O desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória depende da ativação dos receptores TNFR1 e TNFR2 em nociceptores periféricos

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

SILVIANE FERNANDES DE MAGALHÃES

O DESENVOLVIMENTO DA HIPERALGESIA INFLAMATÓRIA

DEPENDE DA ATIVAÇÃO DOS RECEPTORES TNFR1 E

TNFR2 EM NOCICEPTORES PERIFÉRICOS

CAMPINAS 2017

SILVIANE FERNANDES DE MAGALHÃES

O DESENVOLVIMENTO DA HIPERALGESIA INFLAMATÓRIA

DEPENDE DA ATIVAÇÃO DOS RECEPTORES TNFR1 E TNFR2 EM

NOCICEPTORES PERIFÉRICOS

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Funcional e Molecular, na área de Fisiologia.

Orientador: PROF. DR. CARLOS AMILCAR PARADA

CAMPINAS 2017

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA SILVIANE FERNANDES DE MAGALHÃES E ORIENTADA PELO PROF. DR. CARLOS AMILCAR PARADA.

Campinas, 23 de fevereiro de 2017.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Carlos Amilcar Parada (Orientador) Prof.ª Dr.ª Gisele Picolo

Prof. Dr. José Antônio Dias Garcia

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

DEDICATÓRIA

Dedico essa Dissertação aos meus pais, que tanto me incentivaram e apoiaram durante essa trajetória.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por se fazer presente em minha vida, guiando-me durante esses anos.

Agradeço, em especial, à minha mãe, Maria do Carmo Fernandes, meu pai,

Sebastião Dias de Magalhães e meu irmão, Carlos Henrique Magalhães, pelo

incentivo, apoio e, principalmente, por me ensinarem que a maior riqueza que podemos conquistar é a cumplicidade, a confiança e o amor incondicional de uma família.

Aos meus avós, tios e familiares, pelo carinho e apoio.

Agradeço o meu orientador Prof. Dr. Carlos Amilcar Parada, por todo o compromisso, dedicação, suporte e correções. Obrigada por ser um grande incentivador e amigo!

Agradeço aos professores do Laboratório de Estudos da Dor, Prof.ª Dr.ª

Cláudia Herrera Tambeli e Prof. Dr. César Renato Sartori, que direta e

indiretamente contribuíram para a minha formação.

Aos amigos e colegas do Laboratório: Luis Manzo, Willians Vieira,

Fernanda Barchesi, Luara Nicolai, Juliana Teixeira, Amanda Neves, Gilson Gonçalves, Glaucilene Catroli, Kauê Malange, Ivan Bonet, Elayne Vieira, Felipe Farias, Felipe Hertzing, Arthur Brandão, Maria Athié, Marco Pagliusi, Maria Júlia Ceolin, Fabiane Carone, Jalile Garcia e Lilian Calili, por toda ajuda e

companheirismo!

Aos técnicos, Catarine Nishijima e César Bissoto, por toda a paciência e auxílio no desenvolvimento deste trabalho.

Agradeço aos professores membros da Banca de Qualificação e da Defesa,

Prof. Dr. André Schwambach Vieira, Prof.ª Dr.ª Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio, Prof. Dr. Edson Antunes, Prof.ª Dr.ª Gisele Picolo e Prof. Dr. José Antônio Dias Garcia, por compartilharem suas experiências e

conhecimentos, enriquecendo este trabalho!

A todos os meus amigos, que mesmo longe, estão sempre me apoiando e fazendo meus dias mais alegres!

Aos animais que fizeram parte destes experimentos. A eles o meu respeito, minha ética, reconhecimento e agradecimentos!

Agradeço à Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP e ao CNPq pelo apoio estrutural e financeiro para a conclusão deste trabalho.

É certo que estes parágrafos não conseguirão representar todas as pessoas que, de um modo especial, contribuíram para que eu chegasse até aqui. Acredito que agradecimentos escritos são apenas mais algumas linhas dentro um texto qualquer e que são incapazes de alcançar os sentimentos das pessoas. Espero, da minha maneira, conseguir demonstrar a cada uma delas, através de atitudes e palavras ditas, o quanto são especiais em minha vida.

RESUMO

Está bem estabelecido que a hiperalgesia inflamatória depende da liberação de TNF-α. Contudo, tem sido postulado que TNF-α, por sua vez, induz a liberação de outras citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1β, IL-6 e IL-8 (CINC-1 nos ratos). Estas citocinas induzem a liberação de mediadores inflamatórios finais, como prostaglandinas e aminas simpatomiméticas que, em última instância, diretamente sensibilizam os nociceptores. Estudos prévios demonstraram que a talidomida, a qual inibe a síntese de TNF-α, impede o desenvolvimento de hiperalgesia inflamatória. No entanto, os resultados do presente estudo demonstraram que a administração sistêmica de talidomida embora impedisse completamente o desenvolvimento da hiperalgesia induzida pela carragenina, diminuiu apenas parcialmente os níveis de IL-1β e não alterou os níveis de IL-6 e CINC-1. Baseado nestes dados iniciais, foi investigado se a ativação dos receptores neuronais de TNF-α tipo 1 e 2 nos nociceptores, TNFR1 e TNFR2, são importantes para o desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória. Os resultados demonstraram que a administração intratecal de oligodeoxinucleotideos antisense (ODN-AS) contra o receptor TNFR1 ou TNFR2 preveniu completamente a hiperalgesia induzida por carragenina. Além disso, a administração de uma dose sub limiar de PGE2 (4 ng) que não induz hiperalgesia, quando coadministrada com TNF- (0,8 pg/pata) em ratos tratados com dexametasona (1 mg/Kg/mL), induziu hiperalgesia com a mesma magnitude da dose de 100 ng de PGE2. Por outro lado, a hiperalgesia induzida pela coadministração de 4 ng de PGE2 e TNF- foi completamente prevenida pelo tratamento intratecal com ODN-AS contra TNFR1 ou TNFR2. Uma vez que apenas a administração de TNF- com dexametasona não induziu hiperalgesia, estes resultados permitem concluir que a ativação dos receptores TNFR1 e TNFR2 neuronais do nociceptor pelo TNF-α liberado durante o processo inflamatório aumenta a susceptibilidade do nociceptor à ação da PGE2, sendo esta ativação necessária para o desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória.

ABSTRACT

It is well known that inflammatory hyperalgesia depends on TNF-α release. However, it has been postulated that TNF-α, in turn, induces the release of other pro-inflammatory cytokines, such as IL-1β, IL-6 e IL-8 (CINC-1 in rats). These cytokines induce the release of final inflammatory mediators, as prostaglandins and sympathetic amines, which, ultimately, directly sensitize the nociceptors. Previous studies demonstrated that thalidomide, which inhibits the synthesis of TNF-α, prevents the development of inflammatory hyperalgesia. However, our results demonstrated that systemic administration of thalidomide, although, completely preventing the development of carrageenan-induced hyperalgesia, only slightly decreased the level of IL-1β and did not alter the levels of IL-6 and CINC-1. Based on these initial data, we investigated whether the activation of TNF-α receptors type 1 and 2 in the nociceptors (TNFR1 and TNFR2) are important for the development of inflammatory hyperalgesia. Our results demonstrated that the intrathecal administration of oligodeoxynucleotide antisense (ODN-AS) against TNFR1 and TNFR2 completely prevented carrageenan-induced hyperalgesia. Furthermore, the administration of a sub-threshold dose of PGE2 (4 ng) that does not induce hyperalgesia when co-administered with TNF-α (0.8 pg/paw) in rats pre-treated with dexamethasone (1 mg/Kg/ml), induced hyperalgesia at the same magnitude of that resulting from 100 ng PGE2. Moreover, the hyperalgesia induced by the co-administration of 4 ng of PGE2 and TNF-α was completely prevented by the treatment with ODN-AS against TNFR1 and TNFR2. Since, only the administration of TNF-α with dexamethasone did not induce hyperalgesia, these studies lead us to conclude that the activation of neuronal TNFR1 and TNFR2 receptors by TNF-α increases the susceptibility of the nociceptor to PGE2, which, in turn, is essential for the development of hyperalgesia.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1 – Modelo proposto sobre a liberação de citocinas durante um processo

inflamatório. ... 25

FIGURA 2 – Desenho experimental da análise do efeito da talidomida sobre a hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina ... 31

FIGURA 3 – Desenho experimental da análise do efeito da redução de expressão dos receptores TNFR1 ou TNFR2 do nociceptor sobre a hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina ... 32

FIGURA 4 – Desenho experimental da análise do aumento da susceptibilidade à PGE2 induzida por TNF-α ... 33

FIGURA 5 – Desenho experimental da análise da participação dos receptores TNFR1 ou TNFR2 neuronais no aumento da susceptibilidade à PGE2 ... 34

FIGURA 6 – Injeção intraplantar subcutânea de drogas utilizando seringa de 30 unidades para insulina ... 35

FIGURA 7 – Injeção intratecal de drogas no espaço subaracnóide de ratos ... 36

FIGURA 8 – Procedimento para retirada do gânglio da raiz dorsal ... 40

FIGURA 9 – Teste comportamental utilizando o Vonfrey eletrônico ... 42

FIGURA 10 – Efeito da talidomida (45 mg/kg i.p.) ou veículo (1 mL) sobre a hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina ... 46

FIGURA 11 – Efeito da talidomida, dexametasona, salina ou veiculo (45 mg/kg, 1 mg/kg, 1 mL e 1 mL, respectivamente, i.p. 30 min antes da Cg) sobre a liberação de TNF-α, IL 1β, IL-6 e CINC-1 em patas tratadas com carragenina (100 mg) ou salina (50 L) ... 48

FIGURA 12 – Efeito do pré tratamento intratecal (30 g/10L por dia durante 4 dias) com ODN- antisense (AS) ou ODN-mismatch (MM) contra TNFR1 ou TNFR2 no desenvolvimento da hiperalgesia mecânica induzida por carragenina (100 µg/pata) ... 49

FIGURA 13 – Aumento da susceptibilidade do nociceptor à hiperalgesia mediada por PGE2 ... 51

FIGURA 14 – Modelo proposto para explicar o mecanismo de liberação de citocinas e sensibilização dos nociceptores durante um processo inflamatório induzido pela carragenina e subsequente ativação de receptor TLR-4 (toll-like receptor 4) ... 60

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ºC – Graus Celsius

Ácido Desoxirribonucleico – DNA

Ácido etilenodiamino tetra-acético - EDTA Ácido Ribonucleico – RNA

Ácido Ribonucleico mensageiro – RNAm Adenina – A

Adenosina 3’, 5’-monofosfato cíclico – AMPc Albumina de soro bovino – BSA

Anti-inflamatórios não-esteroidais (AINES)

Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) Cálcio – Ca2+

Carragenina – Cg

Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório – CEMIB

Ciclo-oxigenase – COX Citosina – C

Cloreto de Sódio – NaCl Dexametasona – DEXA Diacilglicerol – DAG

Fator de Necrose Tumoral alfa - TNF-α Fator Nuclear Kappa B – NFκB

Gânglio da raiz dorsal – GRD Guanina – G

Hora – h

Inositol trifosfato – IP3 Interleucina-1-beta - IL-1β Interleucina-6 - IL-6 Interleucina-8 – IL-8 Intraplantar – i.pl. Intraperitoneal – i.p. Micrograma - g Microlitro – L Miligrama – mg Mililitro – mL Minutos – min Nanograma – ng Oligodeoxinucleotideos - ODNs

Oligodeoxinucleotideos Antisense- ODN AS Oligodeoxinucleotideos Mismatch – ODN MM Picograma – pg

Potássio – K+

Prostaglandina E2 – PGE2 Prostaglandinas - PGs Proteína Cinase A – PKA Proteína Cinase C – PKC Quilograma – Kg

Receptor do Fator de Necrose Tumoral do tipo 1- TNFR1 Receptor do Fator de Necrose Tumoral do tipo 2 – TNFR2

Rotação por minuto – rpm Salina – Sal

Sódio – Na+

Talidomida – Talid

Tampão fosfato-salina – PBS Trifosfato de adenosina – ATP Timina – T

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 16

2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 18

2.1 Nocicepção e Vias de Condução da Informação Dolorosa ... 18

2.2 Hiperalgesia ... 20

2.3 Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) e seus receptores (TNFR1 e TNFR2) ... 23 3 OBJETIVOS ... 29 3.1 Objetivo Geral ... 29 3.2 Objetivos Específicos ... 29 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 30 4.1 Animais e condições ... 30 4.2 Grupos Experimentais ... 30

4.2.1 Análise do efeito da talidomida sobre a hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina (n=5) ... 30

4.2.2 Análise do efeito da redução dos receptores TNFR2 do nociceptor sobre a hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina (n=5) ... 31

4.2.3 Análise do aumento da susceptibilidade à PGE2 induzida por TNF-α (n=5) ... 32

4.2.4 Análise da participação dos receptores TNFR1 ou TNFR2 neuronais no aumento da susceptibilidade à PGE2 (n=5) ... 33

4.3 Drogas e Doses ... 34

4.4 Injeção intraplantar subcutânea de drogas ... 35

4.5 Injeção intratecal ... 35

4.6 Oligodeoxinucleitídeos (ODNs) ... 36

4.6.1 ODN específico para TNFR1 ... 37

4.6.2 ODN específico para TNFR2 ... 39

4.7 Procedimento para retirada do gânglio da raiz dorsal ... 40

4.8 Teste Comportamental – von Frey eletrônico ... 41

4.9 Análise por Western blot da expressão de TNFR1 e TNFR2 ... 42

4.10 Quantificação de citocinas por ELISA ... 44

5 RESULTADOS ... 46

5.1 Efeito da Talidomida (45mg/Kg) sobre a hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina ... 46

5.2 Efeito da Talidomida sobre os níveis de citocinas pró-inflamatórias: TNF-α, 1β, CINC-1 (análogo ao 8 em humanos e IL-6 ... 47

5.3 Efeito do tratamento intratecal de ODN-Antisense contra TNFR1 ou TNFR2 sobre a hiperalgesia induzida por Carragenina ... 48

5.4 Ativação do TNFR1 ou TNFR2 neuronais aumenta a susceptibilidade do nociceptor à hiperalgesia mediada por PGE2 ... 50

6 DISCUSSÃO ... 52

7 CONCLUSÃO ... 60

REFERÊNCIAS ... 61

ANEXOS ... 70

ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética ... 70

1 INTRODUÇÃO

A Hiperalgesia inflamatória é caracterizada pela diminuição do limiar nociceptivo dos nociceptores aferentes primários, comumente causada pela liberação de prostaglandina E2 no sitio inflamatório (FERREIRA et al., 1974; MONCADA et al., 1974), a qual em última instância sensibiliza os neurônios aferentes primários por agirem diretamente nos receptores EP neuronais (CUNHA et al., 1992). Além das prostaglandinas, tem sido descrito que aminas simpatomiméticas liberadas no sitio inflamatório também são capazes de sensibilizar diretamente os nociceptores (FERREIRA et al., 1974; MONCADA et al., 1974). Experimentalmente a carragenina tem sido utilizada como um agente inflamatório, a qual induz hiperalgesia que depende da liberação de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-, IL1-, IL-6 e IL-8. Estas citocinas, por sua vez, induzem liberação de outros mediadores inflamatórios, tais como PGE2 e aminas simpatomiméticas que diretamente sensibilizam os nociceptores (CUNHA et al., 1992). Experimentos prévios realizados pelo nosso grupo demonstraram que a administração sistêmica de talidomida previne completamente a hiperalgesia induzida por carragenina e bloqueia a síntese e liberação de TNF- sem, contudo, alterar significativamente a síntese e liberação de IL1, IL-6 e IL-8. Está, de fato, bem escrito que a talidomida é um potente agente inibidor de TNF-(KAWAI et al., 2013). Surpreendentemente estes estudos iniciais demonstraram que, por não ter havido alterações significativas nas citocinas IL-1, IL-6 e IL-8, os mecanismos pelos quais a talidomida induz analgesia não poderia ser explicado pelo bloqueio da liberação de prostaglandinas e aminas simpatomiméticas liberados durante a inflamação induzida pela carragenina.

A citocina pró-inflamatória TNF- age em dois subtipos de receptores ambos encontrados no nociceptor periférico, TNFR1 e TNFR2 (para revisão do assunto veja MacEWAN, 2002).

Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar se a ativação dos receptores neuronais TNFR1 e TNFR2 pelo TNF- liberado durante o processo inflamatório é importante para o desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória.

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Nocicepção e Vias de Condução da Informação Dolorosa

A Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) define a dor como “uma experiência sensorial e emocional desagradável que se relaciona a uma lesão real ou potencial dos tecidos”. O nosso grupo de pesquisa assume uma definição mais abrangente que englobe também as dores de origem inflamatória e neuropáticas. Sendo assim, definimos dor como uma percepção desagradável associada à estimulação da via nociceptiva. Portanto, em uma análise restrita, a percepção de dor envolve a ativação das vias nociceptivas, ou seja, as vias sensoriais responsáveis pela detecção de estímulos nociceptivos, seja no sistema nervoso periférico ou central.

Essas vias de condução da informação nociceptiva são compostas por conjuntos de neurônios periféricos (fibras aferentes primárias) e por conjuntos de neurônios medulares (neurônios secundários) (AGUGGIA, 2003). As fibras aferentes primárias são neurônios pseudo-unipolares, cujos corpos celulares estão localizados no gânglio da raiz dorsal (DRG) ou trigeminal e emitem ramificações para a periferia e para o corno dorsal da medula espinal ou núcleo espinotalâmico do trigêmeo (AGUGGIA, 2003).

Os nociceptores possuem alto limiar de ativação e sua ramificação periférica é formada por terminações nervosas livres, as quais não estão associadas a receptores sensoriais especializados. Os nociceptores estão diretamente relacionadas a estímulos intensos e variados (JULIUS e BASBAUM, 2001).

Dois tipos de fibras são responsáveis por conduzirem estímulos dolorosos (nociceptivos): 1) Fibras A-delta (Aδ), de médio diâmetro, finamente mielinizadas, com velocidade de condução média, entre 12 e 30 m/s. Correspondem a 20% das fibras de dor, estão localizadas mais no tecido periférico da pele e são responsáveis pela maioria dos reflexos de origem nociceptiva do tecido cutâneo. 2), Fibras C, não mielinizadas, de pequeno diâmetro, com velocidade de condução menor (0,5 a 2 m/s). Correspondem a 80% das fibras condutoras da informação dolorosa e responsáveis pela dor com característica lenta e difusa) (JULIUS e BASBAUM, 2001; MILLAN, 1999).

Levando em conta o critério funcional, as fibras Aδ respondem à estimulação sobretudo mecânica, porém, podem ser estimuladas pela temperatura, enquanto as fibras do tipo C respondem tanto a estímulos térmicos quanto mecânicos e químicos. Por não estarem relacionados com a qualidade do estímulo, mas com a intensidade dos estímulos, os nociceptores são classificados como receptores polimodais. O nosso grupo de pesquisa assume que, de um modo geral, as fibras Aδ são encontradas mais perifericamente no tecido cutâneo e, portanto, são responsáveis sobretudo pela detecção imediata de estímulos nociceptivos ambientais, enquanto as fibras do tipo C são mais comumente encontradas nas porções mais profundas do tecido cutâneo (tecido conjuntivo da pele) e nos órgãos internos do corpo (vísceras, músculos, ossos e articulações).

Os estímulos ambientais internos ou externos ao organismo são detectados por estruturas receptoras localizadas por todo o corpo conhecidas como receptores sensoriais. Estes receptores traduzem a informação produzida pelos diferentes tipos de estímulos (mecânico, químico ou térmico), a qual será transmitida até o sistema nervoso central (SNC) por meio das fibras nervosas aferentes (primárias). Estas

fibras aferentes estabelecem contato com os neurônios de segunda ordem (secundários) que, por sua vez, conduzem a informação sensorial até o Sistema Nervoso Central. A condução nociceptiva inicia-se no nociceptor e é transmitida de maneira semelhante até o SNC, mas pelo trato espino-talâmica ântero-lateral, juntamente com a temperatura e tato (BONICA, 1990; JULIUS e BASBAUM, 2001). Ainda, a transmissão nociceptiva ocorre pela via neo-espino-talâmica, composta em grande parte por fibras Aδ e paleo-espino-talâmica, composta na sua maioria de fibras do tipo C (GUYTON e HALL, 2012).

2.2 Hiperalgesia

A hiperalgesia é caracterizada pela diminuição do limiar nociceptivo dos nociceptores aferentes primários, causada pela liberação de substâncias mediadoras do processo inflamatório, por exemplo, a Prostaglandina E2 (PGE2) liberada no local inflamado e que, em última análise, sensibiliza os nociceptores aferentes primários atuando diretamente sobre os receptores neuronais tipo EP (FERREIRA et al., 1974; MONCADA et al., 1974; CUNHA et al., 1992).

De um modo geral a PGE2 desempenha um papel crucial no desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória. Este paradigma da relação entre a PGE2 e a dor inflamatória pode ser demostrado também pela ação analgésica dos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINES), inibidores da Ciclo-oxigenase (COX), tanto em animais quanto em humanos. Além das prostaglandinas, já é bem descrito que as aminas simpatomiméticas também são capazes de diretamente sensibilizar os nociceptores aferentes primários (FERREIRA et al., 1974; MONCADA et al., 1974).

Essa sensibilização é caracterizada pela diminuição do limiar de estimulação dos nociceptores, no qual se observa eletrofisiologicamente um aumento da frequência de disparo em resposta a estímulos de baixa intensidade (RIEDEL e NEECK, 2001).

A excitabilidade dos neurônios é controlada por condutâncias iônicas através da membrana plasmática. Os canais iônicos são os alvos finais de segundos mensageiros, tais como a ativação de AMPc e Proteína cinase A (PKA) ou DAG/IP3 e Proteína cinase C (PKC), que levam à sensibilização dos neurônios aferentes primários (SACHS et al., 2009). Os canais de potássio (K+_{) e de sódio (Na}+₎ presentes nas membranas celulares dos neurônios nociceptivos primários são os principais responsáveis pela atividade elétrica que conduz a informação neuronal e, portanto, os principais candidatos a estarem envolvidos na sensibilização dos nociceptores durante um processo inflamatório (CONTI et al., 1976).

Ao contrário da nocicepção, que é considerada um fenômeno puramente iônico, a hiperalgesia é também um fenômeno mais complexo que envolve sinalização intracelular devido ativação de receptores metabotrópicos da membrana neuronal. Por exemplo, a liberação de mediadores inflamatórios que modificam as condições basais de um nociceptor (SNIDER e McMAHON, 1998; RAJA e HAYTHORNTHWAITE, 1999; CATERINA e JULIUS, 2001; LEWIN et al., 2004).

Após uma lesão do tecido, é gerada uma resposta inflamatória iniciada normalmente pela ativação de células imunes residentes, como macrófagos locais. Subsequente a esta ativação, o processo inflamatório é “amplificado” pela migração de células imunes circulantes, tais como neutrófilos e linfócitos (VAN FURTH et al., 1985; LASKIN e PENDINO, 1995).

Parece não restar dúvidas que durante a resposta inflamatória ocorre a liberação de mediadores inflamatórios, principalmente citocinas pró-inflamatórias que, por sua vez, estimulam a síntese das prostaglandinas e a liberação das aminas simpatomiméticas que irão sensibilizar os nociceptores por uma ação direta em receptores encontrados na membrana destes neurônios (CUNHA et al., 1992; FERREIRA et al., 1993; GOLD et al., 1996; RUSH e WAXMAN, 2004).

O modelo de inflamação induzido pela carragenina (Cg) tem sido amplamente utilizado no estudo da hiperalgesia inflamatória em animais (FULGENZI et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2005; OTUKI et al., 2005; Oliveira et al., 2009) uma vez que, semelhante a muitas condições inflamatórias em humanos, a carragenina induz uma resposta hiperalgésica que é significativamente reduzida por anti-inflamatórios não esteroidais (MONCADA et al., 1973; FERREIRA et al., 1974). A carragenina induz hiperalgesia mediada pela liberação de dois mediadores inflamatórios finais, as prostaglandinas e as aminas simpatomiméticas, que sensibilizam diretamente os nociceptores (GOLD et al., 1996; RUSH e WAXMAN, 2004). A produção desses mediadores depende da liberação prévia de uma cascata de citocinas, iniciada com a formação de bradicinina, que por sua vez, induz a liberação da citocina pró-inflamatória Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) (FERREIRA et al., 1993). Mais recentemente, nosso grupo demonstrou que a liberação de TNF- é precedida pela liberação de ATP e ativação do receptor purinérgico P2X3 (OLIVEIRA et al., 2009). Tem sido postulado há vários anos que esta citocina (TNF-) desencadeia a liberação de duas vias distintas, uma mediada pelas Interleucina-1-beta (IL-1β) e Interleucina-6 (IL-6) que estimulam a síntese da cicloxigenase-2 (COX-2), convertendo o ácido araquidônico em prostaglandinas e outra mediada pela Interleucina-8 (CINC-1 em ratos) que estimula a liberação das aminas

simpatomiméticas (CUNHA et al., 1991; CUNHA et al., 1992; LORENZETTI et al., 2002). Neste contexto, é plausível imaginar que a neutralização de uma citocina pró-inflamatória atenue o processo inflamatório, e como consequência, a dor pró-inflamatória (SCHAIBLE, 2014).

Portanto, o uso de anti-inflamatórios esteroidais como os glicocorticoides e similares (dexametasona) tem sido usado clinicamente para o controle da dor inflamatória de moderada a intensa, uma vez que estes medicamentos inibem a formação de NFKappa-B importante para a síntese das citocinas pró-inflamatórias, além de inibirem também a COX (McKAY e CIDLOWSKI, 1999; De BOSSCHER et al., 2003).

2.3 Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) e seus receptores (TNFR1 e TNFR2)

O TNF-α é uma proteína solúvel de 17 kDa que predominantemente medeia as respostas imunes e inflamatórias (GOSSELIN e RIVEST, 2007).

Após uma lesão tecidual, uma resposta inflamatória é gerada com a formação inicial de bradicinina e subsequentemente TNF- (CUNHA et al., 1992). Além dos mediadores inflamatórios, a acidificação do tecido induz e mantêm o desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória (SOMMER e KRESS, 2004). Porém, o TNF-α tem sido considerado uma citocina chave para o controle da inflamação e principalmente da dor inflamatória (GOSSELIN e RIVEST, 2007). Neste sentido, o uso de infliximab, um anticorpo quimérico camundongo-humano anti-TNF- tem sido usado como agente terapêutico no controle da inflamação e dor severa, tal como a que ocorre na artrite reumatoide (BOETTGERET et al., 2008).

Os efeitos periféricos da liberação de TNF-α na sensibilização do nociceptor (sensibilização periférica) têm sido bem documentada. Por exemplo, injeção intraplantar ou intradérmica de TNF-α induz hiperalgesia térmica e alodinia mecânica (SCHAFERS et al., 2003; WAGNER e MYERS, 1996; ZELENKA et al., 2005).

O TNF-α também modula a atividade de vários canais iónicos, incluindo TRPV1, Na+_{, Ca}2+ _{e canais de K}+ _{(CZESCHIK et al., 2008; JIN e GEREAU, 2006;} MILLIGAN e WATKINS, 2009) e induz atividade elétrica espontânea em neurônios sensoriais primários (SCHAFERS et al., 2003; SORKIN et al., 1997).

No desenvolvimento da dor inflamatória, acredita-se que o efeito hiperalgésico do TNF-α ocorra por duas vias paralelas e independentes. Em uma via, o TNF-α induz a síntese e liberação de IL-6 e IL-1β induzindo, por sua vez, a síntese e liberação de PGE2. Em uma outra via, o TNF-α induz a síntese e liberação de CINC-1 (IL-8) e consequentemente a síntese e liberação de aminas simpatomiméticas. Ambas as vias levam a sensibilização do nociceptor (fig. 1) (CUNHA et al., 1992). Neste sentido, drogas tais como a Talidomida, a qual inibe a síntese de TNF-α (SAMPAIO et al., 1991; MARRIOTT et al., 1997), pode oferecer uma opção clínica complementar interessante no controle de processos inflamatórios e dor inflamatória (PETERSON et al., 1995; SOMMER et al., 1998). A Talidomida é um fármaco que foi introduzido no mercado na década de 1960, utilizada em mulheres grávidas para o alívio de náuseas (KUMAR et al., 2002). No entanto, seu uso foi muito restringido, uma vez descoberto seus graves efeitos teratogênicos (ZELLER, 2010). Contudo, seus efeitos anti-inflamatórios, imunossupressor e anti-angiogênicos são reconhecidos, favorecendo o uso hospitalar e controlado deste medicamento (GOLI, 2007; ASHER e FURNISH, 2013).

Figura 1 - Modelo inicialmente proposto sobre a liberação de citocinas durante um processo

inflamatório a partir de estudos de farmacologia comportamental. Cascata desencadeada por um estímulo inflamatório induzido por carragenina em ratos (Para revisão veja VERRI et al., 2006).

Ademais, o TNF-α exerce sua função através da ativação de dois receptores, o TNFR1 e TNFR2. A expressão celular de TNFR2 é mais comumente encontrado a em neutrófilos e neurônios sensoriais primários. Tem sido demonstrado que a ativação do receptor TNFR1 por TNF-α exógeno induz apoptose celular, enquanto a ativação de TNFR2 induz proliferação celular (SIDHU e BOLLON, 1993; HIEBER e HEIM, 1994).

Durante a degeneração Walleriana, o TNF-α é rapidamente liberado no local da lesão do nervo periférico e acredita-se que o mesmo atue como um iniciador de uma rede de liberação de citocinas (LAFLEUR et al, 1996; SHAMASH et al, 2002; WAGNER e MYERS, 1996). Os mecanismos moleculares que estão na base das ações do TNF-α após a lesão do nervo periférico não são totalmente conhecidos, mas sabe-se que este efeito está relacionado à ativação dos receptores TNFR1 e TNFR2 (GEORGE e SOMMER, 2005).

A sensibilização dos nociceptores pelo TNF- é um processo indireto que envolve a síntese e liberação de outros mediadores inflamatórios (VERRI et al., 2006), embora tenha sido demonstrado in vitro que administração de TNF-α em altas doses provoca excitabilidade dos neurônios do DRG (SCHAIBLE, 2014).

Como descrito anteriormente, o TNF-α exerce os seus efeitos através de dois receptores relacionados estruturalmente e funcionalmente distintos, o receptor 1 de TNF- (TNFR1, p55) e o receptor 2 de TNF- (TNFR2, p75) (EASTGATE et al., 1988; JI et al., 2002). Em comparação com TNFR1, pouco se sabe sobre a função do TNFR2 (SOMMER e KRESS, 2004).

O TNFR1 tem sido considerado como um receptor predominante e constitutivamente expresso em quase todos os tecidos. Por outro lado, a expressão de TNFR2 é, na maioria das vezes, regulada e sua função tem sido frequentemente subestimada (CARPENTIER et al., 2004; CHADWICK et al., 2008). Portanto, não existe muitas informações sobre o papel dos receptores TNFR2. Sabe-se que este receptor é expresso de uma maneira mais limitada em certas populações de linfócitos, incluindo as células T-reguladoras (Tregs), células endoteliais, microglia, subtipos neuronais, oligodendrócitos, cardiomiócitos, timócitos, ilhotas de Langerhans e em células tronco mesenquimais humanas (ARNETT et al., 2001; ANNUNZIATO et al., 2002; YANG et al., 2002; McCOY e TANSEY, 2008; BOCKER et al., 2008; FAUSTMAN e DAVIS, 2013).

Foi demonstrado também que a ativação de TNFR2 neuronal aumenta a atividade elétrica espontânea em neurônio cujo nervo foi lesionado sugerindo um papel particularmente importante do receptor TNFR2 em lesões neuronais (SCHAFERS et al., 2008). Tem sido sugerido que a ativação do receptor TNFR2 aumenta a expressão de outros receptores neuronais, tal como TRPV1, durante

condições patológicas como a presença de tumores (CONSTANTIN et al., 2008). Especificamente com relação à transmissão dolorosa, tem sido sugerido que a ativação do receptor TNFR2 participa do desenvolvimento da dor inflamatória relacionada à sensibilização central (ZHANG et al., 2011).

Em relação às suas estruturas, ambos receptores (TNFR1 e TNFR2) contém componentes extracelulares, transmembranares e citoplasmáticos. O TNFR1 contém 434 aminoácidos. A sua região intracelular é composta por 221 aminoácidos e contém um domínio de morte que se liga a TRADD ou FADD (vias de sinalização intracelular). Nas células T, a ativação de TRADD ou FADD ativa as caspases, resultando em apoptose. Em contraste com TNFR1, TNFR2 não tem um domínio de morte citoplasmático. O receptor consiste em 439 aminoácidos. O domínio citoplasmático de TNFR2 tem um sitio de ligação ao TRAF2. TRAF2, por sua vez, liga TRAF1, TRAF3, cIAP1 e cIAP2 (ROTHE et al., 1995; ROTHE et al., 1994). Estas proteínas de sinalização ativam diversas outras proteínas sinalizadoras relacionadas à adaptação celular. Esta melhor adaptação celular que, de certa forma assegura a sobrevivência celular envolve a produção do fator de transcrição NFkB que é formado a partir da proteína inibidora IkB (GEHR et al., 1992; para revisão do assunto veja FAUSTMAN e DAVIS, 2013).

A ativação de qualquer receptor de TNF-α também resulta na sinalização da p38 MAP cinase (SCHAFERS et al., 2003), translocação de NFκB para o núcleo e ativação da liberação de prostanóide de COX-2-dependente (DINARELLO, 1999). No entanto, não se sabe o papel da ativação distinta dos receptores TNFR1 e TNFR2 neuronais do nociceptor no desenvolvimento da dor inflamatória (ZHANG et al., 2011).

Estudos demonstraram que a ativação dos receptores TNFR1 nos neurônios aferentes nociceptivos primários do tecido periférico induz um aumento crônico da susceptibilidade dos nociceptores à PGE2, fenômeno que foi chamado de "priming" neuronal (PARADA et al., 2003). Sendo assim estes dados sugerem que o TNF-α poderia agir nos seus receptores neuronais aumentando também de maneira aguda a susceptibilidade dos nociceptores aos mediadores inflamatórios finais, os quais diretamente sensibilizam o tecido periférico.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar a importância da ativação dos receptores TNFR1 e TNFR2 neuronais no desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória.

3.2 Objetivos específicos

- Analisar do efeito da talidomida sobre a hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina;

- Verificar a expressão das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β, IL-6 e CINC-1 em patas de ratos inflamadas por carragenina e tratadas com Talidomida;

- Analisar o efeito da redução de expressão do receptor TNFR1 sobre a hiperalgesia induzida com carragenina;

- Verificar se a ativação do receptor TNFR1 aumenta a susceptibilidade dos nociceptores à ação hiperalgésica de mediadores inflamatórios;

- Analisar o efeito da redução de expressão do receptor TNFR2 sobre a hiperalgesia induzida com carragenina;

- Verificar se a ativação do receptor TNFR2 aumenta a susceptibilidade dos nociceptores à ação hiperalgésica de mediadores inflamatórios.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Animais e Condições

Ratos Wistar machos, com 6 a 8 semanas (200-250g) provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB), foram acondicionados em grupos de 5 animais por caixa, em estantes ventiladas (Alesco, Brasil) com temperatura (22 ± 2°C), umidade (55% ± 5%) constantes, ciclo determinado de 12 horas de claro/escuro e alimentação com água e ração ad libitum no decorrer de todo o protocolo experimental.

Os animais foram utilizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética para Pesquisas com Animais da Universidade Estadual de Campinas sob o número de protocolo 3771-1 e todos os cuidados e esforços a fim de utilizarmos o menor número de animais possível para a condução dos experimentos e evitar o sofrimento do animal foram tomados.

4.2 Grupos Experimentais

4.2.1 Análise do efeito da talidomida sobre a hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina (n=5)

Neste experimento foi verificado o efeito da talidomida (45 mg/Kg) administrada no tecido periférico 30 minutos antes da injeção intraplantar (i.pl.) de carragenina (100 µg/50 µL/pata). Após a 3ª hora da administração de carragenina foi realizado o teste do limiar nociceptivo mecânico e, posteriormente, todos os animais foram sacrificados por inalação de isoflurano a 4% e o tecido da superfície

plantar da pata traseira direita foi coletado para posteriores análises moleculares (quantificação dos níveis de TNF-α, IL1-β, IL-6 e CINC-1) (fig. 2).

Figura 2 – Desenho experimental da análise do efeito da talidomida sobre a hiperalgesia

inflamatória induzida por carragenina.

4.2.2 Análise do efeito da redução de expressão dos receptores TNFR1 ou TNFR2 do nociceptor sobre a hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina (n=5)

Neste experimento os ratos foram tratados com administração intratecal de

ODN-AS (30 µg/10 µL uma vez ao dia, durante 4 dias) contra o receptor TNFR1 ou contra o receptor TNFR2 e seus respectivos Mismatch. No 5º dia os animais receberam a administração de Cg (100 μg) na pata direita e o limiar hiperalgésico foi verificado na 1ª, 3ª, 6ª e 24ª hora após a injeção. Logo após a verificação do limiar,

os animais foram sacrificados e o DRG foi coletado para análises moleculares (fig. 3).

Figura 3 – Desenho experimental da análise do efeito da redução de expressão dos receptores

TNFR1 ou TNFR2 do nociceptor sobre a hiperalgesia inflamatória induzida por carragenina.

4.2.3 Análise do aumento da susceptibilidade à PGE2 induzida por TNF-α (n=5)

Nesse experimento os animais receberam doses de 4 ou 100 ng/pata de PGE2 e após a 3ª hora o limiar hiperalgésico foi verificado.

Para verificar o aumento da susceptibilidade à PGE2 induzida por TNF-α os animais foram pré-tratados com dexametasona (1 mg/mL/Kg) para inibir a liberação de citocinas e mediadores inflamatórios. Após 30 minutos eles receberam injeção de TNF-α (0,8 pg/pata) ou coadministração de TNF-α (0,8 pg/pata) e PGE2 (4 ng) e, na 3ª hora foi verificado o limiar de hiperalgesia mecânica (fig. 4).

Figura 4 – Desenho experimental da análise do aumento da susceptibilidade à PGE2 induzida por

TNF-α.

4.2.4 Análise da participação dos receptores TNFR1 ou TNFR2 neuronais no aumento da susceptibilidade à PGE2 (n=5)

Para verificar a participação dos receptores neuronais de TNFR1 e TNFR2 no aumento da susceptibilidade à PGE2, os animais foram tratados com administração intratecal de ODN-AS (30 µg/10 µL uma vez ao dia, durante 4 dias) contra o receptor TNFR1 ou TNFR2 e seu respectivo Mismatch. No 5º dia os animais foram pré-tratados com dexametasona (1 mg/mL/Kg) e após 30 minutos receberam a coadministração de TNF- α (0,8 pg/pata) com PGE2 (4 ng) e o limiar de hiperalgesia mecânica foi verificado na 3ª hora. Logo após a verificação do limiar, os animais foram sacrificados e o DRG foi coletado (fig. 5).

Figura 5 – Desenho experimental da análise da participação dos receptores TNFR1 ou TNFR2

neuronais no aumento da susceptibilidade à PGE2.

4.3 Drogas e Doses

Todas as drogas e compostos foram preparados imediatamente antes de seus respectivos usos. Os seguintes compostos foram utilizados: Carragenina (Cg; 100 µg/pata (OLIVEIRA et. al, 2009)); prostaglandina E2 (PGE2; 4 e 100 ng/pata); dexametasona (dexa; 1 mg/kg/mL (SCHULIGOI et al., 2003)) e a talidomida (45 mg/kg i.p. (PARADA et al., 2003)) obtidos da Sigma Chemicals (St. Louis, Missouri, EUA). O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α, 0,8 pg/pata; Ferreira et al., 1993) foi obtido a partir da R&D Systems (Minneapolis, USA).

As drogas foram dissolvidas em solução salina (NaCl à 0,9%), exceto a dexametasona e a PGE2, que foram dissolvidas em etanol e TNF-α que foi dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, EUA).

A solução estoque de PGE2 (1 mg/mL) foi preparada em 10% de etanol e as diluições subsequentes foram feitas em solução salina fisiológica (NaCl 0,9%) para dar uma concentração final de etanol de menos do que 1%.

4.4 Injeção intraplantar subcutânea de drogas

Uma agulha BD Ultra-Fine® (29G) de seringa para insulina 30 unidades foi

inserida no tecido subcutâneo (intraplantar) da pata dos animais brevemente contidos e as substâncias foram administradas em um volume de 50 µL/pata (fig. 6).

Figura 6 - Injeção intraplantar subcutânea de drogas utilizando seringa de 30 unidades para insulina.

4.5 Injeção intratecal

A metodologia de administração intratecal direta descrita por Papir-Kricheli (PAPIR-KRICHELI et al., 1987) foi ligeiramente modificada, de acordo com trabalho publicado por Mestre e colaboradores (MESTRE et al., 1994). Após tricotomia dorsal na altura das cristas ilíacas, os animais foram anestesiados com isoflurano 5% utilizando-se o equipamento de anestesia para pequenos roedores (Matrx) associado ao vaporizador calibrado de isoflurano (fig. 7A) e posicionados em

decúbito ventral sobre um cilindro, para fletir a região lombar. Em seguida, uma agulha BD Ultra-Fine® (29G) de seringa para insulina 30 unidades foi inserida no espaço subaracnóide, perfurando a região medial entre as vértebras L4-L5, em ângulo de aproximadamente 45° (fig. 7B). Foi injetado um volume de 30μg/10μL de ODN antisense ou mismatch, uma vez por dia, durante 4 dias (BARCLAY et al., 2002). A correta localização da punção no espaço subaracnóide pôde ser verificada pela observação de um reflexo na cauda do animal. Após a injeção, a agulha foi mantida por alguns segundos em posição antes de sua cuidadosa retirada, para evitar o refluxo da solução injetada. A avaliação comportamental foi realizada no dia seguinte ao último dia de injeção.

Figura 7 - Injeção intratecal de drogas no espaço subaracnóide de ratos. Painel A: Equipamento de

anestesia para pequenos roedores associado ao vaporizador calibrado de isofluravo. Painel B: Momento da injeção intratecal em um ângulo de aproximadamente 45ºC.

4.6 Oligodeoxinucleotídeos (ODNs)

Os oligodeoxinucleotídeos específicos para TNFR1(Tnfrsf1a) e TNFR2 (Tnfrsf1b) utilizados para o estudo de silenciamento gênico foram desenhados a partir do mRNA referência de rato dos genes referidos disponível no GenBank (Pubmed – Medline).

B A

TNFR1: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_013091.1 TNFR2: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_130426.4

O desenho foi realizado com o auxílio da ferramenta siDESIGN Center (http://dharmacon.gelifesciences.com/design-center), realizando-se os ajustes necessários para a confecção de uma molécula simples-fita de DNA. Os parâmetros selecionados para a confecção da molécula complementar foram: complementariedade à região de Open Reading Frame (ORF), porcentagem de G/C mínima de 30 e máxima de 64 (padrão sugerido pelo programa) e especificidade da molécula complementar projetada comprovada por meio da comparação com o restante do genoma de referência do organismo (Rattus norvegicus) utilizando-se a ferramenta BLAST.

As moléculas de ODN mismatch foram desenhadas alterando-se pelo menos três bases em relação à molécula ODN match, ou seja, complementar a sequência do mRNA do gene a ser silenciado - selecionando aquelas que não apresentavam complementariedade com qualquer outra região do genoma do rato.

Foi realizada uma pesquisa no banco de dados do NCBI para Rattus norvegicus e não foram encontradas sequências homólogas. Os ODNs liofilizados foram adquiridos pela Exxtend Biotecnologia Ltda. (SP, Brasil). Após o recebimento, os mesmos foram reconstituídos em TrisEDTA, aliquotados e armazenados a -20°C.

4.6.1 ODN específico para TNFR1

>NM_013091.1 Rattus norvegicus TNF receptor superfamily member 1A (Tnfrsf1a), mRNA

TTTTCTCCGAGTTTTCTGAACTCTGGCTCATGATCGGGCTTACTGGATACGAGAATCCTGGA GGACCGTACCCTGATTTCCATCTACCTCTGACTTTGAGCCTTTCTAACCCGGGGCTCACGCT GCCAACACCCGGGCCACCTGGTCCGATCGTCTTACTTCATTCACCAGCGTTGCCAATTGCTG CCCTGTCCCCAGCCCCAATGGGGGAGTGAGAGAGGCCACTGCCGGCCGGACATGGGTCTCCC CATCGTGCCTGGCCTGCTGCTGTCACTGGTGCTCCTGGCTCTGCTGATGGGGATACACCCAT CAGGGGTCACCGGACTGGTTCCTTCTCTTGGTGACCGGGAGAAGAGGGATAATTTGTGTCCC CAGGGAAAGTATGCCCATCCAAAGAATAATTCCATCTGCTGCACCAAGTGCCACAAAGGAAC CTACTTGGTGAGTGACTGTCCAAGCCCAGGGCAGGAAACAGTCTGCGAGGTGTGTGATAAAG GCACCTTTACAGCTTCGCAGAACCACGTCAGACAGTGTCTCAGTTGCAAGACATGTCGGAAA GAAATGTTCCAGGTGGAGATTTCTCCTTGCAAAGCTGACATGGACACCGTGTGTGGCTGCAA GAAGAACCAATTCCAGCGCTACCTGAGTGAGACGCATTTCCAGTGTGTGGACTGCAGCCCCT GCTTCAATGGCACCGTGACAATCCCCTGTAAGGAGAAACAGAACACCGTGTGTAACTGCCAC GCAGGATTCTTTCTAAGCGGAAATGAGTGCACCCCTTGCAGCCACTGCAAGAAAAATCAGGA ATGTATGAAGCTGTGCCTACCTCCAGTTGCAAATGTCACAAACCCCCAGGACTCAGGTACTG CCGTGCTGTTGCCTCTGGTTATCTTCCTAGGTCTTTGCCTTT TATTCTTTATCTGCATCAGTCTACTGTGCCGATATCCCCAGTGGAGGCCCAGGGTCTACTCC ATCATTTGTAGGGATTCAGCTCCTGTCAAAGAGGTGGAGGGTGAAGGAATTGTTACTAAGCC CCTAACTCCAGCCTCTATCCCAGCCTTCAGCCCCAACCCCGGCTTCAACCCCACTCTGGGCT TCAGCACCACCCCACGCTTCAGTCATCCTGTCTCCAGTACCCCCATCAGCCCCGTCTTCGGT CCTAGTAACTGGCACAACTTCGTGCCACCTGTAAGAGAGGTGGTCCCAACCCAGGGTGCTGA CCCTCTCCTCTACGGATCCCTCAACCCTGTGCCAATCCCCGCCCCTGTTCGGAAATGGGAAG ACGTCGTCGCGGCCCAGCCACAACGGCTTGACACTGCAGACCCTGCGATGCTGTATGCTGTG GTGGATGGCGTGCCTCCGACACGCTGGAAGGAGTTCATGCGGCTCCTGGGGCTGAGCGAGCA CGAGATCGAGCGGCTGGAGCTGCAGAACGGGCGTTGCCTCCGCGAGGCTCATTACAGCATGC TGGAAGCCTGGCGGCGCCGCACACCGCGACACGAGGCCACGCTGGACGTAGTGGGCCGCGTG CTTTGCGACATGAACCTGCGTGGCTGCCTGGAGAACATCCGCGAGACTCTAGAAAGCCCTGC CCACTCGTCCACGACCCACCTCCCGCGATAAGGCCACACCCCCACCTCAGGAACGGGACTCG AAGGACCATCCTGCTAGATGCCCTGCTTCCCTGTGAACCTCCTCTTTGGTCCTCTAGGGGGC AGGCTCGATCTGGCAGGCTCGATCTGGCAGCCACTTCCTTGGTGCTACCGACTTGGTGTACA TAGCTTTTCCCAGCTGCCGAGGACAGCCTGTGCCAGCCACTT GTGCATGGCAGGGAAGTGTGCCATCTGCTCCCAGACAGCTGAGGGTGCCAAAAGCCAGGAGA GGTGATTGTGGAGAAAAAGCACAATCTATCTGATACCCACTTGGGATGCAAGGACCCAAACA AAGCTTCTCAGGGCCTCCTCAGTTGATTTCTGGGCCCTTTTCACAGTAGATAAAACAGTCTT TGTATTGATTATATCACACTAATGGATGAACGGTTGAACTCCCTAAGGTAGGGGCAAGCACA GAACAGTGGGGTCTCCAGCTGGAGCCCCCGACTCTTGTAAATACACTAAAAATCTAAAAGTG

Sequência alvo: TCAAAGAGGTGGAGGGTG Complementar: AGTTTCTCCACCTCCCAC

Reverso (match): 5’ – CACCCTCCACCTCTTTGA – 3’

4.6.2 ODN específico para TNFR2

>NM_130426.4 Rattus norvegicus TNF receptor superfamily member 1B (Tnfrsf1b), mRNA AGTCACCAGCTAGAGCGCAGCAGAGGCACGAGAGCTCCAGGCGCAAGAGCGGGAGCTACCGC CGCCCCTATGGCGCCCGCCGCCCTCTGGGTCGCGCTGGTCGTCGAACTGCAGCTGTGGGCCA CCGGGCACACAGTGCCCGCCAAGGTTGTCTTGACACCCTACAAGCCAGAACCTGGGAACCAG TGCCAGATCTCACAGGAGTACTATGACAAGAAGGCTCAGATGTGCTGTGCTAAGTGTCCCCC TGGCCAGTATGCAAAACACTTCTGCAACAAGACTTCAGACACCGTGTGTGCGGACTGTGCGG CAGGCATGTTTACCCAGGTCTGGAACCATCTGCATACATGCCTGAGCTGCAGTTCTTCCTGT AGTGATGACCAGGTGGAGACCCACAACTGCACTAAAAAACAGAACCGAGTGTGTGCTTGCAA CGCTGACAGTTACTGTGCCTTGAAATTGCATTCTGGGAACTGTCGACAGTGCATGAAGCTGA GCAAGTGTGGCCCTGGCTTCGGAGTGGCCCGTTCAAGAACCTCAAATGGAAACGTGATATGC AGTGCCTGTGCCCCAGGGACGTTCTCTGACACCACATCATCCACAGATGTGTGCAGGCCCCA CCGCATTTGTAGCATCCTGGCTATTCCTGGAAATGCAAGCACAGATGCAGTCTGTGCATCCG AGTCCCCAACTCCAAGCGCTGTTCCAAGGACAATCTACGTATCTCAGCCAGAGCCCACAAGA TCCCAGCCCATGGATCAAGAGCCAGGGCCTAGCCAAACTCCACACATCCCTGTGTCCTTGGG TTCAACCCCCATCATTGAACCAAGCATCACGGGTGGCATCTCTCTTCCAATTGGTCTGATCG TTGGACTGACAACTCTGGGTCTGCTGATGTTAGGACTGGCGAACTGCTTCATCCTGGTGCAG AGGAAAAAGAAGCCCTCCTGCCTACAACGAGAAACCATGGTGCCTCATCTGCCTGATGACAA ATCCCAGGATGCAATAGGCCTTGAACAGCAGCACCTATTGACCACAGCACCCAGTTCCAGCA GCAGCTCCCTGGAGAGCTCAGCCAGCGCTGGGGACAGGAGAGCGCCCCCTGGGGGTCATCCC CAAGCAAGAGTCACAGCGGAGGCCCAAGGGTCTCAGGAAGCCTGTGCCGGCTCCAGGAGTTC AGATTCTTCCCATGGCAGCCACGGGACCCATGTCAACGTCACCTGCATCGTGAACGTCTGTA GCAGCTCTGACCACAGCTCTCAGTGTTCTTCCCAAGCCAGCACCACGGTGGGAGACCCAGAT GCTAACCCTTCAGGGTCTCCAAAGGATGAGCAGGTCCCCTTTTCCCAGGAGGAGTGTCCCTC TCAGTCCCAGTGGGAGACCACAGAGACACTGCAGAACCATGACAAGCCCTTTCCCCTTGGTG TGCCTGATGTGGGTATGAAGCCCAACCAACCAGGCTGGTATGACCAGATTGCTGTCAAAGTG CCTTGACCCATGACAGGGGCAACACCCTGTAAAGGGACCCCCCTAGGCCCTGAACCCATGGA ACTTCATGACTTTTTCTGAGCCCGTTTCCTTTAGTGGCCTCTACAGTTCCAGTTGCAGGTCA ACTGAGGGCTGAGGCAGCTAGAGTGGTCAAAAACAGCCTTGGTGTTTCATGGGGGCAGTCCC AGGAAGCCCTTGTTCTTCTGTGACCCTCTGGATCTCCTGGGTGCTCTGGCTGATTCTTGTTT CTGAAAGGCCCCAGAATTTTCCCTTCTAAGGAGTTAACATCCTCTTCCATATGCTTTGAGAA AGGATAGCACAGCTCTTCAGCGTGAATGCTGACACTGCAGGGCAGTGTCTGAGGTAAGTAGG AGGAAGTAGTCCCCTGGTAGGGCACAGAGGCCCTTCAGATTAGTGCAAGACTCTTAGGAAGA ACCCTCTCCCAACACACTGAAATCCTGATGCCCCAACAGGCAGGATTGCTCTGTTGTAGGGT GCTGGGGCTGGGGCTCAGTAGTCCAGTGTGCTTTTTGCCCTGGGTTTGATCCGCAGTACTCA AAAAGTACACAGACAGTAGACAGAGACAGCACAGGCTACCCCCCCTGTGTGGATTTTATCCT CTGCCTTTGACTTTTACTCCAGTGGGCACACAGAAGCCTGGAGCTCCTTCTCCTGGCCTTCT CATGAACAGTTCCAAGGCCATACCTTCCTTCAGGGAATCTCAGGGACTGTAGAGTTCCCAGG CCCCTGCAGCCACCTGTCTCGTCCTACCTCAGCCTGGAGCACTCTGTCTAATTCCCCAACCA CTTGGTACTGTACTCGCTGTGACCCAAGTGCATGTCCGGGTTATGCACTGTGAGTTGGAACA GCCAATGGCGTCAGTTGAAGGGCCCACGCAGAAACAGCTGAAGCCAGCTATTTTGCCAAAGG ATTCATGCTTATTTTCTAATCGACCTGCTCCCCTAGCGTGCCTGGAGGGGAAGAGTTCAGGA GACTTCTGAAGACAGAAGAAGTTGAGCCTCAGGTGCTTGGATGCCATGCTCACAGATTCCAC AGGATATGAACTTGTTAGAGGAGCCCAGTTGTTACCATGGAGACTTAAAAAGCTCAGCCCTC TGGAATCAAGATATTGGACACTTGGGACAGACTTGTTAGGTCTCTGTAGCATCGGACTGGAG AAGCGAAGGGACACGTCTGCCCCCTGGTGGCCAGTCCTGGGATGGCCTCGGGCCGCCTAGGC

AACAAAAAGAATGAATTGGAAAAGACTGCTTCTGGGTGCGGCCTCAGCTCCTGTGCTTGTGT GGATCCCTACATGGTGTGTGTGTGCGTGCTAAGGAGTATTTGTCCTGTATGCTGGACAGAAT TCCTGCTTATAAATGCTTTTCGTTGCTGTTTTGCACACTGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

Sequência alvo: GCTCAGATGTGCTGTGCT Complementar: CGAGTCTACACGACACGA

Reverso (match): 5’ – AGCACAGCACATCTGAGC – 3’

Mismatch: 5’ – AGGCTAGTACGTCTGAGC – 3’ (com destaque nas bases alteradas)

4.7 Procedimento para retirada do gânglio da raiz dorsal

Ao final dos experimentos os animais foram eutanasiados através do aprofundamento da anestesia inalatória com isoflurano para a retirada dos gânglios da raiz dorsal (GRD, L4 e L5). Os ratos foram colocados em uma mesa cirúrgica própria para tricotomia da região dorso-lombar, seguida de assepsia e antissepsia da região com povidine iodado. Posteriormente foi feita a incisão póstero-mediana, seguida de abertura por planos até lamina óssea e feita laminectomia para expor e visualizar os gânglios L5 na sua emergência (fig 8A e 8B). Depois de retirados, os gânglios foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido e estocados em -80°C.

Figura 8 - Procedimento para retirada do gânglio da raiz dorsal. Painel A: Momento da incisão para a

visualização dos gânglios L4 e L5. Painel B: Visualização dos GRD com o auxílio de lupa.

4.8 Teste Comportamental - von Frey eletrônico

O limiar nociceptivo mecânico foi avaliado por um analgesímetro eletrônico (EFF 301 Analgesímetro Digital, Insight, Brasil) adaptado para ratos (VIVANCOS et al., 2004) e camundongos (CUNHA et al., 2004). Este aparelho consiste em um transdutor de força conectado a um contador digital que expressa a força em gramas (g). A força máxima aplicada foi de 80 g. O contato do transdutor de força com a pata é realizado através de uma ponteira descartável de polipropileno com 0,5 mm de diâmetro adaptada ao transdutor. Os animais foram colocados em caixas de acrílico, medindo 12x20x17cm cujo assoalho consiste de uma rede de malha igual a 5 mm2_{, constituída de arame não maleável de 1 mm de espessura. Os ratos} permaneceram nas caixas durante 15 minutos antes do experimento para habituação e para que houvesse uma melhor visualização das patas dos animais foram colocados espelhos posicionados 25 cm abaixo das caixas de experimentação (fig. 9A). O experimentador é treinado a aplicar, por entre as malhas da rede, uma pressão na superfície plantar da pata dos ratos com um aumento constante até que o rato emita um reflexo de retirada da pata seguido de uma resposta caracterizada como tremor (flinch) da pata estimulada (fig. 9B). Os estímulos foram repetidos por até seis vezes, em geral, até que o animal apresentasse 3 medidas consecutivas similares, ou seja, com uma diferença de força inferior ou igual a 10%. A intensidade de hiperalgesia foi quantificada pela variação do limiar de nocicepção em gramas (grama-força) obtida subtraindo-se a média de três valores observados antes do procedimento experimental (valor basal) da média de três valores obtidos após os tratamentos, os quais variam de acordo com os protocolos experimentais (Δ limiar nociceptivo mecânico em gramas) (fig. 9C).

Figura 9 - Teste comportamental utilizando o Vonfrey eletrônico. Painel A: Momento da habituação

dos ratos nas caixas de experimentação. Painel B: Pressão aplicada na pata dos ratos utilizando o transdutor de força. Painel C: Demonstração da tabela do excel com o delta do limiar nociceptivo dos ratos .

4.9 Análise por Western blot da expressão de TNFR1 e TNFR2

Após a administração intratecal dos ODNs, os gânglios L4 e L5 da raíz dorsal dos ratos foram coletados, sumersos em nitrogênio líquido e posteriormente armazenados à -80ºC para posterior análise da expressão dos receptores de TNFR1 e TNFR2. As amostras foram homogeneizadas com um aparelho de ultrassons (Sonic Corporation, EUA) em um tampão de lise constituído de PB 50 mM (pH 7,4), -mercaptoethanol 5%, Etilenodiaminatetracetato de Sódio (EDTA) 1 mM, SDS 1% e inibidor de protease 1% em banho de gelo. Após 20 minutos de incubação a 4°C, as amostras foram centrifugadas a 12000 g durante 15 min a 4°C e o sobrenadante resultante foi transferido para um novo tubo. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford e 70 ug de proteínas totais para cada amostra foram separados por SDS-PAGE e transferidos para membrana de PVDF de acordo com técnicas padrão. As membranas foram coradas com Ponceau S™ USB (como

A B

controle interno) e fotodocumentadas para quantificar o conteúdo de proteína total como um controle de carga de proteína (ROMERO-CALVO et al., 2010; IGNARRO et al., 2013).

As membranas foram bloqueadas com solução de leite em pó desnatado 5% em TBS contendo 0,1% Tween-20, e incubadas durante a noite com anticorpo primário anti TNFR1 (1: 1000; 13377; Cell Signaling Technology; MA, EUA) e TNFR2 (1: 1000; 3727; Cell Signaling Technology; MA, EUA), seguidos por anticorpo secundário (1: 10000; 656120; Invitrogen; CA, EUA). Para a revelação das bandas, a membrana foi incubada por 5 minutos à temperatura ambiente com a mistura das soluções A e B do kit de quimioluminescência (ECL, Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK) como descrito no manual de instruções. As membranas foram visualizadas em fotodocumentador (SYNGENE – Cambridge, Reino Unido) sendo as imagens capturadas com uma câmera digital (SYNOPTICS) e analisadas utilizando o software Gene link (SYNGENE).

Em todos os experimentos de Western Blot foi utilizado um padrão de peso molecular (Bio-Rad – Kaleidoscope Prestained Standards, Catalog 161-0324) com os seguintes pesos:

Myosin Blue 197,211

Β-galactosidase Magenta 125,275

Bovine serum albumin Green 83,426

Carbonic anhydrase Violet 37,095

Soybean trypsin inhibitor Orange 31,168

Lysozyme Red 17,154

4.10 Quantificação de Citocinas por ELISA

O teste ELISA (SAFIEH-GARABEDIAN et al., 1995) foi realizado com pequenas modificações. O tecido subcutâneo do dorso da pata traseira do rato foi coletado 180 minutos após a administração subcutânea do mediador inflamatório ou o seu veículo (0,9% de NaCl). Estes tecidos foram pesados e homogeneizados na mesma proporção em peso/volume de uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,4 M de NaCl, 0,05% de Tween 20, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), 0,1 mM de fenil-metil-sulfonilo fluoreto, 0,1 mM cloreto de benzotonico, EDTA 10 mM, e 2 ng/mL de aprotinina (Sigma, EUA). As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 15 min a 4°C. Os sobrenadantes foram armazenados a -80°C para utilização posterior para avaliar os níveis de proteína de TNF-α, IL-1β, IL-6 e CINC-1 no tecido subcutâneo da pata posterior do rato. As citoquinas foram quantificadas pelos seguintes kits: TNF-α de rato /TNFSF1A (R&D Systems, catálogo número: DY510) (IL-1β de rato / IL-1F2 (R&D Systems, catálogo número: DY501), IL-6 de rato (R&D Systems, número de catálogo: DY506), e CINC-1 de rato, CXCLCINC-1/CINC-CINC-1 (R&D Systems, número de catálogo: DY5CINC-15). Todos os procedimentos seguiram as instruções do fabricante (R&D Systems) e todos os procedimentos foram repetidos duas vezes para garantir a precisão dos resultados.

4.11 Análise Estatística

Para determinar se houve diferenças significativas (p < 0,05) entre os grupos de tratamento, foi utilizado ANOVA one-way seguido de teste de Tukey ou t-teste não pareado. A análise estatística dos resultados foi realizada com o auxílio do programa Graph Pad Prism 4.0 e os resultados foram representados como a média

± erro padrão da média em grupos de 5 ratos para os estudos comportamentais e moleculares. A análise das curvas obtidas foi feita pelo teste de análise de variância ANOVA seguido de Teste Bonferroni para as comparações múltiplas.

5 RESULTADOS

5.1 - Efeito da talidomida (45 mg/kg) sobre a hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina

Sabe-se que a talidomida inibe a liberação de TNF-α, citocina chave para o desenvolvimento de hiperalgesia inflamatória. Corroborando com resultados anteriores (PARADA et al., 2003), a administração sistêmica de talidomida (45 mg/ Kg) preveniu o desenvolvimento da hiperalgesia induzida por carragenina (fig. 10).

0 10 20 30 40 50

*

Talid Veic

In

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a

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Figura 10 - Efeito da talidomida (45 mg/kg i.p.) ou veículo (1 mL) sobre a hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina. A talidomida (30 min. antes da Carragenina) preveniu a hiperalgesia mecânica induzida pela administração de carragenina (100 µg) na pata de ratos. ANOVA seguido pelo teste de Tukey (*p < 0,05).

5.2 Efeito da talidomida sobre os níveis de citocinas pró- inflamatórias: TNF-α, IL-1β, CINC-1 e IL–6

Tem sido sugerido que a liberação de TNF- induz a liberação de outras citocinas pro-inflamatórias que, por sua vez, induzem a liberação de mediadores inflamatórios hiperalgésicos finais, os quais diretamente sensibilizam os nociceptores.

Para verificar se o efeito anti-hiperalgésico da talidomida envolveu uma redução das citocinas pro-inflamatórias IL-6, IL-1β e CINC-1 em decorrência do bloqueio da síntese e liberação de TNF-, estas citocinas foram quantificadas nas patas de ratos tratadas com carragenina diante da ação sistêmica de talidomida, dexametasona ou veículo. Como demonstrado na figura 11 A, a administração sistêmica de talidomida (45 mg/kg) ou dexametasona (1 mg/kg), de fato bloqueou a liberação de TNF- no tecido subcutâneo tratado com carragenina quando comparado com o grupo controle tratado apenas com salina (p < 0.05; ANOVA-one way seguido do teste de Tuckey). Por outro lado, a dexametasona, mas não a talidomida, bloqueou as liberações de IL-6, CINC-1 e IL-1β nas patas tratadas com carragenina, quando comparadas ao grupo controle tratado apenas com salina (figura 11B, 11C e 11D; p < 0.05; ANOVA-one way seguido do teste de Tuckey). A administração sistêmica de talidomida apenas reduziu o nível de IL-1β, quando comparado com o grupo tratado com carragenina e veículo (figura 11B; p < 0.05; ANOVA-one way seguido do teste de Tuckey).

Figura 11 - Efeito da talidomida, dexametasona, salina ou veiculo (45 mg/kg, 1 mg/kg, 1 mL e 1 mL,

respectivamente, i.p. 30 min antes da Cg) sobre a liberação de TNF-α ,IL 1β, IL-6 e CINC-1 em patas tratadas com carragenina (100 g) ou salina (50 L). Os símbolos (*) significam diferentes dos demais grupos (p < 0,05; ANOVA-one way seguido por pós-teste de Tuckey.

5.3 Efeito do tratamento intratecal de ODN-Antisense contra TNFR1 ou TNFR2 sobre a hiperalgesia induzida por Carragenina

Como demonstrado nos experimentos anteriores, a administração sistêmica de talidomida preveniu o desenvolvimento da hiperalgesia embora não reduziu na mesma proporção os níveis das citocinas pro-inflamatórias IL-1, IL-6 e CINC-1. Portanto, para verificar a importância da ativação dos receptores TNFR1 e TNFR2 neuronais nos nociceptores do tecido periférico no desenvolvimento da hiperalgesia induzida por carragenina, ratos foram pré-tratados com oligodeoxinucleotídeo

A B C D 0 1000 2000 3000 4000 5000 sal Carragenina *

sal Talid Dexa Veic

* T N F - ( p g /m L ) 0 6000 12000 * sal Carragenina

sal Talid Dexa Veic

* IL -1  (p g /m L ) 0 2000 4000 6000 8000 10000 sal Carragenina

sal Talid Dexa Veic

* * * IL -6 ( p g /m L ) 0 2000 4000 6000 8000 10000 * sal Carragenina

sal Talid Dexa Veic

* * C IN C -1 ( p g /m L )

antisense (ODN-AS) ou mismatch (ODN-MM) contra os receptores TNFR1 ou TNFR2. Como demonstrado na figura 12, o tratamento com ODN-AS contra os receptores TNFR1 ou TNFR2, mas não com ODN-MM (30μg/10μL, 1 vez ao dia durante 4 dias) preveniu o desenvolvimento da hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina medida 3 e 6 horas após a sua administração. Após análises moleculares, foi demonstrado a diminuição da expressão dos receptores de TNFR1 nos gânglios da raiz dorsal (DRG) dos animais pré-tratados com ODN-AS, mas não com ODN-MM (Fig. 12C). Não foi possível demonstrar essa diminuição nos gânglios dos animais pré-tratados com ODN-AS contra o receptor TNFR2 através da técnica de Western Blot.

Figura 12 - Efeito do pré tratamento intratecal (30 g/10L por dia durante 4 dias) com ODN- antisense (AS) ou ODN-mismatch (MM) contra TNFR1 ou TNFR2 no desenvolvimento da hiperalgesia mecânica induzida por carragenina (100 µg/pata). Painel A: ODN-AS, mas não MM contra TNFR1 reduziu a hiperalgesia mecânica medida 1, 3, 6 e 24 horas após a administração de carragenina (Two-way ANOVA; F= 84.33; P < 0.05, seguido do teste Bonferroni) Painel B. ODN-AS, mas não MM contra TNFR2 reduziu a hiperalgesia mecânica medida 1, 3, 6 e 24 horas após a administração de carragenina (Two way ANOVA; F = 50.05; P<0.05, seguido do teste Bonferroni). Painel C: Diminuição da expressão dos receptores TNFR1 no DRG de animais pré-tratados com ODN-AS, mas não com o ODN-MM (30 g/10L por dia durante 4 dias). O simbolo (*) significa diferença entre os grupos.

A B

5.4 Ativação do TNFR1 ou TNFR2 neuronais aumenta a susceptibilidade do nociceptor à hiperalgesia mediada por PGE2

Como já demonstrado anteriormente, a liberação de TNF- no tecido subcutâneo não induz diretamente hiperalgesia, uma vez que a hiperalgesia induzida pela administração de TNF- é prevenida pelo tratamento com dexametasona (FERREIRA et al., 1997). Contudo, o experimento anterior demonstrou que o desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória depende da ativação dos receptores neuronais TNFR1 e TNFR2. Portanto, neste experimento verificamos se a ativação dos receptores TNFR1 e TNFR2 do nociceptor pelo TNF- é importante para a ação hiperalgésica da PGE2. Para isso uma dose sub-limiar de PGE2 (4 ng/pata) foi coadministrada com TNF- (0,8 pg/pata) na pata de ratos tratados com dexametasona (1 mg/Kg), cuja dose preveniu a hiperalgesia induzida pelo TNF- (fig. 13). Como mostra a figura 13A, a co-administração da dose sub-limiar de PGE2 com TNF- induziu hiperalgesia mecânica na mesma magnitude da hiperlagesia induzida por 100 ng de PGE2. Este dado demonstra que a administração de TNF- aumenta a susceptibilidade do nociceptor à ação hiperalgésica da PGE2. Para demonstrar que este aumento da susceptibilidade é mediado pelo receptor neuronal TNFR1 ou pelo TNFR2, ratos foram tratados com administração intratecal de ODN-AS ou ODN-MM contra estes receptores. Como mostra a figura 13B, o tratamento com ODN-AS contra o receptor TNFR1 mas não com ODN-MM preveniu a hiperalgesia induzida pela co-administração de dose sublimiar de PGE2 (4 ng) e TNF-α (0,8 pg/pata) em ratos tratados com dexametasona (1 mg/kg/mL). Como mostrado na figura 9C, resultados semelhantes foram observados na na hiperalgesia induzida pela co-administração de dose

sublimiar de PGE2 (4 ng) e TNF-α (0,8 pg/pata) em ratos tratados com dexametasona (1 mg/kg/mL) submetidos ao pré-tratamento com ODN-AS, mas não ODN-MM contra o receptor TNFR2.

0 5 10 15 20 PGE2 4 ng TNF 0,8 pg + DEXA PGE2 100 ng PGE2 4 ng Controle * * In te n s id a d e d e h ip e ra lg e s ia ( l im ia r d e re ti ra d a , g ) 0 5 10 15 20 MM TNFR2 AS TNFR2

*

In te n s id a d e d e h ip e ra lg e s ia ( l im ia r d e r e ti ra d a , g )

Figura 13 - Aumento da susceptibilidade do nociceptor à hiperalgesia mediada por PGE2. Co-administração de dose sub-limiar de PGE2 (4 ng / pata) e TNF- (0,8 pg/pata) em ratos tratados com dexametasona (1 mg / kg, i.p.) induziu hiperalgesia na mesma magnitude da hiperalgesia induzida por 100 ng de PGE2 (painel A). O tratamento com dexametasona (DEXA) preveniu a hiperalgesia induzida pela administração local de TNF- (painel A). O tratamento intratecal com ODN-Antisense contra TNFR1 (painel B) ou TNFR2 (painel C), mas não com seus respectivos ODN-Mismatch, preveniu a hiperalgesia induzida pela co-administração de PGE2 (4 ng / pata) e TNF- (0,8 pg / pata) em ratos tratados com dexametasona (p<0.05; ANOVA one-way seguido de pós teste de Tuckey). O simbolo (*) significa diferente dos demais grupos (p<0.05; ANOVA one-way seguido de pós teste de Tuckey no painel A e teste-t nos painéis B e C).

A _B C 0 5 10 15 20 MM TNFR1 AS TNFR1

*

In te n s id a d e d e h ip e ra lg e s ia ( l im ia r d e r e ti ra d a , g )