Biossorção de compostos fenólicos de chá em Saccharomyces cerevisiae

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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE QUÍMICA E BIOLOGIA

BACHARELADO/LICENCIATURA EM QUÍMICA

LUDMILA HOLZ AMORIM DE SENA

BIOSSORÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE CHÁ EM SACCHAROMYCES

CEREVISIAE

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

CURITIBA 2017

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BIOSSORÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE CHÁ EM SACCHAROMYCES

CEREVISIAE

Trabalho de conclusão de Curso, apresentado à disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso II, do Curso Superior de Bacharelado e Licenciatura em Química Tecnológica com Ênfase Ambiental, da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR, Campus Curitiba, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel e Licenciada em Química

Orientador: Prof. Dr. Charles Windson Isidoro Haminiuk

CURITIBA 2017

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Esta Folha de Aprovação assinada encontra-se na Coordenação do Curso. 

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BIOSSORÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE CHÁ EM

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Trabalho de Conclusão de Curso aprovado como requisito parcial à obtenção do grau de BACHAREL EM QUÍMICA pelo Departamento Acadêmico de Química e Biologia (DAQBI) do Câmpus Curitiba da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR, pela seguinte banca examinadora:

Membro 1 – Profa. Dra. Giselle Maria Maciel

Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Membro 2 – Profa. Dra. Marlene Soares

Orientador – Prof. Dr. Charles Windson Isidoro Haminiuk

Coordenador de Curso – Prof. Dr. Luiz Marcos de Lira Faria

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AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha família pelo amor e carinho em todos esses anos de graduação e por me apoiarem em todos os aspectos.

À minha namorada, Aline Calisto, pelo amor, pela paciência, pela compreensão e pelo apoio nos momentos mais difíceis.

Ao meu orientador Professor Dr. Charles Windson Isidoro Haminiuk, pela orientação, pelo auxilio no desenvolvimento deste trabalho e até pelos puxões de orelha necessários para meu crescimento pessoal e profissional.

À Professora Drª. Giselle Maria Maciel, pelo auxilio durante os experimentos pertinentes a este trabalho.

À Professora Drª. Marlene Soares, por ter aceitado participar da banca da defesa deste trabalho.

Aos demais professores do Laboratório de Biotecnologia, pelos anos de convivência e pela participação no meu desenvolvimento profissional.

À Desirée Rodriguez, pela amizade, carinho, paciência e por compreender todas as faltas em eventos, devido à faculdade.

À Luciana Westphal, pela amizade, pelos longos anos de companheirismo e dedicação a esta graduação e por todos os momentos compartilhados.

Aos demais amigos e colegas, que compartilharam tantos momentos durante essa graduação.

Ao Departamento de Química e Biologia da UTFPR pela oportunidade de concluir este curso.

A todos que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.

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RESUMO

SENA, Ludmila H. A. de. Biossorção de compostos fenólicos de chá em Saccharomyces cerevisiae. 2017. TCC – Bacharelado/Licenciatura em Química Técnológica com Ênfase Ambiental, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Curitiba – PR

Os chás são a segunda bebida mais consumida no mundo, perdendo apenas para a água. Tradicionalmente, eles são preparados através da infusão de folhas de

Camellia sinensis e suas versões mais populares são a verde, a preta e a oolong.

Eles são considerados uma importante fonte de antioxidantes, incluindo os polifenóis, sendo seus compostos bioativos bastante estudados por conta de seu potencial agente benéfico. Seu consumo tem sido associado à redução da incidência de câncer e doenças cardiovasculares e evidências científicas apontam benefícios para a saúde do consumo de chá verde, havendo também indícios sobre o chá preto, indicando que as catequinas presentes na sua composição possuem função antioxidante, anticarcinogênica, antimicrobiana, antiviral, antiinflamatória e propriedades antidiabéticas. O presente trabalho teve por objetivo investigar o potencial do uso de Saccharomyces cerevisiae como biossorvente para recuperar compostos fenólicos de amostras de chá branco. As isotermas de adsorção obtidas demonstraram que o processo ocorre em monocamada sendo a interação dos compostos fenólicos ocorrida por quimiossorção. Os principais grupos funcionais envolvidos foram os grupamentos amino/hidroxi e amida, fazendo parte também as vibrações de carbonos de dupla ligação. Através da MEV pode-se perceber que a estrutura nas leveduras não se altera com a biossorção, mantendo seu formato oval e granular.

Palavras-chave: Compostos bioativos, Camellia sinensis, Catequinas, Adsorção,

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Processos de obtenção dos diferentes tipos de chá (branco, verde, olong e preto).

Fonte: adaptado de SANTANA-RIOS et al. (2001) ... 9

Figura 2: Estrutura principal dos flavonoides contendo os anéis A, B e C. ... 11

Figura 3: Estrutura química básica das moléculas de flavonoides. Fonte: MARÇO e POPPI (2008). ... 11

Figura 4: Moléculas de a) Ácido hidroxicinâmico e b) Ácido hidrobenzóico ... 12

Figura 5: Estruturas de catequinas presentes em chás. Fonte: adaptado de MATSUBARA e RODRIGUEZ-AMAYA (2006). ... 13

Figura 6: Estruta da quitina presente na parede celular da levedura. Fonte: MENDES, DILARRI e PELEGRINI (2015) ... 16

Figura 7: Levedura seca após autoclavagem. ... 19

Figura 8: Diluições de chá branco adsorvidos em levedura. ... 21

Figura 9: Determinação de CFT a partir do método de Folin-Ciocalteu. ... 22

Figura 10: Curva de calibração do Ácido Gálico. ... 24

Figura 11: Gráfico do modelo de isoterma de Langmuir para o chá branco ... 27

Figura 12: Gráfico do modelo de isoterma de Temkin para o chá branco ... 27

Figura 13: Gráfico do modelo de isoterma de Freundlich para o chá branco ... 28

Figura 14: Eletromicrografia de varredura da Saccharomyces cerevisiae após adsorção de água ... 29

Figura 15: Eletromicrografia de varredura da Saccharomyces cerevisiae após adsorção de chá branco na concentração 1:20... 29

Figura 20: Espectros de infravermelho da Saccharomyces cerevisiae antes e após o processo de biossorção do chá branco ... 32

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Concentração de Compostos Fenólicos Totais e Flavonóides expressos em

equivalente de ácido gálico e catequina, respectivamente, nos chás verde, branco e preto. 11 Tabela 2: Volumes de ácido gálico utilizados nas diluições da curva de calibração ... 20 Tabela 3: Modelos de isotermas ... 21 Tabela 4: Concentração de compostos fenólicos totais presentes nas amostras de chá antes e após a adsorção. ... 25 Tabela 5: Parâmetros das isotermas de Langmuir, Freundlich e Temkin para biossorção de compostos fenólicos de chá branco em Saccharomyces cerevisiae. ... 26

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LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

A - constante de ligação de equilíbrio B – constante de Temkin

Ce – concentração de equilíbrio CFT – Compostos Fenólicos Totais E – energia livre de adsorção Ɛ – potencial Polanyi

IR - Infravermelho

KF – constante de Freundlich KL – constante de Langmuir

MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura

MIR-ATR - Análise de Espectroscopia de Infravermelho Médio com Reflectância Total Atenuada

n – constante da intensidade de adsorção q0 – capacidade máxima de adsorção qe – capacidade de adsorção em equilíbrio R – constante universal dos gases

R2 – coeficiente de correlação

RL – fator de separação ou parâmetro de equilíbrio T - temperatura

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 6 2 JUSTIFICATIVA ... 7 3 OBJETIVOS ... 8 3.1 Objetivo Geral ... 8 3.2 Objetivos específicos ... 8 3.3 Chá ... 9 3.4 Compostos Fenólicos ... 10 3.4.1 Catequinas ... 12 3.5 Antioxidantes ... 13 3.6 Saccharomyces cerevisiae ... 14 3.7 Biossorção ... 15 3.8 Isotermas de adsorção ... 16 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 19

4.1 Preparo das amostras de chá e levedura Saccharomyces cerevisiae ... 19

4.1.1 Infusão de chá ... 19

4.1.2 Preparo do biossorvente. ... 19

4.2 Curva de calibração ... 20

4.3 Biossorção ... 20

4.4 Determinação de compostos fenólicos totais ... 21

4.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 22

4.6 Análise de Espectroscopia de Infravermelho Médio com Reflectância Total Atenuada (MIR–ATR) ... 23

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 24

6.1 Curva de Calibração do Ácido Gálico. ... 24

6.2 Compostos Fenólicos totais (CFT) ... 24

6.3 Isotermas ... 25

6.4 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 28

6.5 Espectroscopia de Infravermelho da Biomassa de Levedura... 32

7 CONCLUSÃO ... 34

8 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 35

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1 INTRODUÇÃO

Chá é uma das bebidas mais consumidas no mundo, perdendo apenas para a água. Em suas formas branca, verde e preta é considerado uma importante fonte de antioxidantes, como os compostos fenólicos. Seu uso tem sido associado à redução da incidência de câncer e problemas cardiovasculares, tendo seus compostos bioativos sido alvos de um grande número de estudos (JILANI et al., 2015).

Os compostos antioxidantes são substâncias capazes de eliminar os radicais livres e as espécies reativas de oxigênio, estruturas responsáveis pelo envelhecimento dos organismos vivos e também pela diminuição da vida útil de alimentos e matérias primas. Eles são associados a efeitos benéficos à saúde, por seu potencial anticarcionogênico, antimicrobiano, antiviral, anti-inflamatório e antidiabético (JILANI et al., 2015).

A indústria utiliza grande quantidade desses compostos tanto em produtos alimentícios, quanto farmacêuticos ou cosméticos, e sua grande maioria é obtida por vias sintéticas. Porém, estudos apontam que antioxidantes sintéticos, como butil-hidroxi-anisol (BHA) e butil-hidroxi-tolueno (BHT) são responsáveis por um aumento na incidência de câncer após um longo período de uso, bem como o aumento do peso do fígado e proliferação do retículo endoplasmático (NOVAES et al.,2013; ZHANG et al., 2012).

Uma boa maneira de reter os compostos fenólicos, responsáveis pela ação antioxidante, presentes nos chás é a biossorção em leveduras do tipo

Saccharomyces cerevisiae. Sua utilização já é bem consolidada para a remoção de

contaminantes têxteis em água e o presente estudo tem por objetivo estudar a adsorção dos compostos bioativos de chá branco por essas leveduras.

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2 JUSTIFICATIVA

Atualmente, há uma preocupação crescente com a saúde e com uma alimentação mais saudável. O estresse oxidativo tem sido apontado como fonte de uma série de doenças degenerativas, como câncer, esclerose múltipla e mal de Parkinson. Estudos revelam que uma dieta rica em compostos fenólicos pode retardar esse processo, diminuindo os efeitos da idade e as doenças a ela ligadas.

As folhas de chá, provenientes da Camellia sinensis, são grandes fontes desses biocompostos, em especial o chá branco. Por seu processo de obtenção menos fermentativo, suas propriedades são mantidas, sendo consumido de forma mais natural.

As leveduras por sua vez são bastante utilizadas na indústria alimentícia. Desse modo, elas se mostram bastante seguras para serem utilizadas na recuperação dessas substâncias. Seu mecanismo de biossorção já é conhecido para contaminantes têxteis em água e por esse motivo há a possibilidade de uso para fenólicos.

Por esse motivo, a biossorção de compostos fenólicos de chá em levedura Sacharomyces cerevisiae é o objetivo deste estudo. Através das isotermas pode ser comprovada sua viabilidade.

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3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar o uso da levedura Sacharomyces cerevisiae como biossorvente na remoção de compostos fenólicos dos chás branco.

3.2 Objetivos específicos

 Realizar a modificação térmica da levedura.

 Bissorver compostos fenólicos a partir das folhas de chá.

 Avaliar a eficiência da levedura Sacharomyces cerevisiae na biossorção dos compostos fenólicos presentes no chá.

 Construir isotermas de adsorção do processo de biossorção em levedura dos compostos fenólicos de chá.

 Analisar a modificação estrutural das amostras do microrganismo através da Microscopia Eletrônica de Varredura.

 Avaliar a alteração das estruturas envolvidas na biossorção através de análises infravermelho.

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4 REFERENCIAL TEÓRICO

3.3 Chá

Chá é uma das bebidas mais consumidas no mundo. Ele é proveniente da infusão em água quente das folhas de Camellia sinensis e dependendo do quanto suas folhas são secas (Figura 1) são obtidos três tipos: verde, oolong, ou semifermentado, e preto (WEISBURGER, 1997). Eles se diferenciam basicamente pelo grau de oxidação de seus compostos fenólicos. O chá verde origina-se de várias partes da planta, podendo ter diversos tipos. Para o chá preto, as folhas passam por processos de oxidação, chamados também de fermentativos. E o oolong consiste em um tipo intermediário submetido à fermentação mais branda (MATSUBARA e RODRIGUEZ-AMAYA, 2006). O chá branco e o amarelo possuem processo de fabricação semelhante ao verde, sendo não fermentados. O que os diferencia é a fase de colheita das folhas, que é mais inicial e prioriza brotos e folhas pequenas e para o chá amarelo as folhas são abafadas em recipiente fechado, caracterizando sua coloração (ZIELINSKI, 2015).

Figura 1: Processos de obtenção dos diferentes tipos de chá (branco, verde, olong e preto). Fonte: adaptado de SANTANA-RIOS et al. (2001)

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Sua história iniciou-se a pelo menos 2700 AC, na China. De lá, a tradição passou para o Japão por volta do século VI. Era uma bebida da nobreza e se popularizou apenas há 700 anos. Mais tarde, foi introduzido na Indonésia e colônias holandesas, chegando à Inglaterra em meados do século XVII, tendo os ingleses desempenhado uma importante papel na popularização da bebida no mundo (WEISBURGER, 1997).

O chá é consumido por centenas de milhões de pessoas no mundo todo. Por tradição, as pessoas no Oriente preferem chá verde ou chá oolong. Em grande parte do resto do mundo, o chá preto é a bebida habitual. No Reino Unido, na Irlanda, e no Canadá, o chá preto é tomado com leite e muitas vezes açúcar. Na maioria dos outros países, o chá preto é consumido doce ou com limão, e o chá verde é normalmente bebido puro (WEISBURGER, 1997).

Diferentes compostos químicos podem ser encontrados nos chás. Dentre eles estão polissacarídeos, compostos aromáticos, vitaminas, lipídios, aminoácidos, minerais, alcaloides e compostos fenólicos, como ácidos fenólicos e flavonoides (ZIELINSKI, 2015). O consumo de chás, pela presença de compostos fenólicos, principalmente catequinas, em sua composição, tem aparecido como um agente benéfico para diversas enfermidades, por suas propriedades antioxidantes, anticarcinogênicas, antivirais, antimicrobianas, anti-inflamatórias e antidiabéticas (JILANI et al., 2015).

3.4 Compostos Fenólicos

Compostos fenólicos são substâncias altamente presentes na natureza, tendo sido detectados mais de 8000 em plantas. Eles podem ser encontrados em vegetais, frutas e também em produtos industrializados. Esses compostos agem como antioxidantes, pois são capazes de inibir a oxidação de diversas moléculas dos alimentos, mantendo suas propriedades. Isso se deve não somente pela capacidade de doar elétrons, mas também pela presença de radicais intermediários estáveis (SILVA et al., 2010).

Nos chás, sua presença depende principalmente do nível de oxidação a que a folha foi submetida. A Tabela 1 apresenta os teores de compostos fenólicos e flavonoides presentes em alguns tipos.

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Tabela 1: Concentração de Compostos Fenólicos Totais e Flavonóides expressos em equivalente de ácido gálico e catequina, respectivamente, nos chás verde, branco e preto.

Tipo de fermentação CFT/mg GAE L-1 Flavonoides/mg CAE L-1

Verde 759-4014 431-1768

Branco 423-3080 218-1786

Preto 935-2500 530

Essa classe de compostos é formada por diferentes grupos benzênicos, tendo por substituintes grupamentos hidroxilas, e pode ser classificada em flavonoides e não-flavonóides.

Os flavonoides tem sua estrutura formada por 15 átomos de carbono dispostos em dois anéis benzênicos (A e B) ligados por um grupo pirano (anel C) e sua representação é C6C3C6 (Figura 1) (MAMEDE e PASTORE, 2004). São encontrados principalmente na forma de flavonóis, flavonas, flavanonas, catequinas, antocianinas e isoflavonas tendo como principais fontes café, vinho, maçã e sobretudo o chá (Figura 2). Sua ação antioxidante se deve aos hidrogênios dos grupos hidroxila adjacentes, as duplas ligações dos anéis e a dupla ligação das carbonilas (MAMEDE e PASTORE, 2004).

Figura 2: Estrutura principal dos flavonoides contendo os anéis A, B e C.

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Dentre os não-flavonoides, destacam-se os derivados dos ácidos hidroxicinâmico (Figura 4a) e hidroxibenzóico (Figura 4b) (SILVA et al., 2010). A atividade antioxidante está relacionada com a presença de grupos –CO2H próximos ao grupo fenil, bem como a posição das hidroxilas.

Figura 4: Moléculas de a) Ácido hidroxicinâmico e b) Ácido hidrobenzóico

3.4.1 Catequinas

As catequinas especificamente são um conjunto de compostos fenólicos presentes principalmente nas folhas de chá. São substâncias incolores e hidrossolúveis que contribuem para a adstringência e amargor do chá verde (MATSUBARA e RODRIGUEZ-AMAYA, 2006). Suas estruturas principais estão apresentadas na Figura 5 e suas propriedades antioxidantes podem ser descritas pela presença dos átomos de hidrogênio dos grupos hidroxila adjacentes, localizados em diferentes posições do anel, das duplas ligações do anel benzênico e da dupla ligação da função C=O (SILVA et al., 2010).

Através do processamento das folhas estas sofrem oxidação, o que contribui para o desenvolvimento da cor e sabor da bebida. Esse processo se dá pela ação das enzimas presentes nos vacúolos das células, que são liberadas após as folhas serem trituradas e deixadas expostas ao ar (MATSUBARA e RODRIGUEZ-AMAYA, 2006).

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Figura 5: Estruturas de catequinas presentes em chás. Fonte: adaptado de MATSUBARA e RODRIGUEZ-AMAYA (2006).

O conteúdo de catequinas pode variar de acordo com o clima, a safra, o modo de cultivo ou a idade da folha, mas na maioria dos casos o chá verde possui maio concentração em detrimento ao chá preto. Isso se deve ao processo de fermentação ao qual as folhas mais escuras passam, que oxidam suas estruturas, convertendo as catequinas em dímeros, através das polifenol oxidases (ZIELINSKI, 2015).

Estudos comprovam que a ingestão de altas doses de catequinas facilita a perda de gordura corporal e auxiliam no gasto energético quando associada à prática regular de exercícios físicos (LAMARÃO e FIALHO, 2009).

3.5 Antioxidantes

Antioxidantes são substâncias capazes de impedir a formação de radicais livres (moléculas que possuem um elétron livre capaz de se ligar a outro elétron de outro átomo, provocando a oxidação) ou impedir a sua propagação. Seu mecanismo constitui da doação de hidrogênio, tornando a molécula estável e impedindo ou retardando o efeito da oxidação (ACHKAR et al., 2013).

Antioxidantes fenólicos são capazes de inibir a formação de radicais livres através do sequestro de radicais e algumas vezes atuam como quelantes de metais, agindo tanto na iniciação quanto na propagação do processo oxidativo. Os compostos fenólicos são então eficazes na prevenção da oxidação lipídica. Mesmo

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assim, poucos são recomendados para uso alimentício, devido ao seu grau de toxicidade (SOARES, 2002).

O estresse oxidativo pode causar uma série de doenças degenerativas, como câncer, esclerose múltipla e mal de Parkinson. Estudos revelam que uma dieta rica em compostos fenólicos pode retardar esse processo, diminuindo os efeitos da idade e as doenças a ela ligadas (HAMINIUK et al., 2012).

Na indústria de alimentos, os compostos mais utilizados são os butil-hidroxi-anisol (BHA), butil-hidroxi-tolueno (BHT), tércio-butil-hidroxi-quinona (TBHQ), tri-hidroxi-butilfenona (THBP) e propilgalato (PG). Porém, estudos toxicológicos revelaram possíveis efeitos adversos dessas substâncias. O GP pode causar hiperplasia do estômago, anemia e retardo do crescimento, o THBP pode ter características mutagênicas e o BHA e o BHT podem provocar tumores em animais. No Brasil esses compostos tem seu uso controlado e o Ministério da Saúde limita o BHA e o THBP a 200 mg/kg e o PG e o BHT a 100 mg/kg (SILVA e JORGE, 2011).

3.6 Saccharomyces cerevisiae

As leveduras são microrganismos eucariotos amplamente explorados pelo homem. A Saccharomyces cerevisiae é uma das mais importantes industrialmente. Por seu baixo custo, facilidade de manuseio, não patogenicidade, alta eficiência e seu fácil desenvolvimento à temperatura ambiente, é um dos biocatalizadores mais comuns, sendo utilizada na produção de diversos alimentos, como pães e cerveja (MITTER, 2012).

As leveduras ao serem introduzidas no processo de fabricação das cervejas catabolizam os açúcares de duas maneiras distintas: via respiratória e via fermentativa. Pela via respiratória, elas oxidam o açúcar, dando origem a gás carbônico, água e energia. Ao fim do oxigênio presente no meio, elas fermentam as moléculas de açúcar, gerando etanol, gás carbônico e energia (STAFUSSA, 2014).

Ao serem descartadas, normalmente são reutilizadas como ração animal, sendo uma boa fonte de proteína para ruminantes e suínos. Por seu alto índice de ácido ribonucleico presente nas células (cerca de um terço do total), o uso dessa biomassa para consumo humano fica comprometido (FERREIRA et al., 2013).

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Vários estudos investigaram extensivamente o uso da S. cerevisiae para processos de biossorção exatamente por sua grande disponibilidade devido à indústria fermentativa. São em sua maioria consideradas mais seguras e por isso possuem maior aceitação pública quando utilizadas para fins alimentícios (JILANI et al., 2015). Porém são também bastante utilizadas na biossorção de corantes têxteis e metais pesados.

3.7 Biossorção

A biossorção é considerada uma alternativa ecológica para o tratamento de poluentes. É definida como a acumulação de poluentes orgânicos e inorgânicos através do uso de materiais biológicos. Esses materiais são formados principalmente de biomassa microbiológica, podendo esta ser viva ou morta. (MITTER, 2012)

O mecanismo de biossorção pode variar de acordo com as interações moleculares, sendo força de van der Waals, ligações covalentes ou iônicas as principais forças envolvidas. (MITTER, 2012) Na adsorção química, também conhecida como quimiossorção, a energia de ligação é da mesma ordem de grandeza das ligações químicas. Na adsorção física, ou fisiossorção, as interações eletrostáticas é que estão presentes. Por esse motivo, a quimiossorção é quase sempre irreversível. (STAFUSSA, 2014)

Diversos fatores podem afetar a capacidade biossortiva, como o tipo de biomassa, de adsorbato, o método de preparo da cultura microbiana, temperatura, pH, entre outros. (MITTER, 2012)

A biossorção é um processo caracterizado por duas fases, sendo a primeira a adsorção, que não depende de energia e atividade metabólica, e a segunda a absorção, dependente de energia e metabolismo.(DEL RIO, 2004) A primeira fase é rápida, podendo ocorrer em questão de minutos, já a segunda, pode levar algumas horas para ocorrer.

De acordo com a estrutura da parede celular da Saccharomyces

cerevisiae, esse processo pode ser baseado nas ligações de hidrogênio entre a

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Figura 6: Estruta da quitina presente na parede celular da levedura. Fonte: MENDES, DILARRI e PELEGRINI (2015)

Essas ligações de hidrogênio podem ocorrer entre os grupos amino ou hidroxi e as hidroxilas presentes nas catequinas. Quanto menor o pH, mais sítios ativos estão disponíveis para a adsorção (MENDES, DILARRI e PELEGRINI, 2015)

3.8 Isotermas de adsorção

Uma isoterma de adsorção é a relação de equilíbrio entre a concentração de um fluido e a concentração de uma partícula sólida a uma dada temperatura. A concentração do adsorbato no sólido é dada através da massa absorvida por unidade de massa do adsorvente. (MCCABE, 1993) Os modelos mais utilizados são de Langmuir, Freundlich e Temkin.

Langmuir define as forças que causam a adsorção como tipicamente químicas, baseadas nas forças de valência. Assim, a adsorção é um fenômeno que ocorre unicamente em uma monocamada da substância sobre a superfície sólida.(LANGMUIR, 1918) Este modelo é representado pela Equação 1.

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Em que qeq é a quantidade adsorvida por unidade de massa do adsorvente no equilíbrio, q0 é o limite de saturação do adsorvente, Ceq é a concentração da fase fluida no equilíbrio, e KL é a constante de Langmuir, que é

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obtida através da razão entre a constante cinética de adsorção e constante cinética de dessorção.

A Equação pode ser linearizada, sendo apresentada na forma da Equação 2.

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O fator de separação, ou parâmetro de equilíbrio, RL é outro fator que pode ser obtido através da isoterma de Langmuir. Ele é uma constante adimensional que possibilita prever a compatibilidade da adsorção. Ele se dá através da Equação 3 e possui quatro possibilidadades:

Se 0< RL <1, a adsorção é favorável. Se RL > 1, a adsorção é desfavorável. Se RL = 1, a adsorção é linear.

Se RL =0, a adsorção é irreversível.

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Freundlich descreve a adsorção como um processo que ocorre em multicamadas. Seu modelo normalmente é utilizado para descrever a adsorção em superfícies heterogêneas.(FREUNDLICH, 1906) Ele define esse modelo através da Equação 4.

(4) Onde kF é a constante da capacidade de adsorção do adsorvente e n é a constante da intensidade de adsorção. Quando 1<n<10, a adsorção é favorável.

Para melhor utilização, a equação da isoterma de Freundlich pode ser linearizada, sendo apresentada na Equação 5.

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O modelo de Temkin contém um fator que leva em conta as interações adsorvente-adsobato. Como implícito na equação, sua derivação se dá através da distribuição uniforme das energias de ligação até um valor máximo. (DADA, 2012) Essa isoterma é descrita pela Equação 6.

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Sendo ela linearizada como mostra a Equação 7.

(7) Em que B=RT/b, com R sendo a constante universal dos gases, e T corresponde à temperatura absoluta do calor de adsorção.

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4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Preparo das amostras de chá e levedura Saccharomyces cerevisiae

4.1.1 Infusão de chá

Cinco gramas de chá branco comercial da marca Leão fuze foram imersos em 250 mL de água destilada à 80oC por 3 minutos. Protegidas da luz, as infusões foram resfriadas à temperatura ambiente e então filtradas para obtenção do extrato.

4.1.2 Preparo do biossorvente.

Em um erlenmeyer de 500 mL foram adicionados 5 g de fermento biológico seco da marca Dr. Oetker à 250 mL de água destilada. A mistura foi autoclavada por 20 minutos à 120ºC. Após isso, ela foi filtrada e seca ao ar, conforme Figura 7.

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4.2 Curva de calibração

Foi realizada uma curva analítica de ácido gálico, para fim de determinação dos Compostos Fenólicos Totais. Para tal, utilizaram-se 100 μL de cada uma das cinco diluições de ácido gálico, dispostas na Tabela 2, misturadas com 500 μL de reagente de Folin - Ciocalteu e, após 3 minutos, com 2,0 mL de solução de carbonato de sódio 15% em balão volumétrico de 10 mL, tendo seu volume aferido.

Tabela 2: Volumes de ácido gálico utilizados nas diluições da curva de calibração

Balão Volume de solução ácido gálico/μL

Branco 0 B1 100 B2 200 B3 400 B4 600 B5 800 B6 1000 4.3 Biossorção

A partir do extrato bruto, prepararam-se cinco diluições, sendo elas: 1:20, 1:25, 1:30, 1:35 e 1:40. Então, 12,5 mL de cada uma foi adicionado a 50 mg de levedura seca. As amostras foram agitadas a 140 rpm a 25ºC por 3 horas (tempo estimado de equilíbrio da adsorção), conforme Figura 8.

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Figura 8: Diluições de chá branco adsorvidos em levedura.

Após esse tempo as amostras foram centrifugadas e filtradas a vácuo. As leveduras foram secas ao ar e armazenadas à temperatura ambiente.

Pode-se então determinar as isotermas de adsorção, através dos modelos (Equações 2, 5 e 7) apresentados na Tabela 3.

Tabela 3: Modelos de isotermas

Isotermas Equação Langmuir (2) Freundlich ₍₅₎ Temkin (7)

Nota: Ceq = concentração de equilíbrio na solução (mg L-1); qeq = capacidade de sorção em equilíbrio(mg g-1); q0 = capacidade de cobertura máxima em monocamada (mg g-1); KL = constante de Langmuir (L mg-1); KF = constante de Freundlich (L g-1); n = intensidade de adsorção; A = constante de ligação de equilíbrio (L g-1); B = constante de Temkin (J mol-1).

4.4 Determinação de compostos fenólicos totais

Os compostos fenólicos totais foram determinados através do método de Folin-Ciocalteu de Singleton e Rossi (1965). Ele consiste na reação de oxirredução entre o ácido gálico e o molibdênio, sendo este reduzido, produzindo a coloração azul do meio. Desse modo, é considerado um método indireto de determinação dos compostos fenólicos presentes na amostra.

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Esse reagente foi adquirido pela Sigma Aldrich® (St. Louis, MO, USA) e consiste de uma mistura de ácidos fosfotunguístico e fosfomolibídico (coloração amarelada) em um meio básico. Os fenóis presentes na amostra são oxidados, resultando na formação de O2-, que reage com os ácidos formando compostos de coloração azul e que absorvem comprimentos de onda de 765nm.

A reação foi realizada através de 150 μL de cada uma das cinco diluições da amostra misturadas com 500 μL de reagente de Folin - Ciocalteu e, após 3 minutos, com 2,0 mL de solução de carbonato de sódio 15% em balão volumétrico de 10 mL, tendo seu volume aferido, conforme Figura 9.

Figura 9: Determinação de CFT a partir do método de Folin-Ciocalteu.

Após 2 horas no escuro, foi realizada a leitura em espectrofotômetro UV-VIS BEL PHOTONICS (Mod. UV-M51) em 765 nm. A análise foi feita em duplicata e os resultados serão apresentados através do equivalente de ácido gálico. Desse modo, a curva padrão foi construída a partir de diferentes concentrações de ácido gálico (45 a 460 mg L-1).

4.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Para visualização das estruturas das leveduras (antes e após o processo de biossorção), fez-se uso da Microscopia eletrônica de varredura. O equipamento utilizado foi o Microscópio Eletrônico de Varredura – MEV EVO® e as

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amostras foram adicionadas a suportes de alumínio utilizando fita de carbono colocada sobre uma película de alumínio, sendo cobertas com uma fina camada de ouro. A obtenção de imagens foi feita a partir da detecção de elétrons secundários e o equipamento foi operado em 20 kV.

4.6 Análise de Espectroscopia de Infravermelho Médio com Reflectância Total Atenuada (MIR–ATR)

A análise de MIR–ATR foi realizada em espectrofotômetro de infravermelho com transformada de Fourier (VARIAN, 640-IR) e um acessório de reflectância total atenuada (PIKE, miracle), com cristal de seleneto de zinco com a finalidade de comprovar a adsorção dos compostos fenólicos presentes no chá branco. Os espectros foram obtidos na faixa de 4000 a 650 cm-1 e antes das amostras (levedura antes e após o processo de biossorção) fez-se a leitura do branco composto por ar, para minimizar sua influência nos espectros.

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6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Curva de Calibração do Ácido Gálico.

Com coeficiente de correlação de 0,99938, a curva de calibração (Figura 10) resultou na Equação 12.

(12) Onde, Abs é a absorbância medida para cada uma das amostras e C é a concentração de fenólicos. 0 100 200 300 400 500 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Ab so rb ân ci a [Acido galico]/mg,L-1

Figura 10: Curva de calibração do Ácido Gálico.

6.2 Compostos Fenólicos totais (CFT)

Os compostos fenólicos totais foram determinados a partir do método de Folin-Ciocalteu e foram utilizados para a construção das isotermas. Na Tabela 4 estão dispostos os valores encontrados de fenólicos totais nas amostras de chá branco puro e após adsorção.

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Tabela 4: Concentração de compostos fenólicos totais presentes nas amostras de chá antes e após a adsorção (mg/L).

Diluição Concentração - mg L-1 Porcentagem de adsorção

Controle Adsorção 1:20 103 81 22% 1:25 85 69 18% 1:30 68 59 13% 1:35 60 53 11% 1:40 50 46 13%

Para a determinação dos valores mencionados, fez-se uso da curva de calibração de ácido gálico, disposta na Equação 12 apresentada anteriormente.

Como se pode perceber, houve uma diminuição da concentração de compostos fenólicos da amostra controle para a que entrou em contato com a levedura. Sendo assim, conclui-se que houve adsorção por parte do microrganismo.

A partir das diluições realizadas, pode-se notar que o chá branco possui em média 2058 mg/L de CFT. Chás menos fermentados possuem quantidades maiores desses compostos e, segundo Jilani (2015), as folhas de apresentam entre 800 e 2400 mg/L, o que comprova os valores obtidos.

Jilani (2015) também mostrou que o chá verde (menos oxidado) apresentou absorções entre 20% e 40%. Isso significa que CFT em concentrações maiores podem saturar os sítios ativos dos microrganismos, estabilizando a adsorção.

6.3 Isotermas

Isotermas de adsorção são utilizadas principalmente para descrever a relação entre a quantidade de soluto adsorvido pelo adsorvato e a concentração de soluto na solução de equilíbrio. Estas isotermas são úteis para aperfeiçoar o uso de biossorventes, estimando a quantidade de biossorvente necessária para captar uma determinada concentração de soluto da solução e prever a distribuição dos locais de adsorção e as partículas adsorvidas na superfície biossorvente. (MACIEL et al, 2013) Neste trabalho fez-se uso das isotermas de Langmuir, Freundlich e Temkin para descrever a interação entre os compostos fenólicos presentes no chá branco e

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a levedura Saccharomyces cerevisiae. As constantes obtidas para cada modelo e os coeficientes de correlação (R2) estão apresentados na Tabela 5.

Tabela 5: Parâmetros das isotermas de Langmuir, Freundlich e Temkin para biossorção de compostos fenólicos de chá branco em Saccharomyces cerevisiae.

Isotermas Constantes R2 Langmuir q0/mg g -1 2094,80 KL/L mg -1 0,027 RL 0,018 0,990 Freundlich KF/L g-1 76,64 n 1,041 1/n 0,961 0,987 Temkin A//L g-1 2,72 B/J mol-1 175,68 0,965

Nota: q0 = capacidade de cobertura máxima em monocamada (mg∙g-1_{); KL = constante de Langmuir (L∙mg}-1 ); RL = fator de separação ou parâmetro de equilíbrio; KF = constante de Freundlich (L∙g-1); n = intensidade de adsorção; A = constante de ligação de equilíbrio (L∙g-1_{); B = constante de Temkin (J∙mol}-1

).

O melhor modelo a descrever a adsorção do chá branco em

Saccharomyces cerevisiae foi o da isoterma de Langmuir. Com um coeficiente de

correlação de 0,990 e fator de separação (RL) 0,018, ela se mostrou favorável, pois para tal os valores de RL devem estar entre 0 e 1. Esse modelo descreve a biossorção como sendo realizada em monocamada, tendo apenas um número fixo de locais para ocorrer a ligação das moléculas de adsorvato, sendo estas idênticas e equivalentes.(VIJAYARAGHAVAN et al, 2006) Ele se baseia no pressuposto de que a adsorção máxima ocorre quando uma monocamada saturada de moléculas de soluto está presente na superfície adsorvente, a energia de adsorção é constante e não há migração de moléculas de adsorbato no plano de superfície (KUMAR, 2010) Os parâmetros q0 e KL foram obtidos através da representação gráfica de Ce versus Ce/qe, apresentada na Figura 11.

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1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 (Ce /qe ) /g .L -1 C_e/mg.L-1

Figura 11: Gráfico do modelo de isoterma de Langmuir para o chá branco

A isoterma de Temkin leva em consideração que o calor de adsorção das moléculas na camada diminui linearmente com a cobertura, devia a interações entre o adsorvente e o adsorvato e que a adsorção é caracterizada por uma distribuição uniforme de energias de ligação, até uma energia de ligação máxima. (KUMAR et al, 2010) Sendo assim, foi possível obter os valores das constantes A (constante isotérmica de ligação de equilíbrio (L g-1)) e B (constante isotérmica de Temkin (J mol-1)) a partir do gráfico apresentado na Figura 12.

6,9 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 10 12 14 16 18 20 qe / mg .g -1 lnC_e

Figura 12: Gráfico do modelo de isoterma de Temkin para o chá branco

Freundlich foi o primeiro pesquisador a descrever os processos de adsorção. Seu modelo se aplica a adsorção em superfícies heterogêneas com interação entre moléculas adsorvidas e a aplicação da equação de Freundlich também sugere que a energia de adsorção diminui exponencialmente com o

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preenchimento dos sítios ativos. A Figura 13 mostra a representação deste modelo e a partir dela se obtém os parâmetros KF e n.

6,9 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0 3,1 lnq e lnC_e

Figura 13: Gráfico do modelo de isoterma de Freundlich para o chá branco

O parâmetro n indica a intensidade de adsorção. Para valores entre 0 e 10, como é o caso, ele demonstra que a adsorção foi favorável. (STAFUSSA, 2014)

6.4 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A partir da técnica de Microscopia eletrônica de varredura foi possível visualizar a estrutura da levedura após a adsorção de água e das soluções de chá. As imagens obtidas a 3500 vezes estão apresentadas nas Figuras, 14, 15, 16, 17, 18 e 19.

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Figura 14: Eletromicrografia de varredura da Saccharomyces cerevisiae após adsorção de água

Figura 15: Eletromicrografia de varredura da Saccharomyces cerevisiae após adsorção de chá branco na concentração 1:20

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O tratamento térmico da levedura proporcionou a inativação de seu metabolismo sem que houvesse modificações drásticas em sua estrutura. Sendo assim, seu formato oval e sua parede celular rugosa conferem uma área superficial propícia para a adsorção ocorrer.

Analisando as imagens, é possível perceber que não houve alteração na estrutura da levedura, independente da concentração de chá branco adsorvido. Isso pode ser explicado pela inativação térmica do fermento biológico seco

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anteriormente ao experimento, indicando pouca ou nenhuma interação biológica com as amostras.

As interações ocorridas entre as moléculas adsorvidas e a levedura muito embora sejam perceptíveis por outros métodos, não são visualizadas em MEV. Isso indica que a adsorção ocorrida não modifica a estrutura do microrganismo, sendo uma ligação apenas superficial. Desse modo, pode ser possível uma recuperação desses compostos, haja vista seu potencial uso como antioxidantes para diversos fins.

6.5 Espectroscopia de Infravermelho da Biomassa de Levedura

Os fungos possuem e sua parede celular diversos tipos de estruturas, como proteínas, lipídios, quitinas, glicanas e outros polissacarídeos. Estas moléculas apresentam diversos sítios possíveis para ligação com compostos a serem adsorvidos. A espectroscopia de infravermelho é uma maneira eficaz de identificar a presença de grupos funcionais de uma biomassa que podem estar envolvidos no processo de biossorção. (STAFUSSA, 2014) A Figura 20 apresenta o espectro infravermelho do microrganismo antes e depois da adsorção. Pode-se perceber uma diferença de intensidade nos picos antes e após a adsorção. Isso pode explicar o processo de adsorção envolvendo estes grupos funcionais presentes na amostra de levedura. 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 55000 Ab so rb â n ci a Comprimento de onda/cm-1 levedura + cha levedura

Figura 20: Espectros de infravermelho da Saccharomyces cerevisiae antes e após o processo de biossorção do chá branco

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A biomassa de Saccharomyces cerevisiae antes da biosorção apresenta uma banda larga no comprimento de onda 3285, representando a deformação axial de grupos amino (N-H) presentes na estrutura e a vibração de hidroxilas de carboidratos (normalmente detectadas na faixa entre 3200 e 3500 cm -1

). As bandas apresentada em 2925 corresponde à deformação axial de carbonos primários e secundários alifáticos.(STAFUSSA, 2014) Em 1635 há a detecção da deformação axial de carbonos do grupo C-N e ao dobramento de aminas primárias. (MITTER, 2012) Os picos observados no ponto 1537 tem correspondência com o estiramento das duplas ligações de carbono (C=C) e dobramento de amidas secundárias. As bandas observadas em 1040 são originadas das ligações σ do anel aromático. (MITTER, 2012)

O processo de interação das catequinas e a estrutura celular da levedura fez com que os picos tivessem intensidades diferentes, bem como alterou a largura das bandas. As pricipais diferenças entre os espectros IR da biomassa após o contato com o chá branco incluem: (1) estreitamento da banda em 3285 cm-1; (2) diminuição da intensidade de todos os picos, indicando a interação dos sítios ativos com a estrutura dos compostos fenólicos.

Os sítios de ligação observados foram identificados como os grupos funcionais amino/hidroxilas, amidas e carboxilas. Entretanto,as interações podem ser diferentes de acordo com os extratos adsorvidos, devido sua heterogeneidade e pelas condições experimentais (temperatura, pH, agitação, entre outros).

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7 CONCLUSÃO

A levedura Saccharomyces cerevisiae mostrou-se um biossorvente eficaz na adsorção dos compostos fenólicos das folhas de chá. Utilizando as isotermas de Langmuir, Freundlich e Temkin, pode-se perceber que a o processo de biossorção dos compostos fenólicos de chá em levedura ocorre através de mecanismos de quimiossorção.

Através da microscopia eletrônica, analisaram-se as estruturas do microrganismo, compreendendo que o processo realizado não as alterou, o que indica que a adsorção ocorre realmente de maneira superficial em monocamada. Os grupamentos envolvidos podem ser determinados por análise de infravermelho, sendo eles os grupos amino e hidroxi, sendo detectadas também vibrações provenientes das duplas ligações.

Sendo assim, os resultados obtidos no estudo demonstraram que é possível adsorver os compostos fenólicos provenientes de Camellia sinensis em

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8 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Com a possibilidade de adsorção dos compostos fenólicos presentes nas folhas de chá (Camellia sinensis), fica a sugestão para que em trabalhos futuros se faça o estudo da utilização desses compostos retidos nas moléculas de leveduraem diversos produtos, como alimentos, bebidas e cosméticos, por exemplo.

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