AISLAMIENTO DEL VIRUS MERMET EN GUATEMALA
Ernesto Gutiérrez V., M.D.‘, Charles H. Calisher, Ph.D?, Kathryn S. C. Maness, B.S? y Rexford D. lord, Sc.D.4
En 1969 se aisld en Guatemala el virus Mermet de la sangre de un pájaro. Este es el sexto aislamiento del virus, proveniente de aves, informado hasta ahora en el Continente Americano, y el primero en el sur de Norteamérica.
Introducción
El virus Mermet, del grupo Simbú, en el supergrupo Bunyamwera, es un arbovirus que se aisló por primera vez de la sangre de una golondrina (Progne subis) capturada en Metropolis, Illinois, en 1964. En total se han aislado e identificado cinco cepas de este virus que se han informado en el mismo trabajo (1). No hay nada en la literatura que indique que el virus haya sido aislado de otros vertebrados o de mosquitos (2).
No se ha dado ninguna evidencia de infección en vertebrados en las encuestas serológicas efectuadas en el área donde se capturaron tres de los cinco pájaros a partir de los cuales se aisló el virus (1).
Este trabajo se refiere al aislamiento del virus Mermet de un pájaro no migratorio capturado en Zacapa, departamento de Zacapa, Guatemala.
Materiales y métodos
Como parte del trabajo de investigación ecológica llevado a cabo durante la epidemia de encefalitis equina venezolana (EEV) que surgió en Guatemala, en 1969, la Unidad de Ecología de Arbovirus del Centro para el Control de Enfermedades (CDC), Atlanta, Georgia, EUA, capturó vertebrados y mos- quitos en una zorra descrita previamente (3).
1 Becario de la Organización Panamericana de la Salud en el Centro para el Control de Enfermedades, Atlanta, Georgia, EUA. Jefe del Departamento de Virus, Instituto Nacional de Higiene “Leopoldo Izquieta Pkez”, Guayaquil, Ecuador.
2 Jefe, Arbovirus Referente Branch, Vector-Borne Diseases Division, Bureau of Laboratories, Centro para el Control de Enfermedades, Fort Collii, Colorado, EUA.
* Centro para el Control de Enfermedades, Atlanta, Georgia, EUA.
4Centro Panamericano de Zoonosis (CEPANZO), Ramos Mejfa, Buenos Aires, Argentina.
En seis días se capturaron entre los vertebra- dos 24 especies de aves, que representaban ll familias. Las aves fueron atrapadas con redes invisibles, tipo japonesa; sangradas de la vena yugular; marcadas y puestas en libertad, tal como se ha descrito antes (4). En total se capturaron 10 orioles Altamira Lichtenstein (Icterus guluris), tres de ellos el 13 de agosto, de un total de 22 aves capturadas ese día.
Igualmente se tomaron muestras de sangre de humanos en tres diferentes zonas de Guatemala. La sangre fue tomada por veni- puntura antecubital dentro de un tubo estéril y al vacío. Luego las muestras fueron diluidas, centrifugadas y separadas en el campo, y los sueros se guardaron en hielo seco y se enviaron al CDC. Los especímenes fueron inoculados intracerebralmente en ratones lactantes (RL) de dos a cuatro días de edad para intentar el aislamiento de virus. Seis de seis ratones inoculados con 0.02 ml de suero de un Icterus gularis se encontraron postrados o muertos al quinto día. Se trataba de una hembra adulta que fue capturada el 13 de agosto de 1969. Este aislamiento fue denominado ZG-37.
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ción del líquido ascítico se prescindió del uso del adyuvante porque este produce reacciones anticomplementarias en la prueba de FC (8).
El virus fue titulado en RL y en ratón adulto (RA) de tres semanas de edad por vías intracerebral e intraperitoneal. También se estudió su morfología y su tamaño con el microscopio electrónico.
Se realizaron pruebas de inhibición de hemaglutinación (IH) siguiendo el método en microtécnica de Clarke y Casals (6).
La prueba de neutralización por reducción de la formación de placas en células Vero, linea estable de riñón de mono verde africano (Cercopithecus aethiops), fue efectuada en la modalidad virus constante-suero diluido. Se usaron aproximadamente 100 unidades for- madoras de placas. Los sueros se inactivaron a 56°C por 30 minutos y luego se diluyeron desde 1: 5 hasta 1: 1,280. La mezcla suero- virus fue incubada a 37’C por 60 minutos y luego inoculada en cantidad de 0.1 ml por hoyo en paneles de seis hoyos. Se permitió que esta mezcla se absorbiera en la mono- capa de células dejándolas a 35°C durante una hora. Después se agregó una primera capa de agarosa (50% de agarosa al 2% + 50 % de medio de crecimiento con COtHNa al 7 %). Tres días después de haberlas in- incubado a 35°C en atmósfera de COZ se agregó una segunda capa de agar (50% de agar Noble al 2% + 50% de medio de crecimiento con C03HNa al 7% y rojo de neutral 1: 30,000). Después de 24 horas de incubación a 35°C en atmósfera de COZ se leyeron los resultados y se consideró como significativa la reducción de la formación de 90 % o más de las placas.
En la Unidad de Investigación de Arbo- virus de la Universidad de Yale (YARU) se efectuaron pruebas FC por el método de Casals (9).
Resultados y discusión
Los títulos de la cepa ZG-37 en RL, por vías intracerebral e intraperitoneal, y en RA por las mismas vías, fueron respectivamente:
9.8, 6.7,7.7 y 6.3 por ml DLsO. Como puede observarse, se obtuvieron títulos más altos por vía intracerebral que por la intra- peritoneal.
El virus fue sensible al éter y al DCS. El índice de sensibilidad fue de 2.6 en la primera prueba y de 3.6 en la segunda.
Las observaciones hechas por el Dr. Frederick A. Murphy, de la Sección de Viropatología del CDC, con el microscopio electrónico, mostraron que el virus tenía morfología compatible con el supergrupo Bunyamwera.
Estudios histopatológicos de ratones in- fectados, realizados por el Dr. Martin D. Hicklin, Unidad de Patología del CDC, revelaron células necróticas individualizadas en la corteza cerebral, hemorragia en la médula espinal a nivel torácico y encefalitis difusa de bajo grado.
El antígeno extraído con sucrosa-acetona produjo hemaglutinación de los glóbulos rojos de un ganso hembra (Anser cinereus) hasta una dilución de 1: 60 con un pH óptimo de 6.0 tanto a 4°C como a 37°C.
Una primera prueba de IH contra los siguientes antisueros dio resultados nega- tivos: grupo A, grupo B, encefalitis equina del este (EEE), encefalitis equina del oeste (EEO), San Luis (ESL), fiebre amarilla, Ilheus, Guama, Bussuquara, Bunyamwera, Nilo occidental y Sindbis.
Una prueba de FC con antisueros de los grupos más representativos dentro de los arbovirus (A, B, C, California, Guama, Simbú, Bunyamwera, Turlock, Tacaribe, Palyam, Capim, Tete, estomatitis vesicular (VSV), Bwamba y Eretmapodites) y también rabia, coriomeningitis linfocítica y un poli- valente rabdovirus, mostró una franca reac- ción positiva (1:32) tanto con el grupo Simbú como con el líquido ascítico homó- logo. Todos los demás fueron negativos. La prueba fue duplicada con el antígeno diluido 1: 4 y 1: 16‘~ los sueros lo fueron desde 1: 4 hasta 1: 32.
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CUADRO l-Resultados de la prueba de fijación del complemento entre el líquido ascítico ZG37a contra todos los antígenos del grupo Simbú y su homólogo ZG37.
Antígenosb Resultados
Aino 0
Akabane 0
Buttonwillow 0
Ingwavuma 1:16
Manzanilla 1:64
Mermet 1:32
Oropouche 1:s
Sabo 0
Sango 0
Sathuperi 0
Shamonda 0
Shuni 0
Simbú 0
Thhnii 0
Utinga 0
Yaba 7 0
ZG-37 1:32
a Líquido ascítico diluido desde 1:s hasta 1:256. b Antígenos diluidos l:& y 1:32.
grupo Simbú se procedió a buscar la identi- ficación definitiva.
En el cuadro 1 se dan los resultados de la prueba de FC en que el líquido ascítico ZG-37 fue probado contra todos los antí- genos del grupo Simbú y su homólogo.
Los resultados indicaron que la cepa ZG-37 podría corresponder a Manzanilla o a Mermet, virus que están muy relacionados antigénicamente. Igual relación existe entre los dos mencionados e Ingwavuma (Z). La reacción con Oropouche fue más débil; sin embargo, era necesario aclarar el papel que pudiera desempeñar este virus en la identifi- cación de la cepa.
CUADRO a-Reacciones cruzadas en la prueba de fijación del complemento entre la cepa ZG37 y algunos arbovirus del grupo Simbá.
Anticuerpos a: Man- Oro- Antígenos ZG-37 Mermet zanilla pouche
ZG-37 >1024 16
Mermet E 512 16 :
Manzanilla 32 al024 16 0
Oropouche 0 32 õ - 32
0=<8.
CUADRO 3-Reacciones cruzadas en la prueba de inhibición de hemaglutinación entre la cepa ZG37 y algunos arbovicus del grupo Siibú.
Anticuerpos a:
Man- OIO-
Antígenos ZG37 zanilla Mennet pouche
ZG-37 160 80 <lO <lO
Manzanilla 160 80 <lO <lO Mermet
1:: 40 160 80
Oropouche <lO 320 - 320
El cuadro 2 muestra los resultados de la prueba de FC en “tablero de ajedrez” (titulación en cajón) con los virus Mermet, Manzanilla, Oropouche y la cepa ZG-37. No se incluyó Ingwavuma porque se con- sideró que, de acuerdo con la distribución de los arbovirus del grupo Simbú en las diferen- tes zonas zoogeográficas del globo (ZO), no correspondía al Continente Americano.
Esta prueba mostró una reacción un poco más fuerte con Mermet que con Manzanilla, especialmente antisuero Mermet versus an- tígeno ZG-37 en relación con antisuero Manzanilla versus antígeno ZG-37.
Sin embargo, en la prueba de IH, también titulación en cajón, tal como se muestra en el cuadro 3, la reacción fue evidentemente positiva entre la cepa ZG-37 y el virus Manzanilla.
La prueba de neutralización, cuyos resul- tados se señalan en el cuadro 4, aclaró el problema en forma definitiva. La reacción fue más fuerte en ambas direcciones entre
CUADRO 4-Reacciones cruzadas en la prueba de neutraliza&n por reducción de la formación de placas en céhdas Vero entre la cepa ZG37 y algunos arbovirus del grupo Siibú.
Anticuerpos a:
Man- Ingwa- virus ZG-37 Mermet zanilla vuma
ZG-37 640 1280 320 5
Mermet 1280 1280 1280 320
Manzanilla 40 80 320 <5
Ingwavuma 40 160 40 !!l
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la cepa ZG-37 y el virus Mermet que entre aquella y el virus Manzanilla.
Este aislamiento amplía el espectro de distribución geográfica del virus Mermet hasta los 15” de latitud norte y señala su presencia en la zona neotropical. Todos los aislamientos anteriores procedían de los Estados Unidos, de lugares ubicados entre los 38 y 33” de latitud norte (1).
Desde el punto de vista de las condiciones ecológicas, estas son diferentes en Zacapa, donde predomina una vegetación xerofitia, de aquellas que existen en los lugares donde el virus Mermet se había aislado antes (II). Sin embargo, las capturas de aves se hicieron con preferencia en árboles tropicales de unos seis metros de altura y en arbustos que crecen en los barrancos de un riachuelo que cruza la zona. Más allá de los barrancos crecen los cactus y espinales propios de la vegeta- ción xerofitia.
Los resultados del trabajo de laboratorio con mosquitos y vertebrados capturados en Zacapa y otras zonas de Guatemala en 1969 (3) no habían mostrado aislamientos de virus diferentes del venezolano. El informe de dos aisla_mientos de un virus del grupo Anopheles A en dos caballos sangrados en diferentes zonas de Guatemala como parte del mismo trabajo de campo que se menciona aquí, será objeto de otra publicación.
Setenta y siete sueros humanos divididos en dos grupos, uno procedente del departa- mento de Santa Rosa y otro del departa- mento de Jutiapa, fueron probados contra la cepa ZG-37. Se utilizó la prueba de neu- tralización por reducción de la formación de placas en células Vero. Ambos grupos in- cluyeron individuos de ambos sexos y de diferentes edades. Ninguno de ellos mostró anticuerpos contra ZG-37.
Este aislamiento confirma el aserto (1) de que las ‘(aves parecen ser huéspedes vertebra- dos significativos” del virus Mermet.
Resumen
Se da cuenta del aislamiento del virus Mermet de la sangre de un oriol Altamira Lichtenstein (Icterus gularis) capturado en Zacapa, Guatemala, en 1969.
La captura se efectuó como parte del trabajo de campo realizado por la Unidad de Arbovirus del Centro para el Control de Enfermedades (CDC), Atlanta, Georgia, EUA, durante la epidemia de encefalitis equina venezolana de ese año.
Como sistema de aislamiento se empleó el ratón lactante. Se realizaron pruebas de sensibilidad al éter y al deoxicolato de sodio (DCS). Se prepararon, asimismo, antígeno extraído con sucrosa-acetona y líquido ascí- tico inmune en ratón. Para identificar la cepa se realizaron pruebas de inhibición de hema- glutinación, fijación del complemento y de neutralización por reducción de la formación de placas en cultivo de tejidos.
Esta cepa, denominada ZG-37, fue sensi- ble al éter y al DCS. El antígeno produjo hemaglutinación de los hematíes de ganso. La prueba de neutralización permitió su identificación como correspondiente al virus Mermet.
Este es el primer aislamiento del virus Mermet fuera de los Estados Unidos y el primero, también, en la región neotropical.
Este aislamiento ratifica el papel de las aves como huéspedes vertebrados impor- tantes del virus Mermet y de los arbovirus en general. q
Agradecimientos
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REFERENCIAS
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Isolation of the Mermet virus in Guatemala (Summary)
The article gives an account of the isolation of the Mermet virus from the blood of an Alta- mira Lichtenstein oreole (Zcterus gularis) cap- tured at Zacapa, Guatemala, in 1969.
complement fixation and neutralization by re- duction of plate formation in tissue cultures were carried out.
The bird was caught as part of the field work carried out by the Arbovirus Unit of the Center for Disease Control (CDC), Atlanta, Georgia, U.S.A., during the 1969 Venezuelan equine en- cephalitis epidemic.
The strain, ZG-37, was sensitive to ether and to sodium deoxycholate. The antigen produtid hemagglutination in goose erithrocytes. The neutralization test confirmed its identitication as belonging to the Mermet virus.
For the isolation procedure, suckling mice were used. Tests of sensitivity to ether and to sodium deoxycholate were made, and antigen extracted with sucrose-acetone and mouse im- mune ascitic fluid were prepared. To identify the strain, tests of hemagglutination inhibition,
This is the tist time that the Mermet virus has been isolated outside the United States, and the first time also in the Neotropical region. The discovery confirms the role played by birds as important vertebrate hosts of the Mermet virus and of arboviruses in general.
Isolamento do virus Merm let na Guatemala (Resumo)
Os autores däo conta do isolamento do vírus Mermet do sangue de um papa-figo Altamira Lichtenstein (Zcterus gularis) capturado em Zacapa, na Guatemala, em 1969.
A ave foi capturada como parte do trabalho de campo realizado pela Unidade de Arbovírus do Centro de Controle de Enfermidades (CDC) de Atlanta, Geórgia; Estados Unidos da Ame- rica, durante a epidemia de encefalite eqiiino- venezuelana verificada naquele ano.
Como sistema de isolamento foi empregado o
rato lactante. Foram realizadas provas de sensi- bilidade ao éter e ao dexicolato de sódio (DCS). Foram também preparados antígeno extraído com sacarose-acetona e líquido ascítico imane
em rato. Para identificar a variedade, reali- zaram-se provas de inibicão da hemaglutinaciio, fixacáo do complemento e neutraliza9áo me- diante a reducáo da forma&0 de placas em cul-
tura de tecidos.
Gutiérrez V. et al. - AISLAMIENTO DEL VIRUS MERMET 29
produziu hemaglutina&o das hemácias de Mermet fora dos Estados Unidos, e também a ganso. A prova de neu&&@o pe&tiu iden& pheha numa wS0 neotropi=l.
ficá-la como correspondente ao vírus Mermet. aves como hóspedes vertebrados importantes 0 isolamento referido confirma o papel das Foi essa a primeira vez que se isolou o vírus do vírus Mermet e dos arbovírus em geral.
Isolement du virus Mermet au Guatemala (Résumé)
Le présent article fait état de l’isolement du virus Mermet dans le sang d’un loriot Altamira Lichtenstein (Zcterus gularis) capturé à Zacapa, Guatemala en 1969.
La capture eut lieu dans le cadre du travail sur le terrain réalisé par 1’Unité des Arbovirus du Centre de lutte centre les maladies (CDC), Atlanta, Géorgie, Etats-Unis d’Amérique, pen- dant l’épidémie d’encephalite équine qui sévit cette année-là.
Pour I’isolement: on recourut k la ratte gra- vide. Les intéressés effectuèrent des épreuves de sensibihté à l’éther et au déoxycolate de so- dium (DCS). Ils préparèrent également un antigène extrait avec de l’acétone et du liquide acétique immun chez la ratte. Pour identi6er la
souche, ils firent des épreuves d’inhibition par hémoaglutination, de íixation du complément et de neutralisation par réduction de la forma- tion de plaques en culture de tissus.
Dénomée ZG-37, cette souche fut sensible & I’éther et au DCS. L’antigène produisit l’hémo- aglutination des hématies de l’oie. L’épreuve de neutralisation permit de l’identitìer comme correspondant au virus Mermet.
C’est la premiere fois que le virus Mermet a été isolé en dehors des Etats-Unis et de la région néotropicale.
