... 113
V.3.2 Cluster mir-71/2 Protostômio específico ... 113
V.3.4 Caracterização dos pré-miRNAs ... 120
V.3.5 Análise Filogenética e Comparativa dos novos miRNAs ... 125
V.3.6 Conservação dos miRNAs maduros do cluster mir-71/2 ... 129
VI. miRNAs: novos controladores da expressão gênica em S. mansoni? ... 133
VI.1 Justificativa ... 134
VI.2 Materiais e Métodos ... 136
VI.2.1 Análise in silico ... 136
VI.2.1.1 Predição computacional dos alvos de miRNAs no genoma de S. mansoni ... 136
VI.2.1.2 3’UTR dos mRNAs ... 136
VI.2.1.3 mRNAs alvos ... 136
VI.2.1.4 Caracterização e Categorização dos RNAm alvos ... 137
VI.2.1.5 Predição de 3'UTR alvo homólogas ... 137
VI.2.2 Análise in vitro ... 138
VI.2.2.1 Obtenção dos Parasitos ... 138
VI.2.2.2 Extração de RNA total ... 139
VI.2.2.2.1 miRNAs ... 139
VI.2.2.2.2 Alvos ... 140
VI.2.2.3 Obtenção da primeira fita de DNA (cDNA) ... 141
VI.2.2.3.1 miRNAs ... 141
VI.2.2.3.2 Alvos ... 141
VI.2.2.4 Oligonucleotídeos iniciadores ... 141
VI.2.2.4.1 miRNAs ... 142
VI.2.2.4.2 Alvos ... 142
VI.2.2.5 qRT-PCR ... 143
VI.2.2.5.1 miRNA ... 143
VI.2.2.5.2 Alvos ... 143
VI.2.2.5.2.1 Curva de eficiência dos iniciadores ... 144
VI.2.2.5.2.2 Curva de dissociação dos amplicons ... 145
VI.2.2.6 Análise estatística ... 146
VI.3 Resultados e Discussão ... 147
VI.3.1 Predição dos alvos de miRNAs ... 147
VI.3.2 Ontologia gênica e participação em vias metabólicas ... 152
VI.3.3.1 miRNAs sexo-específicos ... 159
VI.3.4 Alvos evolutivamente conservados ... 162
VI.3.5 Expressão gênica de alvos conservados de S. mansoni ... 165
VI.3.5.1 Smp_066900 inexina (sma-mir-125a) ... 165
VI.3.5.2 Smp_177060 sinoviolina (sma-mir-124-3p)... 166
VI.3.6 Controle da expressão gênica ao nível pós-transcricional em S. mansoni ... 168
VII. CONCLUSÕES ... 171
VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 173
I
Resumo
Os miRNAs constituem uma classe extensa de pequenos RNAs não codificadores de proteínas possuindo, em sua forma madura, de 20 a 24 nucleotídeos, cuja função principal é regular a expressão gênica. Seus precursores, denominados pré-miRNAs, têm como característica principal a formação de estruturas secundárias estáveis em forma de grampos (hairpins) possuindo um tamanho
variável de 70 a 120 nucleotídeos. Os resultados publicados na última década sugerem que o silenciamento gênico mediado pelos miRNAs é um processo evolutivamente conservado e envolve, em um primeiro momento, a interação entre o miRNA e o respectivo RNA mensageiro alvo, promovendo sua clivagem ou repressão de sua tradução. Apesar de o Schistosoma mansoni ser um
organismo com genoma conhecido, pouco se conhece sobre o repertório de miRNAs presentes neste parasito. Resultados anteriores do nosso laboratório demonstraram que genes centrais da biogênese de miRNAs são mais expressos em cercárias e esquistossômulos jovens quando comparados a vermes adultos, levando a hipótese de que os mecanismos de adaptação do parasito ao hospedeiro mamífero, imediatamente pós-infecção, podem envolver a participação de miRNAs. Para investigar este hipótese, foram utilizados neste trabalho abordagens computacionais e experimentais para identificar miRNAs em S. mansoni, bem como determinar suas características estruturais e padrão de expressão,
correlacionando em paralelo com o perfil de expressão de 13 genes envolvidos em sua biogênese. Os resultados obtidos sugerem que os genes envolvidos na biogênese de miRNAs são conservados e apresentam um perfil de expressão gênica diferencial durante a transição cercária-esquistossômulos jovens. Foram identificados neste trabalho 35 miRNAs conservados, 32 não conservados e mais de 300 prováveis RNA mensageiros alvos no genoma de S. mansoni. Dentre os miRNAs identificados
foram caracterizados duplicações gênicas, clusteres (mir-71/2) e miRNAs sexo-específicos. As análises da expressão gênica dos miRNAs conservados e não conservados evidenciaram padrões de expressão gênero-específicos (sma-miR-61, sma-miR-125a e sma-miR-124-3p) e estágio-específicos
(sma-mir-new10-5p, sma-miR-125a). Observou-se também uma correlação positiva entre a alta
expressão de miRNAs no parasito e baixa expressão de alvos específicos. Estes dados sugerem que a regulação do proteoma do parasito, principalmente nas fases de cercária e esquistossômulos, provavelmente é mediada por regulação pós-transcricional mediada por miRNAs viabilizando a instalação efetiva do parasito no hospedeiro mamífero. Este conjunto de resultados abre perspectiva para avaliação do perfil de expressão em esporocistos demonstrando que transcritos produzidos nesta fase do ciclo biológico do S. mansoni podem ser silenciados e posteriormente traduzidos em cercárias
ou esquistossômulos.
Palavras-chave: miRNAs, mRNA alvo, Schistosoma mansoni, expressão gênica, regulação
II
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are an abundant class of small non-protein-coding RNAs that function as negative gene regulators. These molecules in their mature form are generally 20–24 nucleotides. Their precursors, pre-miRNAs, form a stable stem-loop secondary structure (hairpins) with a variable length (70 to 120 nucleotides). Over the last decade, researchers have been suggesting that the gene silencing mediated by miRNAs is an evolutionarily conserved process and involves the interaction between the miRNA and its target mRNA, promoting its cleavage or repression of protein translation. Although Schistosoma mansoni genome is known, few studies have been done on repertoire of
miRNAs and their machinery. Previous results from our laboratory demonstrated that the central genes of Mirna biogenesis is over expressed in cercariae and schistosomula when compared to adult worms, leading to the hypothesis that mechanisms involving participation of miRNAs may help the parasite adaptation, immediately post-infection in mammalian host. To investigate this hypothesis, we performed computational and experimental approaches to identify miRNAs in S. mansoni and to
determine their structural features and expression pattern, correlating with the expression profile of 13 genes involved in their biogenesis. These results suggested that genes involved in biogenesis of miRNAs are conserved and showed na over expression profile during the transition from cercariae to young schistosomula. We identified 35 conserved miRNAs, 32 not conserved miRNAs and more than 300 putative targets in the S. mansoni genome. The identified miRNAs were characterized and
displayed gene duplication, clusteres (miR-71/2) and sex-specific miRNAs. The analysis of gene expression of conserved and not conserved miRNAs showed gender-specific miRNAs (sma-miR-61, sma-miR-125a and sma-miR-124-3p) and stage-specific miRNAs (new10-5p and sma-mir-125a). There was also a positive correlation between high expression of miRNAs in parasite and low expression of their specific targets. These data suggested that the regulation of the parasite proteome, especially in the stages cercaria and schistosomula, is probably mediated by miRNA pos- transcriptional regulation, enabling the effective installation of the parasite in the mammalian host. This set of results also opens a perspective to evaluate the expression profile in sporocysts demonstrating that mRNAs produced in this stage are silenced and later translated in cercariae or schistosomula.
Keywords: miRNAs, mRNA target, Schistosoma mansoni, gene expression, pos- transcriptional
III
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
µg ... Micrograma µL ... Microlitro µM ... Micro Molar
a.C ... "antes de Cristo" (Ante Christum) AMFE ... Energia mínima livre ajustada BAC ... Bacterial artificial chromosome
(Cromossomo Artificial de Bactérias) BLAST ... Basic Local Alignment Search Tool
Ferramenta de busca de Alinhamento Local
BSA ... Albumina sérica bovina CaCl2 ... Cloreto de cálcio
cDNA ... DNA complementar
CNPq ... Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DNA ... Ácido desorribonucleico
dNTP ... Deoxinucleotídeo trifosfato (N= A, C, G ou T)
EDTA ... Ácido etilenodiaminotetracético EMT ... Esquistossômulos mecanicamente
transformados
EST ... Etiquetas de seqüências expressas FAPEMIG ... Fundação de Amparo a Pesquisa de
Minas Gerais
FAPESP ... Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
Gb ... Giga bases GC ... Guanina citosina
GeneDB ... Gene Data Bank (Banco de dados Gene) GO ... Gene Ontology
Ontologia Gênica
HCA ... Hydrophobic Cluster Analysis Análise de clusteres hidrofóbicos IPTG ... Isopropil-β-D- tiogalactosidio Kb ... Kilo bases
KEGG ... Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
Enciclopédia Kyoto de Genes e Genomas KO ... KEEG orthology
LB ... Meio de cultura Luria Bertani Mb ... Mega bases
MFE ... Energia livre mínima
MFEE ... Energia mínima livre do conjunto termodinâmico
MFEI ... Índice de energia mínima livre mg ... Miligramas
IV
MgSO4 ... Sulfato de magnésio
miRBase ... Banco de dados de miRNAs miRNAs ... microRNAs
mL ... Mililitros
mRNA ... RNA mensageiro NaCl ... Cloreto de Sódio NaOAc ... Acetato de sódio NaOH ... Hidróxido de sódio
NCBI ... National Center for Biotechnology Information
Centro Nacional para Informações Biotecnológicas
ncRNAs ... RNAs não codificadores de proteínas nm ... Nanômetros
nt ... Nucleotídeos PB ... Pares de Bases
PCR ... Reação em Cadeia da Polimerase
PERL ... Practical Extraction and Report Language Linguagem Prática de Extração e Geração de Relatório
PFAM ... Protein families database
Banco de dados de Fmílias de Proteínas pH ... Potencial hidrogeniônico
pré-miRNAs ... Precursores de miRNAs pri-miRNAs ... miRNAs primários
qRT-PCR ... Reação Polimerásica em Cadeia quantitativa
RefSeq ... Sequências de Referência RISC ... RNA-induced silence complex
(Complexo de silenciamento gênico mediado por RNA)
RNA ... Ácido ribonucléico
RT-PCR ... Transcriptase Reversa – Reação Polimerásica em Cadeia
SDS ... Sodio Dodecil Sulfato
stRNAs ... small temporal RNAs (Pequeno RNA temporal )
TIGR ... Institute for Genomic Research (Instituto de Pesquisas Genômicas)
Tris ... Tris-hidroximetilaminometano UCSC ... University of California, Santa Cruz UTR ... Untranslated Region (Região não
traduzida)
WHO ... World Health Organization –
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquistossomose e sua distribuição mundial (WHO, 2010) – modificado.
Figura 2: Distribuição da esquistossomose mansônica de acordo com a prevalência da
doença no Brasil – Adaptado de (Coura, 2004).
Figura 3: Ciclo de vida do S. mansoni. Dentro do seu hospedeiro vertebrado, as formas
larvais (esquistossômulo,A) dão origem a parasitos sexualmente maduros (verme adulto,B), os quais se acasalam e produzem ovos (C) que são liberados para o meio aquático. Os ovos eclodem e liberam os miracídios (D), que penetram nos caramujos, dando origem a numerosos esporocistos (E). Os esporocistos geram cercárias (F) que saem do caramujo e são liberadas na água, as quais são as formas infectantes para o hospedeiro vertebrado (Verjovski-Almeida et al., 2003).
Figura 4: Expressão gênica estágio-específico em S. mansoni. A figura representa os genes
altamente expressos estágios-específicos baseados nos projetos transcriptoma do parasito (Han et al., 2009).
Figura 5: Mecanismo de silenciamento gênico mediada por miRNAs. Figura 5: O mecanismo de silenciamento gênico mediada por miRNAs ocorre em dois passos distintos: um nuclear (a, b, c) e outro citoplasmático, sendo finalizada quando uma das fitas do duplex encontra mi-RISC e seu respectivo mRNA alvo (d, e, f). (Adaptado de (Naqvi et al., 2009).
Figura 6: Preparação de esquistossômulos de 24 horas.Os esquistossômulos foram cultivados por 24 horas em estufa de CO2 5% a 37ºC em meio 169 analisados em lupa de
aumento.
Figura 7: Análise em gel de agarose/formaldeído a 1%. O RNA total foi obtido utilizando o kit SV40 a partir de vermes adultos (1), cercárias (2), esquistossômulos de 3,5 horas (3); esquistossômulos de 24 horas (4); esquistossômulos de 48 horas(5); esquistossômulos de 72 horas (6); esquistossômulos de 5 dias (7) e esquistossômulos de 7 dias (8).
Figura 8: Plot de amplificação referente à curva de eficiência do α tubulina utilizando diluição seriada de 4x de cDNA de cercária. Em X está demonstrado o valor dos ciclos de
PCR e em Y os valor de ∆Rn.
Figura 9: Curva padrão referente ao gene α tubulina utilizando diluição seriada de 4x de cDNA. Em X estão demonstrados os valores de Log da concentração de cDNA e em Y os valores de CT correspondes a cada diluição. A direita do gráfico os valores de slope e de
VI
Figura 10: Curva de dissociação referente ao amplicon de SmTudor-SN. No eixo x está
representado a temperatura de dissociação do amplicon gerado pela reação de PCR e no eixo Y a derivada do valor de emissão de fluorescência.
Figura 11: Distribuição evolutiva das proteínas XPO5, XPO1 e XPOt. Árvore filogenética consenso baseada na sequências de resíduos de aminoácidos das proteínas XPO5 , XPO1 e XPOT. Para árvore consenso e confiabilidade dos ramos formados foram utilizados testes de bootstrap com 2000 réplicas e mínimo de 50% para cada ramo confiável. A árvore mostrou 3 clados distintos (separado por colchetes) sendo um para cada conjunto de proteínas ortólogas. As proteínas evidenciadas em caixa cinza representam as proteínas identificadas
neste trabalho. A construção da árvore e a análise do “bootstrap” foram realizadas no programa MEGA 4.0.
Figura 12: Conservação evolutiva dos domínios de XPO5, XPO1 e XPOt. As proteínas ortólogas XPO5, XPO1 e XPOt encontradas nos organismos D. melanogaster, C. elegans e H. sapiens e aquelas identificadas no parasito S. mansoni foram comparadas quanto a disposição e presença de domínios conservados na estrutura primária. A descrição de cada domínio foi representada na estrutura por um polígono indicado no rodapé da Figura juntamente com os números PFAM. O tamanho de cada proteína está indicado no final de cada sequência e os valores comparativos de cada domínio estão indicados a direita de cada sequência.
Figura 13: Distribuição evolutiva das proteínas partner-Drosha e partner-Dicer. A árvore filogenética consenso foi baseada na sequências de resíduos de aminoácidos das proteínas partner-Drosha e partner-Dicer. Para árvore consenso e confiabilidade dos ramos formados foram utilizados testes de bootstrap com 2000 réplicas e mínimo de 50% para cada ramo confiável. A árvore mostrou 2 clados distintos (caixas cinza) sendo um para cada conjunto de proteínas ortólogas. As proteínas evidenciadas em negrito representam as
proteínas identificadas neste trabalho. A construção da árvore e a análise do “bootstrap” foram realizadas no programa MEGA 4.0.
Figura 14: Conservação evolutiva dos domínios de partner-Drosha e partner-Dicer. As proteínas ortólogas partner-Drosha e partner-Dicer encontradas nos organismos D. melanogaster, C. elegans e H. sapiens e aquelas identificadas no parasito S. mansoni foram comparadas quanto a disposição e presença de domínios conservados na estrutura primária. Cada domínio esta representado por uma caixa cinza entre o inicio e o termino dos resíduos de aminoácidos da proteína. O tamanho de cada proteína está indicado no final de cada sequência e os valores comparativos de cada domínio estão indicados a direita de cada sequência.
VII
Figura 16: Distribuição evolutiva das proteínas FMR1. A árvore filogenética consenso foi baseada na sequências de resíduos de aminoácidos de proteínas ortólogas FMR1. Para árvore consenso e confiabilidade dos ramos formados foram utilizados testes de bootstrap com 2000 réplicas e mínimo de 50% para cada ramo confiável. A árvore mostrou clados distintos (representados por colchetes) sendo um para cada grupo de proteínas ortólogas. As proteínas evidenciadas em caixas representam as proteínas identificadas neste trabalho. A construção
da árvore e a análise do “bootstrap” foram realizadas no programa MEGA 4.0.
Figura 17: Estruturas secundárias e resíduos hidrofóbicos das proteínas contendo domínio SN. As proteínas termonuclease (Staphylococcal Nuclease -2SNS) e SmTudor-SN foram representadas na forma 2D evidenciando a estrutura secundária e os resíduos hidrofóbicos de cada porção da proteína. As estruturas secundárias foram preditas pelo programa PredictProtein e representadas por retângulos verticais azuis as α hélices e pelos retângulos verticais vermelhos as folhas beta. Os domínios SN foram indicados em cada estrutura por um traço contínuo preto mostrando em suas extremidades o resíduo de aminoácido inicial e final. Os residuos de aminoácidos foram representados pelas letras referentes exceto prolina, glicina, serina e treonina que foram representados por ★,◆,▣ e □, respectivamente. Os sítios catalíticos presentes na proteína 2SNS, descritos por, Ponting (1997) foram mostrados por setas (D21, F34, D40, E43, K84, Y85 and R87). A sequência β1
-β2-β3-α1-β4-β5-α2-α3 foram mostradas no gráfico representando a sequência de estruturas secundárias caracteristica de domínios SN. As estruturas secundárias foram preditas utilizando o programa PredictProtein.
Figura 18: Estruturas tridimensionais dos domínios conservados SN em SmTudor-SN e Staphylococcal Nuclease (2SNS). A ilustraçao em forma de desenho foi obtida atavés da modelagem baseada em homologia no banco de dados repositório Swiss-Model. O programa Pymol foi utilizado para exposição dos domínios SN obtidos das proteínas SmTudor-SN e Staphylococcal Nuclease. As estruturas α hélices foram representadas pelas cores vermelho, amarelo e azul claro e as folhas beta representadas por setas azuis e verdes.
Figura 19: Distribuição evolutiva das proteínas Tudor-SN. A árvore filogenética consenso foi baseada na sequências de resíduos de aminoácidos de proteínas ortólogas Tudor-SN encontradas em três diferentes reinos: Fungi, Plantae e Metazoa. Para árvore consenso e confiabilidade dos ramos formados foram utilizados testes de bootstrap com 2000 réplicas e mínimo de 50% para cada ramo confiável. A árvore mostrou clados distintos (representados por colchetes) sendo um para cada reino. As proteínas evidenciadas em caixas representam as
proteínas identificadas neste trabalho. A construção da árvore e a análise do “bootstrap” foram realizadas no programa MEGA 4.0.
Figura 20: Expressão relativa dos gene (A) SmDrosha1/2 e (B) SmExportina5.1/2 no
desenvolvimento de S. mansoni. A expressão destes genes foi avaliada nos estágios de
cercárias, esquistossômulos mecanicamente transformados (EMT-3,5 horas, EMT-24 horas, EMT-48 horas, EMT-72 horas, EMT-5 dias, EMT-7 dias) e vermes adultos. Como
VIII
horas, *** diferente de EMT-24 horas, # diferente de EMT-48 horas, ## diferente de EMT-72 horas, ### diferente de EMT-5 dias, & diferente de EMT-7 dias.
Figura 21: Expressão relativa dos gene (A) SmPartner-Dicer e (B) SmPartner-Drosha no
desenvolvimento de S. mansoni. A expressão destes genes foi avaliada nos estágios de
cercárias, esquistossômulos mecanicamente transformados (3,5 horas, 24, EMT-48 horas, EMT-72 horas, EMT-5 dias, EMT-7 dias) e vermes adultos. Como normalizador
(gene constitutivo) foi utilizado o gene da α-tubulina e a expressão gênica relativa foi determinada pelo método do 2-ΔCt. A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Tukey com P<0,05 no programa GraphPad Prism. As diferenças estatísticas entre os estágios foram determinadas pelos sinais: * diferente de cercária, ** diferente de EMT-3,5 horas, *** diferente de EMT-24 horas, # diferente de EMT-48 horas, ## diferente de EMT-72 horas, ### diferente de EMT-5 dias, & diferente de EMT-7 dias.
Figura 22: Expressão relativa dos gene (A) SmTudor-SN e (B) SmFmr1.1 no
desenvolvimento de S. mansoni. A expressão destes genes foi avaliada nos estágios de
cercárias, esquistossômulos mecanicamente transformados (EMT-3,5 horas, EMT-24 horas, EMT-48 horas, EMT-72 horas, EMT-5 dias, EMT-7 dias) e vermes adultos. Como normalizador (gene constitutivo) foi utilizado o gene da α-tubulina e a expressão gênica relativa foi determinada pelo método do 2-ΔCt. A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Tukey com P<0,05 no programa GraphPad Prism. As diferenças estatísticas entre os estágios foram determinadas pelos sinais: * diferente de cercária, ** diferente de EMT-3,5 horas, *** diferente de EMT-24 horas, # diferente de EMT-48 horas, ## diferente de EMT-72 horas, ### diferente de EMT-5 dias, & diferente de EMT-7 dias.
Figura 23: Mecanismo proposto da via de silenciamento gênico mediada por miRNAs
no parasito S. mansoni. A via de miRNA envolve grupos de proteínas nucleares e
citosólicas. As proteínas nucleares têm a função de expressar e processar o miRNA primário e posteriormente exportá-lo para o citoplasma. No citoplasma, proteínas processam os precursores de miRNA transformando-os em moléculas ativas aptas a atuarem no processo de regulação da expressão gênica.
Figura 24: Fluxograma da abordagem computacional para identificação de miRNAs conservados e não conservados em S. mansoni
Figura 25: miRNAs maduros em S. mansoni. A frequência de cada nucleotídeo presente
nos miRNAs maduros de S. mansoni estão indicados pelos logos U (uracila), A (adenina),C (citosina), G (Guanina). As posições são indicadas pelos números no eixo x e o tamanho de cada logo indica a relativa freqüência de cada nucleotídeo naquela posição específica.
IX
Figura 27: Características estruturais e termodinâmicas de pré-miRNAs. Os valores utilizados (A) MFE, (B) AMFE, (C) MFEI e (D) Conteúdo de GC foram baseados nos pré-miRNAs depositados no banco de dados miRBase provenientes de diferentes grupos de espécies como Animais, Bilateria, Deuterostômios, Ecdysozoa, Lophotrochozoa, S. japonicum assim como dos pré-miRNAs identificados neste trabalho. As caixas representam 50% dos dados analisados. A extremidade mais baixa do e Box plot é o primeiro quartil ou 25 % e a extremidade mais alta representa o terceiro quartil ou 75 %. A linha horizontal dentro
da caixa representa a mediana e os valores maiores que 1,5 vezes a mediana são os “outliers”.
Figura 28: Características estruturais e termodinâmicas de pré-miRNAs. Os valores utilizados (A) MFEE, (B) Diversidade do conjunto termodinâmico, (C) Freqüência da estrutura de energia mínima livre no conjunto termodinâmico e (D) Tamanho foram baseados nos pré-miRNAs depositados no banco de dados miRBase provenientes de diferentes grupos de espécies como Animais, Bilateria, Deuterostômios, Ecdysozoa, Lophotrochozoa, S. japonicum assim como dos pré-miRNAs identificados neste trabalho. As caixas representam 50% dos dados analisados. A extremidade mais baixa do e Box plot é o primeiro quartil ou 25 % e a extremidade mais alta representa o terceiro quartil ou 75 %. A linha horizontal dentro
da caixa representa a mediana e os valores maiores que 1,5 vezes a mediana são os “outliers”.
Figura 29:Distribuição dos preditos miRNAs nos cromossomos scaffolds de S. mansoni.
A localização relativa de cada pré-miRNAs nos cromossomos de S. mansoni (versão 5.0) mostrou a presença destes em 7 cromossomos autossômicos e um cromossomo sexual (W). As linhas pretas representam os pré-miRNAs em suas respectivas posições. As setas indicam a presença dos dois clusteres encontrados em S. mansoni: sma-mir-71/2 e sma-mir71b/2.
Figura 30: Distribuição filogenética dos miRNAs em genomas animais. Os miRNAs conservados encontrados em S. mansoni foram comparados com seus respectivos ortólogos
em espécies de animais. “X” indica a presença do miRNA em ao menos uma espécie dentro
do clado. Os quadros acima apresentam os nomes de cada família de miRNA. A filogenia simplificada foi baseada em Jones e Blaxter, 2005 (Jones and Blaxter, 2005).
Figura 31: Análise estrutural comparativa entre sma-mir-190 e sja-mir-190. (A) O alinhamento global das estruturas secundárias dos precursores sma-mir-190 e sja-mir-190 foram realizados utilizando os programas ClustalX 2.0 e RNAalifold. Os miRNAs maduros mir-190-3p e mir-190-5p foram mostrados no alinhamento dentro de caixas tracejadas. (B) O dobramento consenso das estruturas secundárias dos precursores sja-mir-190 e sma-mir-190 foi realizado utilizando RNAalifold. Os miRNAs maduros foram representados em uma caixa amarela.
X
Figura 33: Conservação do miRNA sma-mir-10 no grupo Bilateria (a) As relações filogenéticas foram referidas entre os precursores sma-mir-10 e seus ortólogos. A árvore filogenética foi gerada utilizando o método Neighbor-Joining, e o modelo Kimura-2-parâmetros, ambos executados no programa MEGA 4.0. Os clados distintos apresentaram os grupos Deuterostômios, Ecdysozoa e Lophotrochozoa. Somente os “bootstraps” acima de 30 foram considerados para 2000 réplicas analisadas. (b) A alta fidelidade nos alinhamentos entre os precursores sma-mir-10 e seus respectivos ortólogos de Ecdysozoa e Lophotrochozoa foram realizadas usando Clustal 2.0 e RNAalifold. As formas maduras dos miRNAs são mostradas nas caixas cinza.
Figura 34: Conservação do miRNA dos genes sma-mir-71 e sma-mir-71b no grupo Bilateria. (a) As relações filogenéticas foram referidas entre os precursores da família mir-71. A árvore filogenética foi gerada utilizando o método Neighbor-Joining, e o modelo Kimura-2-parâmetros, ambos executados no programa MEGA 4.0. Os clados distintos apresentaram os grupos Deuterostômios (Cephalochordata, Echinodermata e Hemichordata), Ecdysozoa e Lophotrochozoa. Somente os “bootstraps” acima de 30 foram considerados para
2000 réplicas analisadas. (b) A alta fidelidade nos alinhamentos entre os precursores sma-mir-71, sma-mir-71b e seus respectivos ortólogos de Ecdysozoa e Lophotrochozoa foram realizadas usando Clustal 2.0 e RNAalifold. As formas maduras dos miRNAs são mostradas nas caixas cinza.
Figura 35:Clusteres de miRNAs no genoma de S. mansoni. As estruturas secundárias dos
clusteres sma-mir-71/2 e sma-mir-71b/2 foram realizadas por RNAfold (Hofacker, 2009). A posição nos cromossomos, tamanho e direção da fita são mostradas nas caixas cinza abaixo da figura.
Figura 36:Árvore evolutiva e representação dos genes mir-71, mir-2 e mir-13. A árvore representa um esquema dos genes de miRNAs mir-71, mir-2 e mir-13 na escala evolutiva. A disposição destes genes em diversas espécies é representada por barras horizontais com seta indicando a presença do gene. A legenda mostra as formas dispostas na figura e suas denominações. A disposição dos ramos da árvore foi extraída de Hashimoto-Gotoh, 2009.
Figura 37: Análise conservativa das estruturas dos genes cbr-mir-2 e cel-mir-2. A estrutura secundária dos genes é mostrada pelos sinais, “(“, “)”, “.”, acima do alinhamento
global. A estrutura do miRNA maduro conservada é mostrada pelo retângulo pontilhado preto. A região seed do miRNA maduro é mostrada na parte inferior da figura.
Figura 38: Estruturas secundárias dos precursores de miRNAs Protostômios-específicos mir-71, mir-2, mir-13. O programa RNAFold do pacote Vienna foi utilizado para elucidação da estrutura secundária. Os miRNAs maduros são evidenciados por uma caixa cinza.
XI
representa o terceiro quartil ou 75 % dos dados. A linha horizontal dentro da caixa representa
a mediana e os valores maiores que 1,5 vezes a mediana são os “outliers”.
Figura 40: Distribuição evolutiva dos novos mir-13 no grupo Protostômios. As relações filogenéticas foram referidas entre os novos precursores de mir-13 e seus homólogos. A árvore filogenética foi gerada utilizando como método Neighbor-Joining, como modelo Kimura-2-parâmetros e executada no programa MEGA 4.0. Os clados distintos apresentaram os grupos mir-13a e mir-13/13b. Somente “bootstrap” acima de 30 foram considerados para 2000 réplicas analisadas.
Figura 41:Conservação dos novos mir-13 no grupo Protostômios O alinhamento múltiplo de sequência entre os precursores de mir-13 e seus respectivos ortólogos de Ecdysozoa e Lophotrochozoa foram realizadas usando ClustalX 2.0 e RNAalifold. As formas maduras dos miRNAs são mostradas nas caixas cinza.
Figura 42: Conservação dos novos mir-71 no grupo Protostômios (a) As relações filogenéticas foram referidas entre os novos mir-71 e seus ortólogos. A árvore filogenética foi gerada utilizando como método Neighbor-Joining, como modelo Kimura-2-parâmetros e executada no programa MEGA 4.0. Os clados distintos apresentaram os grupos Deuterostômios, Ecdysozoa e Lophotrochozoa. Somente “bootstraps” acima de 30 foram considerados para 2000 réplicas analisadas (b) O alinhamento múltiplo de sequência entre os precursores de mir-71 e seus respectivos ortólogos de Ecdysozoans e Lophotrochozoans foram realizadas usando ClustalX 2.0 e RNAalifold. As formas maduras dos miRNAs são mostradas nas caixas cinza.
Figura 43: miRNAs maduros da família mir-2. Representação Weblogo das sequências maduras dos miRNAs mir-2 e as sequências maduras dos novos miRNAs identificados. A caixa cinza corresponde a região seed dos miRNAs maduros entre os nucleotídeos 2 e 8.
Figura 44: miRNAs maduros da família mir-13. Representação Weblogo das sequências maduras dos miRNAs mir-13 e as sequências maduras dos novos miRNAs identificados. A caixa cinza corresponde a região seed dos miRNAs maduros entre os nucleotídeos 2 e 8.
Figura 45: miRNAs maduros da família mir-71. Representação Weblogo das sequências maduras dos miRNAs mir-71 e as sequências maduras dos novos miRNAs identificados. A caixa cinza corresponde a região seed dos miRNAs maduros entre os nucleotídeos 2 e 8.
Figura 46: RNA total obtido a partir de formas evolutivas do S. mansoni. O RNA total
foi obtido utilizando o kit SV40 a partir de verme adulto (1) e cercária (2)
Figura 47: Plot de amplificação referente à curva de eficiência do gene α tubulina. Em X está demonstrado o valor dos ciclos de PCR e em Y os valor de ∆Rn. Foi utilizado cDNA de
cercária e uma diluição seriada de 4 vezes.
Figura 48: Curva padrão referente ao gene α tubulina. Em X estão demonstrados os
XII
diluição. Os valores de slope e de coeficiente de linearidade estão representados a direita do gráfico. Foi utilizado cDNA de cercária e uma diluição seriada de 4 vezes.
Figura 49: Representação dos termos “GO” associados aos alvos de miRNAs em S. mansoni. Os termos GO foram contados por contagem única representando um total de 127
termos ancestrais GO-Slim.
Figura 50: Expressão gênica dos miRNAs, conservados e não conservados, identificados no genoma de S. mansoni. Os genes (a) sma-mir-124-3p, (b) sma-mir-8-3p, (c)
sma-mir-36-3p, (d) sma-mir-61, (e) sma-mir-125a, (f) sma-mir-190-5p, (g) sma-mir-3479-3pe (conservados) e (h) sma-mir-new10-5p (não conservado)foram avaliados quanto a expressão gênica por qRT-PCR nas fases de cercária, esquistossômulo de 3,5 horas e 24 horas e vermes adultos fêmeas e machos. Como normalizador (gene constitutivo) foi utilizado o gene da U6 e a expressão gênica relativa foi determinada pelo método do 2-ΔCt. A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Tukey com p<0,05 no programa GraphPad Prism. As diferenças estatísticas entre os estágios foram determinadas pelos sinais: * diferente de cercária, ** diferente de EMT-3,5 horas, *** diferente de EMT-24 horas, # diferente de vermes fêmea.
Figura 51: Expressão gênica relativa dos genes alvos Sinoviolina e Inexina. As expressões relativas dos genes sinoviolina e inexina foram analisadas utilizando Real Time PCR nas fases cercária e vermes adultos. Como normalizador (gene constitutivo) foi utilizado
o gene da α-tubulina e a expressão gênica relativa foi determinada pelo método do 2-ΔCt. A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Tukey com P<0,05 no programa GraphPad Prism. As diferenças estatísticas entre os estágios foram determinadas pelos sinais: * diferente de cercária.
Figura 52: Controle da expressão gênica em S. mansoni. A contribuição dos mecanismos
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Hospedeiros intermediários e região de maior endemicidade dos parasitos do gênero Schistosoma.
Tabela 2- Meio 169 com seus componentes e concentração.
Tabela 3: Sequência de primersforward e reverse referente aos genes avaliados, tamanho
do amplicon gerado, eficiência e R2 dos primers utilizados avaliado através de uma
curva de eficiência.
Tabela 4: Expansão dos genes envolvidos na via de silenciamento gênico mediada por miRNAs no genoma de S. mansoni.
Tabela 5: Comparação entre o repertório de miRNAs identificados neste trabalho e os identificados por Simões, 2011.
Tabela 6: miRNAs maduros em S. mansoni.
Tabela 7: Comparação das características dos pré-miRNAs de Lophotrochozoa e S. mansoni.
Tabela 8: Pré-miRNAs de S. mansoni e suas características estruturais e
termodinâmicas.
Tabela 9: Localização dos preditos pré-miRNAs no genoma e nos cromossomos
scaffolds de S. mansoni.
Tabela 10: Sequências preditas dos miRNAs maduros, miRNA mir-2, mir-13 e mir-71, seus respectivos ortólogos no miRBase e suas predições pelos programas MapMi e Mirortho.
Tabela 11: Características estruturais e termodinâmicas dos novos precursores Protostômios-específicos.
Tabela 12: Número de acesso das sequências e oligonucleotídeos iniciadores referentes aos miRNAs avaliados.
Tabela 13: Número de acesso das sequências e oligonucleotídeos iniciadores referentes aos alvos de miRNAs.
XIV
Tabela 15: Ontologia gênica de miRNA em S. mansoni.
Tabela 16: Associação entre os miRNAs identificados em S. mansoni, alvos preditos no
genoma e alguns identificadores.
Tabela 17: Alvos preditos em S. mansoni e S. japonicum usando conservação evolutiva
do pareamento miRNA/3`UTR.
1
CAPÍTULO I
2
I.1 Esquistossomose
I.1.1 Histórico
Embora descoberta em 1851 pelo patologista alemão Theodore Bilharz, o qual confirmou a presença do verme conhecido atualmente como Schistosoma hematobium nas veias mesentéricas de um camponês egípcio autopsiado, ovos de Schistosoma foram encontrados em múmias egípcias datadas de 3500 a.C. Apesar da síndrome de Katayama ter sido descrita por Fuji em 1847, quatro anos antes da descoberta de Bilharz, ela somente foi identificada como a forma aguda de infecção pelo S. japonicum tempos depois(Fuji, 1847). Em 1902, Manson encontrou ovos com espícula lateral em pacientes das Antilhas, admitindo a existência de uma nova espécie de Schistosoma, a qual foi classificada como S. mansoni por Sambon em 1907 (Manson, 1902; Sambon, 1907). Esta mesma espécie teve sua presença confirmada no Brasil, através da descrição de quatro casos, registrados pelo médico e
pesquisador Manuel Augusto Pirajá da Silva, 1908, no artigo intitulado “Contribuição para o estudo da Schistosomíase na Bahia”(Pirajá da Silva, 1908; Passos, 1998).
A palavra Schistosoma é derivada do grego que significa literalmente “corpo fragmentado”, referindo-se a anatomia dióica da maioria das espécies. Existem seis espécies dentro do gênero Schistosoma que infectam seres humanos: S. mansoni, S. hematobium, S.
japonicum, S. intercalatum, S. mekongi e S. malayensis; entretanto, somente uma delas, S. mansoni, existe no Brasil.
3
Tabela 1: Hospedeiros intermediários e região de maior endemicidade dos parasitos do gênero Schistosoma.
Parasito Schistosoma Hospedeiro
intermediário Região de endemicidade
S. mansoni Biomphalaria África, Oriente Médio, Caribe e Sul
da Ásia
S. mekongi Tricula Ásia
S. intercalatum Bulinus África
S. japonicum Oncomelania Ásia
S. haematobium Bulinus África e Oriente Médio
I.1.2 Distribuição geográfica
I.1.2.1 Mundo
4
Figura 1: Esquistossomose e sua distribuição mundial (WHO, 2010) – modificado.
I.1.2.2 Brasil
No Brasil, acredita-se que a esquistossomose mansônica tenha sido introduzida através do tráfico negreiro, tendo como porta de entrada o estado da Bahia. O fluxo migratório que se seguiu em virtude da colonização do país, aliado a não realização de inquéritos coproscópicos por quase meio século no Brasil, contribuíram de maneira significativa, para a disseminação do parasito no país. Além disso, a exploração inadequada de recursos hídricos, a distribuição ampla dos hospedeiros intermediários, a longevidade da doença e a falta de educação em saúde também foram somatórios para esta propagação da esquistossomose (Coura, 2004).
5
Figura 2: Distribuição da esquistossomose mansônica de acordo com a prevalência da
doença no Brasil – Adaptado de (Coura, 2004). 1.2 O ciclo biológico de S. mansoni
O parasito S. mansoni pertence à família Schistosomatidae, classe Trematoda, subclasse Digenea e gênero Schistosoma. Este gênero se difere dos outros da mesma subclasse por apresentar sexos separados (Rey, 2001). O ciclo de vida deste parasito, descrito por Leiper em 1915, é do tipo heteroxênico envolvendo uma passagem por um hospedeiro invertebrado, representado por moluscos do gênero Biomphalaria e um hospedeiro definitivo, representado pela espécie humana, conforme Figura 3 (Verjovski-Almeida et al., 2003).
6
digestivo, adquire seus nutrientes por difusão ou transporte ativo. Os esporocistos mãe desenvolvem-se por multiplicação assexuada gerando numerosos esporocistos-filhos ou esporocistos secundários que irão migrar para o hepatopâncreas do caramujo onde continuarão dando origem à terceira geração de larvas, denominadas cercárias. Atingida a maturidade, estas migram através da hemocele do caramujo para a cavidade do manto, abandonando o caramujo e migrando para a água doce. A cercária possui órgão anterior ou ventosa oral, segmento do corpo e cauda bifurcada para propulsão. Esta última região da cercária, no seu processo de penetração no hospedeiro definitivo, é eliminada. não se alimentando no meio externo possuindo vida curta. Nesta fase a principal fonte de energia para a larva são os estoques de carboidratos principalmente glicogênio (Wilson and Barnes, 1979).
O homem infecta-se por contato com água que contenha cercária. A cercária de Schistosoma deve ultrapassar uma importante barreira mecânica oferecida pela pele do mamífero. Para este fim, a larva infectante é equipada com dois pares de células glandulares, situadas em posição anterior à ventosa ventral e três pares posteriores a ela. O conteúdo destas glândulas é secretado através de ductos que se abrem na porção anterior da larva. O conjunto posterior de glândulas secreta principalmente muco para auxiliar na aderência à pele (Dorsey et al., 2002).
Após a infecção, ocorrem algumas alterações estruturais no parasito em decorrência da mudança de ambiente. Além da perda da cauda o parasito modifica o tipo de respiração (aeróbica para anaeróbica), altera o glicocálix e se metamorfeia atingindo o estágio de esquistossômulo. Os esquistossômulos permanecem nos tecidos da apiderme e derme por 2 a 3 dia. Por volta do quarto dia, se os esquistossômulos não forem destruídos pelo sistema imune do hospedeiroos eles penetram nos vasos sanguíneos sendo carregados passivelmente em direção aos pulmões e coração. Por volta do sétimo e nono dia após a infecção eles atingem o pulmão (Clegg, 1965). A partir do oitavo dia o verme passa por diversos órgãos e já podem ser localizado no sistema porta intra-hepático, onde se alimentam do sangue do hospedeiro definitivo, iniciam a divisão celular crescendo e amadurecendo até o final da terceira-quarta semana (REY, 2001). Decorridas aproximadamente quatro semanas, os vermes se acasalam e começam o processo de oviposição (Cunha, 1970; Roberts, 2000).
7
e a conseqüente liberação de antígenos solúveis pelo ovo no tecido hepático, induz o aparecimento de uma intensa reação inflamatória em torno do ovo, a qual posteriormente, por um processo de fibrose dará origem ao granuloma. Hipertensão portal, esplenomegalia e ascite são ao longo prazo, características marcantes da infecção pelo S. mansoni (Caldas et al., 2008).
A Figura 3 ilustra as macroestruturas formadas nos 3 diferentes habitats do parasito, hospedeiro definitivo, hospedeiro intermediário e ambiente aquático enfatizando os aspectos macromorfológicos distintos de cada estágio.
Figura 3: Ciclo de vida do S. mansoni. Dentro do seu hospedeiro vertebrado, as formas
8
são liberadas na água, as quais são as formas infectantes para o hospedeiro vertebrado (Verjovski-Almeida et al., 2003).
I.3 Genômica e Transcriptômica de S. mansoni
Os primeiros estudos envolvendo o genoma de S. mansoni foram realizados por Simpson em 1982. Ele estimou o tamanho do genoma haplóide do parasito em aproximadamente 2.7 × 108 pares de bases e a porcentagem de sequências repetitivas no genoma em aproximadamente 40% do total (Simpson et al., 1982). Somando esforços para o entendimento do genoma do parasito, Le Paslier construiu uma biblioteca de fragmentos genômicos em vetores BAC para a elucidação de sequências genômicas e aplicação de técnicas de hibridização (Le Paslier et al., 2000).
Até o final de 2003 nenhum projeto em larga escala envolvendo análise do genoma ou transcriptoma tinham sido executados para Platelmintos e menos de 20.000 etiquetas de sequências expressas (ESTs), representando genes do parasito S. mansoni, tinham sido obtidas (Franco et al., 1995; Franco et al., 1997; Rabelo et al., 1997; Franco et al., 2000). No entanto, no final de 2003, um projeto em larga escala liderado pelas agências FAPESP e CNPq permitiram a obtenção de 200.000 sequências que foram agrupadas em 30.000 contigs (conjuntos não redundantes de sequências expressas) e tornadas públicas através do projeto
“S. mansoni EST Genome” (Verjovski-Almeida et al., 2003). Foram estimados 14000 genes neste conjunto de dados apresentando diversos padrões de expressão nas diferentes fases do parasito (Verjovski-Almeida et al., 2003). Em 2009, o Wellcome Trust Sanger Institute e o TIGR finalizaram a montagem do genoma do S. mansoni sem seu completo fechamento. Estes dados estão disponíveis no website do banco de dados GeneDB (http://www.genedb.org) e no NCBI (http://www.ncbi.nih.gov) (Berriman et al., 2009).
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não se restringe a apenas um estágio de vida refletindo toda complexidade do parasito (Berriman et al., 2009).
Outra característica do genoma de S. mansoni é o grande número de elementos repetitivos que somam aproximadamente 40 %. Apesar de até o momento não ser conhecida o impacto desses elementos na biologia do parasito, este percentual tem dificultado o fechamento do genoma gerando fragmentação em scaffolds. Este percentual está bem próximo do encontrado no genoma de seres humanos onde se estima que mais de dois terços do genoma sejam elementos repetitivos (de Koning et al., 2011). Atualmente, o genoma de S. mansoni está fragmentado em 885 scaffolds depositados no genoma versão 5.0 do GeneDB. Esta nova versão do banco de dados disponibiliza uma classificação funcional dos transcritos preditos e sequenciados pelo Gene Ontology (GO). Esta representação gênica confirma a presença de genes associados e/ou homólogos a eucariotos e processos específicos dos metazoários, como diferenciação eixo anterior-posterior, dorso-ventral, epitélio, processo neural, mobilidade, diferenciação sexual, maturação, longevidade, parasitismo, evasão imune e resposta ao estresse.
Atualmente, com a disponibilidade de quase 200.000 ESTs, aliado ao projeto genoma do S. mansoni, em fase final de conclusão, o Schistosoma integra-se à categoria dos organismos com os quais se podem utilizar técnicas modernas para, por exemplo, identificar genes estágios-específicos, avaliação global dos efeitos causados por drogas sobre o metabolismo do parasita, entre outros (Oliveira et al., 2008; Berriman et al., 2009). Neste contexto, surge a possibilidade do estudo dos transcritos nas diferentes fases de ovos, cercária, miracídio, esquistossômulos, esporocistos e vermes adultos, permitindo a identificação de genes estágios-específicos bem como as vias de regulação da transcrição envolvidas durante o ciclo biológico deste parasito.
I.4 Regulação da expressão gênica em S. mansoni
10
consequentemente no controle da expressão gênica ao nível transcricional (Berger, 2007). Processos pós-transcricionais envolvem principalmente interações proteína-RNA e RNA-RNA desencadeando um arraste na expressão do gene ou sua degradação. Estes processos pós-transcricionais podem envolver adição de cauda poli-A, adição de 5`CAP, splicing, edição do transcrito primário e silenciamento gênico por pequenos RNAs (Keene, 2007).
O S. mansoni apresenta um ciclo biológico bastante peculiar, no qual diversas alterações bioquímicas e morfológicas ocorrem no parasito para que ele complete um ciclo biológico. Acredita-se que estas mudanças são adaptações evolutivas desenvolvidas pelo parasito para sobrevivência em distintos ambientes, como na água e interior dos hospedeiros. sendo possível apenas devido a expressão de um conjunto de genes coordenadamente, em cada estágio, a fim de permitir a adaptação do parasito aos seus ambientes. Trabalhos recentes têm mostrado que o perfil de transcritos e a atividade transcricional no parasito S. mansoni modificam significantemente entre seus diferentes estágios (Fitzpatrick et al., 2009). Uma das formas viáveis e de mais fácil alcance para estudar o padrão de expressão gênica é o estudo do transcriptoma. Este tem propiciado a descoberta de novos genes, elaboração de modelos gênicos, desenho de sondas de microarranjos, clonagem de genes de interesse e outras informações pertinentes para o entendimento da biologia da célula (Brindley and Pearce, 2007; Wilson et al., 2007). Plataformas de microarranjos e SAGE (Serial analysis of gene expression) vêm sendo utilizadas extensivamente para analisar o transcriptoma do parasito evidenciando padrões de expressão de genes estágio-específico (DeMarco et al., 2006; Ojopi et al., 2007; Parker-Manuel et al., 2011). A expressão transitória de genes é totalmente dependente das funções e atividades realizadas pelo organismo em determinado estágio de vida. Por exemplo, genes envolvidos com o remodelamento corporal e formação de tegumento externo se mostraram altamente expressos em esquistossômulos (Parker-Manuel et al., 2011).
11
relacionada a alterações na regulação da expressão gênica (Han et al., 2009). A figura 4 resume a distribuição dos genes estágios-específicos em S. mansoni.
Figura 4: Expressão gênica estágio-específico em S. mansoni. A figura representa os genes
altamente expressos estágios-específicos baseados nos projetos transcriptoma do parasito (Han et al., 2009).
12
empregada na tecnologia de RNA interferente desvendando soluções para genética reversa, genômica funcional, terapia gênica, desenvolvimento de animais modelo, estudos do comportamento, validação de alvos para novas drogas e o combate a patógenos (Denli and Hannon, 2003; Baum and Craig, 2004).
I.5 microRNAs
I.5.1 Histórico e Origem
Os microRNAs foram descobertos em 1993 por Victor Ambros, Rosalind Lee e Rhonda Feinbaum durante um estudo sobre a participação do gene lin-14 no desenvolvimento do nematódea Caenorhabditis elegans que levou a descoberta de que este gene era regulado por um pequeno RNA, transcrito como um precursor com 61 nucleotídeos a partir do gene lin-4. Este estudo também evidenciou que esta pequena molécula de RNA continha sequências parcialmente complementares à região 3´UTR do mRNA lin-14 e que esta complementaridade era suficiente e necessária para inibir a tradução do mRNA lin-14. (Lee et al., 1993). Esta descoberta permitiu a caracterização de um novo mecanismo de regulação da expressão gênica liderado por pequenos miRNAs maduros de aproximadamente 22 nucleotídeos. Entretanto, somente em 2000, foi descoberto um segundo miRNA, let-7, que reprimia a tradução de lin-41, lin-14, lin28, lin42 e daf12 atuando durante os estágios de desenvolvimento larval do C. elegans (Reinhart et al., 2000). Devido ao papel de ambos miRNAs no controle do desenvolvimento, foram também denominados de pequenos RNAs temporais, ou small temporal RNAs (stRNAs)(Ambros, 2000).
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cluster mir-17-92 atuam como oncogenes modulando a formação de tumor por influência na tradução do gene E2F1 (Hayashita et al., 2005).
O modelo atual para a biogênese de miRNAs propõe duas etapas: uma intranuclear e uma citoplasmática e encontra-se esquematizada na Figura 5. Na etapa intranuclear os miRNAs podem ser transcritos individualmente por uma RNA polimerase (II principalmente e ocasionalmente III) ou a partir de blocos de sequências genômicas denominadas clusteres (Zhang et al., 2009b). Estes miRNAs se formam a partir de um produto primário complexo, com várias características peculiares, tornando-os reconhecíveis pela maquinaria no meio intranuclear. Geralmente, os pri-miRNAs são processados liberando um intermediário com estrutura secundária em forma de grampo com aproximadamente 60-70 nt, denominado pré-miRNA (precursor de pré-miRNA). Esta clivagem é realizada por um micro complexo liderado pela enzima RNase III Drosha, que cliva ambas as fitas do pri-miRNA em sítios próximos à base da estrutura em forma de grampo, gerando um pré-miRNA (Lee et al., 2003).
A seguir, o pré-miRNA é transportado de forma ativa, com gasto de GTP, do núcleo para o citoplasma, pelo complexo Ran-GTP/Exportina-5. Para tal transporte, têm sido relatadas duas proteínas responsáveis: XPO-5 e XPO-1 (Castanotto et al., 2009; Bussing et al., 2010). A direção deste transporte, geralmente, é unidirecional, sempre do núcleo para o citoplasma. Recentemente, foi sugerida a participação da proteína XPO-1 no transporte também de miRNAs em D. melanogaster e C. elegans, no sentido inverso, do citoplasma para o núcleo (Castanotto et al., 2009; Bussing et al., 2010). O pré-miRNA, após o transporte para o citoplasma, é processado pela enzima Dicer, juntamente com uma proteína ligante de RNA fita dupla, que em D. melanogaster é chamada Loquacious e R2D2, e em C. elegans, R3D1 (Saito et al., 2005). De acordo com este modelo, a especificidade da primeira clivagem determina a posição correta da segunda clivagem do pré-miRNA, definindo assim, ambas as extremidades do miRNA (Lee et al., 2003).
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Inicialmente, os miRNAs foram encontrados em associação com um complexo ribonucleoprotéico denominado miRNP (miRNA ribonuclein complex), que em humanos inclui a proteína Ago1, a helicase GEMIN3 e GEMIN4 e em D. melanogaster inclui a Ago1, Fmr1, Tudor-SN e VIG (Mourelatos et al., 2002; Meister and Tuschl, 2004). Desta forma, foi sugerido que o complexo miRNP corresponde ao RISC, que direciona a clivagem de mRNAs no mecanismo de silenciamento de RNA por meio do decapeamento e retirada da cauda de poli-A.
Uma vez incorporado ao RISC, o miRNA vai direcionar a clivagem específica de mRNAs complementares ou reprimir sua tradução em corpos citoplasmáticos chamados corpos P (Meister and Tuschl, 2004; Naqvi et al., 2009) (Figura 5). miRNAs em animais, geralmente, atuam como repressores da tradução de determinados genes por pareamento não perfeito na região 3`UTR, embora, outros estudos tem mostrado sítios funcionais em regiões codificadoras e/ou regiões 5`UTR (Lai, 2002; Lytle et al., 2007).
Vale a pena ressaltar que, recentemente, foi descrita uma via alternativa de processamento de miRNA à partir de regiões intrônicas. Este miRNAs, denominados mirtrons, são processados diretamente a pré-miRNAs pela maquinaria de splicing evitando a primeira passagem pelo complexo enzimático comandado pela proteína RNAseIII Drosha (Westholm and Lai, 2011). Posteriormente o processamento do miRNA de origem intrônica segue a mesma via descrita acima e ilustrada pela Figura 5.
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I.5.2 Estratégias de Predição e Validação de miRNAs
A descoberta dos miRNAs, seja por estratégias computacionais ou experimentais, não tem sido considerada uma tarefa fácil trazendo vários problemas associados. Os problemas dirigidos à predição e validação dos miRNAs, a partir de sequências genômicas e/ou transcriptômicas, tem como exemplos: a presença de RNA não codificadores de proteínas com características semelhantes aos miRNAs, posição e orientação não conservada dos miRNAs no genoma, tamanho pequeno das sequências maduras e precursoras, baixa expressão relativa em alguns organismos ou estágios de vida, presença de miRNAs estágio ou espécie específicos, entre outros. Devido a este grande número de fatores, a construção de metodologias robustas e específicas (às vezes organismo-específico) se torna necessária, tanto para predição e validação dos miRNAs quanto para seus alvos.
O número de genes que codificam miRNAs inicialmente foram subestimados em menos de 1% do número total de genes (Lim et al., 2003). Em trabalhos posteriores, este número cresceu exponencialmente tornando esta classe de RNA uma das maiores classes de moléculas regulatórias em animais (Berezikov et al., 2005). Atualmente, C. elegans e D. melanogaster, possuem mais de 200 genes que codificam miRNAs, enquanto seres humanos possuem aproximadamente 1500 genes (miRBase versão 18.0 – outubro 2011).
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predição de miRNAs baseados na utilização de filtros (específicos de características dos miRNAs), aprendizado de máquinas, homologia ou ab initio. Os métodos baseados em filtros circundam um número diverso de características aplicadas para moléculas de miRNAs diferenciando-as de outros tipos de moléculas no genoma. Dentre estas características, as denominadas estruturais e termodinâmicas, são as mais utilizadas para tal predição. Exemplos destas características são: conteúdo de GC na sequência do pré-miRNA, energia mínima livre da estrutura secundária do precursor de miRNA, localização da molécula precursora no genoma, conservação evolutiva da região madura, etc. Entre os programas que utilizam estas características para predição estão miRScan, MIRSCANII, MIRSEEKER, entre outros (Lai et al., 2003; Lim et al., 2003). Outra abordagem, bastante empregada para identificação de miRNAs, é o treinamento de aprendizado de máquina. Este método utiliza informações de grupos de sequências provindas de miRNAs reais e de grupos de sequências genômicas randômicas não composta por miRNAs utilizadas para o treinamento das máquinas no reconhecimento destas classes distintas. Assim, os candidatos a miRNAs são comparados aos grupos de sequências e uma probabilidade é aplicada classificando-os entre miRNA real ou miRNA não real. Exemplos de aprendizado de máquina utilizados são: MiRFinder, MiPred, MIRCOS, dentre outros (Huang et al., 2007; Jiang et al., 2007; Sheng et al., 2007).
