UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DIEGO ROCHA SILVA
“CLONAGEM, EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E
CARACTERIZAÇÃO DA HEAT SHOCK PROTEIN BETA 8
(HSPB8) DE AEDES AEGYPTI”
CAMPINAS 2018
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DIEGO ROCHA SILVA
“
CLONAGEM, EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E
CARACTERIZAÇÃO DA HEAT SHOCK PROTEIN BETA 8
(HSPB8) DE AEDES AEGYPTI”
Dissertação de mestrado
apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Funcional e Molecular, na área de Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos
ESTE EXEMPLAR
CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO DIEGO ROCHA SILVA E ORIENTADA PELO PROF. DR. CARLOS HENRIQUE INÁCIO RAMOS.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Silva, Diego Rocha,
Si38c SilClonagem, expressão, purificação e caracterização da heat shock protein beta 8 (HspB8) de Aedes aegypti / Diego Rocha Silva. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
SilOrientador: Carlos Henrique Inacio Ramos.
SilDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Sil1. Chaperonas moleculares. 2. Proteínas de choque térmico. 3. Proteínas de choque térmico pequenas. I. Ramos, Carlos Henrique Inacio, 1967-. II.
Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Cloning, expression, purification and characterization of heat shock
protein beta 8 from Aedes aegypti
Palavras-chave em inglês:
Molecular chaperones Heat shock proteins
Heat-shock proteins, Small
Área de concentração: Bioquímica
Titulação: Mestre em Biologia Funcional e Molecular Banca examinadora:
Carlos Henrique Inacio Ramos [Orientador] Juliana Ferreira de Oliveira
Jörg Kobarg
Data de defesa: 19-09-2018
Programa de Pós-Graduação: Biologia Funcional e Molecular
COMISSÃO EXAMINADORA
Profª. Dra. Juliana Ferreira de Oliveira
Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos
Prof. Dr. Jorg Kobarg
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, em primeiro lugar, ao Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos por ter me dado a oportunidade de trabalhar em seu laboratório e pela excelente orientação neste período. Tenho muito a agradecer aos meus colegas de trabalho pelo profissionalismo, proatividade e união. Foi ótimo trabalhar com todos vocês neste período.
Eu gostaria de agradecer também à minha namorada Ludimila, à minha família e aos meus amigos por tudo; não só pelo conforto nos momentos difíceis, mas por serem responsáveis em grande parte pelo que sou hoje.
Agradeço ao CNPq pelo auxílio financeiro e à Universidade Estadual de Campinas pela infraestrutura fornecida.
“There's some good in this world, Mr. Frodo ... and it's worth fighting for.” - Samwise Gangee The Lord of the Rings: The Two Towers
Resumo
Chaperonas moleculares são um grupo de proteínas fundamentais para a manutenção da homeostase proteica celular. Estas ajudam outras proteínas a se enovelarem corretamente e sendo classificadas como holders, foldases ou desagrases, de acordo com a função específica. As small heat shock proteins (sHsps) são uma família de chaperonas moleculares as quais atuam como holders, ou seja, têm a capacidade de se ligar a proteínas clientes parcialmente enoveladas, impedindo sua agregação. Neste trabalho, visamos investigar, obtendo parâmetros hidrodinâmicos e ensaios funcionais, a proteína HspB8, uma sHsp de Aedes aegypti, um transmissor dos vírus Zika (ZIKV), Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV) e Febre Amarela. (YFV). Em humanos, camundongos e em Drosophila melanogaster sabe-se que a HspB8 desempenha um papel essencial para a manutenção de importantes funções celulares e a sua desregulação tem relação com doenças neurodegenerativas e câncer. O gene para a expressão da HspB8 foi clonado em vetor pET28a e a proteína foi expressa em Escherichia coli BL21. Os procedimentos de purificação da HspB8 consistiram em uma cromatografia de afinidade ao níquel e, em seguida, uma cromatografia de exclusão por tamanho e a proteína foi obtida com elevado grau de pureza. Experimentos de espectropolarimetria de dicroísmo circular mostraram que a proteína foi produzida enovelada e foi estável até 40 °C. A proteína em estudo contém 27% de conteúdo α-helicoidal. Além disso, os testes feitos usando cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a espalhamento de luz multi-ângulo (SEC-MALS) e espalhamento de luz dinâmico (DLS), mostrou que a HspB8 comportou-se como um monômero não esférico com massa molecular de 24 kDa, tendo raio hidrodinâmico de 33 Å e um coeficiente de difusão de aproximadamente 6,3 cm² s-1. A HspB8 foi capaz de proteger diversas proteínas contra agregação inclusive contra a formação de fibrilas do tipo amiloide em experimentos com α-sinucleína humana. Os resultados aqui apresentados trazem informações importantes e inovadoras para um melhor entendimento das sHsps, visto que, a AaHspB8 se apresenta com características conformacionais que diferem das tradicionais para esta classe de proteínas.
Abstract
Molecular chaperones are a group of proteins that are essential for the maintenance of cellular protein homeostasis by helping other proteins to reach the correct folding. Chaperones can be classified as holders, foldases or disaggregases according to the specific function. Small heat shock proteins (sHsps) are a family of molecular chaperones that act as holders, binding to partially folded proteins preventing their aggregation. In this work, we aimed to investigate the structure and function of a sHsp from Aedes aegypti named AaHspB8. Aedes aegypti is the vector for Zika (ZIKV), Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV) and Yellow Fever viruses (YFV). In humans, mice and in Drosophila melanogaster it is known that HspB8 plays an essential role for the maintenance of important cellular functions and their deregulation is related to neurodegenerative diseases and cancer. The gene for AaHspB8 was cloned into pET28a vector and the protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) strain. The procedures for purification consisted of a nickel affinity chromatography and a size exclusion chromatography, respectively, and the protein was 95% pure. Circular dichroism spectropolarimetry experiments showed that the protein was 27% alpha-helical and stable at 40 °C. In addition, tests performed using size exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (SEC-MALS) and dynamic light scattering (DLS) showed that AaHspB8 was a non-spherical monomer with 24 kDa, having a hydrodynamic radius of 33 Å and a diffusion coefficient of approximately 6.3 x 10-7 cm² s-1. AaHspB8 was able to protect several proteins against aggregation including the formation of amyloid-like fibrils in experiments with human alpha-synuclein. The results presented here provide important and innovative information for a better understanding of sHsps, since AaHspB8 presents with conformational characteristics that differ from the traditional ones for this class of proteins.
Lista de figuras
Figura 1: Destinos proteicos na rede proteostática ... 15
Figura 2: Esquema genérico de uma sHsp ... 16
Figura 3: As sHsps se ligam a proteínas parcialmente enoveladas ... 16 Figura 4: Estrutura de cristalina da região ACD e C-terminal de αB-cristalino sem sua extensão flexível do C-terminal ... 19
Figura 5: Estruturas cristalinas de diferentes formas oligoméricas de sHsps ... 20
Figura 6: Região de clonagem/expressão do plasmídeo pET-28a(+) (Sítios de
enzimas de restrição) ... 25
Figura 7: Esquema da composição do operon lac e ativação da expressão deste operon pela inibição do repressor ligado ao operador ... 27
Figura 8: Sequência de resíduos de aminoácidos da proteína HspB8 de Aedes
aegypti ... 40
Figura 9. Alinhamento de sequências primárias de HspB8 de A. aegypti (AaHspB8),
Homo sapiens (HsHspB8) e de D. melanogaster (DmHspB8) ... 42
Figura 10: Teste de expressão da proteína HspB8 de Aedes aegypti usando a
linhagem de E. coli BL21(DE3) ... 43
Figura 11: Análise por SDS-PAGE da purificação da HspB8 de Aedes aegypti por cromatografia por afinidade ao níquel ... 44
Figura 12: Cromatograma da cromatografia de exclusão por tamanho da amostra eluída com 300 mmol L-1 de imidazol a partir da cromatografia por afinidade ... 45
Figura 13: SDS-PAGE do pico 2 da cromatografia de exclusão por tamanho com amostras de HspB8 de Aedes aegypti provenientes da eluição com 300 mmol L-1 de imidazol da cromatografia por afinidade ... 46
Figura 14: Cromatografia por afinidade ao níquel com a proteína HspB8 de Aedes
aegypti advinda da cromatografia de exclusão por tamanho e clivada com a protease
trombina ... 47
Figura 15: Western blotting com a proteína HspB8 de Aedes aegypti pós clivagem com a protease trombina. ... 48
Figura 17: Desenovelamento da proteína HspB8 de Aedes aegypti induzido por temperatura ... 50
Figura 18: Cromatograma com volumes de eluição das proteínas padrão e da HspB8 de Aedes aegypti ... 51
Figura 19: Curva de calibração calculada a partir da cromatografia de gel filtração analítica ... 52
Figura 20: Gráfico de obtido a partir do experimento de DLS ... 53
Figura 21: Caracterização da massa molecular da proteína HspB8 de Aedes aegypti ... 54
Figura 22: Ensaio de proteção da proteína-modelo citrato sintase a 1 µmol L-1 pela HspB8 de Aedes aegypti ... 56
Figura 23: Ensaio de proteção contra agregação da insulina... 57
Figura 24: Ensaio de proteção das proteínas-modelo lisozima (A) e luciferase (B) .. 58 Figura 25: Teste de expressão da proteína α-sinucleína de Homo sapiens usando a linhagem de E. coli BL21(DE3) ... 59
Figura 26: Cromatograma proveniente da cromatografia de troca iônica feita com a proteína α-sinucleína de homo sapiens ... 60 Figura 27: Análise por SDS-PAGE da purificação da α-sinucleína de Homo sapiens por cromatografia de troca iônica. ... 61 Figura 28: Ensaio de proteção contra agregação e formação de fibras β-amilóides utilizando-se a tioflavina T ... 62
Lista de tabelas
Tabela 1. Proteínas-padrão de massa molecular e raio conhecidos utilizadas na construção da curva de calibração da GFA ... 37
Tabela 2. Ortólogos da HspB8 e suas respectivas porcentagens de identidade com a proteína HspB8 de Aedes aegypti (214 resíduos) ... 41
Tabela 3. Parâmetros hidrodinâmicos medidos experimentalmente e preditos para uma esfera não hidratada de mesma massa molecular que a proteína HspB8 de
Sumário
Introdução ... 14
Chaperonas moleculares e a homeostase proteica ... 14
Small heat shock proteins (sHsps) ... 15
sHsps em insetos ... 21
HspB8 e sua importância ... 21
Aedes aegypti e sua importância sanitária ... 22
Objetivo ... 24
Materiais e métodos ... 24
Meios de cultura utilizados ... 24
Clonagem e linhagens de Escherichia coli utilizadas ... 24
Expressão da AaHspB8 ... 27
Purificação AaHspB8 ... 29
Rompimento de células bacterianas ... 29
Cromatografia por afinidade ao níquel ... 29
Cromatografia de exclusão por tamanho ... 30
Remoção da cauda de poli-histidinas ... 30
Western blotting anti-his ... 31
Expressão da α-sinucleína humana ... 32
Purificação da α-sinucleína humana ... 32
Rompimento de células bacterianas ... 33
Cromatografia de troca iônica ... 33
Determinação do grau de pureza da amostra ... 33
Caracterização dos parâmetros hidrodinâmicos da AaHspB8 ... 34
Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD) ... 34
Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ... 35
Gel filtração Analítica (GFA) ... 36
Cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a um detector multi-ângulo de espalhamento de luz (SEC-MALS) ... 37
Caracterização funcional da AaHspB8 ... 38
Ensaio de proteção de proteínas-modelo ... 38
Ensaio agregação da α-sinucleína in vitro e prevenção da formação de estruturas β-amiloide pela AaHspB8 ... 39
Clonagem e análise de sequência ... 40
Expressão da AaHspB8 ... 42
Purificação da AaHspB8 ... 43
Remoção de cauda de poli-histidinas e western blotting anti-his ... 47
Estrutura secundária ... 48
Desenovelamento induzido por temperatura monitorado com CD ... 50
GFA ... 51
DLS ... 53
SEC-MALS ... 54
Parâmetros hidrodinâmicos preditos ... 54
Caracterização funcional da AaHspB8 ... 55
Ensaio de proteção e proteínas-modelo ... 55
Ensaio de proteção contra agregação e formação de fibras β-amilóides ... 62
Expressão da α-sinucleína humana ... 59
Purificação da α-sinucleína humana ... 60
Discussão ... 63
AaHspB8 ... 63
A AaHspB8 foi produzida pura e enovelada ... 64
A AaHspB8 é um monômero não esférico nas condições testadas ... 67
A AaHspB8 apresenta atividade de chaperona... 67
Conclusão ... 70
Referências ... 71
Anexos ... 88
Declaração de biossegurança ... 88
Introdução
Chaperonas moleculares e a homeostase proteica
Para evitar a formação de agregados proteicos, existe um grupo de proteínas que auxilia outras proteínas a se enovelarem corretamente; são as chamadas chaperonas moleculares ou proteínas de choque térmico (Hsp, heat shock proteins). Estas, juntamente com o proteossoma, fazem parte do chamado controle de qualidade proteico (PQC), que auxilia na manutenção da homeostase proteica celular. Os componentes celulares envolvidos na manutenção da proteostase compõe a rede proteostase PN (Proteostasis network) (figura 1) (Kim, 2013 et al.; Balch et al., 2008). As chaperonas reconhecem resíduos hidrofóbicos expostos, que são característicos de proteínas mal enoveladas, e auxiliam no enovelamento destas por propiciarem um microambiente apropriado para o enovelamento sem alterar a estrutura final da proteína-cliente (Borges e Ramos, 2005).
As proteínas que não são reparadas por este sistema, em geral, são ubiquitinadas e degradadas pelo proteossoma. Quando isto não ocorre, as proteínas parcialmente enoveladas podem seguir uma rota de formação de agregados proteicos (Borges e Ramos, 2005; Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011; Kim et al., 2013). As chaperonas também são classificadas de acordo com a sua massa molecular, sendo Hsp40s, Hsp60s, Hsp70s, Hsp90s, Hsp100s e as sHsps (small heat shock proteins) (Fink, 1999; Borges e Ramos, 2005). Além disso, as Hsps também são classificadas, de acordo com as suas interações com o substrato, em holders, enovelases e desagregases. As holders atuam como co-chaperonas que se ligam, sem consumir ATP, a proteínas-cliente mantendo-as estáveis para que estas sirvam de substrato para outras chaperonas. As enovelases auxiliam efetivamente no enovelamento proteico, utilizando energia proveniente da hidrólise de ATP. Por fim, as desagregases são capazes de interagir com as proteínas em agregação e, por meio de hidrólise de ATP, liberam-nas para re-enovelamento ou degradação (Figura 2) (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011). As funções das chaperonas não estão limitadas a enovelar outras proteínas mal enoveladas. Tanto a Hsp70 quanto a Hsp90 e suas respectivas co-chaperonas auxiliam no enovelamento de proteínas envolvidas com cascatas de sinalização, direcionamento de proteínas e degradação (Huang et al., 2014; Kadota e Shirasu, 2012; Kriechbaumer et al., 2012; Lee et al., 2009)
Figura 1. Destinos proteicos na rede proteostática. Durante o enovelamento, uma proteína pode atingir o estado nativo (com ou sem auxílio de chaperonas), se enovelar incorretamente ou seguir a rota de agregação. As chaperonas têm a função e manter a proteostase, e por isso, caso os processos de re-enovelamento e desagregação falhem, elas também auxiliam no processo de degradação pelo UPS (do inglês,
ubiquitin-proteasome system) (modificado de Kim et al., 2013) Small heat shock proteins (sHsps)
As sHsps compreendem um grupo de chaperonas moleculares que são caracterizadas por apresentarem uma massa molecular que varia de 12 a 43 kDa e apresentarem um domínio altamente conservado, de 80 a 100 resíduos, chamado de domínio α cristalino (ACD do inglês, alpha crystallin domain) (Waters et al., 1996; de Jong et al., 1998; Basha et al., 2012; Haslbeck et al., 2005). As sHsps compõe uma família de chaperonas que é pouco conservada, sendo que somente o domínio ACD é altamente conservado nestas proteínas (Denlinger et al., 2001). Este domínio ACD é flanqueado por um domínio N-terminal e um domínio C-terminal (Figura 2). As sHsp são independentes de ATP e têm como principal função se ligarem a proteínas parcialmente enoveladas deixando-as passíveis de serem enoveladas por outros
grupos de chaperona que fazem uso do ATP, sendo, portanto, uma holder. (Jakob, 1993 et al.; Hartl et al., 2011; Haslbeck e Vierling, 2015) (Figura 3).
Figura 2. Esquema genérico de uma sHsp. Em vermelho o domínio N-terminal; em verde o domínio α cristalino que define a família das sHsps; em azul o domínio C-terminal e em amarelo o motivo de oligomerização.
Figura 3. As sHsps se ligam a proteínas parcialmente enoveladas. As sHsps evitam que agregados sejam formados e quando se ligam a proteínas parcialmente enoveladas, são formados complexos de sHsp e proteínas parcialmente enovaldas. Estes são reconhecidos pelo sistema da Hsp70/100 e, então, as proteínas podem ser reenoveladas (modificado de Mogk e Bukau, 2017)
As sHsp são encontradas em eucariotos, bactérias, archea e vírus. As sHsp têm sua expressão altamente elevada em diversas situações de estresse como, estresse térmico e oxidativo (Li et al., 2010; Maaroufi et al., 2013). O número de membros
pertencentes à família de sHsps é significativamente maior em organismos eucariotos multicelulares (Kriehuber et al., 2010; Haslbeck et al. 2005). Por exemplo, 10 sHsps são codificadas no genoma humano, 16 sHsps estão presentes em Caenorhabditis
elegans e em plantas superiores há pelo menos 20 ou mais sHsps (Haslbeck et al.,
2005; Kriehuber et al., 2010; Kappé et al., 2003; Scharf et al., 2001; Waters, 2013). A este respeito, plantas superiores são únicas em comparação com outros eucariotos, em que sHsps são encontrados não apenas no citosol, mas em praticamente todos os compartimentos ligados à membrana como cloroplastos, mitocôndrias, retículo endoplasmático (ER), peroxissomos e núcleo (Waters, 2013; Waters 1999 et al.; Waters et al., 2007; Ma et al., 2006; Siddique et al., 2008). Drosophila melanogaster e
Toxoplasma gondii, nos quais uma sHsp é encontrada nas mitocôndrias, são até agora
os únicos outros eucariotos conhecidos por terem sHsps em organelas (Michaud, 2002; Morrow et al., 2000; Miguel et al., 2005).
Além das sHsps terem a capacidade de proteger outras proteínas contra a formação de agregados proteicos, as sHsps também têm relação com diversas funções celulares como, por exemplo, degradação de proteínas, manutenção da integridade do citoesqueleto, diferenciação, migração de células cancerígenas, apoptose, longevidade do organismo e transdução de sinais celulares (Van Montfort et al., 2001; Narberhaus, 2002; Haslbeck et al., 2005; Bai et al., 2004; Ito et al., 2001; Kamradt et al., 2005; Charette e Landry, 2000; Crippa et al., 2016). Dada a importância que as sHsps têm em inúmeros processos celulares, o mau funcionamento das sHsps pode causar cardiopatias, miopatia miofibrilar, neuropatia motora distal hereditária, doença de Charcot-Marie-Tooth, além de cataratas e outras patologias (Evgrafov et al., 2004; Ghaou et al., 2016; Irobi et al., 2004; Perng et al., 1999; Vicart et al., 1998; Muranova et al., 2015). Em virtude destes papéis importantes desempenhados pelas sHsps, algumas delas, como a HspB8 e a HspB5 humanas, por exemplo, têm sido apontadas como possíveis alvos terapêuticos (Arrigo et al., 2007; Ciocca et al., 2013; Mymrikov et al., 2011)
Como já mencionado, as sHsps apresentam um domínio N-terminal (NTD) e um C-terminal (CTD) que flanqueiam o domínio ACD. Este domínio contém duas isoformas que são denominadas αA-cristalino e αB-cristalino. O αA-cristalino é encontrado principalmente no cristalino, a lente natural do globo ocular, onde mantém
a transparência deste e corresponde a 40% de todas as proteínas presentes no cristalino (Delaye e Tardieu, 1983; Bloemendal et al., 2004). Além disso, αA-cristalino protege as células epiteliais do cristalino evitando a agregação de proteínas (Horwitz, 1992). Brady et al. (1997) mostrou a importância do αA-cristalino em lentes oculares observando que a deleção do gene do αA-cristalino em camundongos leva ao desenvolvimento de catarata precoce. A αB-cristalino, por outro lado, é representada praticamente em todas as células de vertebrados (Dubin et al., 1989). Ademais, a expressão aumentada de αB-cristalino em um tecido é associada com doenças como mal de Alexander, doença de Creutzfeldt-Jakob, mal de Huntington, mal de Parkinson e Alzheimer, esclerose múltipla e dentre outras patologias (Iwaki et al., 1989; Renkawek e Voorter, 1994; Oliveira et al., 2016; Ecroyd e Carver, 2009; Peferoen et al., 2015).
Sob o ponto de vista estrutural, o ACD forma um sanduíche β compacto que é composto de duas folhas anti-paralelas de três e quatro cadeias-β as quais são interligadas por regiões não estruturadas (Figura 4) (Delbecq e Klevit, 2013; Van Montfort et al., 2002; Van Montfort et al., 2001). Experimentos com ACDs isolados demonstram que eles formam dímeros estáveis, porém, o ACD por si só não é suficiente para a formação de oligômeros (Bagneris et al., 2009; Baranova et al., 2011; Clark et al., 2011). Os domínios CTD e NTD das sHsps são menos conservados entre as várias espécies, diferentemente do ACD. Todavia, estudos estruturais e funcionais demonstraram que todos os três domínios desempenham um papel importante na oligomerização e função das sHsps (Mainz et al., 2015; McDonald et al., 2012; van Montfort et al., 2001). As sHsps geralmente não são vistas na forma monoméricas e, quando vistas, estas encontram-se em equilibro com dímeros, como visto por Shemetov e Gusev (2011) e Mymrikov et al. (2017) com a HspB8 humana. Na família das sHsps a unidade estrutural, geralmente, é o dímero formado pela interação de β6 + β7 presentes no ACD (Van Montfort, 2001) (Figura 4). A massa molecular dos oligômeros varia, em situações normais, de 100 até 1000 kDa e, em determinadas situações, pode atingir 5000 kDa (Skouri-Panet et al., 2012). Acredita-se que a formação de oligômeros tão variáveis aumentam o espectro de características funcionais e o número de parceiros possíveis nas interações proteína-proteína. A formação e estabilização destas estruturas oligoméricas são explicadas pela presença de motivos estruturais em domínios, por exemplo, o motivo I / L / V- X- I / L / V no CTD
ou o Motivo WDPF no NTD (Pasta et al., 2004; Poulain et al., 2010; Lambert et al., 1999). O motivo I / L / V- X- I / L / V pode ligar-se ao sulco hidrofóbico do ACD do dímero adjacente, favorecendo, desta maneira, a forma oligomérica (Sudnitsyna et al., 2012). Além de desempenhar um papel na oligomerização, o motivo WDPF também é responsável pela ligação a proteínas clientes (Lambert et al., 1999). A regulação do estado de oligomerização das sHsps pode ser influenciada por vários fatores, incluindo modificações pós-traducionais como isomerização, desamidação, glicosilação e fosforilação. Além disso, proteólise parcial, agentes oxidantes e altas concentrações também influenciam no estado oligomérico das sHsps (LeljGarolla e Mauk, 2012; Haslbeck e Strauch, 2016). A fosforilação de sHsps por diferentes proteínas quinases de diferentes cascatas de sinalização é uma resposta a situações estressantes como aumento da temperatura, alta pressão osmótica, queda de pH dentre outros (Ito et al., 1997; Vertii et al., 2006). Segundo Landry et al. (1992), os resíduos de serina em diferentes regiões do NTD são mais passíveis de serem alvo de quinases. Além disso, a fosforilação dessas regiões pode promover o rearranjo de complexos de oligômeros, a desestabilização e desintegração parcial de grandes oligômeros (Ecroyd, 2007 et al.; Rogalla et al., 1999; Ito et al., 2001). Neste processo pode ocorrer a formação de diferentes hetero-oligômeros com propriedades físicas e a atividade de chaperona afetadas (Aquilina et al., 2013).
Figura 4. Estrutura cristalográfica da região ACD e C-terminal de αB-cristalino sem sua extensão flexível do C-terminal. Os contatos que formam o dímero acontecem entre fitas β6+7 do ACD cadeias de cada subunidade, dispostos de maneira antiparalela, PDB: 2KLR (modificado de Jehle et al., 2011)
A dinâmica oligomérica das sHsps também se deve às NTD e CTD, as quais apresentam uma estrutura secundária não muito definida e exibindo flexibilidade (Jehle et al., 2011; Basha et al., 2012). Em virtude dessa característica dinâmica que é vista, por exemplo, em sHsp de mamíferos, as tentativas de cristalização das proteínas inteiras fracassaram, no entanto, há estruturas cristalográficas de ACDs isolados de Hsp27 e Hsp20 humanas (Mornon et al., 1998; Bagnéris et al., 2009; Baranova et al., 2011; Laganowsky et al., 2010; Hochberg et al., 2014). Há também estruturas cristalográficas para algumas sHsps as quais carecem de extensões flexíveis do CTD e formam oligômeros monodispersos, como a Hsp16.5 de
Methanococcus jannaschii e a Hsp16.9, um dodecâmero de trigo (Kim et al., 1998;
Van Montfort et al., 2001) (Figura 5).
Figura 5. Estruturas cristalinas de diferentes formas oligoméricas de sHsps. MjHsp16,5; M. jannashii Hsp16.5 representando um oligômero com 24 subunidades (Kim et al., 1998); SpHsp16; Schizosaccharomyces pombe Hsp16 representando oligômero de 16 subunidades (Hanazono, 2013); TaHsp16.9; Tritium aestivum (trigo) Hsp16.9 representando um dodecâmero de dois anéis empilhados (Van Montfort et al., 2001) (modificado de Haslbeck et al., 2015).
sHsps em insetos
Inúmeros genes sHsps são mais expressos em condições de estresse térmico e, portanto, podem proteger insetos em situações de estresse. Por exemplo, acredita-se que a Hsp26 proteja larvas e pupas de Aedes aegypti do estresacredita-se térmico (Zhao et al., 2010). Os genes sHsps também podem desempenhar um papel na tolerância ao frio, como sugerido pela regulação positiva da expressão de Hsp20 na recuperação de Drosophila melanogaster debilitada por frio (Colinet et al., 2010). A Hsp23 é altamente expressa durante a diapausa de pupa na mosca da carne, Sarcophaga
crassipalpis, enquanto a expressão de Hsp20.8 tem sido associada à diapausa em Sesamia nonagrioides (Rinehart e Denlinger, 2000; Hayward et al., 2005; Gkouvitsas
et al., 2008). O significado funcional dos sHsps em muitas ordens de insetos ainda não está claro, apesar de uma crescente quantidade de informações de sequências estarem disponíveis (Akano et al., 2006; Li et al., 2009; Shen et al., 2011). Mudanças nos padrões de expressão sugerem que os genes sHsp em Spodoptera litura podem ser importantes nas respostas contra o frio, bem como na metamorfose das traças (Shen et al., 2011; Gu et al., 2012). Na mariposa Cydia pomonella, três sHsps apresentaram uma maior expressão sob estresse térmico e foram persistentemente expressos durante o desenvolvimento, sugerindo um papel em ambos os processos (Garczynski et al., 2011). Na mosca Sarcophaga crassipalpis, três sHsps são regulados durante a diapausa e tem sido proposto que estas contribuam para a sobrevivência deste inseto em condições de baixas temperaturas (Yocum et al., 1998; Li et al., 2007; Rinehart et al., 2007; Colinet et al., 2010). Marínez-paz et al. (2014) observa que o gene Hsp27 em Chironomus riparius é aproximadamente 30 vezes mais expresso em situações de estresse e, portanto, é capaz de detectar o estresse celular causado por temperatura e por vários poluentes ambientais como triclosan (TCS), bisfenol A (BPA) e cádmio.
HspB8 e sua importância
A HspB8 foi identificada pela primeira vez células humanas de melanoma (Smith et al., 2000). Sua expressão é vista em praticamente todos os tecidos, porém, a expressão é maior em neurônios sensoriais e motores, coração, cérebro, rins, próstata e pulmão (Benndorf et al., 2001; Taylor e Benjamin, 2005; Irobi et al., 2004). Na espécie humana, mutações nesta proteína causam doença de
Charcot-Marie-Tooth tipo 2L, neuropatia motora distal hereditária, cardiomiopatia, dentre outras doenças que comprometem neurônios motores e/ou células musculares (Fontaine et al., 2006; Irobi et al., 2010;Sanbe et al., 2013; Ghaoui et al., 2016). A expressão de HspB8 é regulada positivamente em camundongos transgênicos G93A-SOD1 (tg G93A-SOD1) e a HspB8 remove seletivamente o mutante neurotóxico SOD1 das células neuronais motoras, restaurando a atividade proteassômica normal. A HspB8 evita a formação de agregados TDP-43, proteína relacionada com a esclerose lateral amiotrófica, em modelos animais (Crippa, 2010). A HspB8 também apresenta relação com câncer, como visto por Piccolella et al., (2016) que a proteína HspB8 modula a tanto o ciclo celular quanto a migração de células de câncer de mama sensíveis a estrógeno. Neste sentido, Goplen et al., (2010) verificou que a HspB8 bloqueia a apoptose de células de glioma altamente migratórias. A HSPB8 facilita a depuração autofágica da proteína deformada associando-se à proteína BAG3 e à Hsp70 (Carra et al., 2008b). A BAG3 é essencial no complexo e sua ausência culmina em uma rápida degradação da HspB8 (Carra et al., 2008b). Em condições fisiológicas, o complexo HSPB8-BAG3-HSP70 é essencial a nível muscular para a manutenção do disco Z, onde é induzido em resposta ao exercício físico agudo e à estimulação mecânica repetida (Ulbricht et al., 2015). A superexpressão de HSP67Bc, o ortólogo funcional de mosca da HspB8 humana, exerce efeitos protetores em dois modelos de esclerose lateral amiotrófica de Drosophila melanogaster. A superexpressão de HSP67Bc evitou a localização errada de uma proteína TDP-43 mutante neurotóxica (Ritson et al., 2010), enquanto a regulação negativa de HSP67Bc se correlacionou com o aumento de TDP-43 e a acumulação de proteínas poliubiquitinadas, agravando o fenótipo ocular de moscas TDP-43 (Crippa et al., 2016). A HSP67Bc também resgatou de letalidades de pupas, superexpressando o fragmento TDP-43 (Crippa et al., 2016).
Aedes aegypti e sua importância sanitária
A primeira descrição do A. aegypti foi feita por Linnaeus, no Egito, em 1792 e estima-se que a introdução desta espécie de mosquito no Brasil tenha ocorrido entre os séculos XVI e XIX, durante o comércio de escravos (Christophers, 1960; Consoli, 1994; Forattini, 2002). Esta espécie de mosquito é pouco frequentes em ambientes semissilvestres ou onde não há presença intensa do homem, pois, os criadouros em
ambiente de convívio com o homem, aumentam a proliferação da espécie por propiciarem condições ideais para reprodução e alimentação. (Consoli et al., 1994; Costa et al., 2010). Atualmente o A. aegypti encontra-se distribuído por quase todo o mundo, especialmente em regiões tropicais e subtropicais e, no Brasil, está em aproximadamente, 4.523 municípios (Nunes, 2015; Miller e Ballinger, 1988).
O A. aegypti é o vetor responsável pela transmissão de vírus emergentes como Zika (ZIKV), Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV) e Febre amarela (YFV) e é considerado um assunto de saúde pública (Mayer et al., 2017). O mosquito, sobretudo, apresentou algumas adaptações de modo que fossem facilmente levados para outras áreas por meios de transporte, o que aumentou sua competência vetorial (Dye, 1992). Neste contexto, a fêmea do mosquito é capaz de realizar múltipla ingestões de sangue durante um único ciclo gonadotrófico, o que amplia a sua capacidade de se infectar e de transmitir os vírus (Scott et al., 1993). A viabilidade dos ovos de A. aegypti chega até 492 dias na seca, eclodindo após contato com a água (Da Silva e Da Silva et al., 1999). Neste cenário, as condições ambientais interferem no ciclo de do A. aegypti (Donalísio e Glasser, 2002). O aumento da temperatura, por exemplo, ocasionado pelo aquecimento global, tem grande influência no aumento da população de mosquitos, pois reduz o tempo de desenvolvimento das larvas (Githeko et al., 2000; Lima-Camara, 2016).
O controle do vetor é a melhor maneira para se evitar surtos de Zika, dengue, Chikungunya e Febre amarela (Braga e Valle, 2007). Porém, obstáculos como o aumento desordenado da população, falhas na vigilância epidemiológica e casos de resistências a certos inseticidas dificultam este processo (Mayer et al., 2017; Bisset et al., 2013). O genoma de A. aegypti foi sequenciado visando novos alvos para inseticidas e alterações genéticas que impeçam a propagação de vírus (Nene et al., 2007). Por fim, diante dos desafios de controle do vetor e de um quadro grave e preocupante com relação às arboviroses, o desenvolvimento de estratégias que permitam a erradicação do mosquito torna-se algo necessário. Portanto, a caracterização de possíveis alvos moleculares, como proteínas essenciais ao desenvolvimento ou adaptabilidade do mosquito é de extrema importância.
Objetivo
Com o intuito de entender melhor as sHsps de diferentes organismos e a biologia do Aedes aegypti, visou-se estudar a AaHspB8 por meio da clonagem da sequência que codifica para esta proteína, expressão, purificação para se estudar a sua relação estrutura/função.
Materiais e Métodos
Meios de cultura
Para o crescimento das bactérias foi utilizado o meio de cultura LB (Luria-Bertani) composto por 10 g L-1 de triptona, 5 g L-1 de extrato de levedura e 10 g L-1 de NaCl, preparado em água deionizada, pH 7,0 e esterilizado em autoclave a 121ºC por 20 minutos. No meio sólido utilizado em placas de Petri utilizou-se o mesmo meio de cultura LB acrescentando-se ágar 1,5%. Na etapa de transformação das bactérias termo competentes utilizou-se o meio de cultura SOC composto por 20 g L-1 de peptona, 5 g L-1 de extrato de levedura, 0,5 g /L de NaCl, 2,5 mmol L-1 de KCl, 0,01 mmol L-1 de MgCl2 e 0,02 mmol L-1 de glicose.
Clonagem
A sequência de nucleotídeos que codifica para a AaHspB8 foi obtida pela busca por similaridade pelo site NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ do inglês, National
Center for Biotechnology Information) e otimizada e analisada com o auxílio dos
programas OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER) e Rare Codon Analyzer (http://www.biologicscorp.com/tools/RareCodonAnalyzer#.VumaGuIrLcc) para ser expressa em sistema heterólogo em Escherichia coli. Uma vez otimizada, a sequência foi analisada quanto aos sítios de restrição presentes utilizando-se das ferramentas
NEBcutter2 (http://nc2.neb.com/NEBcutter2) e peptide cutter
(http://web.expasy.org/peptide_cutter). A partir disso, optou-se pela pelas enzimas
NdeI (5’ - CATATG - 3’) e XhoI (5’ - CTCGAG - 3’) as quais não clivam o inserto. O
vetor de expressão utilizado foi o pET-28a(+) (69864, Novagen®), que após uma digestão com as enzimas de restrição citadas, recebeu o inserto também digerido com as mesmas enzimas. Os fragmentos digeridos foram submetidos a uma reação de ligação utilizando-se a enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen®). Posteriormente, o
plasmídeo de expressão contendo a sequência que codifica para a AaHspB8 foi, por meio de transformação por choque térmico, incorporado a bactérias E. coli da linhagem DH5a (Invitrogen®) com o objetivo de se obter mais cópias do vetor. O local de inserção do inserto no plasmídeo permite que uma cauda de poli-histidinas, advinda do vetor pET28a(+) (Figura 6) seja inserida na porção N-terminal da proteína com o objetivo de facilitar sua purificação futuramente. Os plasmídeos foram confirmados por sequenciamento pela empresa Helixxa, utilizando-se os primers do vetor indicados abaixo.
T7 promoter (forward): 5’ - TAATACGACTCACTATAGGG - 3’ T7 terminator (reverse): 5’ - GCTAGTTATTGCTCAGCGG - 3’ Primers T7 pET28a(+) utilizados no sequenciamento
Figura 6. Região de clonagem/expressão do plasmídeo pET-28a(+). Nos retângulos vermelhos estão evidenciadas as enzimas de restrição utilizadas no processo de clonagem do inserto que codifica para a proteína HspB8 de Aedes
aegypti. No retângulo verde está representado o sítio para a protease trombina. Figura
modificada de https://www.staff.ncl.ac.uk/p.dean/pET28.pdf
A linhagem de E. coli utilizada para expressar a proteína AaHspB8 foi a BL21(DE3), que por sua vez, contém o gene que codifica para a T7 RNA polimerase a qual reconhece o promotor T7 do plasmídeo pET28a(+) e realiza a transcrição da sequência de interesse (Studier e Moffatt, 1986). Operon é um grupo de genes com um único promotor. Em E. coli, o operon lac apresenta genes que estão diretamente envolvidos no metabolismo da lactose que, por sua vez, é consumida pelas bactérias
quando não há glicose disponível. Para serem aptas a consumir a lactose, as bactérias precisam que o operon lac seja ativado e, consequentemente, que enzimas responsáveis pelo metabolismo da lactose sejam expressas. O operon lac contém os genes lacZ, lacY e lacA. Estes genes estão sob o controle de um único promotor e são transcritos na forma de um único RNAm. O operon lac, além dos três genes citados, também apresenta um conjunto de sequências reguladoras nas quais proteínas reguladoras podem se ligar e controlar a transcrição do operon lac, ver figura 7. O promotor é o sítio no qual a RNA polimerase se liga. O operador é um sítio de regulação ao qual se liga um repressor lac e, quando o repressor lac está ligado, a RNA polimerase não consegue se ligar ao promotor e dar início à transcrição. O sítio de ligação CAP é um sítio de regulação no qual se liga a proteína ativadora de catabólitos (CAP). Quando a CAP está ligada a esse sítio, ela favorece a transcrição ajudando a RNA polimerase a se ligar ao promotor. Em ocasiões nas quais a lactose não se encontra disponível, o repressor lac se liga ao operador, evitando a transcrição pela RNA polimerase. Em contra partida, quando a lactose está presente, o repressor lac muda de conformação e perde sua capacidade de se ligar ao DNA, se desligando, portanto, do operador e permitindo que a RNA polimerase faça a transcrição do operon lac. A inativação do repressor lac é causada pela pequena molécula alolactose, um isômero da lactose. A alolactose é um exemplo de indutor, pois ativa a expressão de um gene ou operon. No caso deste deste trabalho, utilizou-se o IPTG (Isopropyl β-D -1-thiogalactopyranoside), que é um análogo da alolactose, para induzir a expressão
Figura 7. Esquema da composição do operon lac e ativação da expressão deste operon pela inibição do repressor ligado ao operador. Figura modificada de
Prokaryotic gene regulation: Figure 3, OpenStax College, Biology.
(http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@10.8)
Expressão da HspB8 de Aedes aegypti
Após a transformação por choque térmico (Sambrook e Russell, 2001), as bactérias foram centrifugadas a 1000g e o excedente de meio de cultura foi descartado. Em seguida, as bactérias foram diluídas em 50 µL de meio de cultura e plaqueadas em LB-Agar contendo o antibiótico canamicina (30 µg mL-1). Após o plaqueamento, as placas foram alocadas em uma estufa sob a temperatura de 37ºC por 17 horas. Foi feito um pré-inóculo e, no dia seguinte, uma porção deste foi utilizada para se fazer o inóculo. O pré-inóculo foi feito coletando-se uma colônia isolada e transferindo-a para um Erlenmeyer com 200 mL de meio de cultura estéril contendo canamicina. Este pré-inóculo foi mantido sob agitação de 200 rpm a 37ºC por 17 horas. Para se fazer o inóculo, 10 mL do pré-inóculo foram retirados e transferidos
para um erlenmeyer contendo 500 mL de meio LB estéril contendo o antibiótico canamicina. Em seguida, o inóculo foi submetido a agitação e temperatura constantes de 200 rpm e 37ºC até que absorbância a 600 nanômetros atingisse valores entre 0,6 e 0,8, o que leva cerca de 3 horas. Em seguida, a indução da expressão da proteína de interesse foi feita adicionando-se 500 µmol L-1 IPTG (Isopropyl
β-D-1-thiogalactopyranoside) ao inóculo e manteve-se a agitação e a temperatura por mais
5 horas. Após isso, o inóculo foi centrifugado por 15 minutos, 4ºC, 2496g, o meio de cultura excedente foi descartado e o precipitado de bactérias foi estocado a -20ºC. A superexpressão da proteína de interesse foi confirmada por meio SDS-PAGE (Sodium
Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis), correndo-se no gel uma amostra
da fração solúvel proveniente do extrato de células rompidas e avaliando a bandas presentes neste.
SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
Com o auxílio desta técnica, as proteínas podem ser separadas pelas suas massas moleculares. Isto ocorre pelo fato do detergente SDS (Sódio dodecil sulfato) desnaturar as proteínas se ligando a elas e deixando-as negativamente carregadas. Com isso, ao se aplicar uma diferença de potencial, que as proteínas migrem no gel em virtude da sua carga negativa adquirida (Laemmli, 1970). As amostras de proteína foram diluídas 2 vezes em tampão de amostra para aplicação no gel. Este tampão de amostra é formado por 100 mmol L-1 de TrisHCl, pH 6,8, glicerol 20%, azul de bromofenol 0,2%, SDS 4% e 200 mmol L-1 de DTT (ditiotreitol). O gel de poliacrilamida subdivide-se em de duas partes, o gel de empacotamento e o gel de separação. O gel de empacotamento 5% é preparado com uma mistura acrilamida/bis-acrilamida 5 %, 130 mmol L-1 de Tris pH 6,8, SDS 0,1 %, persulfato de amônio 0,1 % e TEMED. O gel de separação 10 % é feito misturando-se acrilamida/bis-acrilamida 10 %, 390 mmol L -1 de Tris pH 8,8, SDS 0,1 %, persulfato de amônio 0,1 % e TEMED. A eletroforese foi efetuada em cuba Mini-PROTEAN® Tetra System (BIO-RAD) usando a fonte Electrophoresis Power Supply – EPS 301 (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Os géis foram incubados em corante por aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente. O corante utilizado se trata de uma solução contendo etanol 30 %, ácido acético 10 %, água 60 % e corante Coomassie Brilliant Blue R250 0,25 %. Após serem incubados no corante, os géis de poliacrilamida foram descorados em uma solução contendo etanol 10 %, ácido acético 10 % e água 80 %.
Rompimento das células do precipitado bacteriano contendo a AaHspB8
O precipitado bacteriano resultante da centrifugação após 5 horas de indução foi dissolvido em 40 mL de tampão contendo fosfato de sódio 25 mmol L-1, 150 mmol L-1 de NaCl, 1 mmol L-1 de inibidor PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 5 u de DNAse e 30 µg mL-1 de lisozima. O precipitado dissolvido no tampão citado foi mantido no gelo por 30 minutos antes de passar para o passo de lise sônica, que por sua vez, foi realizada utilizando-se 3 minutos de tempo total de pulso, cada pulso tinha a amplitude de 35W e a duração de 10 segundos. A pausa entre pulsos era de 1 minuto e 30 segundos, tempo necessário para resfriamento da amostra. As células que passaram por esses processos de quebra, tanto enzimática pela lisozima quanto física pelo ultrassom, foram centrifugadas a 16000g, 4ºC por 15 minutos e, desta maneira, foi possível separar a porção insolúvel e solúvel do extrato de bactérias. A porção solúvel foi removida e filtrada logo em seguida utilizando-se um filtro de 45 µm.
Cromatografia por afinidade ao níquel
Uma vez que a proteína recombinante é expressa com uma cauda de poli-histidinas, a cromatografia por afinidade ao níquel torna-se uma estratégia de purificação interessante, visto que, os nitrogênios das histidinas presentes na cauda de poli-histidinas coordenam-se com o níquel presente na coluna de afinidade, permitindo assim, que a proteína de interesse fique retida na coluna enquanto os contaminantes são eluídos (Porath, 1992). Este processo de purificação se dá pela injeção do sobrenadante proveniente da lise em coluna de afinidade previamente equilibrada com tampão contendo 25 mmol L-1 fosfato de sódio, 150 mmol L-1 NaCl, 40 mmol L-1 imidazol e pH 7,5. Após a injeção da parte solúvel do lisado bacteriano, visando-se eliminar contaminantes retidos na coluna, foram feitas lavagens com 6 volumes de coluna (30 mL) utilizando-se crescentes concentrações de imidazol. Concentrações estas que foram de 40 mmol L-1, 150 mmol L-1, 300 mmol L-1e 5 mmol L-1 de imidazol. A coluna utilizada neste processo de purificação foi a His-trap de 5 mL contendo a resina Ni-Sepharose (Ge Lifesciences®) acoplada a uma bomba peristáltica (Ge Lifesciences®). Alíquotas de cada lavagem foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE.
Cromatografia de exclusão por tamanho ou gel filtração
Após a cromatografia por afinidade ao níquel, com o intuito de se aumentar a pureza da amostra, realizou-se o procedimento de cromatografia por exclusão por tamanho ou filtração em gel. Este método separa moléculas de tamanhos diferentes de modo que, moléculas menores percorram uma trajetória maior pela coluna por adentrarem em pequenos poros presentes na resina, sendo, portanto, são eluídas maiores volumes de eluição (Barth et al., 1994). As moléculas de maior tamanho percorrem uma trajetória mais curta na coluna, sendo eluídas em volumes de eluição menores por não adentrarem nos pequenos poros. Neste processo utilizou-se o equipamento Äkta FPLC e uma coluna XK 26-60 de 320 mL contendo a resina Superdex 200. Para realizar este procedimento, as frações da cromatografia por afinidade nas quais a proteína de interesse foi eluída foram unidas e injetadas na coluna XK 26-60 previamente equilibrada com o tampão contendo fosfato de sódio 25 mmol L-1, NaCl 150 mmol L-1 e pH 7,5. O processo foi monitorado pela absorbância a 280 nanômetros e as frações foram confirmadas por SDS-PAGE.
A concentração de proteína foi calculada através da técnica colorimétrica
Bradford, segundo o fabricante BioRad (
https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/LIT33.pdf), com algumas modificações. A curva
de calibração utilizando-se BSA foi feita em triplicata assim como as medidas das amostras contendo a proteína AaHspB8. As concentrações de BSA utilizadas na construção da curva de calibração foram 1,5, 3, 4, 6, 8 e 10 µmol L-1. Foram feitas diluições com amostras contendo a proteína AaHspB8 e estas ficaram em um volume final de 800 µL no qual foram adicionados 200 µL de reagente de Bradford filtrado e mistura ficou incubada por 5 minutos a temperatura ambiente. A medição de absorbância a 595 nm foi realizada após estes 5 minutos de incubação.
Remoção da cauda de poli-histidinas
A sequência que codifica para a proteína HspB8 de Aedes aegypti foi estrategicamente inserida no vetor de expressão o pET28a de modo que uma cauda de poli-histidinas fosse adicionada na porção N-terminal da proteína em estudo. É importante mencionar que, na própria sequência que codifica para produção da cauda de poli-histidinas, há uma região envolvendo uma leucina, valina, prolina, arginina, glicina e serina que é um sítio de reconhecimento para a protease trombina. A trombina é uma serino protease amplamente utilizada para se clivar cauda de
poli-histidinas. Neste trabalho, visando-se trabalhar com a proteína na forma mais próxima possível do natural, isto é, sem a cauda de poli-histidinas, realizou-se, uma reação de digestão com a protease trombina para remover a cauda. A remoção da cauda de poli-histidinas foi realizada incubando-se a proteína AaHspB8, a 70 µmol L-1, em um volume de 1 mL com 5 u trombina (Sigma, T6200). Esta incubação durou 1 hora a e a temperatura foi mantida constante a 20ºC. Em seguida, adicionou-se 1 mmol L-1 PMSF (Fenil metil sulfato). Após a adição do PMSF fez-se uma cromatografia de afinidade utilizando-se uma coluna de 1 mL (Ge Lifesciences®) para verificar se a proteína ficaria retida na coluna novamente. Realizou-se lavagens de 4 mL utilizando-se tampões contendo 25 mmol L-1 de fosfato de sódio, 150 mmol L-1 de NaCl com 0 mmol L-1, 20 mmol L-1 e 500 mmol L-1 de imidazol. pH 7,5. Em seguida, o resultado da cromatografia por afinidade foi analisado por SDS-PAGE e por western blotting utilizando-se anticorpo Mouse Anti-His.
Western blotting
O western blotting é uma técnica utilizada na detecção proteínas ou determinadas porções destas fazendo-se uso de anticorpos. A primeira etapa do
western blotting consiste em uma eletroforese em gel de poliacrilamida que separa as
proteínas da amostra de acordo com a massa molecular. O gel utilizado para esta técnica foi de 1 mm de espessura e utilizou-se um marcador previamente corado para facilitar o acompanhamento da corrida. Ao final da eletroforese fez-se a transferência das proteínas contidas no gel para uma membrana de nitrocelulose com o auxílio de um equipamento de transferência semi-seca (BioRad®). Para isso utilizou-se um tampão de transferência contendo 25 mmol L-1 de Tris base,192 mmol L-1 de glicina e metanol 20 %. Após a transferência, foi realizado o bloqueio da membrana utilizando-se leite desnatado em pó. Para realizar o bloqueio, o tampão TBS-T (Tris buffer saline) contendo 50 mmol L-1 de TrisHCl, 150 mmol L-1 de NaCl, pH 7,5, 0,1% de tween e 5% de leite desnatado em pó foi colocado sobre a membrana de nitrocelulose e ficou sob agitação por 17 horas. Após as 17 horas de bloqueio, foram feitas 3 lavagens de 5 minutos com 15 mL de tampão TBS-T. O anticorpo primário Mouse Anti-His (código 27-4710-01, Ge Lifesciences®) na diluição 1:5000 foi adicionado à membrana, que ficou sob agitação por 1 hora. Em seguida, outras 3 lavagens de 5 minutos com 15 mL de tampão TBS-T foram feitas e o anticorpo secundário Anti Mouse HRP (do inglês, horseradish peroxidase; ab6728 abcam®) foi utilizado na proporção 1:15000 e
diluído em tampão TBS-T com 5% de leite desnatado em pó. A incubação com o anticorpo secundário durou 1 hora e, em seguida, foram feitas mais 3 lavagens de 5 minutos com 15 mL de tampão TBS-T e após isso a membrana passou pelo processo de revelação (Amershan ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, equipamento Amershan Imager 600 Ge Lifesciences ®).
Expressão da α-sinucleína humana
O plasmídeo pT7-7 asyn (Addgene plasmid #36046) contendo o gene que codifica para a α-sinucleína humana foi cedido por um colaborador do grupo. Nesta proteína não há adição de cauda de poli-histidinas. Para expressá-la foi utilizada a metodologia de Hoyer (2002) com alterações. Primeiramente, foi realizado um processo de transformação para fazer as células de BL21(DE3) incorporarem o plasmídeo. Em seguida, as células transformadas foram plaqueadas em placas contendo LB-Ágar contendo o antibiótico ampicilina. O mesmo processo de se fazer um pré inóculo e posteriormente um inóculo utilizado para expressão da AaHspB8, foi utilizado para se expressar a α-sinucleína humana, alterando-se somente o antibiótico de seleção de canamicina para ampicilina. Após a adição do IPTG, durante o período de indução, o inóculo ficou sob agitação e temperatura constantes de 200 rpm e 37ºC, respectivamente, por 4 horas. Após este período de indução o inóculo foi centrifugado por 15 minutos, 4ºC, 2496g. O meio LB excedente foi descartado e o precipitado de bactérias foi armazenado em um freezer a -20ºC.
Lise do precipitado bacteriano contendo a α-sinucleína humana
O rompimento das células foi feito por meio de um sonicador e foi realizado dissolvendo o precipitado de bactérias em tampão contendo 10 mmol L-1 de Tris HCl pH 8,0, 1 mmol L-1 EDTA, 1 mmol L-1 PMSF. Após a dissolução do precipitado de bactérias no tampão citado, com o auxílio do sonicador, foi realizado o rompimento das células utilizando-se 3 minutos de tempo total de pulso, amplitude de 40 W e duração de 10 segundos por pulso e pausa entre pulsos de 1 minuto.
Purificação da α-sinucleína humana
Os passos de purificação da α-sinucleína humana foram seguidos de acordo
com o Hoyer et al. (2002) com determinadas modificações. O lisado celular advindo da lise sônica foi distribuído em tubos de plástico e foram submetidos a temperatura
de 100ºC por 20 minutos. Após este tempo de incubação, o lisado foi centrifugado por 15 minutos a 16875g e o sobrenadante foi coletado. Ao sobrenadante foi adicionado sulfato de estreptomicina a 10 mg mL-1, mantendo a solução sob agitação e a 4ºC por 15 minutos. Em seguida, centrifugou-se a solução por 18700g por 15 minutos e coletou-se o sobrenadante. Desta vez, adicionou-se sulfato de amônio a 0,36 g mL-1 ao sobrenadante, mantendo a solução sob 4ºC e agitação constante por 30 minutos. Após este tempo de incubação com o sulfato de amônio, a solução foi centrifugada a 18700g, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi solubilizado em tampão Tris HCl 25 mmol L-1 pH 7,7.
Cromatografia de troca iônica
Esta última solução contendo o tampão Tris HCl 25 mmol L-1 pH 7,7 no qual o precipitado com o sulfato de amônio foi diluído, foi filtrada e injetada em uma coluna de troca iônica MonoQ 5/50 (Ge Lifesciences®) previamente equilibrada com tampão Tris HCl 25 mmol L-1 pH 7,7. A α-sinucleína foi eluída com aproximadamente ~400 mmol L-1 de NaCl em um gradiente de 0 mmol L-1 a 1 M de NaCl. As frações eluidas da troca iônica foram analisadas por SDS-PAGE e as frações contendo a α-sinucleína em alto grau de pureza foram unidas e dialisadas para o tampão no qual são feitos os ensaios de agregação. A medida da concentração proteica neste caso foi calculada utilizando-se a absorbância a 275 nanômetros usando o coeficiente de extinção de 5600 M-1cm-1.
Determinação de grau de pureza da purificação
Proteínas muito concentradas não são completamente marcadas pelo corante, necessitando-se realizar uma série de diluições para se ter uma melhor comparação.
As imagens dos géis foram analisadas pelo software ImageJ
(https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Com esta ferramenta é possível avaliar a
contribuição de cada banda presente no gel, possibilitando obter a porcentagem de pureza da proteína purificada quando comparada com outras bandas de contaminantes.
Caraterização dos parâmetros hidrodinâmicos da proteína AaHspB8
Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD, circular dichroism)
A técnica de espectropolarimetria de dicroísmo circular é uma técnica usada para se avaliar a estrutura secundária de proteínas. Esta técnica tem como vantagem a rápida obtenção de dados, o uso de baixas concentrações de amostras e é técnica não destrutiva, ou seja, a amostra utilizada no CD continua viável para futuros experimentos. Nesta técnica, incide-se um feixe de luz circularmente polarizada em uma amostra que contém moléculas/macromoléculas quirais, e a diferença de absorção de luz circularmente polarizada à esquerda e à direita e é medida pelo software do instrumento.
O espectropolarímetro de dicroísmo circular gera um espectro que varia de acordo com a estrutura secundária da proteína estudada. Por exemplo, espectros de proteínas ricas em hélices α apresentam mínimos de valores negativos em 222 nm e 208 nm e banda positiva em 190 nm aproximadamente. O espectro para proteínas que tem folhas-β em abundância tem, geralmente, um mínimo negativo entre 210-220 nm e uma banda positiva entre 195-200 nm. Para proteínas desordenadas, o espectro mostra um mínimo significativo de valor negativo próximo dos 200 nm (Ramos, 2008; Correa e Ramos, 2009; Woody, 1995). O espectropolarímetro utilizado neste trabalho foi o JASCO J-720, o qual faz uso de uma lâmpada de xenônio como fonte de luz. Durante o procedimento é necessário um fluxo de N2 para se remover o O2 e evitar a formação de ozônio. O fluxo de N2 foi mantido em 5 L min-1 enquanto não se iniciava a leitura e após o início da leitura da amostra para formação do espectro passou-se para 10 L min-1. Certificou-se em todos os experimentos de que a lâmpada ficasse ao menos 30 minutos ligada antes de se iniciar as medidas. As amostras e os respectivos tampões foram centrifugados por 15 minutos, 17949g 4ºC antes de se realizar as medições. De acordo com a concentração da proteína AaHspB8 disponível, utilizou-se cubetas Hellma® de quartzo com caminhos óticos que variavam entre 1, 2 e 5 milímetros. As medidas foram realizadas em triplicata com 16 acumulações cada, velocidade de escaneamento de 2 nm min-1, sensibilidade padrão de 100 mdeg, resposta de 1 s, faixa de comprimento de onda de 260 a 202 nanômetros e limitando-se a voltagem a 700V a fim de limitando-se evitar ruídos na leitura.
Ainda com o auxílio do dicroísmo circular, foi realizado o desenovelamento induzido por temperatura com proteína AaHspB8. A temperatura, neste caso, é
aumentada em 1ºC min-1 por um peltier. Durante essa elevação foi monitorado o comprimento de onda de 222 nm. Os dados brutos produzidos pelo CD são obtidos em miligraus (mdeg) e deste valor são abatidos os valores das medidas feitas com tampão no qual a proteína se encontra. Em seguida, estes dados foram tratados a fim de se obter o valor em elipticidade molar residual. Para isso, aplicou-se a seguinte equação:
[θ] =(θ x 100 x M) (C x l x n)
Onde θ é a elipticidade em graus, l é o caminho ótico em cm, C é a concentração em mg mL-1, M é a massa molecular e n é o número de resíduos de aminoácidos da proteína, resultando na unidade graus.cm2. dmol-1.
Uma vez com os resultados de elipticidade molar residual em 222 nm em mãos, foi possível se estimar a porcentagem de hélices α (fH) contida na proteína. Para isso, faz-se uso da seguinte equação (Correa e Ramos, 2009; Morriset et al., 1973):
𝑓𝐻 = 100 𝑥 ([θ]222 − 3000) (−36000 − 3000) Espalhamento dinâmico de luz (DLS)
Partículas estão em constante movimento em solução e espalham luz e para todas as direções. A técnica de DLS consiste na análise desse espalhamento de luz feito pela amostra. Essas informações são relacionadas diretamente com o movimento destas partículas em solução, sendo que, como uma característica do movimento browniano, partículas menores se movimentam mais rapidamente e partículas grandes mais lentamente (Jachimska et al., 2008). A medida direta obtida do DLS é o coeficiente de difusão. O equipamento utilizado nas medições da proteína em estudo foi o ZETASIZER Nano series da Malvern. As medições foram feitas a 25ºC, utilizou-se concentrações de 30, 80 e 160 µmol L-1 de proteína. As medidas foram realizadas em triplicata. Com o coeficiente de difusão obtido a partir do DLS, pode-se calcular o raio hidrodinâmico (Rh) (Edward, 1970). Para isso, utiliza-se a equação de Stokes-Einstein que segue logo abaixo. Além disso, pode-se calcular a massa molecular (MM) para a proteína com a equação mostrada abaixo. Mais informações sobre as equações podem ser encontradas em Borges e Ramos (2011).
Os resultados consideram uma esfera não hidratada de mesma massa molecular que a da proteína em estudo.
𝐷 = (kB x T)
(6π x n x Rh)
Equação de Stokes-Einstein onde kB é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta (K), n é a viscosidade do tampão (0,9223 x 10-3 Pa s, obtida pelo software Sednterp - http://www.jphilo.mailway.com/download.htm/) e Rh é o raio de hidrodinâmico ou raio de Stokes (Rs).
Rh = (3 x MM x Vbar
4 x π x N )
1/3
Onde MM é a massa molecular da proteína (Da), Vbar é o volume parcial específico da água (0,7269 cm3 g-1) e N é o número de Avogadro.
Gel filtração Analítica (GFA)
Com esta técnica é possível se calcular o raio hidrodinâmico da proteína em estudo. Nesta técnica, são realizadas inúmeras injeções contendo soluções de proteínas globulares de massa e raio conhecidos (GE Lifesciences®) em uma coluna de exclusão por tamanho e em seguida uma curva de calibração é construída. As soluções utilizaram as proteínas na concentração de 1 mg mL-1 e estas foram diluídas do tampão 25 mmol L-1 fosfato de sódio, 150 mmol L-1 de NaCl e as proteínas utilizadas estão indicadas na tabela 1. Neste processo utilizou-se uma coluna contendo a resina Superdex 200 10/300 GL de 24 mL conectada ao equipamento Äkta FPLC (Amersham Pharmacia Biotech). A absorbância a 280 nanômetros foi monitorada durante todo o procedimento.
Tabela 1. Proteínas-padrão de massa molecular e raio conhecidos utilizadas na construção da curva de calibração da GFA
Proteínas-padrão Massa molecular (kDa) Raio hidrodinâmico (Å)
Aprotinina 6,5 13,5
Ribonuclease A 13,7 16,4
Anidrase carbônica 29,0 21,4
Ovalbumina 44,0 30,5
Conalbumina 73,0 47,0
O coeficiente de distribuição é calculado para cada proteína, tanto a de estudo quanto as proteínas-padrão de acordo com a equação.
𝐾𝑎𝑣 = 𝑉𝑒 − 𝑉0 𝑉𝑐 − 𝑉0
Ve corresponde ao volume de eluição de cada proteína, V0 é o volume morto da coluna (obtido pelo volume de eluição do reagente Blue Dextran, BD) e Vc é o volume total da coluna.
Tendo em mãos os Kav de todas as proteínas-padrão, construiu-se uma curva de calibração com Raio hidrodinâmico (Rh) em função do (-logKav)1/2 para assim se estimar o raio hidrodinâmico da proteína AaHspB8.
Cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a um detector multi-ângulo de espalhamento de luz (SEC-MALS)
Este equipamento permite que se obtenha a massa molecular de diferentes espécies proteicas dentro de uma mesma amostra, pois estas são separadas pela cromatografia de exclusão por tamanho antes de serem analisados pelo equipamento. Com a massa, obtem-se também informações sobre estados oligoméricos da proteína em estudo (Wyatt,1993; Gava et al., 2011; da Silva et al., 2013; Zanphorlin et al., 2014). Para a caracterização foi utilizada a coluna de cromatografia de exclusão por tamanho utilizada do processo de gel filtração analítica foi utilizada e acoplada ao FPLC. O SEC-MALS utilizado é composto por três partes fundamentais, o detector de espalhamento de luz (miniDAWN TREOS. Wyatt®) e conta com 3 fotodetectores com
ângulos que variam entre 45° e 135°, o detector de índice de refração chamado Optilab T-rEX (Wyatt®) e software ASTRA (Wyatt®) no qual são tratados os dados para a obtenção da massa molecular. Os experimentos foram feitos em triplicata. As amostras de AaHspB8 utilizadas foram filtradas em filtro de 0,22 µm e a concentrações utilizadas eram de aproximadamente 80 µmol L-1.
Caraterização funcional da AaHspB8
Ensaio de proteção e proteínas-modelo
A proteção pela AaHspB8 contra a agregação de possíveis proteínas-cliente foi testada utilizando-se proteínas-modelo luciferase, malato desidrogenase, citrato sintase, lisozima e insulina. As duas últimas foram submetidas a agregação utilizando-se o agente redutor DTT (ditiotreitol). As proteínas-cliente luciferautilizando-se, malato desidrogenase e citrato sintase passaram por um processo de agregação induzido por temperatura. Os experimentos foram conduzidos em um fluorímetro Cary Eclispse Varian e a agregação foi verificada em tempo real de acordo com o aumento da turbidez (320 nm). A atividade relativa de chaperona foi calculada de acordo com a equação abaixo.
Porcentagem de proteção = 100 x (𝛥𝑒 − 𝛥𝑒𝑐ℎ) 𝛥𝑒
Δe representa o espalhamento de luz no tempo final de experimento na ausência de chaperonas e Δech representa o espalhamento de luz no tempo final de experimento na presença de chaperonas
As proteínas-modelo luciferase, malato desidrogenase e citrato foram compradas e testadas como possíveis clientes da AaHspB8. Os testes de agregação foram feitos na proporção de 1:1 e de 1:10 de AaHspB8, por 50 minutos a 42ºC e o espalhamento de luz foi monitorado durante este tempo. No experimento foram feitos controles os quais continham somente a AaHspB8 e, quando supostamente havia proteção pela AaHspB8, utilizou-se a proteína BSA (albumina de soro bovino) na mesma proporção da AaHspB8 a fim de se provar o efeito de chaperona da AaHspB8.
Para se verificar a agregação induzida por agente redutor utilizou-se as proteínas lisozima e insulina comerciais como possíveis proteínas clientes para a AaHspB8. O agente redutor utilizado neste experimento foi o ditiotreitol (DTT) na concentração de 20 mmol L-1 quando utilizado insulina e 30 mmol L-1 quando utilizado lisozima. As amostras tiveram um período de incubação de 20 minutos e, em seguida, a agregação foi medida durante 50 min. Foram testadas concentrações de 1:1 e 1:10 de AaHspB8 com ambas as proteínas. A temperatura do experimento foi mantida a 20ºC. No caso da insulina, utilizou-se a proteína aldolase como controle com o intuito de se verificar a atividade de chaperona da AaHspB8.
Ensaio agregação da α-sinucleína in vitro e prevenção da formação de estruturas β-amiloide pela AaHspB8
Este ensaio foi realizado utilizando frascos de vidro devidamente higienizados e passíveis de serem fechados. Os quatro tratamentos deste experimento foram a α-sinucleína na concentração final de 90 µmol L-1, α-sinucleína a 90 µmol L-1 com adição de AaHspB8 a 30 µmol L-1, somente a AaHspB8 30 µmol L-1 e α-sinucleína a 90 µmol L-1 com adição de albumina de soro bovino (BSA) 30 µmol L-1 como controle. Agitadores magnéticos foram colocados em cada um dos frascos e estes foram mantidos a temperatura e agitação constantes de 42ºC e 550 rpm, respectivamente, por até 72 horas (Hoyer et al., 2002).
Com a finalidade de se verificar a formação de fibrilas amilóides, fez-se uso do composto tioflavina T, que é uma sonda amplamente utilizada para se monitorar, in
vitro, a formação de estruturas amyloid-like (Nilsson, 2004; Groenning et al., 2007).
Ao se ligar a estruturas β-amilóide, o ThT adquire a capacidade de emitir uma forte fluorescência a 482 nm quando excitado a 450 nm. A tioflavina T (Sigma, T3516), foi utilizada na concentração de 5 µmol L-1, visto que, o ThT se torna auto-fluorescente em concentrações superiores a 5 µmol L-1 em tampão PBS (do inglês, phosphate buffered saline) (Xue et al., 2017). O ThT foi dissolvido em tampão 10 mmol L-1 de fosfato de sódio, 150 mmol L-1 de NaCl e pH 7. Em seguida, utilizou-se filtro 0,22 µm para filtrá-lo e para se determinar a concentração de ThT utilizou-se absorbância a 412 nm e o coeficiente de extinção molar 36 mmol L-1 cm-1 (Groenning et al, 2007). Para avaliar a formação β-amilóide, realizou-se um protocolo modificado de Hoyer et al. (2002). Preparou-se um estoque de ThT a 5 µmol L-1 do qual retirava-se, a cada hora, 395 µL deste estoque e adicionava-se 5 µL das amostras que estavam em
