UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
SAMARA CAMAÇARI DE CARVALHO
“TERAPIA FARMACOLÓGICA DAS DISTROFINOPATIAS:
FIBROSE E REGENERAÇÃO MUSCULAR EM
CAMUNDONGOS mdxTRATADOS COM ÔMEGA-3”
CAMPINAS 2016
SAMARA CAMAÇARI DE CARVALHO
“TERAPIA FARMACOLÓGICA DAS DISTROFINOPATIAS:
FIBROSE E REGENERAÇÃO MUSCULAR EM
CAMUNDONGOS mdxTRATADOS COM ÔMEGA-3”
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Celular e Estrutural, na área de Anatomia.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Julia Marques
CAMPINAS 2016
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA, SAMARA CAMAÇARI DE CARVALHO E ORIENTADA PELA DRA. MARIA JULIA MARQUES.
Campinas, 29 de julhode 2016
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria Julia Marques Prof. Dr. César Renato Sartori Prof. Dr. Edmar Zanoteli
Profa. Dra. Elen Haruka Myabara
Profa. Dra. Tânia Aparecida Marchiori Oliveira Cardoso
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico e agradeço...
Aos meus pais, Osmar (in memoriam) e Iraci, pelo amor incondicional, pela confiança e apoio em minhas decisões e propulsão em minha vida. Aos meus irmãos
Túlio e Glauco pelo carinho, companheirismo e apoio! Ao meu sobrinho,Luiz Henrique, pela alegria que a sua Vida traz a minha!!!
Á Tia Celeste (in memoriam), a quem admiro o forte espírito, positivismo, autoconfiança e determinação; e principalmente por partilhar sua presença em nossas vidas. Serei sempre grata, pelas inúmeras situações (boas e “ruins”) em que sempre esteve presente e nos fortaleceu!!!
“Hoje” eu me dei conta que existe muito mais de vocês em mim do que eu supunha, e que talvez eu nunca consiga agradecer a vocês o suficiente. Amo-os incondicionalmente!!
Agradecimento especial...
À Profa. Dra. Maria Julia Marques, por ter aberto as portas desta Universidade; por ser exemplo de educadora; pelos seus seguros einestimáveis ensinamentos profissionais e de vida; pelo despertar de ideias; por todas as oportunidades dedesenvolvimento pessoal eintelectual, a mimdedicados; por conduzir meus passos na pós-graduação e zelar pelos próximos passos; por ter proporcionado uma das melhores experiências que tive até hoje (doutorado sanduíche); por todas as conversas; pelo convívio diário; por todo estímulo, paciência, compreensão, confiança e amizade! Obrigada, por tudo que aprendi, aprendo e espero aprender com a Senhora!
“O valor de um Homem não se mede pelo que ele possui ou pelo que ele sabe,mas sim pela maneira como compartilhao que tem e o que sabe.” Eternamente grata por me tornar um de seus frutos!
Thanks...
First, I would like to express my sincere gratitude to my advisor, Dr. AshokKumar for having received me as a member of his lab, for all attention, shared lessons and opportunities to learn new techniques.
I would like to personally thank my fellow labmates:Sajedah M. Hindi, Dr. Yuji
Ogura, Dr. Guangyan Xiong, Dr. Shuichi Sato, Dr. Marjan Tajrishi and Alex, for the
stimulating discussions, for have contributed immensely to my research, for all the fun we have had in the last year and for the personal time during my doctorate. Thank you for creating a great working environment.
Thank you Ms. Donna Bottorff and Ms. Dana Thomas(of ASNB office staff) for all attention, help and love! It’s so good to be in contact and received yours messagens!!
Thank You to the Kumar family: Savita Kumar, Aman Mann and Eira Mann!
Last, but certainly not least, special thanks to the Hindi family: Mrs Fatima Hindi, Sajedah, Samiha, Lubna, Balsam, Musa, Yousef, Mohammad. I thank you every day for all friendship and support… and for being part of my cherishing memories in Louisville.
“You will never be completely at home again. Because part of your heart always will be elsewhere. That is the price you pay for the richness of knowing
Special people in more than one place.” (Miriam Adeney)
Agradeço aos membros da banca...
Ao Prof. Dr. Cesar Renato Sartori,
Prof. Dr. Edmar Zanoteli,
Profa. Dra. Elen Haruka Miyabara,
Profa. Dra. Tânia A. M. Oliveira Cardoso,
Dr. André Luis Bombeiro
Prof. Dr. Carlos Alberto da Silva e
Profa Dra. Valéria Helena Alves Cagnon Quitete
por gentilmente aceitarem nosso convite para compor a banca deste trabalho e pelas valiosas sugestões que contribuiram para este estudo.
Agradeço...
Ao Prof. Dr. Humberto Santo Neto pela contribuição em minha formação profissional e pessoal e pelas valiosas sugestões durante toda minha formação na pós-graduação.
À Profa. Dra. Elaine MinateleProfa. Dra. Valéria Cagnon Quitetepor sempre e gentilmente abrirem as portas de seus laboratórios e por contribuirem em minha formação.
À todos os demaisdocentes do “Departamento de Anatomia” da UNICAMP pelo conhecimento compartilhado.
Aos meus amigos, frutos de bons momentos de bancada: Dra.Ana Paula Tiemi
Taniguti, Dra. Adriana Fogagnolo Maurício,Dra.Adriana Pertille, Dra.Cintia Yuri Matsumura, Dra. Drielen Moreira, Dr. Juliano Alves Pereira, Ms.Letícia Montagholi Apolinário, Dr. Rafael Machado, Dr. Renato Ferretti,por todo acolhimento e ensinamentos
durante a pós-graduação. Obrigada, por todos os momentos compartilhados e pela amizade sincera.
À Camila Saqueli, Jéssica S. Ferreira, Júlia M. Guitti, Marcos M. Júnior, Renato
Rissi e Stephanie Furlan, pelo apoio e torcida para a realização deste trabalho.
À Dra. Aline Macedo, Ms. Daniela Mizobuti, Elisa Rolfini, Dr. Fábio Montico,
Ms. Larissa Kido, Ms. Rafael Mancio, Ms. Túlio Hermes, Fernanda e Luís Rapucci,
Agradeço...
Á Profa Dra. Ana Carolina de Mattos Zeri, por nos apresentar o LnBio e a ressonância magnética nuclear. Obrigada, por todos os ensinamentos de física, muitas vezes de difícil compreensão (rsrsrsr), pela disponibilidade e alegria com que sempre nos recebeu e por todo o auxílio no desenrolar dos dados do metaboloma.
À Profa.Dra. Selma Maria Michelin Matheus por ser presente em minha vida acadêmica e pessoal. Por ter guiado meus primeiros passos científicos e pela amizade e carinho de mãe que tem por mim.
Aos demais docentes do Instituto de Ciências Biológicas daUNESP-Botucatu, local de início da minha jornada acadêmica, onde tive momentos de grande aprendizado intelectual e pessoal. Obrigada, pelo carinho e dedicação, e por fazerem parte da minha vida até os dias de hoje!
Aos meus queridos amigos:Carlos Henrique Camargo,Elisa Mari Kawamoto,
Mariana Almeida Barbosa eTassiani Nunes Yamashitapelo companheirismo, bons
momentos, apoio e amizade inestimável!!
À Maria Conceição Selke, Ingo Grinhard Selke, Elisabeth Gerda Selke e Marlene
Castanharo por todo carinho, zelo e apoio recebidos desde o primeiro dia em que os conheci.
Agradeço...
Aos Srs. Norivaldo Celestino e Marco Aurélio Ribeiro de Paula, Paulo Afonso
Bernardes, Paulo Francisco dos Santos,Toni Donizeti dos Santos e Walter Ferreira pela
prestatividade durante a pós-graduação.
Ao Dr. Maurício Sforça, por todas as lições e orientações em ressonância magnética nuclear, pela disponibilidadegratuita e paciência. Muito obrigada!
Ao Laboratório Nacional de Biociências (LnBio) por gentilmente abrir as portasde seus laboratórios e permitir a realização de parte deste trabalho!
À FAPESP (2012/15492-3) pelo apoio financeiro que permitiu a execução deste trabalho e pela autorização do doutorado sanduíche.
ÀCAPES (99999.003839/2014-01) pelo apoio financeiro para o desenvolvimento do doutorado sanduíche.
À FUNCAMP, CNPq pelo apoio financeiro ao nosso grupo de pesquisa.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural pela excelência na formação profissional de seus alunos.
À Sra. Lílian Alves Senne Panagio pela atenção, carinho, dedicação e auxílio durante todo o período da pós-graduação.
“O real não está na saída nem na
chegada: ele se dispõe para a gente é no
meio da travessia.”
RESUMO
A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é a mais grave das distrofinopatias e resulta da falta da distrofina nos músculos esquelético e cardíaco. A resposta inflamatória é exacerbada e parece contribuir para a progressão da doença levando à fibrose e dificultando a regeneração muscular. Macrófagos M2 auxiliam na regeneração muscular, entretanto podem ativar células miogênicas, levando a formação de tecido conjuntivo fibroso. No presente trabalho investigamos os efeitos do ômega-3 sobre a fibrose, inflamação,regeneração e metabólitos,no estágio inicial ( tratamento por 16 dias) e no estágio tardio da doença(tratamento por 5 meses) 5. Camundongos mdx (14 dias ou 3 meses de vida pós natal) receberam 300mg/Kg de ômega-3, via gavagem 3 vezes na semana durante 16 dias ou 5 meses. Camundongos mdx controles e camundongos C57BL/10 receberam óleo mineral via gavagem em mesmo volume e período. Verificamos que o ômega-3 previniu a perda de força muscular, diminuiu a mionecrose (redução da CK no plasma) e melhorou a regeneração (MyoD e área com fibras em regeneração) no coração (COR), diafragma (DIA) e quadríceps femoral (QDR). O ômega-3 reduziu os fatores inflamatórios TNF-α e NF-κB nos mdx tratados por 16 dias (COR, DIA e QDR) e 5 meses(DIA). Em todos os músculos e em ambos os períodos de tratamento houve predomínio dos M2 (demonstrado pelos níveis elevados de CD206, IL-10 e IL-13) sobre os macrófagos M1 (indicado pelos níveis de INF-γ, iNOS eIL-6). Os níveis do TGF-β1diminuíram no tratamento nos períodos de16 dias (DIA) e 5 meses (COR). A área de fibrose aumentou em todos os músculos, após o tratamento por 5 meses. Os metabólitosglutamato, glutamina, taurina, creatina, ascorbato e oxipurinol apresentaram alterações relacionadas com a progressão da doença, indicando serem bons marcadores biológicos e o tratamento com ômega-3 interferiu na maioria destes metabólitos. Apesar dos efeitos benéficos do ômega-3 sobre a força muscular,mionecrose, inflamação, regeneração e metabólitos, seu uso prolongado deve ser feito com cautela e estudos sobre a ação deste suplemento nas vias da fibrose precisam ser realizados.
ABSTRACT
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most severe dystrophinopathy and results from the lack of dystrophin in skeletal and cardiac muscles. The inflammatory response is exacerbated and contributes to the progression of the disease leading to fibrosis and difficulting muscle regeneration. M2 macrophages can activate myogenic cells and can promote fibrosis, in the long run. In the present study we investigated the effects of omega-3 on fibrosis, inflammation, regeneration and metabolites in the early (16 days of therapy) and later (5 months of therapy) stages of the disease. Mdx mice (14 days or 3 months of age) received 300mg/kg of omega-3 by gavage 3 times a week for 16 days or 5 months. Mdx and C57BL/10 (control) mice received mineral oil by gavage in the same volume and period. We verified that omega-3 improved muscular force, decreased myonecrosis (CK reduction in plasma) and improved regeneration (MyoD and area with regenerating fibers) in heart, diaphragm and quadriceps muscles. Omega-3 reduced the pro-inflammatory factors TNF-α and NF-κBafter16 days (in all dystrophic muscles) and after5 months (only in mdx diaphragm) of treatment. In all muscles and in both treatment periods there was a predominance of M2 (shown by high levels of CD206, IL-10 and IL -13) over the M1 (indicated by reduced levels of INF-γ, IL-6 and iNOS). The levels of TGF-β1 decreased in the short (diaphragm) and in the long (heart) termtherapies. There was a significant increase infibrosis area in all muscles studied after the 5-monththerapy. The metabolites glutamate, glutamine, taurine, creatine, ascorbato and oxypurinol showed changes related to disease progression and omega-3 therapy interfered in most of these metabolites. Overall, the present study indicates that, despite the beneficial effects of omega-3 in muscle force, myonecrosis, inflammation, regeneration and metabolites, 5 months therapy with omega-3 needs caution and further studies of omega-3 effects on fibrosis pathways and metabolism are necessary.
SUMÁRIO
1. Introdução
1.1. Distrofia Muscular de Duchenne... 019
1.2. Distrofina... 022 1.3. Terapia Genética... 1.4. Terapia Celular... 024 025 1.5. Terapia Farmacológica... ... 025 1.5.1. Ômega-3... 027 1.6. Metabolômica... 029 1.7. Modelos Experimentais da DMD... 031 1.7.1. Golden Retriever (GRMD)... 031 1.7.2. Beagle (CXMDJ)... 032 1.7.3. Felino (HFMD)... 032 1.7.4. Camundongo mdx... 033 2. Histopatologia do Camundongo mdx 2.1. Degeneração Muscular... 034 2.2. Resposta Inflamatória... 035 2.3. Regeneração Muscular... 036 2.4. Fibrose... 038 3. Objetivos... 044 Objetivo: Experimento 1 Objetivo: Experimento 2 (Doudorado Sanduíche) 4. Materiais e Métodos (Experimento 1) 4.1. Animais... 045
4.2. Protocolo Experimental... 045
4.3. Medida de Força... 047
4.4. Eutanásia... 047
4.5. Determinação da Creatina Quinase... 048
4.6. Coleta dos Músculos... 048
4.7. Preparação dos Músculos... 048
4.7.1. Hematoxilina e Eosina... 048
4.7.2 Tricrômico de Masson... 049
4.7.3. Imunomarcação dos Macrófagos M1 e M2... 049
4.7.4. Western blot... 050
4.9. Metabolômica: Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)... 051
5. Materiais e Médotos (Experimento 2) 5.1. Animais... ... 054
5.2. Protocolo Experimental... ... 054
5.2.1. Tratamento com ômega-3... 054
5.2.2. Genotipagem... ... 054
5.2.3. Indução da Regeneração Muscular... 055
5.2.4. Cultura de Mioblastos Primários... 056
5.2.5. Transplante de Mioblastos... 056
5.2.6. Eutanásia... ... 058
5.2.7. Seleção das Células Satélites e Macrófagos Ativos... ... 058
5.2.8. Isolamento de RNA e Quantificação por Real Time PCR (QRT-PCR)... 058
5.2.9. QRT-PCR – Sinalização Notch e Wnt... 059
6. Análise Estatística... 061
7. Resultados (Experimentos 1 e 2) 7.1. Ômega-3 não interferiu no ganho de peso dos mdx... 062
7.2. Ômega-3 preveniu a perda da força de tração dos mdx... 063
7.3. Ômega-3 reduziu a mionecrose ... 064
7.4. Ômega-3 diminuiu a inflamação e aumentou a regeneração nos músculos distróficos... 065
7.5. Ômega-3 reduziu a população dos macrófagos (M1) nos músculos distróficos... 076
7.6. Ômega-3 favoreceu o predomínio dos macrófagos M2 (regenerativos)... 080
7.7. Ômega-3 pode proporcionar um ambiente pró-fibrótico... 086
7.8. Ômega-3 alterou o perfil metabolômico dos músculos distróficos... 091
7.9. Ômega-3 melhorou o enxerto de mioblastos transplantados... 099
7.10. Ômega-3 ativou as células satélites e os macrófagos M2, enquanto a porcentagem de macrófagos M1 ativos foi reduzida... 100 7.11. Ômega-3 aumentou a expressão gênica de componentes da via notch e Wnt... 102
8. Discussão... ... 103
9. Conclusão... ... 123
10. Referências Bibliográficas... 124
Anexo I: Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UNICAMP)... 150
LISTA DE ABREVIATURAS
BSA – Albumina de soro bovino
CDG - Complexo distrofina-glicoproteínas CK – Creatina Quinase
COR – coração (músculo cardíaco) DABCO -1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano DIA – Músculo diafragma
DMD – Distrofia Muscular de Duchenne EPA –Eicosapentaenoic acid
Grb2 -growth factor receptor-bound 2 HE – Hematoxilina-eosina
IL –Interleucina
IFN-γ –Interferon gama iNOS –indusivel oxide nitric i.p. – injeção intraperitoneal
mdx –Murine dystrophin X-liked
MRF-4-Fibroblast Growth Factor
Receptor 4
MyoD -Myogenic Differentiation Myf-5 - Myogenic factor 5
NF-κB - nuclear fator kappa B nNOS – Óxido nítrico sintase neural NO -óxido nítrico
NC – Núcleo central
NP – Núcleo periférico PBS – Tampão fosfato salina PLS-DA - partial least squares discriminant analysis
PSA -principal component analysis PUFA – Ácido graxo poli-insaturado QDR – Músculo quadríceps femoral RMN – Ressonância Magnética Nuclear TNF-α – Tumor Necrosis Factor alpha TGF-β -Transforming growth factor beta VIP -Variable Importance in Projection
1. INTRODUÇÃO
Distrofinopatia é o termo utilizado para designar o grupo de doenças genéticas de caráter degenerativo e progressivo (Engelet al., 1994). Refere-se a doenças como a distrofia muscular de Becker (BMD) edistrofia muscular de Duchenne(DMD).
A BMDé uma variantemais branda daDMD, sendo a incidênciade aproximadamente1 em18.450homens eprevalência de 2,4por 100.000na população (Emery, 1991). Os primeiros sintomasgeralmente aparecementre 3 e21 anos de idade, comidade médiade inícioaos 11 anos. A BMDé caracterizada pelotarde-início dafraquezamuscular e os indivíduos afetadospermanecem independentes da cadeira de rodasemseus 20 anos de idade.Apesar doenvolvimentodo músculo esqueléticomais branda do que na DMD, a insuficiência cardíaca é a causa comumde morbidade (Cox & Kunkel,1997). A média de idadeno momento do diagnósticode cardiomiopatiaé de 14,6anos, semelhanteao deDMD(14,4 anos; Connuck etal,2008). A idade médiademorte éem meados dos40anos (Bushby,1999). Com amelhoria dastécnicas de diagnóstico, tem-sereconhecidoque o fimsuavedo espectroincluihomens cominício dos sintomasapós a idadede 30 anos quepermanecemdeambulantesaté mesmo emseus60 anos (Yazakietal, 1999).
Os pacientes com DMD exibem ausência daproteína distrofina, localizada nafacecitoplasmática do sarcolema e associada com glicoproteínas no chamado complexo distrofina-glicoproteínas(Hoffmanet al., 1987; Engel et al., 1994). A distrofinajuntamente com asglicoproteínas atua como estabilizadora mecânica do sarcolema durante a contração muscular (Petrofet al., 2002). A ausência da distrofina gera fraqueza muscular, a qual é principalmente proximal (Magriet al., 2011) e progride para complicações respiratóriase cardíacas, que são as causas demorte entre os pacientes desta distrofinopatia (Parkeretal, 2005).
1.1.Distrofia Muscular de Duchenne
A distrofia muscular de Duchenne (DMD), descrita em 1861, é a mais comum e mais grave distrofia muscular (Swash e Schwartz, 1998; Biggar, 2006). É uma doença ligada ao cromossomo X e herdada pelos indivíduos do sexo masculino, sendo que somente 30% dos casos originam-se de mutação não herdada (Tinsleyet al., 1994; Bobo et al., 2009).A anormalidade genética da DMD acomete 1 em cada 5000 meninos nascidos vivos (Hoffman et al, 1987; Mendell et al, 2012) e está associada ao tamanho e complexidade do gene da distrofina, que proporciona uma elevação na frequência de mutações de ponto, deleções ou
duplicações (Tinsleyet al., 1994). Isso resulta na leitura errada e/ou parada prematura da transcrição gênica e codificação anormal da distrofina, tornando-a instável e facilmente degradada por proteases endógenas (Seixas et al., 1997). A não expressão da distrofina resulta na ausência desta proteína nos músculos esqueléticos, lisos e cardíaco (Engelet al., 1994) e também em células da glia, ocasionando disfunção cognitiva (Hoffman et al., 1987),como os déficits de memória, visuo-espacial e verbal-auditivo (Wicksell et al., 2004).
A gravidade clínica das distrofinopatias depende do tipo de mutação apresentada. Quando há a manutenção do open reading-frame, a expressão da distrofina é semi funcional com a preservação dos domínios N- e C- terminal (Ciafaloni et al, 2009). Algumas partes da
rod-domain central pode ser truncado com um impacto mínimo sobre a função da proteína
(Nguyen et al, 2015). As mutações frameshift e a nonsense causam ausência na expressão de distrofina e um fenótipo DMD. As mutações in-frame levam a anormal ou reduzida expressão da distrofina no músculo, causando a distrofia muscular de Becker (BMD), que possui início mais tardio e progressão mais lenta que a DMD.
Apesar da maioria dos pacientes da DMD terem uma deleção (~ 68%) ou duplicação (~ 11%) de um ou mais exons, pequenas mutações também são observadas (~ 20% dos pacientes). Mas, estas deleções e duplicações podem ocorrer em qualquer lugar no gene, em sua maioria estão concentradas entre os exons 45-55 e 2-10, para as deleções e duplicações respectivamente (Ankala et al, 2012). Assim, existe uma grande variedade de mutações que geram a DMD (Aartsma-Rus et al, 2006; Ankala et al, 2012; Bladen et al, 2015), o que implica em considerar tais variedades para o desenvolvimento de novas terapias. Portanto, é essencial fornecer informações precisas para o aconselhamento genético em famílias distrofinopatias.
Pelas características particulares de cada mutação nota-se que as investigações moleculares são a base promissora para a terapeutica na tentativde de induzir a exclusão de exons e restauração da leitura - open reading-frame, permitindo que, teoricamente, haja conversão da DMD para o fenótipo DMB (Tuan-Pham et al, 2015; Muller &Grimm, 1986). Recentemente, um grande avaço no estudo da DMD, permitiu converter um quadro de DMD, onde não há expressão da proteína distrofina para a síntese funcional e normal desta proteína pela administração de ataluren (Haas et al, 2015). O ataluren é uma medicação que tem como alvo a maquinaria de tradução do ribossomo, permitindo a leitura através do stop codon criado pela mutação nonsense(Haas et al, 2015). Entretanto, está evolução no tratamento da DMD até o momento se restringe as mutações do tipo nonsense. Mas, como ja vimos às mutações que atingem o gene da DMD são diversas. Assim, para que novas descobertas como essa
possam ser realizadas é necessário que se possa distinguir cada tipo de mutação e então dar andamento no desenvolvimento de novas terapias.
Os primeiros sinais clínicos da DMD são evidentes no início da infância, entre 2 e 5 anos de idade (Engel et al., 1994), sendo o mais caracteristico a fraqueza muscular (Chakkalakalet al., 2005). A fraqueza gera quedas frequentes, dificuldades em correr, subir escadas, atraso do ato de sentar e do ficar em pé de forma independente (Chakkalakalet al., 2005). Com a progressão da doença, a fraqueza muscular se agrava e ocorre a dependência de cadeira de rodas para a locomoçãodestes pacientes, geralmente por volta dos 13 anos de idade (Parkeretal, 2005).Além da fraqueza muscular,outros marcos desta miopatia são: atraso motor (em 42% dos casos), problemas de marcha (30%), atraso na caminhada (20%), dificuldades de aprendizagem (5%) e problemas de fala (3%) (Wicksell et al., 2004). Apesar dos avanços nas terapias para a DMD, poucosindivíduos afetadossobrevivemalém da terceiradécada de vida(Parkeretal, 2005).
A análise histológica dos músculos esqueléticos de pacientes portadores de DMDrevela fibras em degeneração e presença de infiltrado inflamatório com macrófagos e linfócitos. A resposta inflamatória é exacerbada (Wehlinget al., 2001; Porter et al., 2003; Hodgetts et al., 2006) e a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α (Tumor
Necrosis Factor alpha), IFN-γ (Interferon gama) e IL-1β (interleucina1β), pelas células do
sistema imunológico contribuem para intensificar a necrose nos músculos distróficos (Chen et al., 2000). Além das fibras em degeneração e infiltrado inflamatório, observam-se pequenas fibras imaturas de núcleo central, refletindo a regeneração muscular pelas células satélites (McDouallet al., 1990; Schmalbruch, 2006).Porém, com a progressão da doença, a capacidade de regeneração diminui e as fibras musculares são substituídas por tecido fibroaso (Engel et al., 1994; Seixas et al., 1997; Grounds et al., 2004; Holterman e Rudnicki, 2005), sem função contrátil, o que justifica a fraqueza muscular observada nos pacientesda DMD.
A fibrose nos músculos distróficos (Engelet al.,1994) é principalmente sinalizada pelos elevados níveis de TGF-β (Transforming Growth Factor beta), principal fator responsável pela síntese das proteínas de matriz extracelular e inibição da produção de proteases, as quais degradam as proteínas da matriz (Wynn, 2008).
Assim, embora a causa primária da DMD seja a ausência ou expressão de forma não funcional da distrofina (Engel, 1994), a inflamação (Wehling et al., 2001; Porter et al., 2003; Hodgetts et al., 2006), a limitação no processo regenerativo (McDouall et al., 1990; Schmalbruch, 2006) e a fibrose (Engel et al., 1994; Seixas et al., 1997; Grounds et al., 2004;
Holterman e Rudnicki, 2005)são fatores secundários que influenciam negativamente na progressão da doença.
1.2. Distrofina
A distrofina, proteína ausente nos pacientes com DMD, é um membro da família das espectrinas, com peso molecular de 427kDa(Engel et al., 1994; Hoffmanet al., 1987), que conecta o citoesqueleto da fibra muscular à matriz extracelular (Ervasti e Campbell, 1993). Em músculos esqueléticos normais localiza-se na face citoplasmática do sarcolema e se associa com glicoproteínas formando o complexo distrofina-glicoproteínas (CDG); Hoffmanet al., 1987.
Além da distrofina, fazem partedo CDG (Figura 1)as distroglicanas, as sintrofinas, as sarcoglicanas e as distrobrevinas(Rando, 2001; Biggaret al., 2002; Lapidos et al., 2004; Marques, 2004). Admite-se que o CDG atue como estabilizador mecânico do sarcolema durante a contração muscular (Petrofet al., 2002).
As moléculas de sinalização associadas ao CDG incluem a calmodulina, o receptor-ligante 2do fator de crescimento (growthfactor receptor-bound 2 – Grb2), que participa das vias de transdução de sinais e está conectado à β-distroglicana e a óxido nítrico sintase(nitric
oxide synthase- NOS). A NOS interage com vários componentes do complexo,
principalmente com a sintrofina e leva à produção de óxido nítrico (NO), o qual modula vias de sinalização intracelular e provoca lesão muscular (Rando, 2001; Marques, 2004).
A β-distroglicana está envolvida na ligação da matriz extracelular com o citoesqueleto intracelular (Ervasti e Campbell, 1993), por ligar-se a distrofina e a α-distroglicana. A distrofina interage com o citoesqueleto de actina e a α-distroglicana, que se encontra no espaço extracelular se liga à laminina-2 (Ervasti e Campbell, 1993).
A laminina compreende um grupo de glicoproteínas de elevado peso molecular (400-900 KDa), abundantes na membrana basal (Miner, 2008). A proteína laminina madura tem a forma de T, formando uma cadeia α, uma β e outra γ, que se associam para formar uma molécula heterodimérica (Miner, 2008).
Figura 1. Organização molecular do complexo distrofina-glicoproteínas no sarcolema, incluindo os
componentes integrais do complexo (distrofina, complexo distroglicano, complexo sarcoglicano, -distrobrevina e sintrofinas), a ligação com a matriz extracelular (laminina), parte da ligação intracelular (F-actina) e molécula de sinalização ligada ao complexo (sintase de oxido nítrico neuronal – nNOS). Laboratório de Biologia Estrutural do Sistema Neuromuscular, 2012
As sarcoglicanas são proteínas transmembrânicas pertencentes ao CDG, e que servem de ancoragem para os componentes do CDG por meio de múltiplas interações (Sandona e Betto, 2009). As sarcoglicanas do músculo esquelético se ligam à α-distroglicana (Ozawa et al., 2005) e são compostas por quatro subunidades de proteínas transmembrânicas (α, β, γ e δ-sarcoglicanas), que interagem e funcionam como uma proteína única.
As sintrofinas são proteínas intracelulares que, nas células musculares, existem sob a forma das subunidades α1 e β1. Ambas se ligam à distrofina(Straub e Campbell, 1997; Joneset al., 2003). A α1-sintrofina liga-se também à enzima óxido nítrico sintase neuronal (neuronal nitric oxide synthase- nNOS).
A nNOS corresponde à isoforma do NOS encontrada em maior quantidade no músculo esquelético, embora pequenas quantidades das isoformas endotelial (endothelialnitric oxide
synthase- eNOS) e induzível (induciblenitric oxide synthase- iNOS) também sejam
encontradas. Nas fibras musculares, a nNOS é encontrada próximo ao sarcolema, ligada à α1-sintrofina ou livre no citosol (Straub e Campbell, 1997; Jones et al., 2003).
A distrobrevina é uma proteína intracelular que se liga à distrofina. Esta proteína interage com a nNOS e com os canais de cálcio voltagem-dependentes (Durbeej e Campbell, 2002).
Como a distrofina tem a forma de um dímero antiparalelo, que se liga aα-actina e interage com a α2-laminina e α-distroglicana, via β-distroglicana (Engelet al., 1994) direta ou indiretamente, a distrofina liga-se também com glicoproteínas da membrana, como as sarcoglicanas (alfa, beta e gama-SG), distroglicana (beta-DG) e sintrofinas (Spencer e Mellgren, 2002; Bogdanovichet al., 2004). Assim, na ausência da distrofina, o CDG é desorganizado tornando as fibras musculares sujeitas a lesões do sarcolema, principalmente durante os ciclos de contração e relaxamento, permitindo o influxo elevado de íons cálcio, resultando em mionecrose (Groundset al., 2005). Outros mecanismos podem estar relacionados àmionecrose, tais como a sinalização celular alterada do óxido nítrico que é liberado em níveis citotóxicos ocasionando degeneração muscular (Rando, 2001), aumento do estresse oxidativo e participação de fatores inflamatórios liberados por neutrófilos, macrófagos e citocinas, como o TNF-α (Whitehead et al, 2006).
Assim,visando restaurar e/ou minimizar os efeitos da ausência da distrofina, os últimos avanços científicos envolvem pesquisas em terapias genéticas e celulares (Gregorevic e Chamberlain 2003; Markert et al., 2009; Konieczny et al, 2013).
1.3.Terapia Genética
As terapias genéticas, como as terapias baseadas em adeno-associatedvirus vector (AAV) e peptide-conjugatedphosphorodiamidatemorpholinooligomers (PPMO); (Goyenvalle, 2011; Koniecznyet al, 2013), são consideradas as intervenções moleculares mais promissoras para o tratamento da DMD (Faircloughet al., 2013; Koo et al., 2013).Entretanto, existem vários desafios para o sucesso destas terapias, tais como o número restrito de oligonucleotídeosantisense disponíveis para mutações específicas, a necessidade de melhorar a entrega da proteína ou de oligonucleotídeos em células alvo, o aumento da atividade sistêmica de exonkipping, o monitoramento de sua toxicidade e de possíveis reações imunológicas (Van Deutekomet al, 2007; Faircloughet al., 2013; Koo et al., 2013).
Recentemente, os avanços nos estudos permitiram converter um quadro de DMD, onde não há expressão da proteína distrofina,para um quadro em que há síntese funcional e normal
desta proteína, pela administração de ataluren(Haas et al, 2015). O ataluren é uma medicação que tem como alvo a maquinaria de tradução do ribossomo, permitindo a leitura através do
stop codon criado pela mutação nonsense (Haas et al, 2015). Entretanto, aevolução no
tratamento da DMD até o momento se restringe às mutações do tipo nonsense.
1.4 Terapia Celular
A terapia celular, distribuição de células miogénicas que determinam o reparo muscular, tem sido considerada como um potencial a terapia para a Distrofia muscular de Duchenne (DMD) durante muitos anos, desde Partridge et al. (1978). O que a torna uma terapia potencial para o tratamento de doenças genéticas que afetam a estabilidade ou funcionamento das miofibras (Bentzinger et al, 2012;. Wang e Rudnicki, 2012; Wang et al., 2013) é a capacidade de corrigir defeitos genéticos através da introdução do genoma das células transplantadas para as fibras musculares sinciciais por meio de fusão (Wang e Rudnicki, de 2012).
No entanto, estudos ainda precisam ser feitos para aprimorar a entrega destas células. A recuperação funcional de fibras musculares através da fusão de mioblastos doadores com mioblastos de acolhimento (Partridgeet al,1978) tem ocorrido, mas lamentavelmente, pouca ou nenhuma restauração da distrofina foi observada nos músculos injetados (Gussoni et al, 1992; Huard et al, 1992; Karpati et al, 1993; Tremblay et al, 1993a; Tremblay et al, 1993b; Mendell et al, 1995; Morandi et al, 1995; Miller et al, 1997). Os problemas no sucesso dos transplantes foram atribuídos a diversos fatores, incluindo a morte celular rápida da maioria das células (dentro de algumas horas após o transplante),a limitada capacidade migratória das células transplantadase a falta de supressão imunitária,o que conduz a rejeição do enxerto (Negroniet al, 2011;Bentzingeret al., 2012).
Uma vez identificadas às falhas no sucesso dessa terapia, estratégias para a entrega de células vem sendo elaboradas e incluem melhoria da imunossupressão, injeção de maior quantidade de células, mas em volumes menores para prevenir isquêmica e necrose, e múltiplas injeções para ajudar na migração (Skuket al, 2006; Skuk et al, 2007; Skuk & Tremblay, 2011). Utilizando-se destas estratégias, a fase I de ensaios clínicos para DMD promoveu um grande númerode mioblastos alogênicos com injeções múltiplas(protocolo de injeção de alta densidade) para o bíceps braquial,sob imunossupressão contínua por tacrolimus(FK506), para evitar a rejeição. A expressão a longo prazo de distrofina derivada do doador foi detectado em 27,5% dos fibras em um mês após a injeção e, em 34,5% de fibras,depois de 18 meses (Skuk et al, 2006; Skuk et al, 2007). Apesar de promissor, ainda
não solucionou todas as falhas do transplante, pois só se conseguiu observar tais feitos em um paciente. Adicionalmente, nos locais de injeção do transplante, aimunossupressão érequeridaa longo prazo e o protocolo é aplicável somente aos grupos musculares pequenos e facilmenteacessíveis (Vilquin et al, 2011).
Dessa forma concluiu-se que embora as células satélites sejam absolutamente
necessárias para a regeneração muscular (Lepperet al, 2011; Murphy et al, 2011;Sambasivan
et al, 2011; McCarthy et al, 2011),elas não funcionam sozinhas. A regeneração é um processo de múltiplos passos que exigema remoção dos detritos, além da regulação, proliferação e diferenciaçãodas células satélites (Arnold et al, 2007;Chazaud et al, 2009). Destacandoa importância de resposta inflamatóriafoi demonstrado em muitos estudos, que a redução de monócitos/macrófagos no músculo lesionado causa atraso na regeneração e persistência deadipócitos (Arnold et al, 2007;Chazaud et al, 2009; V et al, 2007; Tidball & Wehling-Henricks, 2007;Lescaudron et al, 1999). Além disso, a completa depleção resultou em nenhuma resposta regenerativa(Chazaud et al, 2009; Lescaudron et al, 1999).
Considerando que a fibrose reduz as funções contrácteis do musculo esquelético e que impede a intervenção terapêutica e que a resposta inflamatória pode agravar o quadro da DMD ao interferir na regeneração e fibrose. Propomos investigar o potencial terapêutico do ômega-3, sobre a proporção dos macrófagos M1 e M2, bem como na regeneração, fibrose e metabólitos nos músculos esqueléticos de camundongos mdx, modelo experimental mais utilizado para estudos da DMD.
1.5. Terapia Farmacológica
A única terapia amplamente utilizada e reconhecida para todos os tipos de mutações envolvendo a DMD é a terapia farmacológica com corticóides (Bonifati et al., 2000, Manzuret al., 2008; Griggs et al. 2013).Os corticóides prednisona e deflazacorte são os fármacos de escolha para tratamento dos portadores de DMD (Bonifati et al., 2000;Manzuret al., 2008, Griggs et al., 2013). Embora não restaurem a expressão da distrofina, estes fármacos retardam a progressão da doença (Griggs et al. 2013), melhorando a função motora (Bonifati et al., 2000). Porém, a necessidade do uso contínuo de corticoides ocasiona efeitos colaterais, comoganho de peso, perda de massa óssea, imunosupressão, involução da glândula adrenal, retardo da puberdade e edema (Manzuret al., 2008).
Apesar das corticoterapias diminuírem o acometimento muscular e melhorarem os prejuízos funcionais (Bonifati et al., 2000; Porter et al., 2002), seus efeitos colaterais (Manzuret al., 2008) tornamsua eficácia relativa. Quanto aos estudos das terapias genéticas e
celulares, apesar de serem potencialmente úteis, ainda não são suficientes para a aplicação clínica (Fairclough et al., 2013; Koo et al., 2013). Neste contexto, a busca por outros fármacos ou suplementos sãode extrema importância. Nosso grupo de pesquisa vem investigando o óleo de peixe (ômega-3) como umagente benéficoem potencial para tratamento das distrofinopatias(Machado et al., 2013; FogagnoloMaurício et al., 2013; Apolinário et al, 2015; Fogagnolo Maurício et al.,2016).
1.5.1 Ômega-3
Os ácidos pesados poliinsaturados (PUFAs) apresentam duas famílias principais: o ômega-6 e o ômega-3 (Calder, 2008). O ômega-6, mais especificamente os ácidos linoléico e linolênico são ácidos pesados essenciais para a produção do ácido araquidônico, o qual é metabolizado e origina os eicosanóides (prostaglandinas e prostaciclinas) que são mediadores e reguladores da inflamação (Figura 2).Os ácidos ômega-3 mais comuns incluem o ácido alfa-linolênico (ALA), ácido docosahexanóico (DHA) e o ácido eicosapentaenóico (EPA).
O ALA pode ser atrativo para a intervenção nutricional (Holy et al, 2011). Entretanto,existem relatos que este ácido é menos eficiente do que o DHA e EPA na prevenção de doenças cardiovasculares (Lee et al, 2008). Recentemente, pesquisas demonstraram que o ácido linolênico não substituiu os efeitos positivos do DHA no córtex cerebral (Arsenault et al, 2011; Zhu et al, 2010). O EPA, DHA e ALA são incorporados na membrana da célula e depois de absorvidos modulam diversas funções celulares, tais como a expressão de genes (Surette, 2008).
Figura 2. Metabolização dos ácidosaracdônico, eicosapentaenóico e docosahexaenóico pela
ação das enzimas dessaturase e elongase na via dos ácidos pesados (ômega-6 e 3).Síntese dos eicosanóides pró-inflamatórios e anti-inflamatóriospor meio da atividade enzimática da cicloxegenase.
O consumo de ômega-3 produzefeitos benéficos na prevenção e terapia de várias doenças, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes, doenças neurodegenerativas, câncer (De Caterina, 2011; Osterud & Elvevoll, 2011; Wardhana et al, 2011, Bazan et al, 2011; van der Meij et al, 2011; Davidson et al, 2011), doenças inflamatórias, incluindo artrite reumatóide, doenças inflamatórias do intestino, asma (Calder, 2008; Calder, 2009, Calder, 2011), arterioesclerose, lupus sistêmico eritomatoso, psoríase e artrite reumatóide (Stamopoulos, 2002). Os efeitos benéficos do ômega-3 estão atribuídos à alta concentração do ácido poliinsaturado (PUFA), particularmente o EPA e DHA (Loet al, 1999).
A ingestão de fontes ricas em ácidos graxos n-3 poliinsaturados resulta na diminuição de ácido araquidônico na membrana plasmática. O EPA, ao competir com o ácido araquidônico, inibe a produção dos eicosanóides pró-inflamatórios e, conseqüentemente, o processo inflamatório e promove redução ou inibição da produção das citocinas pró-inflamatórias, atuando, portanto, nas vias das prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos(Babcock et al., 2000; Babcocket al., 2002). Adicionalmente, o ômega-3 pode ser associado com o papel inibidor diretona produção excessiva de citocinas pró-inflamatórias (Calder, 2008, Calder, 2011). Um dos mecanismos anti-inflamatório do ômega-3 está relacionada à IkB (a subunidade inibidora de Complexo de NFkB) (Zhao et al, 2004). O ômega-3 mantém a IkB ligada ao NF-kB, previnindo a translocação do NF-kB para o núcleo, portanto, impedindo a transcrição de citocinas pró-inflamatória (Babcock et al., 2000). Desta forma, ocorre redução na síntese de TNF-α (Babcocket al., 2000).
Estudos anteriores em nosso laboratório comprovaram que o EPA, um dos componentes do óleo de peixe, foi de fato eficiente na redução do TNF-α (Machado etal., 2011) e das citocinas anti-inflamatórias (de Carvalho et al., 2013), melhorando a regeneração muscular. Portanto, sabendo que a resposta inflamatória é exacerbada nos pacientes distróficos(Wehlinget al., 2001; Porter et al., 2003; Hodgettset al., 2006) e que o uso do ômega-3 como antiinflamatório já é estabelecido para o tratamento de outras patologias humanas (Stamopoulos, 2002; Bouzianas et al., 2013; Davidson et al., 2013; Shinto et al, 2014), sugerimos que o óleo de peixe, possa ser potencialmente útil como terapia adicional aos corticóides para as distrofias musculares.
1.6. Metabolômica
A metabolômica é uma ferramenta que vem sendo utilizada para prover diretrizes terapêuticas para doenças como a DMD (Griffin 2005;Martins-Bach et al, 2015) e pode auxiliar na avaliação da resposta à terapia. A metabolômica tem por objetivo identificar e quantificar metabólitos celulares por meio de métodos estatísticos e de análise multivariada para a interpretação de dados (Roessner & Bowne, 2009). O estudo da metabôlomica fornece grande quantidade de informações, o que leva a acreditar que muitas áreas biológicas, antes inacessíveis ou negligenciadas, venham a ser descobertas ou elucidadas (Kell, 2004). Os metabólitos, moléculas relativamente pequenas, com poucos quilodaltons de massa, são considerados pela metabolômica como produtos intermediários ou finais do metabolismo celular (Giegeret al., 2008). Estes produtos transmitem sinais da arquitetura genética e do meio intra e extra-celular, permitindo a avaliação do estado fisiológico e funcional de uma
célula ou de um organismo (Gieger et al., 2008). Entre as áreas de investigação que o estudo metabolômico propicia, destaca-se a metabolômica clínica, a qual é o foco deste trabalho.
A metabolômica clínica tem como objetivo compreender a etiologia de doenças, a fisiologia de condições patológicas e da normalidade e buscar marcadores metabólicos que possam auxiliar a tomada de decisões nos mais variados estágios clínicos (Ng et al, 2010; Vinayavekhin et al, 2010). A busca por biomarcadores, por sua vez, visa auxiliar diagnósticos, dar embasamento para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e avaliar a resposta à terapia de doenças específicas (Lindon et al, 2007; Nordström & Lewensohn, 2010). Uma das técnicas utilizada para a identificação de biomarcadores pode ser a Ressonância Magnética Nuclear (RMN); (Rosset al, 2007).
O RMN é detecta à propriedade que o núcleo de alguns átomos possui de absorver e reemitir radiação eletromagnética (“ressonar”) numa freqüência específica quando submetido a um campo magnético (Ross et al, 2007). A frequência dessa radiação varia com à intensidade do campo magnético, além de depender de propriedades atômicas particulares. A RMN é uma ferramenta importante e possível de ser aplicada em amostras sensíveis ou em organismos vivos e permite a preservação de amostras escassas ou raras (Rosset al, 2007). Essas propriedades se devem a não utilização de radiação ionizante e ao fato de não provocarem qualquer tipo de reação química (Rosset al, 2007).
Além destas vantagens, o perfil metabolômico encontrato na amostra de interesse conta com a possibilidade de comparação com sinais de RMN de moléculas individuais, previamente medidos em condições fisiológicas e adicionados a uma biblioteca de metabólitos (Aytaç et al, 2006; Dennison et al, 2006). Os dados espectrais dos metabólitos são mais comumente encontrados em biofluidos (tais como aminoácidos, carboidratos, lipídeos, etc.), muitos estão disponíveis na literatura científica e fazem parte de bancos de dados integrados a programas para processamento e análise de dados de RMN (Chenomx NMR Suite, Canada; KnowItAll, Bio-Rad, EUA). Neste estudo, utilizamos o banco de dados do Chenomx NMR Suite para a quantificação dos metabólitos nos músculos do camundongo
1.7.Modelos Experimentais da DMD
Para os estudos dos mecanismos fisiopatológicos e terapêuticos da DMD utilizam-se modelos experimentais tais como, os cães GRMD (goldenretriever muscular dystrophy) e CXMD (beaglecanine-based X-linked muscular dystroph), o felino HFMD (hypertrophicfeline muscular dystrophy) e o camundongoC57BL/10-Dmdmdx (murine
dystrophin X-linked - mdx); (Mulleretal., 2001; Sasaokaet al., 2003; Nakamura e Takeda,
2011). A escolha do modelo experimental para o teste pré-clínico de novos tratamentos leva em consideração vários aspectos, conforme resumido na Figura 3.
Figura 3.Aspectos avaliados em modelos experimentais para testes pré-clinicos (Willmannet
al., 2009).
1.7.1. Golden Retriever (GRMD)
No Golden Retriever (GRMD), a doença resulta de uma única mudança de base do par 30 de consenso local do intron6, levando ao salto do exon 7 e alteração do quadro de leitura no exon 8, a qual cria uma parada prematura (Sharp et al., 1992). Nos GRMD a doença progride rapidamente, semelhante a DMD e é fatal (Ambrósio et al., 2008). A regeneração muscular é incompleta resultando na fraqueza progressiva e anormalidades da marcha entre 6-9 semanas de idade. Os cães gravemente afetados têm dificuldades para subir escadas. Por - A base genética da doença deve ser a mesma para ambos, seres humanos emodelo animal;
- O modelo deve reiterar características principais da doença humana.Para a DMD, incluem: fraqueza muscular, insuficiência respiratória,cardiomiopatia, alterações histológicas no músculo esquelético(por exemplo, fibras com núcleo central);
- Os animais devem ser comercialmente disponíveis, de fácil manuseio e sustentáveis nas condições de habitação padrão do laboratório;
- A progressão da doença deve ser bem caracterizada e disponível na literatura científica, para permitir que a análise de resultados seja precisa;
- O fenótipo deve ser reproduzível ao longo de geraçõespara permitir a utilização de parâmetros padrão eassegurar a comparação dos resultados;
volta do sexto mês de idade há desenvolvimento da cifose (Ambrósio et al., 2008). Adicionalmente, aos 12 meses de vida observamdisfunções da faringe e esôfago e a capacidade respiratória começa a ser reduzida (Kornegayet al., 2003). A cardiomiopatia é muito mais evidente no GoldenRetriever do que em outros animais modelos para a DMD (Moiseet al., 1991).
Apesar dessas semelhanças com o paciente da DMD, o grau de variabilidade dos GRMD na gravidade da doença entre os próprios irmãos de mesma ninhada é elevado,embora todos eles tenham a mesma mutação genética (Willmannet al., 2009). Assim, é necessário um número elevado de animais para fundamentar quaisquer conclusões sobre a eficácia do tratamento (Willmannet al., 2009).Outras desvantagens são o elevado custo de produção, a necessidade de uma instalação de veterinária e grande quantidade de materiais e alimentos necessários para tratar os animais de grande porte (Willmannet al., 2009).
1.7.2. Beagle (CXMDJ)
Os cães da raça beagle foram acasalados com um golden retriever afetado para obter uma raça de menor porte (CXMDJ) (Shimatsuet al., 2003), o que é vantajoso para algumas intervenções terapêuticas. Assim GRMD e CXMDJ apresentam fenótipos muito semelhantes.
O músculo diafragma dos CXMDJ é afetado logo após o nascimento, ao passo que anormalidades nos músculos dos membros tornam-se evidentes apenas depois de 2 meses de idade (Shimatsu et al., 2005). O envolvimento cardíaco nestes cães é mais brando e tem uma progressão mais lenta do que o descrito para os cães GRMD. Embora o modelo CXMDJ não seja amplamente utilizado, portanto, não é caracterizado em detalhe, parece ser uma alternativa atraente para a substituição do goldenretriever em estudos pré-clínicos. Além disso, o beagle é a espécie de escolha para estudos de toxicologia com drogas em desenvolvimento. Entretanto, embora o beagle carregue o defeito genético encontrado nos pacientes com DMD, ainda não são bem caracterizados, portantoa literatura disponível é limitada (Willmannet al, 2009).
1.7.3. Felino(HFMD)
Os felinos HFMD carecem de cerca de 200 kb do gene da distrofina (Winand et al., 1994). A hipertrofia muscular do modelo animal felino é caracterizada pelo aumento dos níveis de creatina quinase no sangue entre 4-5 semanas de idade, embora o comprometimento muscular torna-se aparente apenas entre 10-14 semanas de idade (Winandet al., 1994).
A análise histológica revelou presença de focos de necrose e de regeneração, mas sem sinais de fibrose (Winandet al., 1994). A cardiomiopatia nestes animais é rara, sendo o coração hipertrófico aos 9 meses de idade (Gaschen et al., 1999). O felino, embora geneticamente semelhante aos pacientes da DMD, tem patologia mais branda enão é bem caracterizado na literatura (Willmann et al, 2009).
1.7.4. Camundongo mdx
O camundongo mdx foi descoberto ao acaso em 1984 (Bulfieldet al., 1984), durante a realização de estudos sobre alterações nos glóbulos vermelhos em uma linhagem mutante de camundongos C57BL/10-ScSn. Os mdx apresentam elevado nível plasmático de creatina quinase (CK), sugerindo degeneração muscular (Hoffmanet al., 1987), bem como alteração genética na sequência de nucleotídeos da banda HqBpa do cromossomo X, correspondente ao lócus p21.2 do cromossomo X humano, o que resulta em ausência da distrofina nos músculos esquelético, cardíaco e liso (Bulfieldet al., 1984).Nestes camundongos, a análise histológica de músculos esqueléticos revela a existência de degeneração e regeneração muscular semelhantes ao que ocorre em pacientes da DMD (Bulfield et al., 1984). Entretanto, diferenciam do humano por apresentarem ciclos de degeneração e regeneração (Engelet al., 1994) e apenas os animais idosos demonstram perda funcional (Pastoret e Sebille, 1995; Deconink e Dan, 2007).
O camundongo mdx é bem caracterizado na literatura, sendo que o número elevado de trabalhos publicados resultam em um bom entendimento da patologia (Willmannet al, 2009). A reprodutibilidade do fenótipo, a disponibilidade comercial e os custos relativamente baixos de manutenção (Tanabe et al., 1986; Hamer et al., 2002; Sasaoka et al., 2003)são vantagens para a utilização como modelo experimental. Além disso, tem sido amplamente utilizado para demonstrar a eficácia de tratamentos, incluindo fármacos ou suplementos alimentares,bem como a correção de genes e as abordagens de substituição celular (Willmannet al, 2009). Portanto, o camundongo mdxé um modelo experimental que abrange os requisitos apresentados na Figura 3 e por isso é o modelo experimental de escolha do nosso grupo de pesquisa.
2. Histopatologia do Camundongo mdx
Nos camundongos mdx, os ciclos de degeneração e regeneração ocorrem durante grande parte da vida do animal. Apenas os animais idosos demonstram perda funcional, que ocorre devido à exaustão das células satélites e consequentemente diminuição da capacidade regenerativa do tecido muscular (Pastoret e Sebille, 1995; Deconink e Dan, 2007).Com o passar dos anos, os repetidos ciclos de degeneração/regeneração, aos quais os músculos são submetidos,além de provocarem a exaustão das células satélites levam ao acúmulo progressivo de tecido conjuntivo fibroadiposo (Engelet al., 1994), que não tem função contrátil. Quanto à inflamação, os mdx apresentam intenso infiltrado inflamatório nas áreas de mionecrose semelhante ao observado nos pacientes da DMD (Liet al., 2009; Pasternak et al., 1995).
Nomdx, a degeneração das fibras musculares se inicia por volta dos 20 dias de vida pós-natal, seguida por regeneração muscular. Por volta dos 30 dias, os músculos esqueléticos apresentam-se com até 60% das fibras com núcleo periférico (Marqueset al., 2008; Machado et al., 2011). Entre 2 e 3meses, mais de 50% das fibras musculares encontram-se em processo de regeneração, com núcleo central. Com 4 meses de idade, a incidência de fibras necróticas é reduzida (Tanabe et al., 1986), estando praticamente todas as fibras musculares com núcleo central, indicativo de regeneração (Tanabeet al., 1986; Pastoret e Sebille, 1995; Briguet et al., 2004). Aos6 meses de idade, alguns músculos esqueléticos estão quase completamente regenerados (80-90%), restando poucas áreas em degeneração (Pastoret e Sebille, 1995). Com 9 meses observa-se completa regeneração muscular, com fibras de diâmetro heterogêneo e depósito de tecido conjuntivo fibroso no perimísio (Briguet et al., 2004).Com 20 meses de vida, a capacidade de regeneração muscular decresce devido a diminuição gradual da quantidade e capacidade de proliferação das células satélites (Luz et al., 2002). Os animais começam a apresentar características patológicas semelhantes às observadas em humanos, como fraqueza motora progressiva e perda de fibras musculares, que são substituídas por tecido conjuntivo fibroso (Lefaucheuret al., 1999).
Dependendo do músculo estudado, observam-se diferenças na evolução e na intensidade das lesões musculares (Pastoret e Sebille, 1995; Radley e Grounds, 2006; Marqueset al., 2008).
O diafragma sofre intensa degeneração e apresenta histopatologia semelhante a dos pacientes distróficos (Stedmanet al., 1991). Por outro lado, os músculos intrínsecos da laringe não apresentam mionecrose, sendo protegidos da falta da distrofina(Marqueset al., 2007), tal como os músculos extraoculares (Baker et al., 2006; Marques et al., 2007). O músculo
cardíaco do mdx é afetado ao redor dos 7 meses de idade (Quinlanet al., 2004; Taniguti et al., 2011). Já o músculo sóleo, quando comparado ao diafragma e gastrocnêmio, apresenta reduzida área de inflamação (Porteret al., 2003; Bani et al., 2008). No músculo quadríceps observa-se pico inflamatório ao redor de 1 mês de idade, demonstrado pela presença de macrófagos (Villalta et al., 2009; de Carvalho et al., 2013). Desta forma, observa-se que os músculos esqueléticos respondem diferentemente à ausência da distrofina, o que pode ter correlação com o tipo de fibra, com a idade do animal (Baniet al., 2008), com a variação no metabolismo de colágeno, ao apresentarem diferenças na expressão de TGF-β (Gosselin et al., 2007),ou com a intensidade da resposta inflamatória (Wehling et al., 2001; Porter et al., 2003; Hodgetts et al., 2006) ou alterações nos níveis de canais de cálcio (Whitehead et al., 2006; Matsumura et al., 2011).
2.1. Degeneração Muscular
Admite-se quea degeneração do músculo distrófico se deva a instabilidade mecânica do sarcolema (Chakkalakalet al., 2005; Ervasti, 2007) e a alteração no funcionamento dos canais de cálcio da membrana (Whitehead et al., 2006; Matsumura et al., 2011).
A instabilidade do sarcolema ocorre pela ausência da distrofina, que ocasiona aumento na formação de micro-rupturas, as quais ocorrem pela força contrátil do sarcômero durante os ciclos de contração e relaxamento (Groundset al., 2005). Essas rupturas na membrana plasmática podem ser observadas pela perda de conteúdo intracelular da fibra muscular para o meio extracelular, como por exemplo, da proteína creatina quinase (CK); Straubet al., 1997. Também pela ausência da distrofina, há alteração no funcionamento dos canais de cálcio. O mau funcionamento destes canais permite o influxo de íons cálcio descontroladamente, o que provoca sobrecarga das mitocôndrias, com consequente redução da síntese de ATP, ativação de proteases endógenas cálcio-dependentes e ativação de fosfolipases A2(Whiteheadet al.,
2006). As fosfolipases A2são enzimas que digerem os fosfolipídeos da membrana o que
aumenta as áreas de descontinuidade do sarcolema, gerando aumento do influxo de íons cálcio para o meio intracelular (Whiteheadet al., 2006) e,portanto, mionecrose.
Adicionalmente, contribuem para a progressão da doença: a resposta inflamatória, que é exacerbada nos músculos distróficos (Wehling et al., 2001; Porter et al., 2003; Hodgetts et al., 2006), além da fibrose (Sime e O´Reilly, 2001; Azouz et al., 2004; Vidal et al., 2008; Wehling-Henricks et al., 2010).
2.2. Resposta Inflamatória
A resposta inflamatória ocorre com a invasão das células imunes, macrófagos, linfócitos-T citotóxicos, células-T helper e neutrófilos no tecido muscular lesado, logo após a morte das fibras musculares, com a finalidade de reparação (Prisk e Huard, 2003). A proporção destes diferentes tipos celulares parece influenciar significativamente agravidade da doença (Spenceretal., 1997; Spencer et al., 2001; Wehling et al., 2001; Tidball, 2005; Hodgetts et al., 2006. Villalta et al., 2009).
Citocinas pró-inflamatórias, proteases, fatores quimiotáticos e fatores de crescimento são liberados pelas fibras musculares em degeneração (Bondesenet al., 2006). As citocinas pró-inflamatórias e os fatores quimiotáticos estimulam a migração de células inflamatórias, principalmente neutrófilos e macrófagos, para o local da lesão (Tidball, 2005).Os neutrófilos e macrófagos liberam proteases que degradam os fragmentos celulares e os fagocitam. As proteases liberadas por estas células podem provocar danos ao tecido muscular íntegro que circunda a lesão e assim aumentar a área lesada, gerando aumento da resposta inflamatória local (Tidball, 2005).
Figura 4. População de macrófagos M1 e M2. Macrófagos expostos a IFN-γ (interferon gama) e/ou TNF-α (Tumor necrosisfactoralpha)expressão proteínas relacionadas com a
resposta imune Th1, como o iNOS (induciblenitric oxide synthase). Os M1 liberam interleucinas1β (IL-1β), 6 (IL-6) e TNF-α levando a inflamação e degeneração muscular. Macrófagos expostos as IL-4, IL-10 e/ou IL-13 expressão proteínas relacionadas com a resposta imune Th2, como o CD206. Os M2 liberam as IL-10, IL-13 e o TGF-β (Transforminggrowthfactor beta) levando a regeneração muscular e fibrose.
Os macrófagos estão presentes em populações distintas, M1 e M2, os quais influenciam respectivamente a degeneração e a regeneração da fibra muscular distrófica (Villalta et al., 2009; Figura 4. Macrófagos M1 são citotóxicos, pró-inflamatórios e participam da resposta imune Th1; macrófagos M2 promovem regeneração muscular, participando da resposta imune Th2 (Villalta et al., 2009
Os macrófagos M1 (Figura 4) são ativados pela via do Interferon-γ (IFN-γ) (Lagrota-Candidoet al., 2002) e provocam lesão muscular in vivo e in vitro pela produção de óxido nítrico (NO) em níveis citotóxicos através da indução da síntese de NO (Villalta et al., 2009). O NO pode aumentar o dano ao tecido (Shiet al., 2002).Depois que os macrófagos M1 atingem seu pico de concentração, provocando dano e degeneração muscular, eles passam a expressar outras proteínas que os caracterizam como macrófagos tipo 2 (M2), que atenuam a resposta inflamatória e promovem o reparo do tecido (Wehling-Henricks et al., 2010).
Os macrófagos M2 são fenotipicamente divididos em três subcategorias, M2a, M2b e M2c, que refletem especializações funcionais e moleculares. Os macrófagos M2a são ativados por IL-4 e IL-13 e promovem o restabelecimento e reparação do tecido; os M2b são ativados por complexos imunes ou pelo receptor Toll-like e os macrófagos M2c são ativados por IL-10. Os macrófagos M2a e M2c estão presentes na regeneração muscular e expressam a proteína CD206 (M2a e M2c) e a proteína CD163 (M2c); (Villaltaet al., 2009). Porém, a atividade por tempo prolongado da população de macrófagos M2, nos músculos esqueléticos e cardíaco do camundongo mdx,parece favorecer a ativação de fibroblastos e produção de colágeno, o que pode agravar a patologia ao promover fibrose (Sime e O´Reilly, 2001; Azouz et al., 2004; Vidal etal., 2008; Wehling-Henricks et al., 2010).
As populações de macrófagos M1 e M2 recebem atenção nas pesquisas atuais, já que a proporção destas células podem influenciar, respectivamentepela lesão ou reparo dos músculos esqueléticos (Villaltaet al., 2009; Hindi et al, 2013), além do possível papel na formação de fibrose (Sime e O´Reilly, 2001; Azouz et al., 2004; Vidal etal., 2008; Wehling-Henricks et al., 2010).
2.3. Regeneração Muscular
O músculo é um tecido normalmente estável, mas quando lesado entra no processo de regeneração que ocorre para reparar ou substituir a fibra muscular danificada (Moss e Leblond, 1971; Neve, 1978). A capacidade de um tecido tão complexo como o músculo esquelético adulto para regeneraréatribuído à célula satélite (Studitsky, 1964; Carlson, 1986; Mauro, 1961).
As células satélites são definidas anatomicamente, pela sua posiçãoentre o sarcolema e a lâmina basal das fibras musculares(Mauro, 1961). Estas célulasestão mitoticamente em repousoaté que sejam ativadas para o crescimento ou reparo. Ao receber sinais de ativação, as células satélites rapidamente proliferam para produzir um pool de mioblastos que se fundem uns com os outros para formar novas miofibras e/ou com fibras danificadas para repará-las (Zammitet al, 2004). Uma pequena minoria não se diferencia, mas,em vez disso, mantém-se em estado de repouso para garantirum pool de célula-tronco (Zammitet al, 2004). Vários milhares de mionúcleos podem ser gerados a partir de um pequeno número de células satélite transplantadas, por exemplo (Collinset al, 2005). Quando transplantadas, estas células podem ocuparo nicho de outras células satélite e participar de futuros ciclos de regeneração,
indicando auto-renovação e confirmandoo seu estado de células-tronco (Collinset al, 2005). O
nicho das células satélite é localizado entre o miofibra e a sua lâmina basal e para que seja funcional é necessária à presença da célula de satélite (Morrison & Spradling, 2008).
Em patologias como a distrofia muscular de Duchenne (DMD), as células satélites ativadas pela lesão muscular entram em exaustão devido acrônicadegeneração e regeneração (Morgan& Zammit, 2010). Na DMD, as fibras musculares sofrem necrose devido à deficiência de distrofina e embora, as células satélites reparem as fibras musculares danificadas, a nova fibra formada é susceptível a degeneração. Portanto, ocorrem ciclos de regeneração-degeneração até que a regeneração não consegueacompanhar a degeneração muscular e músculo é substituído por tecido conjuntivo fibroso/adiposo (Emery et al, 1990). Assim, afunção das células satélites é de extrema importância clínica e o de transplante de células derivadas de doadores normais é uma proposta atraente para proporcionar um tratamento a longo prazo de perturbaçõesdo sistema hematopoiético, fígado, osso, pele e muscular esquelético (Boldrin et al, 2007; Chandaet al., 2010; Korbling et al, 2011; Russo et al, 2011).
O processo de reparo/regeneração envolve tipicamente 2 estágios distintos: a fase regenerativa, onde as células lesadas são substituídas por células de mesmo tipo, não deixando nenhuma evidência duradoura de dano; e a fase conhecida como fibroplasia, onde o tecido
conjuntivo fibroso substitui o tecido parenquimal normal (Wynn, 2007), ou seja, formação de fibrose.
Antes de compreendermos as fases do processo regenerativo na DMD, vamos abordar como ocorre o reparo do músculo normal. Em animais experimentais e em humanos sadios, após a lesão as células inflamatórias removem as fibras musculares mortas e as reparada ou substituí por novo tecido através da ação das células satélites (Mann et al., 2011). Assim, no músculo normal durante a fase inicial da lesão, a migração e ativação dos leucócitos, macrófagos e neutrófilos, eliminam os restos do tecido, como células mortas e qualquer organismo invasor (Wynn, 2007). Estas células produzem citocinas e quimiocinas, as quais amplificam a resposta de cicatrização (Wynn, 2007). Esses fatores também são mitogênicos e quimioatrativos para células epiteliais, as quais cercam a lesão formando novos vasos sanguíneos que migram em direção ao centro da lesão (Wynn, 2007). Subsequentemente, as células T tornam-se ativas e secretam citocinas pró-fibróticas assim como IL-13 e TGF-β1 (Porter et al., 2002), as quais são ativadas respectivamente pelos macrófagos e fibroblastos (Wynn, 2003). Em seguida, as células satélites agem e ocorre a substituição das fibras lesadas (Mannet al, 2011; Wynn, 2007), finalizando o processo de regeneração.
Já nas doenças humanas crônicas, como na DMD e muitas outras distrofias, as fibras geradas após o reparo são também inclinadas para a degeneração, porque retém o defeito genético, o que leva em uma maior facilidade de serem lesionadas. Assim, acarretam em constantes ciclos de degeneração e regeneração, associados com a inflamação crônica (Porter et al., 2002). Adicionalmente, lembramos que as células satélites, responsáveis pelo reparo muscular, em músculos distróficos são levadas a exaustão e consequentemente há diminuição da capacidade regenerativa do tecido muscular (Pastoret e Sebille, 1995; Deconink e Dan, 2007). Além disso, na DMD, o reparo causa acúmulo excessivo dos componentes da matriz extracelular como ácido hialurônico, fibronectina, prostaglandinas e colágeno intersticial, os quais contribuem para a formação da fibrose permanente (Wynn, 2007). Normalmente, o excesso desses componentes produzidos a fim de reparar o tecido é digerido por enzimas (metaloproteinases).
As metaloproteinases alteram padrões de expressão enzimáticos no fenótipo distrófico. Por exemplo, o aumento na atividade da MMP-1, a qual limita a fibrose, principalmente por degradar colágeno I e III, foi observado em músculos distróficos durante a remodelação da matriz extracelular (Zanotti et a, 2011). Alterações nos níveis de atividade da MMP-1 e MMP-7 favorecem um fenótipo fibrótico e foram encontrados em biópsias de pacientes da DMD (Zanotti et al, 2010). A abolição da MMP-9 reduz a fibrose por meio da diminuição dos
