Universidade Estadual de Campinas
Instituto de Física “Gleb Wataghin”
Vitor Bianchin Pelegati
Microscopias Ópticas de Processos
Coerentes
Campinas 2016
Vitor Bianchin Pelegati
Microscopias Ópticas de Processos Coerentes
Tese apresentada ao Instituto de Física “Gleb Wataghin” da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências
Orientador: Carlos Lenz Cesar
Este exemplar corresponde à versão final de tese
defendida pelo aluno Vitor Bianchin Pelegati e
orientada pelo Prof. Dr. Carlos Lenz Cesar.
Campinas 2016
Agradecimentos
Especialmente ao Prof. Lenz pela oportunidade e orientação.
A todos do grupo de biofotônica e do Infabic, Hernandes, André, Mariana, Diogo, Javier, Ariane, Wagner e Gislaine.
À Dayana e ao Henrique pelo enorme apoio.
Ao Bernardo pela contribuição com a automação da varredura, e ao Rodrigo pela ajuda com informações biológicas sobre os tecidos.
Resumo
Técnicas de microscopias ópticas são as principais ferramentas capazes de observar células e tecidos biológicos em tempo real e com mínimo dano. Essa área foi revolucionada recentemente através das microscopias confocais de varredura a laser e as microscopias de óptica não linear, naturalmente confocais. Entre os processos não lineares temos, a fluorescência excitada por dois ou mais fótons, geração de segundo harmônico [Second Harmonic Generation - SHG] e terceiro harmônico [Third Harmonic Generation - THG]. SHG e THG são técnicas de óptica não linear coerentes, não necessitam de marcadores exógenos e permitem reconstrução de imagens em três dimensões com resolução espacial subcelular.
As técnicas de fluorescência permitem visualizar estruturas específicas no espaço, mas não permitem discriminar as substâncias químicas nas estruturas celulares, e as técnicas de SHG e THG não possuem especificidade química. Espectroscopia Raman possui especificidade química através das propriedades vibracionais das moléculas e pode ser usada como mecanismo de contraste na aquisição de imagens. Comparada com a espectroscopia/microscopia infravermelho, a microscopia Raman traz a informação das vibrações moleculares do infravermelho para o visível, eliminando os problemas da baixa resolução espacial e opacidade das amostras. Entretanto a baixa sensibilidade dessa técnica implica em tempos de aquisição de imagens muito longos, da ordem de horas, inviabilizando acompanhar a dinâmica de processos celulares em tempo real. Como solução para essa baixa sensibilidade do espalhamento Raman espontâneo, surgiu a microscopia por espalhamento Raman Coerente anti-Stokes [Coherent Anti-Stokes Raman Scattering - CARS]. Comparado com Raman espontâneo, a microscopia CARS representa aumento de 4 a 5 ordens de grandeza na sensitividade da técnica, diminuindo os tempos de aquisição ao ponto de viabilizar a aquisição em taxas de vídeos (mais rápido do que 30 quadros por segundo) e estudos em tempo real.
Essa tese é dedicada ao estudo experimental e teórico, assim como de algumas aplicações, das técnicas de óptica não linear, com destaque para processos de óptica não linear coerentes. Apresentamos de forma detalhada três sistemas experimentais para a aquisição de imagens de Raman coerente e um sistema integrado com várias técnicas de óptica não linear. Mostramos as primeiras imagens de CARS realizadas no Brasil. Além do CARS convencional, trabalhamos com outra técnica de CARS de ordem mais alta, o CARS cascata [cascade CARS - CCARS], e, no melhor do nosso conhecimento, apresentamos as primeiras imagens internacionais obtidas com essa metodologia.
CCARS aumenta o contraste da técnica CARS, diminuindo o fundo não ressonante, um problema que aflige a comunidade científica dedicada ao uso dessa técnica. Além da diminuição do fundo não ressonante, a emissão do CCARS acontece em um comprimento de onda diferente de qualquer outro efeito não linear coerente, significando um acréscimo de complexidade mínimo para sua detecção quando comparado com o CARS.
Por último mostramos algumas aplicações realizadas com o sistema experimental desenvolvido para integrar diversas modalidades ópticas em paralelo, especialmente da geração de harmônicos com a fluorescência excitada por dois fótons e suas variantes, como microscopia de tempo de vida de fluorescência [Fluorescence Lifetime Imaging – FLIM].
Abstract
Optical microscopies techniques are the main tools capable of observing cell and biological tissues in real time and with minimum damage. This area have recently been revolutionized by confocal laser scanning microscopies and non-linear microscopies, naturally confocal. Among the non-linear process we have, the two or more photons excited fluorescence, second harmonic generation [SHG] and third harmonic generation [THG]. SHG and THG are coherent nonlinear techniques, they do not require exogenous markers and allow three dimension imaging reconstruction with subcellular resolution.
The fluorescence techniques allow visualizing specific structures in space, but do not allow discriminating the chemical substances in cellular structures, SHG and THG techniques do not have chemical specificity. Raman spectroscopy has chemical specificity through the vibrational properties of the molecules and can be used as a contrast mechanism for imaging acquisition. Compared to infrared spectroscopy/microscopy, Raman microscopy brings information about molecular vibration from infrared to visible, eliminating the low resolution and sample opacity problems. However, this technique low sensibility implies in very long imaging acquisition times, order of hours, making it not viable for following cellular process dynamics in real time. As an answer for the spontaneous Raman scattering low sensibility, the coherent anti-Stokes Raman scattering [CARS] emerged. Compared to spontaneous Raman, CARS microscopy presents an increase of 4 to 5 orders of magnitude in the sensitivity of the technique, lowering the acquisition times to the point of making video acquisition (faster than 30 frames per second) and real time studies possible.
This thesis is dedicated to the experimental and theoretical study, as well as some applications, of the non-linear techniques, with emphasis on coherent non-linear optical processes. We present in detailed form three experimental systems for the acquisition of coherent Raman images, and a system with the integration of various non-linear techniques. We show the first CARS images acquired in Brazil. In addition to conventional CARS, we worked with other higher order CARS technique, the cascade CARS [CCARS], and, in the best of our knowledge, we present the first international image acquired with this methodology. CCARS increases the contrast from CARS technique, decreasing the non-resonant background, a problem that afflicts the scientific community dedicated to the use of this technique. Besides the decrease of the non-resonant background, the
CCARS emission occurs in a different wavelength from any other non-linear coherent effect, meaning a minimum complexity increase for its detection when compared with CARS.
Finally we show some applications performed with the experimental system developed to integrate several optical modalities in parallel, especially the generation of harmonics with two photons excitation fluorescence and their variants such as Fluorescence Lifetime Imaging [FLIM].
Sumário
Capítulo 1 ... 12 Introdução ... 12 Capítulo 2 ... 27 Teoria ... 27 2.1 - Fundamentos de Óptica ... 272.2 - Introduções do eletromagnetismo e suas expansões... 40
2.3 - Cálculos de
(2) e (3) com modelo clássico ... 542.4 - CARS ... 63
2.5 - CARS por mistura de seis ondas ... 66
2.6 - Limiar de detecção para as duas técnicas ... 69
2.7 - Conclusão ... 75
Capítulo 3 ... 76
Sistemas Experimentais para aquisição de imagens. ... 76
3.1 - Sistemas de Lasers ... 84
3.1.1 - Osciladores Paramétricos Ópticos e Laser de Ti:Safira ... 84
3.1.2 - Amplificador Regenerativo e OPA ... 89
3.1.3 - Spirit NOPA SHG e bombeio Spirit 1040 ... 96
3.2 - Sistema de Varredura e Microscópios ... 101
3.2.1 - FV300 e IX-81 da Olympus ... 101
3.2.2 - LSM780 e Axio.Observer da Zeiss ... 102
3.3 - Detecção ... 102
3.3.1 - Fotodiodo e Fotomultiplicadora ... 103
3.3.2 - Monocromador ... 104
3.3.3 - Detecção de fótons individuais correlacionados no tempo ... 105
3.4 - Alinhamento e sistema experimental CARS ... 108
3.5 - Alinhamento e sistema experimental CCARS I ... 109
3.6 - Alinhamento e sistema experimental CCARS II ... 114
3.7 - Alinhamento e sistema experimental técnicas NLO ... 116
3.8 - Resumo das montagens e Conclusão ... 118
Capítulo 4 ... 119
Resultados ... 119
4.2 - Resultados preliminares sistema CCARS I ... 126
4.3 - Resultados preliminares sistema CCARS II ... 130
4.4 - Imagens CCARS e CARS ... 131
4.5 - Conclusão ... 137
Capítulo 5 ... 138
Aplicações biológicas para microscopias de óptica não linear. ... 138
5.1 - Desenvolvimento Embrionário: ... 141
5.2 - Aplicações em cortes histológicos de tecidos biológicos corados com H&E. ... 145
5.3 - Conclusão ... 158
Capítulo 6 ... 159
Conclusões e Perspectivas ... 159
Capítulo 1
Introdução
Contexto Internacional da Física Biológica: Na opinião de muitos analistas a
próxima revolução científica-tecnológica viria da capacidade do controle da biologia celular e molecular sem precedentes na história. Essa capacidade abriria a possibilidade para a criação de vários produtos de biologia sintética e tratamentos médicos inovadores1.
Em Junho de 2016, o Massachusetts Institute of Technology [MIT] publicou um relatório intitulado “Convergence: The Future of Health”2 onde eles enfatizam a importância
da convergência de várias áreas do conhecimento para a área da saúde. Nele, a convergência aplicada à área da saúde, ou somente convergência, é explicada como “uma abordagem para solução de problemas que integra expertise das ciências da vida com física, matemática, e ciências computacionais, bem como engenharia, para formar estruturas compreensivas para unir áreas de conhecimento de múltiplos campos...” (tradução nossa). Dessa forma a convergência vai além de estudos multidisciplinares e é uma mudança cultural na forma como
1 http://www.cimit.org/images/about/MIT-White-Paper-on-Convergence.pdf 2 http://www.convergencerevolution.net/
as pesquisas científicas são conduzidas, e que novas integrações devem ser “amplamente repensadas a fim de capitalizar uma ampla base de conhecimento” (tradução nossa).
Os físicos devem se questionar qual será seu papel na convergência. É de se esperar que a convergência traga novos desafios de física pura, além de auxiliar os profissionais da ciência da vida a resolverem seus problemas. O fato de que o prêmio Nobel de química de 2014 foi concedido a dois físicos e um físico-químico pelo desenvolvimento de microscopia de fluorescência super-resolvida, reforça a ideia de convergência das áreas do conhecimento com aplicação nas áreas biológicas. No comunicado à imprensa3 do anúncio na
primeira linha já fica clara a aplicação das técnicas de microscopia óptica para estudos celulares: “No que ficou conhecido como nanoscopia, cientistas visualizam o caminho de moléculas individuais dentro de células vivas” (tradução nossa).
Células são as unidades básicas dos organismos vivos, e o seu estudo, Citologia, pode ser considerado uma das áreas mais importantes das pesquisas biológicas. Entender o funcionamento das células saudáveis e doentes permite aos pesquisadores desenvolver novas vacinas, medicamentos mais eficazes, plantas com qualidades melhoradas, etc.
Muito do que se sabe hoje sobre o funcionamento celular vem de técnicas de biologia molecular e bioquímica4, como western blotting [1] e cromatografia. Essas técnicas
não são aplicadas a uma célula, mas a um conjunto de células, e o que é analisado é a quantidade de uma substância através de interações químicas. Outras técnicas para análise bioquímica incluem espectroscopia de massa e ressonância magnética nuclear. Em relação ao estudo morfológico de tecidos, o chamado padrão ouro da patologia é a coloração por Hematoxilina e Eosina [H&E], incluindo tecidos de biópsias para avaliação patológica. Esses tecidos passam por fixação em formalina tamponada e não seria exagero dizer que toda informação química é perdida durante o processo, ficando somente os resultados estruturais dos processos químicos celulares.
Importância da Óptica nesse Contexto: Por essas técnicas, os conhecimentos da
composição química e de sua morfologia são mutuamente excludentes. Permitir a observação de processos celulares nos aspectos bioquímicos e biomecânicos, não destrutivamente, em
3 https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014/press.html
tempo real, com resolução subcelular é o grande desafio para entender a bioquímica mantendo a forma do sistema.
Técnicas de microscopias ópticas são as principais ferramentas capazes de observar esses processos celulares com mínimo dano biológico. Elas se baseiam na interação de fótons com a matéria, na qual a informação é transportada através de ondas pouco destrutivas em profundidades relevantes para biologia celular. A sensibilidade da óptica permite a detecção de um único fóton, que pode ser devido à fluorescência de uma única molécula. Uma molécula fluorescente emite a uma taxa de 1 bilhão de fótons por segundo, o que em uma taxa de emissão constante permite facilmente a observação de eventos em tempo real e bem abaixo dos tempos típicos de difusão molecular.
Um grande passo proporcionado pelas microscopias ópticas foi através do princípio da confocalidade. Ele surge como uma solução para um problema comum na microscopia óptica por fluorescência que é aquisição de imagens em 3 dimensões de amostras espessas, detectando somente a fluorescência proveniente do foco da objetiva. Na microscopia confocal, um orifício micrométrico, pinhole, é usado para rejeitar qualquer luz proveniente de regiões que não estejam no plano focal, sendo possível adquirir imagens em diferentes profundidades. Os primeiros microscópios confocais adquiriam imagens movendo a amostra e mantendo o feixe de luz estático. Essa configuração se mostrou incompleta devido à perda de precisão ao mover a amostra. Nos confocais modernos o feixe de um laser é varrido sobre a amostra que é mantida estática. Como o pinhole é fixo no espaço é necessário realizar um descanning antes de passar pelo mesmo. O caminho óptico da fluorescência é o mesmo do feixe de excitação, garantindo que, ao passar de volta pelos dois espelhos de varredura (scanning) o feixe de fluorescência se torna colinear com o feixe de excitação. A microscopia confocal permite a reconstrução em três dimensões de estruturas a partir de imagens em duas dimensões de diferentes profundidades.
Vantagens da Óptica Não Linear: Além da microscopia confocal surgiram as
microscopias de óptica não linear. Processos não lineares ocorrem na presença de um ou mais fótons e, para isso, é necessário que esses fótons coincidam no tempo e no espaço, com a excitação da fluorescência ocorrendo apenas no volume focal. Dessa forma não é necessário rejeitar luz advinda das camadas acima e abaixo da região focal e as imagens adquiridas com
processos não lineares são naturalmente confocais, não necessitando do uso de pinhole. Nos processos não lineares podemos usar a detecção NDD [Non Descanned Detection]. Além disso, os processos de óptica não linear não ressonantes, no qual o elétron é excitado para um nível virtual, é praticamente instantâneo, pois o elétron excitado só permanece no nível virtual pelo período de tempo dado pelo princípio da incerteza, e será inversamente proporcional a diferença entre o nível virtual e o nível real mais próximo.
Conseguir efeitos não lineares com lasers contínuos necessitaria de potências altas demais, o que causaria danos térmicos nas amostras. A utilização de lasers pulsados com duração de picossegundos ou femtossegundos, conhecidos como pulsos ultracurtos, nos quais a potência de pico é muito mais alta do que a potência média, facilitou imensamente a exploração desses efeitos para microscopia. Como exemplo vamos usar um laser com 3W de potência média pulsado com 100 fs de duração e taxa de repetição de 80 MHz. Nesse caso, a potência de pico será de 375 kW, impensável para um laser de emissão contínua e que evaporaria qualquer material a ser analisado, incluindo aço.
Os processos não lineares incluem a fluorescência excitada por dois ou mais fótons, que tem espectro e direção de emissão igual à fluorescência por um fóton, mas é naturalmente confocal. Outros processos não lineares aplicáveis à biologia celular são processos coerentes, que incluem a geração de harmônicos. As microscopias de segundo harmônico [SHG] e terceiro harmônico [THG] não utilizam marcadores exógenos e permitem reconstrução de imagens em 3 dimensões com resolução espacial sub-celular, aproximadamente 300 nm lateral e 500 nm axial. Em amostras animais a microscopia SHG visualiza a matriz de colágeno, enquanto a microscopia THG visualiza heterogeneidades com contraste advindo da variação da susceptibilidade de terceira ordem, 3 , que varia por
ordens de grandeza em diferentes materiais.
Como cada emissão não linear coerente é devido a um processo particular que não ocorre em qualquer estrutura elas não necessitam de marcadores exógenos, por isso são adequadas para estudo de tecidos in vivo ou de processos celulares, onde a adição de um marcador significa modificar o meio a ser estudado. A janela mais interessante para os comprimentos de ondas serem detectados é no visível, onde a maioria dos detectores tem boa eficiência. Para efeitos multifótons isso significa o uso de lasers no infravermelho, que
proporcionam maior penetração em meios espalhadores. Devido a essas características, nos últimos anos as ferramentas de microscopias de óptica não linear se consolidaram como uma poderosa fonte de informações para estudos biológicos.
Importância do Raman e suas variantes: Em amostras biológicas sem
autofluorescência, ou que não suportam marcação exógena, a microscopia Raman e infravermelha podem ser usadas como mecanismo de contraste baseado em propriedades vibracionais das moléculas. Entretanto, a microscopia infravermelha convencional está limitada a uma baixa resolução espacial, pois é realizada com grandes comprimentos de onda. Além disso, todo sistema biológico vivo está imerso em água, que significa uma absorção muito alta do infravermelho após 2500 nm, onde começam as vibrações do hidrogênio, tornando as amostras opacas. O Raman traz a informação das vibrações moleculares do infravermelho para o visível, eliminando os problemas da baixa resolução espacial e opacidade das amostras. Além disso, a microcopia Raman pode ser utilizada em conjunto com sistemas confocais de varredura para adquirir imagens com seletividade química. O problema em utilizar Raman para imagens está em sua baixa sensibilidade, que força a utilização de grande tempo de aquisição, e é um entrave para aplicação em células e tecidos vivos.
Como solução para a baixa sensibilidade do espalhamento Raman espontâneo, surge a microscopia por espalhamento Raman Coerente anti-Stokes [CARS] [2]. Comparado com Raman espontâneo, a microscopia CARS oferece aumento na sensitividade, sem a necessidade de grandes tempos de aquisição, possibilitando taxas de aquisição necessárias para criação de vídeos e estudos em tempo real.
No CARS dois campos eletromagnéticos, com frequências
s e p, criam um batimento entre eles, de frequência ps, frequência essa em que há resposta molecular. Quando esse batimento, em ps, está em ressonância com uma frequência vibracional de uma molécula do meio, a vibração é forçada de forma ressoante. Essa vibração forçada é coerente, e gera um sinal forte na frequência 2ps, que está na frequência anti-Stokes com relação ao campo p, esse sinal emitido em um comprimento de onda menorCARS é um efeito de mistura de quatro ondas, a polarização gerada pelas moléculas é proporcional à susceptibilidade de terceira ordem, 3 , e sua intensidade à
2 3
. A susceptibilidade de terceira ordem, 3
tem componentes ressonantes com níveis
vibracionais moleculares e termos não ressonantes, esses termos não ressonantes não oferecem informação química sobre o meio [5]. As vibrações não ressonantes não dependem de qualquer linha Raman e são um obstáculo para aquisição de imagens de CARS. Entre CARS e Raman há uma troca de sensibilidade por seletividade.
Desde que Zumbusch et al. [2] em 1999 demonstrou imagens de CARS por varredura em 3D, outras técnicas de Raman coerente utilizadas em espectroscopia, que apresentam menor sinal não ressonante, foram aplicadas na aquisição de imagens com seletividade vibracional. Cada uma dessas técnicas traz vantagens particulares, algumas conseguem suprimir inteiramente o sinal não ressonante, mas suas aplicações apresentam novas dificuldades e aumento na complexidade dos sistemas de aquisição de imagens.
Vamos citar como exemplo, CARS polarizado [P-CARS] [6], CARS resolvido no tempo [T-CARS] [7] e microscopia por espalhamento Raman estimulado [SRS] [8]. No CARS polarizado [P-CARS], escolhendo a polarização de detecção do CARS e, selecionando a polarização dos feixes de excitação, é possível reduzir o fundo não ressonante à zero, mas o sinal não ressonante também é reduzido. Apesar de teoricamente nenhum sinal ser emitido na polarização selecionada, quando o feixe entra no microscópio e interage com os elementos ópticos desse e do alinhamento, sua polarização é alterada, acrescentando fundo não ressonante. Para o CARS resolvido no tempo, são utilizados três feixes, pump-1, Stokes e
pump-2. O pump-2 é atrasado em relação aos dois primeiros, que são os responsáveis por
induzir vibração molecular no meio. Essa técnica suprime o sinal não ressonante pelo fato de que a vibração não ressonante não permanece após os pulsos dos lasers, mas a vibração ressonante sim. O Raman estimulado é medido através do ganho (Raman Gain) ou a perda (Raman Loss) na intensidade dos feixes de pump ou Stokes. Raman estimulado também não apresenta fundo não ressonante. No trabalho realizado por Freudiger et al. [8] o feixe de Stokes é modulado e a perda de intensidade no feixe de pump é medida com um fotodiodo e filtrado por uso de lock-in. O uso do lock-in é necessário, pois o sinal está no mesmo comprimento de onda da onda de excitação. Isso representa um custo em relação ao tempo
de aquisição do sinal, pois o lock-in filtra as outras frequências após uma integração em torno de 10 a 100 períodos do feixe modulado. Um feixe com 100 MHz deveria ser modulado no máximo com 10 MHz, exigindo um tempo de integração mínimo de 1 s, dependendo do ruído do sinal de fundo. O tempo de aquisição de 1 s significa 1 segundo para a aquisição de uma imagem de 1 MPixel, ou seja, 1 quadro por segundo, bem abaixo da taxa de vídeo de 30 quadros por segundo. Dos exemplos citados a microscopia SRS tem apresentado os melhores resultados [5], como exemplo, é possível: monitorar a degeneração do nervo periférico em camundongos com Esclerose Lateral Amiotrófica[9], construção de imagens de DNA in vivo em camundongos [10], monitorar variação de biomassa em palha de milho [11]. SRS é também uma das técnicas que apresenta maior complexidade para aplicação.
A microscopia CARS tem sido usada para: monitoramento dinâmico de metabolismo e armazenamento de lipídios [12], adquirir imagem estrutural de cérebro de rato com seletividade vibracional [13], acompanhar as tendências na distribuição de lignina através do monitoramento de imagens de diferentes paredes celulares de alfafa quase simultaneamente [14], e principalmente para adquirir imagens de lipídios em amostras biológicas com velocidade para construção de vídeos [15], entre outros. Cirurgia de tumores do cérebro tem sido uma das aplicações do CARS que mais tem exigido a aquisição de imagens em tempo real e que possa ser realizada via um sistema de fibras ópticas ou braço articulados. Nesse caso a ideia é acompanhar a cirurgia do tumor delimitando suas margens com a microscopia CARS durante o procedimento [16].
Diminuindo o Non-Resonant Background: Nos perguntamos que outras técnicas
que apresentem seletividade química gerariam melhoras em relação às microscopias já conhecidas e poderiam ser utilizadas para aquisição de imagens. Ou, quais outras técnicas que apresentam ressonância com vibrações moleculares química podem ser aplicadas à aquisição de imagens de amostras biológicas. O que encontramos foi um processo por mistura de seis
ondas com intensidade proporcional à 3 4, que é resultado do efeito cascata do CARS [17]. Até onde sabemos esse foi o primeiro trabalho internacional de aquisição de imagens através do efeito cascata do CARS.
A emissão desse efeito ocorre em um comprimento de onda igual5 ao de uma
polarização de quinta ordem proporcional a 5 , e, devido ao seu sinal ser mais intenso, é
por vezes visto com problema para detecção de efeitos de ordem superiores. Nesse trabalho mostramos as características que fazem o efeito cascata de CARS uma ótima técnica para microscopia.
Histórico do Grupo na área de Microscopias Biofotônicas: O histórico do grupo
em biofotônica se inicia em 1990 após retorno do pós-doutorado do Prof. Lenz onde descobriu as pinças ópticas com seu pioneiro, Dr. Arthur Ashkin. O foco principal do trabalho na época era o de fotônica para comunicações ópticas e quantum dots semicondutores para dispositivos ópticos, incluindo um convênio do grupo com CPqD-Telebrás, enquanto a pinça óptica se tornou um projeto paralelo, quase um hobby. De 1986 até 1998 o grupo, na época denominado Grupo de Fibras Ópticas, contou com financiamento do CPqD-Telebrás, dois projetos grandes do PADCT em 1992 e 1995 e um temático da FAPESP. Em 2000 conseguiu a aprovação de um CEPID (Centro de Pesquisa Inovação e Difusão) da FAPESP chamado CEPOF (Centro de Pesquisa em Óptica e Fotônica) que perdurou até 2014, e que foi a principal fonte de financiamento para os lasers de pulsos ultracurtos utilizados nessa tese, e responsável por grande parte do suporte no meu mestrado e doutorado. Em 2009 foi aprovado nosso Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia denominado INFABIC (Instituto Nacional de Fotônica Aplicada à Biologia Celular) em conjunto, principalmente, com a Biologia, Medicina e Engenharia de Alimentos da UNICAMP, o qual está em vigência até hoje, renovado em 2016, com o qual completou a aquisição dos microscópios mais modernos.
A primeira pinça óptica do Brasil foi montada em 1990 e aperfeiçoada em 1991, após financiamento do PADCT. Em 1995 se inicia uma colaboração da física com o Hemocentro, ambos da UNICAMP, para estudos de reologia de hemácias e em 1999 o grupo inicia o trabalho com quantum coloidais, que são usados como marcadores celulares, entre outras possíveis aplicações. Esse foi o ponto de partida que re-orientou os trabalhos do grupo da área de fotônica para comunicações para a área de biofotônica. As duas áreas compartilham muito fortemente os conhecimentos de materiais, quantum dots, óptica não linear e lasers de pulsos ultracurtos. A percepção dessa proximidade levou o grupo a integrar
5 A emissão é em um comprimento de onda infimamente diferente, mas não ao ponto de poder ser separada
a óptica não linear com as microscopias biofotônicas em 2000 quando uma reforma nos laboratórios permitiu colocar na mesma mesa óptica os lasers de femtossegundos com o microscópio. Infelizmente, o primeiro microscópio confocal por varredura a laser que deveria ter chegado em 2003, só foi adquirido em 2005 devido à crise da taxa de câmbio de 2002-2003. Foi um Olympus FV300, hoje fora de linha, que adaptamos para a realização de microscopias multifótons, e que foi fundamental para boa parte dos trabalhos dessa tese.
Desde então o grupo publicou 54 trabalhos em revistas internacionais nessa área de biofotônica, sem contar os trabalhos na área de fotônica em si que continuam até hoje, dos quais 9 se referem a estudos de quantum dots coloidais usados como marcadores celulares. Em termos de teses foram orientados 7 doutoramentos, com 2 teses defendidas pela Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da UNICAMP, e 9 mestrados, com 2 da FCM e 2 em quantum dots coloidais.
Dessas teses, 5 doutorados foram importantes para o desenvolvimento das técnicas de microscopia e manipulações fotônicas. A primeira foi da Dra. Adriana Fontes que integrou as pinças ópticas com sistemas de óptica não linear e Raman em 2002, obtendo o primeiro espectro Raman de partículas capturadas em pinça ópticas do Brasil. Em 2003 publicamos o que pode ser considerado a primeira imagem de microscopia multifóton e espectroscopia Raman, Hiper Raman e SHG do Brasil, mas de baixa qualidade, pois foi adquirida varrendo a amostra e não o laser. Além disso, foram observadas ressonâncias de Mie nas fluorescências de microesferas, o que exigia um tratamento teórico para descrição dos campos eletromagnéticos em feixes de laser de alta abertura numérica. Antônio Neves continuou experimentalmente e teoricamente o trabalho sobre a descrição dos campos eletromagnéticos, realizando um tratamento exato para feixes focalizados com alta abertura numérica. Esse trabalho teórico foi utilizado tanto na minha tese de mestrado quanto na do Alexandre de Thomaz. Nesse mesmo tópico, Wendel Moreira, durante seu doutorado, generalizou o tratamento teórico da expansão em vetores harmônicos esféricos para qualquer tipo de feixe. A chegada do microscópio da Olympus em 2005 coincidiu com o período do mestrado de André de Thomaz que deu continuidade ao trabalho de aquisição de imagens de alta qualidade obtendo a primeira imagem de SHG do Brasil por varredura laser. No seu doutorado montou uma plataforma integrada no confocal com pinças ópticas, FLIM e FCS, obtendo também a primeira imagem de FLIM, assim como as primeiras medidas de FCS, no
Brasil. Diogo Almeida, no seu doutorado, demonstrou que a plataforma biofotônica integrada se tornaria também uma plataforma analítica, permitindo a realização de espectroscopias de óptica não linear inclusive em baixa temperaturas.
Histórico do meu trabalho no Grupo (2008-2016): Durante meus primeiros anos
de trabalho no grupo de biofotônica desenvolvi um sistema de imagens que uniu três importantes técnicas de microscopia de óptica não linear, a fluorescência excitada por dois fótons, o segundo harmônico e o terceiro harmônico. Esse sistema está descrito na minha dissertação de mestrado, com o título “Microscopias de Óptica Não Linear: Fluorescência Excitada por Absorção de Dois Fótons, Geração de Segundo Harmônico e Geração de Terceiro Harmônico”. Com esse sistema realizamos a primeira imagem de terceiro harmônico do Brasil. O terceiro harmônico com lasers pulsados no infravermelho próximo se mostrou um grande desafio, pois sua emissão é no ultravioleta. Para conseguir detectar esse sinal e para viabilizar a construção de imagens foi necessário conhecimento detalhado de todos os elementos ópticos necessários para o alinhamento e para detecção. A primeira imagem de THG foi obtida em um sistema espectral da Olympus FV1000 que ficou 3 meses no laboratório para demonstração. Logo a seguir melhoramos o sinal por ordens de grandeza no FV300 colocando o detector logo após a objetiva para evitar perdas do UV nos elementos ópticos. Infelizmente a óptica do sistema Zeiss não transmite nada abaixo de 350 nm, justamente a região do THG para o laser de Ti:safira, e não permitia a detecção externa realizada com o Olympus. Essa nova plataforma permitiu integrar as técnicas de TPEF, SHG, THG e FLIM que se mostrou capaz de responder a um grande número de perguntas biológicas. Meu mestrado foi dedicado totalmente à montagem da plataforma multimodal, mas a otimização e utilização dessa plataforma para estudos de biologia celular foram realizados no meu trabalho de doutorado.
Dessa forma, logo após a defesa do meu mestrado passamos a utilizar essa plataforma para responder a questões relevantes na área biológica. As imagens adquiridas nesse sistema são de ótima qualidade e com elas conseguimos seis publicações. Cada técnica mostra diferentes estruturas, e as imagens das técnicas conjuntas possibilitaram a análise computacional da organização do tecido sem a necessidade do fator humano, que pode incorrer em erros. No caso o terceiro harmônico foi principalmente utilizado para estudo morfológico dos núcleos de células epiteliais e para contagem dessas células.
Desde o início do meu doutoramento houve a necessidade de uma forte interação com pesquisadores da área de ciências da vida. Após desenvolver uma metodologia, a vontade de vê-la utilizada para responder questões biológicas é muito alta. Entretanto, como físicos, nos faltava conhecimento de biologia para manipular as amostras e, mesmo, escolher o melhor sistema para demonstrar a importância da nossa metodologia. Em muitas circunstâncias nós procuramos os biólogos e médicos com questões relevantes adequadas às nossas técnicas. Em outros casos, esses profissionais batiam na nossa porta procurando respostas para uma determinada questão, que rapidamente percebíamos que se encaixavam na nossa metodologia. Vale salientar que a comunidade de ciências da vida nunca tinha ouvido falar de terceiro harmônico, raramente de segundo harmônico, ou FLIM e FCS. Nesse caso, rapidamente os convencíamos a usarem essas técnicas para responderem suas perguntas. Claramente que para o uso de THG, SHG, FLIM ou FCS é necessário fazer uma otimização amostra-metodologia para obtenção de bons resultados, o que exigia da nossa parte, como desenvolvedores da metodologia, um trabalho de adaptação da mesma à pergunta específica. Para tanto foi necessário, também, adquirir um conhecimento grande sobre a biologia do problema e esclarecer que respostas importantes trariam as grandezas que podíamos medir, além de como medi-las. Um trabalho com desenvolvimento de embriões, por exemplo, exigiu muito da metodologia para fazer a aquisição de imagens por dias em 3D usando fluorescência excitada por 2 fótons, FLIM e terceiro harmônico. Sem a nossa participação nenhuma das publicações nas aplicações teria ocorrido. Entretanto, claro, os primeiros autores nessas publicações foram os profissionais das ciências da vida responsáveis pelas amostras e questões biológicas.
No meio do meu doutorado, em 2012, fui contratado como técnico no INFABIC, que conta com mais de 30 pesquisadores e com 20 subprojetos6. No meu trabalho como
técnico, onde sou responsável, além de operar, acompanhar e ensinar os pesquisadores no uso dos equipamentos, montar e manter novos sistemas de microscopias e lasers. Essa missão só pode ser cumprida se estiver em contato próximo com as questões dos pesquisadores interessados na potencialidade das técnicas para ajudar responder importantes questões dos processos celulares e químicos.
Parte importante do meu trabalho de doutorado foi a microscopia CARS. Nessa tese vamos mostrar as primeiras imagens de CARS realizadas no Brasil e os detalhes sobre a montagem experimental para realizá-la. Em sintonia com os principais estudos sobre a metodologia da microscopia CARS, que concentram-se na diminuição do fundo não ressonante, nós iremos demonstrar a primeira imagem por varredura laser de efeito cascata de CARS. O CARS cascata [cascade CARS – CCARS] apresenta menor fundo não ressonante, sua emissão é em um comprimento de onda diferente de qualquer outro efeito não linear coerente, isso significou um acréscimo de complexidade mínimo para sua detecção quando comparado com o CARS.
Descrição e Resumo dessa Tese: No capítulo dois faremos uma introdução à teoria
necessária para entendimento dos processos de óptica não linear, com o modelo de dipolo oscilante forçado por um ou mais campos elétricos. No final do capítulo faremos uma comparação do limiar de detecção entre as técnicas de Raman coerentes desenvolvidas nesse trabalho. No capítulo três apresentaremos de forma detalhada três sistemas experimentais para a aquisição de imagens de Raman coerente e de união de técnicas de óptica não linear, serão demonstrados os principais detalhes e as dificuldades superadas. Os resultados originados de microscopia Raman coerente serão apresentados no capítulo quatro, os principais resultados são as imagens adquiridas, mas também mostraremos resultados que comprovam a mistura de seis ondas do efeito cascata através da dependência com a intensidade dos feixes de excitação. O capitulo cinco mostrará as aplicações realizadas com um sistema experimental desenvolvido com objetivo de integrar a geração de segundo e terceiro harmônicos com a fluorescência excitada por dois fótons. Mostraremos as imagens e os resultados obtidos com a análise das imagens para estudo de tecidos, com especial atenção à análise de núcleos celulares e à organização das fibras de colágeno. Por último, o capítulo seis apresentará a conclusão e perspectivas desse trabalho.
A seguir, listo os trabalhos publicados no período do meu doutorado, dentre os quais os trabalhos em que minha participação foi fundamental, e não apenas coadjuvante, fazem parte dessa tese.
[1] J. Adur, G. O. Barbosa, V. B. Pelegati, M. O. Baratti, C. L. Cesar, V. H. Casco, and H. F. Carvalho, “Multimodal and Non-Linear Optical Microscopy Applications in
Reproductive Biology,” Microsc. Res. Tech., vol. 79, no. 7, pp. 567–582, DOI 10.1002/jemt.22684, Jul. 2016.
[2] A. F. Oliveira, V. B. Pelegati, H. F. Carvalho, C. L. Cesar, R. G. Bastos, and L. G. de la Torre, “Cultivation of yeast in diffusion-based microfluidic device,” Biochem. Eng. J., vol. 105, no. A, pp. 288–295, DOI 10.1016/j.bej.2015.09.015, Jan. 2016.
[3] L. C. Machado, V. B. Pelegati, and A. L. Oliveira, “Study of simple microparticles formation of limonene in modified starch using PGSS - Particles from gas-saturated suspensions,” J. Supercrit. Fluids, vol. 107, pp. 260–269, DOI 10.1016/j.supflu.2015.09.023 , Jan. 2016.
[4] M. Ericson, G. Viera-Damiani, M. N. da Silva, K. Gupta, T. Soares, M. Cintra, A. de Almeida, V. Pelegati, A. de Thomaz, M. Baratti, H. Carvalho, C. L. Cesar, and P. Velho, “Bartonella Henselae Initial Infection of Mature Human Erythrocytes Observed in Real Time Using Bacterial Endogenous Fluorescence,” J. Invest. Dermatol., vol. 135, no. 1, p. S90, DOI 10.4172/2329-891X.1000207, 2015.
[5] A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, V. B. Pelegati, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Measurement of the Hydrodynamic Radius of Quantum Dots by Fluorescence Correlation Spectroscopy Excluding Blinking,” J. Phys. Chem. B, vol. 119, no. 11, pp. 4294–4299, Mar.DOI 10.1021/jp512214p, 2015.
[6] R. de A. Natal, V. B. Pelegati, C. Bondarik, G. R. Mendonca, S. F. Derchain, C. P. Lima, C. L. Cesar, L. O. Sarian, and J. Vassallo, “Increased metabolic activity detected by FLIM in human breast cancer cells with desmoplastic reaction: a pilot study,” in
ADVANCED MICROSCOPY TECHNIQUES IV; AND NEUROPHOTONICS II,Proceedings of SPIE,DOI 10.1117/12.2183442, 2015, vol. 9536.
[7] J. Adur, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, M. O. Baratti, L. A. L. A. Andrade, H. F. Carvalho, F. Bottcher-Luiz, and C. L. Cesar, “Second harmonic generation microscopy as a powerful diagnostic imaging modality for human ovarian cancer,” J. Biophotonics, vol. 7, no. 1–2, pp. 37–48,DOI 10.1002/jbio.201200108, 2014.
[8] J. Adur, L. DSouza-Li, M. V. Pedroni, C. E. Steiner, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “The Severity of Osteogenesis Imperfecta and Type I Collagen Pattern in Human Skin as Determined by Nonlinear Microscopy: Proof of Principle of a Diagnostic Method,” PLoS One, vol. 8, no. 7,DOI 10.1371/journal.pone.0069186, Jul. 2013.
[9] J. Adur, A. M. Herrera Torres, A. Masedunskas, M. O. Baratti, A. A. de Thomaz, V. B. Pelegati, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Multiphoton intravital microscopy setup to visualize the mouse mammary gland,” in ADVANCED MICROSCOPY TECHNIQUES III, Proceedings of SPIE , DOI 10.1117/12.2032439 , 2013, vol. 8797.
[10] J. Adur, V. B. Pelegati, M. Bianchi, A. A. de Thomaz, M. O. Baratti, H. F. Carvalho, V. H. Casco, and C. L. Cesar, “Multimodal Nonlinear Optical Microscopy used to Discriminate Human Colon Cancer,” in MULTIPHOTON MICROSCOPY IN THE
BIOMEDICAL SCIENCES XIII, Proceedings of SPIE, DOI 10.1117/12.2001708 , 2013, vol.
8588.
[11] Adur J, Pelegati VB, de Thomaz AA, et al; “Quantitative changes in human epithelial cancers and osteogenesis imperfecta disease detected using nonlinear multicontrast microscopy.” J. Biomed. Opt. 0001;17(8):081407-1-081407-10. doi:10.1117/1.JBO.17.8.081407.
[12] J. Adur, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, M. O. Baratti, D. B. Almeida, L. A. L. A. Andrade, F. Bottcher-Luiz, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Optical Biomarkers of Serous and Mucinous Human Ovarian Tumor Assessed with Nonlinear Optics Microscopies,”
PLoS One, vol. 7, no. 10, DOI 10.1371/journal.pone.0047007 , 2012.
[13] V. B. Pelegati, J. Adur, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, M. O. Baratti, L. A. L. A. Andrade, F. Bottcher-Luiz, and C. L. Cesar, “Harmonic optical microscopy and fluorescence lifetime imaging platform for multimodal imaging,” Microsc. Res. Tech., vol. 75, no. 10, pp. 1383–1394, DOI 10.1002/jemt.22078 , 2012.
[14] K. Metze, G. Vieira-Damiani, R. L. Adam, D. P. Ferro, A. A. de Thomaz, V. Pelegati, and C. L. Cesar, “Why is a blood channel located in the external part of the media layer in aortas with acute dissection?,” Histopathology, vol. 61, no. 1, SI, p. 40, 2012.
[15] V. B. Pelegati, J. Adur, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, M. O. Baratti, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Multimodal optical setup for nonlinear and fluorescence lifetime imaging microscopies: improvement on a commercial confocal inverted microscope,” in IMAGING, MANIPULATION, AND ANALYSIS OF BIOMOLECULES, CELLS,
AND TISSUES X, DOI 10.1117/12.909358 , Proceedings of SPIE , 2012, vol. 8225.
[16] J. Adur, A. E. Ferreira, L. D’Souza-Li, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, M. O. Baratti, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Quantitative Second Harmonic Generation Imaging to Detect Osteogenesis Imperfecta in Human Skin Samples,” in
MULTIPHOTON MICROSCOPY IN THE BIOMEDICAL SCIENCES XII, Proceedings of SPIE,
DOI 10.1117/12.907320 , 2012, vol. 8226.
[17] J. Adur, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, F. Bottcher-Luiz, L. A. L. A. Andrade, D. B. Almeida, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Combined nonlinear laser imaging (two-photon excitation fluorescence, second and third harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging microscopies) in ovarian tumors,” in MULTIPHOTON
MICROSCOPY IN THE BIOMEDICAL SCIENCES XII, Proceedings of SPIE ,DOI
10.1117/12.906945 2012, vol. 8226.
[18] M. F. Andreoli-Risso, A. S. S. Duarte, T. B. Ribeiro, P. Bordeaux-Rego, A. Luzo, M. O. Baratti, J. Adur, A. A. de Thomaz, V. B. Pelegati, H. F. Carvalho, C. L. Cesar, P. Kharmadayan, F. F. Costa, and S. T. Olalla-Saad, “Second Harmonic Generation Microscopy Used to Evaluate the Effect of the Dimethyl Sulfoxide Cryopreservation Process in Collagen Fibers of Differentiated Chondrocytes,” in MULTIPHOTON
MICROSCOPY IN THE BIOMEDICAL SCIENCES XII, Proceedings of SPIE , DOI
10.1117/12.909284 , 2012, vol. 8226.
[19] P. Bordeaux-Rego, M. O. Baratti, A. S. S. Duarte, T. B. Ribeiro, M. F. Andreoli-Risso, B. Vidal, J. B. Miranda, J. Adur, A. A. de Thomaz, V. B. Pelegati, F. F. Costa, H. F. Carvalho, C. L. Cesar, A. Luzo, and S. T. Olalla Saad, “Use of the second harmonic generation microscopy to evaluate chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells for cartilage repair,” in MULTIPHOTON MICROSCOPY IN THE BIOMEDICAL
SCIENCES XII, Proceedings of SPIE , DOI 10.1117/12.909185 , 2012, vol. 8226.
[20] J. Adur, V. B. Pelegati, L. F. L. Costa, L. Pietro, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, F. Bottcher-Luiz, L. A. L. A. Andrade, and C. L. Cesar, “Recognition of serous ovarian tumors in human samples by multimodal nonlinear optical microscopy,” Journal of Biomedical
Optics, vol. 16, no. 9. p. 96017, DOI 10.1117/1.3626575 , 2011.
[21] G. Vieira-Damiani, D. P. Ferro, R. L. Adam, A. A. de Thomaz, V. Pelegati, C. L. Cesar, and K. Metze, “Elastic fibers and collagen distribution in human aorta,” in
Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XI, Proceedings of SPIE , DOI
10.1117/12.874695 , 2011, p. 79030B–79030B–8.
[22] M. O. dos Santos, V. B. Pelegati, C. L. Cesar, P. R. Correa, T. M. T. Zorn, and D. M. Zezell, “Characterization of third-degree burned skin by nonlinear microscopy technique,” Sci. York, vol. 7903, p. 79032Y–79032Y–5, Proceedings of SPIE , DOI 10.1117/12.878763 , 2011.
[23] J. Adur, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, F. Bottcher-Luiz, L. A. L. A. Andrade, and C. L. Cesar, “Multimodal nonlinear optical microscopy used to discriminate epithelial ovarian cancer,” Adv. Microsc. Tech. Ii, vol. 8086, DOI 10.1117/12.889554 , 2011.
Capítulo 2
Teoria
Nesse capítulo desenvolvemos a teoria necessária para o entendimento dos processos de óptica não linear, incluindo CARS e o six-wave mixing CARS. A forma escolhida é partir da radiação de um dipolo fazendo a expansão tanto nas coordenadas eletrônicas quanto nucleares e comparando com a expansão típica em termos dos campos eletromagnéticos da óptica não linear. Também explicitamos os significados de termos como processos coerentes e espontâneos, paramétrico/elástico e inelástico, entre outros.
2.1 - Fundamentos de Óptica
Espalhamento
Quando a luz interage com objetos homogêneos grandes valem as leis da óptica geométrica, como ângulo de incidência igual ao de reflexão e a lei de Snell. Para uma superfície plana a luz refletida e refratada tem uma direção bem definida. Entretanto quando os objetos
no caminho do feixe se tornam da ordem ou menores do que o comprimento de onda da luz incidente o fenômeno de difração aparece e a direcionalidade da luz é perdida. Chamamos espalhamento os processos ópticos em que as partículas que interagem com a luz são menores, tipicamente bem menores, do que o comprimento de onda. Estamos no limite, então, do espalhamento Rayleigh.
Os centros espalhadores são regiões onde existem descontinuidades do índice de refração do meio e que se comportam como dipolos que re-irradiam a luz incidente. Esses dipolos podem ser espacialmente organizados, que vai dar origem a um processo coerente, como veremos a seguir, ou posicionados aleatoriamente no espaço, que vai originar um processo incoerente. Vale notar que a reflexão difusa não é um espalhamento, pois se tratam de objetos grandes (comparados ao comprimento de onda), mas com superfícies que variam no espaço, nas quais a luz é refletida em muitas direções.
Como afirmamos, iniciamos nosso estudo com a radiação de um dipolo.
Radiação de Dipolo
Os campos magnéticos e elétricos de um dipolo e seu correspondente vetor de
Poynting (Intensidade) são dados por [18] (onden r r
é o vetor radial unitário):
2 4 o B r p cr (2.1.1) c E r B r (2.1.2) 2 2 3 4 1 1 16 o r S r p n c r r (2.1.3)
Considerando um dipolo na direção z da forma i t
o z p p ee para o qual 2 i t o z p p ee temos que: 4 4 4 2 2 2 2 2 3 2 2 4 2 1 1 2 1 1 sin sin 16 o o 16 o o c S p n p n c r r (2.1.4)
2 2 2 4 2 1 1 sin o o c S p n r (2.1.5)
A figura 2.1.1 mostra o padrão de uma irradiação que segue a lei 2
sin
I . Notamos que esse dipolo oscilante só não irradia na direção ao longo do próprio dipolo.
Figura 2.1.1: Padrão de radiação de um dipolo oscilante.
No caso em que o dipolo é induzido pelo campo incidente em uma esfera de dimensões muito menor do que o comprimento de onda incidente, vale o eletromagnetismo na região próxima, near field, equivalente ao caso eletrostático, apenas incorporando as variações temporais. O momento de dipolo do caso estático é dado pela equação (2.1.6) retirada do livro de Eletrodinâmica Clássica por J. D. Jackson [19] equação 4.56:
2 3 2 1 4 2 r o inc z r n p a E e n (2.1.6) Dessa forma, 2 3 2 1 4 2 r o o inc r n p a E n e
2 2 2 2 6 2 2 1 4 2 r o o inc r n p a E n .Podemos reescrever esse resultado em termos da intensidade da luz incidente usando o fato de que qualquer fluxo pode ser escrito como J v. No caso eletromagnético a densidade de energia é dada por 1 2
2 o
u E e a velocidade é a velocidade da luz c, então
2
1 2 o
2 2 2 5 2 2 2 2 6 2 6 2 2 2 1 1 2 1 4 2 2 2 o r r o o o inc inc o r r n n p a E c a I c n c n (2.1.6)Levando de volta à equação 2.1.5 obtemos:
2 2 5 2 2 2 2 6 6 2 4 2 4 2 2 2 4 2 2 1 1 1 1 1 sin 32 sin 2 2 o r r inc inc o r r n n c a S a I n I n c n r n r (2.1.7)
A irradiação é, naturalmente, radial com uma intensidade dada por:
2 2 6 2 4 2 4 2 1 sin 32 2 r irrad inc r n a I I n r (2.1.8)
O fato de que a intensidade cai com I 12 r
só expressa a conservação da energia,
pois
2
2 4 a IA r cte r , como deveria ser para a radiação eletromagnética em um meio não absorvedor. O termo angular vai mudar nos casos de luz polarizada ou não polarizada, ao fazer uma média sobre os dipolos, mas a feição básica da irradiação do dipolo é que ela
depende do comprimento de onda na forma14 e da sexta potência do tamanho do dipolo
induzido. Além disso, é necessário que o índice de refração do centro espalhador seja diferente do meio em sua volta, pois quando 2
1 0
r
n não existe uma re-irradiação devido
ao meio.
Somando dipolos, processos Coerentes e Não Coerentes.
O que acontece com a intensidade emitida por um conjunto de N dipolos? Depende da coerência do processo. Sabemos que a intensidade de feixe depende do
quadrado do campo elétrico, na forma 1 2 2 o
I cu c E . Agora suponha o caso em que temos uma adição de vários campos na forma: EE1E2 En. Que operação devemos fazer primeiro, (1) somar antes os campos e depois elevar ao quadrado na forma
21 2
1
2 o n
intensidades na forma 2 2 2 1 2
1
2 o n
I c E E E ? Suponha que todos os campos sejam
iguais à Eo. Na operação (1) a soma será E1E2 EnNEo, e a intensidade será proporcional ao quadrado do número de dipolos, 2 2
o
IN E . Na operação (2) a intensidade é
proporcional apenas ao número de dipolos 2
o
INE .
Sabemos que a operação adição deve ser feita primeiro, o que poderia nos induzir à conclusão errada de que a operação (2) não existe na realidade. O fato é que ambas podem existir e teremos o resultado da operação (1) ou (2) dependendo da relação de fase entre os dipolos.
Para entender como isso ocorre considere o j-ésimo campo dado por
j
i t i
j z o
E e E e . A intensidade será dada pelo quadrado da soma dos campos na forma
* I EE : 2 2 * j j i i t i i t i z o z o o j j E e E e e E e E e
(2.1.9)Agora suponha o caso coerente em que todas as fases são iguais, ou seja, j
. O processo em que as fases mantêm uma relação fixa determinística é chamado de processo
coerente. Nesse caso j 0 j e a somatória dupla 1 2
j
N
é dada peloquadrado do número de dipolos. Assim, a intensidade, 2 2 2
coerente o
I E N E , é proporcional ao quadrado do número de dipolos. Agora suponha o caso de um processo incoerente, no qual as fasesjsão aleatórias. A relação não é mais verdadeira. Na somatória dupla separamos dois casos, e j , na forma: j
j j j i i i j j j j j e e e
(2.1.10) Agora , 1 j i j j j e N
, mas , 0 j i j j e
por conta da aleatoriedade das fases. Assim caímos no caso (2) em que os termos cruzados da somatória se anulam e a intensidade é proporcional ao número de dipolos:0
j j
2 2
incoerente o
I E N E (2.1.11)
No processo incoerente, então, podemos analisar apenas o caso de um centro espalhador e multiplicar o resultado pelo número dos mesmos.
A coerência das fases em dipolos que respondem instantaneamente é dada pela coerência da localização espacial dos mesmos. Cada dipolo idêntico vê um campo com uma fase diferente dependendo da sua posição na forma j ikxj i t
inc o
E e E e . Se os dipolos são organizados espacialmente as fases mantém uma relação entre si e o processo é coerente. Quando um feixe incide em uma superfície plana todos os dipolos oscilam na mesma frequência da luz incidente e o resultado é uma reflexão bem direcionada com ângulo de incidência igual ao de reflexão. Por outro lado, se os centros espalhadores estão aleatoriamente posicionados no espaço, como um gás, ou impurezas em um sólido, as fases são aleatórias e o processo é incoerente. Outra fonte de incoerência é um atraso individual em cada dipolo. Exemplo típico é a fluorescência, pois os elétrons excitados decaem aleatoriamente dentro de um tempo de vida de fluorescência. Como veremos a seguir o movimento dos elétrons é instantâneo acompanhando o campo elétrico incidente, mas o dipolo depende também das coordenadas nucleares, e elas variam de dipolo a dipolo, gerando uma incoerência no sistema.
O quadrado no número de dipolos tende a amplificar fortemente os processos coerentes em comparação com os processos incoerentes. Exemplos das duas situações, coerente versus não coerente, são o espalhamento hiper-Rayleigh, um espalhamento incoerente de luz reemitida no dobro da frequência da luz incidente, versus a geração de segundo harmônico, SHG, coerente. No SHG os centros espalhadores são coerentemente excitados pela luz incidente e o feixe emitido possui alguma, ou total, direcionalidade. Colágeno é uma molécula que gera o dobro da frequência, se essas moléculas estão dispersas no meio aleatoriamente teremos o espalhamento hiper-Rayleigh, já quando estão organizadas espacialmente na forma de fibrilas numa escala comparável ao volume focal, teremos o SHG, muito mais intenso do que o espalhamento hiper-Rayleigh. Por outro lado no processo de SHG em cristais grandes o feixe tem uma direcionalidade bem definida e o processo exige a condição de casamento de fase (phase-matching) para ocorrer. Essa condição é relaxada para amostras microscópicas, mas ainda mantém resquícios, com alguma
direcionalidade nos feixes reemitidos. Esse mesmo argumento sobre coerência é válido para qualquer processo óptico que depende da irradiação de vários dipolos.
Outros termos usados no contexto de processos de óptica não linear são:
Processos de Óptica Não Linear
Os processos de óptica não linear ocorrem na presença de mais de um fóton. Fazendo uma analogia dos processos de óptica não linear com a velocidade de reações químicas. Quando temos a reação A B C a velocidade da reação é dada pelo produto das concentrações de A e B, ou seja, V
A B , que no fundo é uma lei de probabilidade, ou seja, a probabilidade de encontrar A no mesmo volume que B é a multiplicação das probabilidades de encontrar A e B no volume dado. A velocidade de uma reação do tiponAC ou A A A C é dada por V
A n. A analogia com os fótons é que, sen fótons são necessários para excitar um elétron, f f f eexc. A concentração de
fótons, no caso, é dada pela intensidade do feixe incidente, logo a velocidade dessa reação será proporcional a n
V . Dessa forma, um processo de 1 fóton é linear com a intensidade, I
e um processo de 2 fótons vai com a intensidade ao quadrado, de 3 fótons, com a intensidade ao cubo, e de n fótons com a enésima potência da Intensidade do feixe incidente. Com mais de um fóton envolvido estamos no regime da óptica não linear. Uma consideração importante é que, com algumas exceções, como a probabilidade de um processo não linear ocorrer é baixa, com baixa quantidade de fótons absorvidos, o número de fótons das fontes pode ser considerado constante.
Em processos lineares, para um feixe com potência constante, caso a área de incidência desse feixe em um meio absorvedor seja diminuída, conseguimos aumentar sua intensidade e assim gerar mais fótons, mas a área onde esses fótons são gerados também diminui na mesma proporção, fazendo com que a emissão fique constante. Isso por que a intensidade da emissão será proporcional à potência, com o número de fótons emitidos iguais
à ev P N AI A P A .
Para processos não lineares a quantidade de fótons gerados não permanece constante quando da área é modificada. Se diminuirmos o diâmetro de um feixe em 10 vezes, o número de fótons gerados por um processo não linear de segunda ordem (proporcional ao quadrado da intensidade do feixe incidente) aumentará de 10 vezes. No caso de um processo não linear de terceira ordem, o aumento é de 100 vezes e assim por diante. Com expressão
genérica dada por ev 1
n n n n n P P N AI A A A
. Essa característica é responsável pela confocalidade dos processos não lineares, não sendo necessário o uso de pinhole como na microscopia confocal convencional.
Seguindo o mesmo raciocínio, quando o efeito não linear for gerado por laser que, ao invés de emitirem luz constante, emitirem pulsos de luz, que concentram toda a potência emitida em um pequeno espaço de tempo, o efeito não linear também será aumentado. Suponha um laser pulsado com duração temporal do pulso dada por que se repete a cada
rep
. A energia do pulso será dada por Ep Pp onde Pp é a potência de pico do pulso. Essa será a única energia presente até a chegada do próximo pulso, então a potência média é dada
por: p p
rep rep
E
P P
, a relação entre a potência de pico e a potência média é dada então
por: rep
p
P P
.
Vamos usar o exemplo do laser com pulsos de 100 fs com taxa de repetição de 100
MHz, ou rep 10ns. Nesse caso
9 5 15 10 10 10 100 10 p P P P
. Ou seja, para uma potência média
de 1 W a potência de pico será de 100 kW. Os processos de óptica não linear dependem da potência de pico, e não da potência média. Por outro lado, os processos térmicos, lentos, dependem da potência média. Assim aumentar a potência do laser em um laser contínuo para gerar um efeito de óptica não linear pode simplesmente levar a danos térmicos da amostra. Nos lasers pulsados pequenas potências médias se transformam em altas potências de pico, evitando danos térmicos na amostra e gerando os fenômenos de óptica não linear.
Figura 2.1.2: Diferença entre excitação por um e dois fótons
Outros termos importantes para nosso trabalho utilizados no contexto de processos de óptica não linear são:
Paramétrico versus Não-Paramétricos.
Nos processos paramétricos o estado quântico final do sistema é igual ao estado inicial. Só há uma remoção do estado fundamental durante a interação com o pulso de luz.
Em um caso em que a polarização é escrita como Po
nin
2E, os processosparamétricos só modificam a parte real n do índice de refração. O meio material só opera para promover a transferência de energia entre os feixes de luz, sem qualquer modificação do mesmo. Já nos processos não paramétricos, a parte imaginária n é modificada. Os processos paramétricos são elásticos e instantâneos, conservam a energia, e coincidem temporalmente com o pulso incidente. Os processos não paramétricos são inelásticos, não conservam a energia, e podem sofrer um atraso em relação ao feixe incidente de excitação do processo.
Linear
Não-Linear
M ei o Abs or ve dor M ei o Ab sor ve dor La ser C W La ser p u ls ad oEstimulado versus espontâneo.
Nos processos ópticos estimulados o sinal óptico gerado tem a mesma direção, fase, polarização e frequência do campo eletromagnético incidente. No espontâneo o sinal é gerado sem relação com qualquer outro campo pré-existente.
Processos Coerentes. Equações de Maxwell:
Para os processos coerentes precisamos resolver a equação da onda frente a uma interação dos campos eletromagnéticos com um meio não linear. Vamos considerar o caso de ausência de cargas 0 e correntes J 0. Nas frequências ópticas em questão a
permeabilidade magnética é a do vácuo, ou seja,
B
oH
, e podemos esquecer qualquer contribuição magnética. No entanto, os dipolos estão presentes e a relaçãoD
oE P
pode ser reescrita considerando os termos lineares e não lineares:o L NL NL
D
E P
P
E P
(2.1.12)As equações de Maxwell são dadas por:
0 0 B D E t D B H t (2.1.13) Sabemos que
