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GUILHERME HENRIQUE COSTA OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DO PAPEL DO MARCADOR DE SUPERFÍCIE CD166 NA
DIFERENCIAÇÃO OSTEOBLÁSTICA/CEMENTOBLÁSTICA DE
CÉLULAS MESENQUIMAIS INDIFERENCIADAS DO LIGAMENTO
PERIODONTAL DE HUMANOS
Piracicaba 2015
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Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Odontologia De Piracicaba
GUILHERME HENRIQUE COSTA OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DO PAPEL DO MARCADOR DE SUPERFÍCIE CD166 NA
DIFERENCIAÇÃO OSTEOBLÁSTICA/CEMENTOBLÁSTICA DE
CÉLULAS MESENQUIMAIS INDIFERENCIADAS DO LIGAMENTO
PERIODONTAL DE HUMANOS
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Clínica Odontológica, na área de Periodontia.
Orientadora: Profa. Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida por Guilherme Henrique Costa Oliveira e orientada pela Profª. Drª. Karina Gonzales Silvério Ruiz.
_________________________ Assinatura da Orientadora
Piracicaba 2015
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vii Resumo
Células mesenquimais isoladas do ligamento periodontal (PDLSCs) de dentes humanos mostraram ser multipotentes e possuem a capacidade de se diferenciar em adipócitos osteoblastos in vitro. Além disso, possuem a capacidade de formar tecido semelhante ao cemento e ao ligamento periodontal quando transplantadas para animais imunossuprimidos. Por outro lado foi mostrado na literatura uma grande heterogeneidade destas linhagens de células e muito tem sido feito na tentativa de isolar grupos com fenótipos mais favoráveis a diferenciação em tecido mineralizado. A literatura aponta que existe uma modulação na expressão do marcador de superfície CD166 durante a diferenciação osteoblástica e a partir destes achados levanta-se a hipótese de sua participação neste processo. Em acréscimo, células positivas para este marcador mostraram alta capacidade de diferenciar-se em fenótipo osteoblástico. Deste modo, este estudo tem como objetivo avaliar se um grupo de células enriquecido para o marcador CD166 através de separação magnética (PDL/CD166+) apresenta maior potencial de diferenciação osteoblástica/cementoblástica quando comparado ao pool de células não separadas (PDL) e ao grupo de células que não foram retidas na coluna magnética (PDL/CD166-). Este estudo ainda se propõe a avaliar se o marcador de superfície CD166 é regulado no processo de diferenciação osteoblástica. Após a separação magnética de três populações celulares, os grupos PDL/CD166+ foram
submetidos a citometria de fluxo para que fosse comprovado a alta expressão de CD166. Em seguida os três grupos, PDL, PDL/CD166+ e PDL/CD166- das três populações, foram
submetidos aos ensaio de Alizarina para avaliar a capacidade formação de nódulos minerais in vitro, foram ainda caracterizados por real-time PCR para avaliação da expressão de genes relacionados ao fenótipo osteoblástico (fator de transcrição relacionado a Runt2 -Runx-2; a fosfatase alcalina – ALP – e a osteocalcina – OCN). Nos grupos PDL e PDL/CD166+ também foi avaliado a expressão de CD166 por qPCR e citometria de fluxo. Os grupos enriquecidos apresentaram uma expressão média de 91,5% (±4,3%) de CD166. Apenas um grupo PDL/CD166- de uma população não apresentou depósitos minerais in vitro e foi identificado diferença estatisticamente significante entre os grupos PDL/CD166+ e PDL/CD166- (p<0,05). Quanto a expressão dos marcadores biológicos do tecido ósseo, foi identificado uma tendência a aumento da expressão destes marcadores quando as células
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foram cultivadas sob indução e ao longo do tempo de cultura. Os grupos cultivados em meio osteogênico apresentaram maior expressão de CD166 por PCRq e também foi identificado que o grupo PDL/CD166+ mostrou uma expressão significativamente maior
que o PDL, ambos sob indução (p<0,05). Por citometria de fluxo, foi identificado um acréscimo na expressão de CD166 no terceiro dia de diferenciação nas células PDL/CD166+ e foi estatisticamente significativo comparado ao meio padrão (p<0,05). Ao longo do tempo de cultivo sob indução, a expressão deste marcador foi diminuída. Através dos resultados deste estudo é possível concluir que o grupo enriquecido na expressão de CD166 apresenta um alto potencial de formação de nódulos minerais in vitro. Além disso, foi notado que os três grupos apresentam uma tendência a maior expressão de Runx-2, ALP e OCN quando cultivados em meio osteogênico e que a grande heterogeneidade destas três populações dificulta a identificação de diferenças significativas tanto na análise intergrupo como intragrupo e compromete a identificação de um subgrupo com fenótipo mais favorável a diferenciação osteoblástica. A expressão gênica de CD166 é aumentada sob indução e ao longo do tempo de cultura e por citometria de fluxo observa-se que as células cultivadas em OM tendem a reduzir a expressão deste marcador.
Palavras-chave: células-tronco; células-tronco mesenquimais; ligamento periodontal; regeneração.
ix Abstract
Mesenchymal stem cells from periodontal ligament (PDLSCs) isolated from human teeth were shown to be multipotent and have the capacity to differentiate into adipocytes and osteoblasts in vitro. Moreover, they have the ability to form cement and periodontal ligament-like tissues when transplanted into immunosuppressed animals. On the other hand, it has been shown in literature a great heterogeneity of these cell lines and much has been done in the attempt to isolate groups with a phenotype more prone to differentiate into mineralized tissues. The literature suggests that there is a modulation of the CD166 surface marker expression during osteoblast differentiation and from these findings it is hypothesized of its participation in this process. In addition, cells positive for this marker have shown strong ability to differentiate into osteoblastic phenotype. Thus, this study aims to assess whether an enriched cell group for the CD166 marker (PDL/CD166+) has greater potential for osteoblastic/cementoblastic differentiation when compared to the not separated cell pool (PDL) and cell group which are not enriched (PDL/CD166-). Then, the three groups PDL, PDL/CD166+ and PDL/CD166- from three populations were submitted to Alizarin red-based assay to evaluate the ability of mineral nodule formation in vitro, groups were further characterized by qPCR for the evaluation of the expression of genes related to the osteoblastic phenotype (transcription factor related to Runt-2 -Runx-2; alkaline phosphatase - ALP - and osteocalcin - OCN). In the PDL and PDL/CD166+ groups the
CD166 expression was also assessed by qPCR and flow cytometry. Enriched groups showed an average expression of 91.5% (± 4.3%) of CD166. Only a PDL/CD166- group from one population showed no mineral deposits in vitro and it was identified statistically significant difference between the groups PDL/CD166+ and PDL/CD166- (p <0.05). Regarding the expression of bone tissue biomarkers, it was noted a tendency to increased expression of these markers when cultured under osteogenic induction and along time in culture. Groups cultured in osteogenic medium showed higher expression of CD166 by qPCR and it was also identified that the PDL/CD166+ group showed a significantly higher expression than the PDL group, both under osteogenic induction (p <0.05). By flow cytometry, it was noticed an increase in CD166 expression on the third day of differentiation in PDL/CD166+ cells and it was statistically significant compared to the
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standard medium (p <0.05). Along time in culture, the expression of this marker was decreased. Through the results of this study it is possible to conclude that the group enriched in CD166 expression has a high potential to form mineral nodules in vitro. In addition, it was noted that the three groups have a tendency to increased Runx-2, ALP and OCN expression when cultured in osteogenic medium and the great heterogeneity of these three populations difficult to identify significant differences both intra and inter-group analysis what may jeopardize the identification of a subgroup with a phenotype more prone to osteoblastic differentiation. Gene expression for CD166 is increased under induction e through culture time and by flow cytometry it is observed that cells cultured in OM tend to reduce the expression of this marker.
xi Sumário
Dedicatória...xiii
Agradecimentos Especiais...xv
Agradecimentos...xvii
Lista de Abreviatura e Siglas...xxi
Epígrafe………xxiii
1.Introdução………..1
2.Revisão de literatura……….3
3.Proposição………11
4.Material e métodos………..12
4.1 Isolamento das PDLSCs de terceiros molares de humanos………..12
4.2 Separação magnética para o marcador de superfície CD166………..12
4.3 Caracterização das populações de células por citometria de fluxo………..13
4.4 Ensaio de mineralização para avaliação do potencial de formação de nódulos minerais in vitro………....14
4.5 Expressão dos marcadores biológicos Runx-2, ALP, OCN, CD166………..15
4.6 Extração de RNA……….…15
4.7 Síntese de DNA complementar………16
4.8 Reações de real-time PCR………...16
4.9 Avaliação da expressão dos marcadores de superfície por citometria de fluxo…….17
4.10 Análise estatística...18
5. Resultados……….…19
5.1 Isolamento da população enriquecida em CD166 por separação magnética…….…19
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5.3 Ensaio de mineralização para avaliação do potencial de formação de nódulos
minerais in vitro...22
5.4 Avaliação da expressão dos genes relacionados ao fenótipo osteoblástico(Runx-2, ALP e OCN)...24
5.5 Modulação da expressão do gene CD166 durante o processo de diferenciação osteoblástica...29
5.6 Expressão dos marcadores de superfície por citometria de fluxo………31
6. Discussão………34
7. Conclusão………….………..39
xiii Dedicatória
Dedico este trabalho ao meu bom Deus, pois por Ele eu cheguei até aqui e através de Sua graça e bondade sempre tive tudo que precisei.
Palavras não são suficientes para agradecer, apenas peço que nunca me deixe esquecer que tudo que tenho, tudo que sou e o que vier a ser, vem de Ti Senhor.
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Agradecimentos Especiais
Ao meu pai, Júlio Verne Carvalho de Oliveira, por ter sido meu pai e minha mãe nesta vida. Por muitas vezes trocar a sua própria felicidade pela minha. Por ser um exemplo de caráter, dedicação ao trabalho e nunca ter medido esforços para que meus sonhos fossem realizados. Pai, essa conquista é tão minha quanto sua. Obrigado por tudo!
Às minhas avós Luzia Borges e Eny Alves, que sempre comemoraram comigo cada conquista e torceram muito pelo meu sucesso. Sou muito privilegiado por tê-las em minha vida e me perdoem por roubar um pedacinho da alegria de vocês estando longe da famíliahá tanto tempo. É por uma boa causa. Amo as senhoras.
Aos meus irmãos Gustavo Hernane Oliveira e Júlio César Oliveira agradeço por serem companheiros, amigos e incentivadores da minha jornada acadêmica.
À Profª. Drª. Karina Gonzáles Silvério Ruiz, minha orientadora neste mestrado. Agradeço por ter acreditado em mim e me dado a oportunidade de cursar a pós-graduação. Obrigado pela paciência com as minhas muitas limitações e por me incentivar a ser melhor. Ser seu aluno é um grande privilégio por toda sua paciência, serenidade, competência e inteligência. A senhora é certamente um exemplo a ser seguido como profissional e como ser humano.
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Agradecimentos
À Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do seu Magnífico Reitor, Prof. Dr. José Tadeu Jorge.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do seu Diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques, e do Diretor Associado Prof. Dr. Francisco Haiter Neto.
À Coordenadora dos Cursos de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, Profª. Drª. Cinthia Pereira Machado Tabchoury.
À Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Clínica Odontológica da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, Profª. Drª. Karina Gonzales Silvério Ruiz.
Aos professores da Área de Periodontia da FOP-UNICAMP, Dr. Francisco Humberto Nociti Junior, Dr. Antônio Wilson Sallum, Dr. Enilson Antônio Sallum e Dr. Márcio Zaffalon Casati, por terem contribuído com meu crescimento profissional e na formação como docente e pesquisador.
À pós-doutoranda Bruna Amorim, por ser um exemplo de ser humano e de dedicação à pesquisa. Obrigado por ter me recebido no laboratório e pela paciência em ensinar os principais conceitos e condutas. Muito deste trabalho devo a você. Obrigado!
Às queridas funcionárias do Departamento de Prótese e Periodontia Regina Caetano, Mariana Lazarim e Eliete Marin, por serem tão solícitas, pessoas tão doces e dispostas a colaborar.
Às professoras Drª. Thaisângela Rodrigues e Drª. Denise Carleto Andia por terem aceito ao convite em participar da minha banca de defesa e pela disposição em contribuir com o meu trabalho de mestrado.
Aos professores da minha banca de qualificação Drª. Cristine Salmon, Drª Flávia Mariano e Dr. Valentim Barão, por terem aceito ao convite e por todas as considerações e sugestões realizadas. Vocês certamente contribuíram para o enriquecimento deste trabalho.
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Ao Prof. Dr. Valentim Barão, mestre nesta instituição, com quem tenho o privilégio em ter construído uma grande amizade, companheiro de treinos, dietas e que sempre me proporciona bons momentos. Barão, obrigado por sua amizade e companheirismo.
À Profª. Drª. Denise Carleto Andia por ser tão amigável, solícita, competente e doce. Trabalhar com você no desenvolvimento de nossos projetos é um grande privilégio.
Aos meus colegas de pós-graduação da área de Periodontia da FOP-UNICAMP Ana Lívia Fileto, Ana Regina Moreira, Isabela França, João Paulo Sangiorgio, Lucas Queiroz, Mabelle Monteiro, Manuela Rocha, Marcela Barbosa, Maria Alice Palma, Tiago Taiete e Tiago Tarbes, pelo companheirismo e pelos bons momentos. Agradeço em especial às colegas Mayra Albiero e Miki Saito, por toda a ajuda no laboratório, pela paciência e pelo tempo gasto auxiliando em meus experimentos. Muito obrigado à vocês duas!
Às queridas amigas Camila Camarinha, Mércia Cunha e Viviene Barbosa, também da área de Periodontia da FOP-UNICAMP. Muito obrigado pela amizade sincera, pelas boas risadas, conselhos, motivação e por saber que posso contar com vocês no que precisar.
Às amigas Larissa Soares e Karla Vasconcelos, por serem amigas para todos os momentos, pelas visitas desde os tempos de Bauru e por todo incentivo para que eu alcançasse meus objetivos.
Às amigas Fernanda Piras, Mayara Viandelli e Juliana Gomes, agradeço por todos os momentos bons e ruins que passamos juntos. Por todas as risadas, choros e por estarem ao meu lado apesar da distância.
A todos os colegas do laboratório de Prótese Parcial Removível. Em especial à Andrea Araújo, Ana Paula Martins, Antônio Pedro Ricomini, Bruna Alfenas, Camila Heitor, Cindy Dodo, Cláudia Brilhante, Edmara Bergamo, Fernando Rigolin, Germana Camargos, Giselle Ribeiro, Giancarlo Torre, Indira Cavalcanti, Kelly Machado, Marco Aurélio Carvalho, Marcele Pimentel, Martinna Bertolini, Paula
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Furlan, Priscilla Lazari, Raissa Machado e Vitor Muñoz. Obrigado pelo ótimo convívio, pelas boas risadas e pelo cafezinho depois do almoço.
Às colegas de pós-graduação das áreas de Dentística e Endodontia, Isabel Ferreira, Marília Zeczowski e Érika Clavijo, agradeço pela amizade
À amiga Stefania Possamai, por me acompanhar em toda minha jornada dentro da Periodontia, por ser uma grande incentivadora e motivadora. Obrigado pela sua amizade, pela troca de ideias e experiências.
Ao amigo Eduardo Muncinelli, companheiro de leitura e escrita de artigos. Um grande amigo que Bauru me deu de presente. Mesmo de longe me incentivou e contribuiu para que hoje eu estivesse aqui.
Aos meus tios Letícia Oliveira, Márcio Alves, Geovani Alves, Ednamar Costa (Mara) e Marcília Costa, por sempre acreditarem em mim e se alegrarem com minhas conquistas.
À Eliane Caixêta, que me viu crescer e sempre torceu para que alcançasse os meus objetivos. Obrigado por tudo que já contribuiu na minha formação como ser humano.
À querida Profª. Drª Rejane Faria Ribeiro-Rotta, da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás, minha primeira orientadora e que tanto contribuiu para que hoje eu estivesse aqui. A senhora é um exemplo de dedicação à vida acadêmica e certamente me inspirou a seguir este caminho. Muito obrigado!
À pós-doutoranda Luciane Martins, por sempre ter me ajudado quando precisei e pelo bom convívio no laboratório.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela bolsa de estudos.
xxi Lista de Abreviatura e Siglas
ALCAM – Molécula de Adesão Celular Ativada por Leucócito (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule)
ALP – Fosfatase Alcalina (Alkalin Phosphatase)
CD – Grupo de Diferenciação (Cluster of Differentiation) FBS – Soro Fetal Bovino (Fetal Bovine Serum)
GAPDH – Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase (Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)
MSC – Células Mesenquimais Indiferenciadas (Mesenquimal Stem Cells) OCT-4 – Proteína Octamérica (Octameric protein – 4)
OM – Meio osteogênico (meio de cultura padrão suplementado com 50 µg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de β-glicerolfosfato e 10-5M de dexametasona)
PBS – Solução Fosfato Salina (Phosphate Bufered- Saline)
PCRq – Reação de Cadeia Polimerase em Tempo Real (Real Time Polymerase Chain Reaction)
PDLSC – Células Mesenquimais Indiferenciadas do Ligamento Periodontal (Periodontal Ligament Stem Cells)
RUNX2 – Fator de Transcrição Relacionado a Runt 2 (RuntRelated Transcriptor Factor -2)
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‘Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o decidir.’
1 1. Introdução
A periodontite é uma das doenças infecciosas mais comuns, está associada à destruição do tecido periodontal e é causada diretamente pela presença de um biofilme periodontopatogênico. As bactérias que desencadeiam este processo são responsáveis pela ativação da resposta inflamatória e dos osteoclastos, levando a perda de inserção e reabsorção óssea (Izumi et al., 2011; Jung et al., 2012). O tratamento periodontal convencional geralmente não é capaz de promover a regeneração dos tecidos perdidos pelo progresso da doença. Recentemente, diversos estudos tem investigado o uso da engenharia tecidual na tentativa de aumentar a previsibilidade da regeneração periodontal (Izumi et al., 2011).
A terapia periodontal que visa à regeneração utiliza técnicas específicas para que haja restauração das estruturas e tecidos que suportam os dentes. O termo regeneração é definido pela reconstrução dos tecidos perdidos ou injuriados para que sua função seja restabelecida. Os procedimentos clínicos para esta finalidade visam a criação de nova inserção, incluindo a formação de novo ligamento periodontal com suas fibras inseridas em um cemento e osso alveolar neoformados (Ramseier et al., 2012).
A engenharia do tecido ósseo tem sido proposta para tratamento de defeitos orais e maxilofaciais utilizando uma combinação de um arcabouço, fatores de crescimento e células mesenquimais que possuem um alto potencial de se diferenciarem em células de linhagem osteoblástica e, deste modo, auxiliar no processo regenerativo (Sununligan & Singhatandgit, 2012). Células mesenquimais isoladas do ligamento periodontal (PDLSCs) de dentes humanos são uma fonte alternativa de células para regeneração tecidual. Estas células são multipotentes e possuem a capacidade de se diferenciarem em adipócitos e osteoblastos in vitro (Silvério et al., 2010). Também possuem a capacidade de formar tecido semelhante ao cemento e ao ligamento periodontal quando transplantadas para animais imunossuprimidos (Seo et al., 2004). Em acréscimo, PDLSCs mostraram a capacidade de formar matriz mineralizada quando cultivadas em condições apropriadas in vitro (Seo et al., 2004; Chen et al., 2006; Silvério et al., 2010; Saito et al., 2014).
As PDLSCs são caracterizadas pela presença dos marcadores de superfície CD29, CD44, CD90 e CD105 e pela ausência de expressão de marcadores relacionados a células
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hematopoiéticas como CD14, CD34 e CD45 (Lee et al., 2014). De maneira semelhante o CD166 vem sendo descrito numa grande variedade de trabalhos como um importante marcador presente nas linhagens de células mesenquimais indiferenciadas (Trubiani et al., 2010; Silvério et al., 2010, Ponnaiyan et al., 2012; Saito et al., 2014; Hynes et al., 2014).
Alguns estudos sugeriram que populações enriquecidas com células mesenquimais hematopiéticas e do pericôndrio que expressam CD166 poderiam se caracterizar por uma linhagem mais favorável a se diferenciar em células semelhantes a osteoblastos (Bruder et al.; 1997; 1998; Arai et al., 2002). Neste mesmo contexto, estudos recentes demonstram que a expressão de CD166 é modulada e reduzida ao longo de tempo de cultura de algumas linhagens de células (Chitteti et al., 2013, 2014) e sugerem que este marcador pode estar relacionado à capacidade de células mesenquimais obterem um fenótipo osteogênico (Saito et al., 2014).
Apesar de alguns estudos terem avaliado a expressão de CD166 e sua modulação durante o processo de diferenciação osteoblástica (Chitteti et al., 2013, 2014), o papel deste marcador nesta fase de diferenciação ainda não está elucidado na literatura (Saito et al., 2014). Especialmente considerando a expressão deste marcador de superfície em PDLSCs, apenas um estudo recente (Saito et al., 2014) apresentou dados referentes ao CD166 em subclones de PDLSCs submetidos a indução osteogênica. Portanto, uma avaliação mais detalhada e ampla é necessária para o entendimento do papel deste marcador na diferenciação osteoblástica de PDLSCs.
3 2. Revisão de literatura
O periodonto corresponde aos tecidos que suportam e revestem os dentes, abrangendendo o cemento, ligamento periodontal (PDL), osso alveolar e a gengiva (Nanci & Bosshardt, 2006). O periodonto tem como função primária ancorar os dentes ao osso alveolar permitindo a mastigação e a estabilidade dos tecidos que circundam os dentes (Elangovan et al., 2009). Especificamente, o PDL é um tecido conjuntivo situado entre o cemento e a parte interna do processo alveolar. Apresenta como funções sustentar e reter os dentes nos maxilares. O PDL também possui um papel importante na nutrição dental, homeostasia e reparo de tecidos danificados (Seo et al., 2004).
Uma das formas mais comuns de doença que afeta o periodonto é a periodontite que se desenvolve em um hospedeiro suscetível na presença elevada de bactérias patogênicas (Quirynen et al. 2002). Além disso, esta doença infecciosa é caracterizada por perda progressiva do periodonto, eventualmente levando à perda dentária (Bosshardt & Sculean, 2009). A etiopatogenia da periodontite envolve a formação e maturação do biofilme, avanço do processo inflamatório para a área subgengival com início da destruição do tecido conjuntivo e extensão apical do epitélio juncional devido à reabsorção do osso alveolar formando uma bolsa periodontal (Heitz-Mayfield et al. 2003). Deste modo, o princípio básico da terapia periodontal é a redução ou eliminação da microbiota periodontopatogênica combinado ao restabelecimento de um ambiente menos anaeróbico o que permite o equilíbrio do sistema mastigatório como um todo. (Quirynen et al. 2002; Swierkot et al., 2009). Entretanto, esta abordagem não é capaz de promover regeneração tecidual do periodonto (Izumi et al., 2011). Uma vez controlado o aspecto infeccioso-inflamatório da doença, a correção de defeitos anatômicos e a regeneração dos tecidos periodontais perdidos devem então ser buscadas (Elagovan et al., 2009; Ivanovski, 2009).
No contexto do tratamento periodontal, a reconstrução dos tecidos perdidos durante o avanço da doença é o objetivo principal, apesar de ser um processo complexo (Seo et al., 2004; Tomokiyo et al., 2008). Isto se deve ao fato do periodonto ser uma estrutura bastante singular, sendo composto por mais de um tipo de tecido, sendo eles mineralizados (osso alveolar e cemento) e não mineralizados (gengiva e PDL), os quais estão intimamente
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relacionados e, deste modo, a regeneração do periodonto tem se mostrado extremamente difícil de ser alcançada (Aichelmann-Reidy & Reynolds, 2008; Ivanovski, 2009).
Neste cenário, a regeneração é definida pelo desenvolvimento de novo osso, novo ligamento periodontal e novo cemento em uma superfície radicular previamente exposta à doença periodontal (Bosshardt & Sculean, 2009). Diversas abordagens terapêuticas tem sido utilizadas no intuito de alcançar o tratamento regenerativo, dentre elas podem ser destacadas a utilização de enxertos ósseos de diferente origens, regeneração tecidual guiada, proteínas derivadas da matriz do esmalte e fatores de crescimento (Bosshardt & Suculean, 2009; Nevins et al., 2012). De maneira geral, os resultados alcançados por meio destas técnicas ainda precisam ser melhor elucidados, haja vista que a utilização das diferentes técnicas de regeneração mostram ampla variabilidade dos resultados e baixa previsibilidade de regeneração. Portanto, a complexidade estrutural do tecido periodontal é provavelmente uma das razões que justificam a dificuldade em se alcançar a regeneração de mesmo (Bosshardt & Suculean, 2009).
Nos últimos anos, a periodontia vem buscando soluções na área da regeneração baseando-se no conceito da engenharia tecidual, que envolve a combinação de eventos celulares e moléculas sinalizadoras (Izumi et al., 2011). Esta abordagem baseia-se basicamente em três aspectos fundamentais: células, moléculas de sinalização e arcabouços, com o objetivo de aumentar a previsibilidade de obtenção de regeneração periodontal além de ampliar as indicações clínicas dos procedimentos que envolvem regeneração tecidual (Bartold et al., 2000). Dentre as técnicas que estão relacionadas à engenharia tecidual destaca-se e regeneração tecidual guiada, uso de proteínas derivadas da matriz de esmalte, fatores de crescimento e terapia com células mesenquimais (Izumi et al., 2011).
Dentro deste campo, muitos autores têm abordado a utilização de células mesenquimais (MSCs), que são multipotentes e podem se diferenciar em diferentes linhagens. Estas MSCs indiferenciadas já apresentaram capacidade de diferenciação em diversos tipos de linhagens mesenquimais, como adipócitos, condrócitos, osteócitos e tem sido isoladas a partir de diferentes tecidos adultos e embrionários (Pittenger et al., 1999; Trubiani et al., 2010; Mafi et al., 2011). Já foram identificadas linhagens de MSCs com capacidade de proliferação e diferenciação na medula óssea, cordão umbilical, placenta e
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tecido adiposo (Hynes et al., 2014). Em acréscimo, estas populações de células têm recebido muita atenção da comunidade científica pelo potencial de aplicação em diversas abordagens clínicas como regeneração óssea, tecidos cardíacos e tratamentos que demandam enxertos (Trubiani et al., 2010).
De acordo com a Sociedade Internacional para Terapia Celular (Dominici et al., 2006), as populações celulares são consideradas como MSCs quando são aderentes ao plástico sob condições de cultura em meio padrão, assumem um aspecto fusiforme e expressam um painel de marcadores-chave incluindo CD105, CD73, CD166 (ALCAM), CD90 e dependendo da sua origem e condições de cultura ainda expressam SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen), Oct-4 e nanog. Também é esperado que não expressem os marcadores CD45, CD34, CD14, CD79α e HLA-DR e que tenham capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condroblastos in vitro (Dominici et al., 2006; Trubiani et al., 2010). Em acréscimo, as MSCs devem apresentar capacidade de auto-renovação e clonogenicidade (Singhatanadgit et al., 2009).
Está claro que as MSCs vêm recebendo atenção crescente no contexto científico da engenharia tecidual, mas algumas dificuldades são enfrentadas no emprego desta opção terapêutica. Dependendo da fonte de células a ser utilizada, alguns procedimentos invasivos como cirurgias ósseas ou lipossucção podem ser necessárias para aquisição das mesmas (Jin et al., 2014). Portanto, é interessante a identificação de diferentes fontes de MSCs e a caracterização fenotípica das mesmas como multipotentes.
Apesar das MSCs terem sido primeiramente identificadas em biópsias de medula óssea, mais recentemente foi identificado a presença deste grupo de células em tecidos da cavidade bucal. Deste modo, no campo da odontologia, MSCs foram identificadas e caracterizadas tendo como origem a polpa dentária, o ligamento periodontal, dentes decíduos esfoliados, folículo dental, células da região do periápice e mais recentemente do tecido conjuntivo gengival (Ponnaiyan et al., 2012; Hynes et al., 2014; Jin et al., 2014)
A partir de alguns estudos (Buser et al., 1990; Beertsen et al., 1997) que especularam a ideia de que o processo de regeneração periodontal dependia da migração e proliferação das células provenientes do ligamento periodontal remanescente, acompanhada pela diferenciação e síntese de componentes da matriz tecidual, foi identificado que o ligamento periodontal apresenta uma população
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heterogênea de células com alta capacidade proliferativa e clonogênica (Seo et al., 2004). A regeneração completa do periodonto parece estar relacionada à capacidade destas células em reconstituir os tecidos mineralizados do osso e do cemento (Wang et al., 2011). Deste modo, células mesenquimais isoladas do ligamento periodontal (PDLSCs) se mostram como uma possibilidade para o campo da regeneração tecidual (Silvério et al., 2010).
A literatura aponta que as PDLSCs possuem papel fundamental no fenômeno da regeneração por migrarem em direção ao osso alveolar e cemento onde elas se diferenciam em osteoblastos, cementoblastos e fibroblastos (Gay et al., 2007). A migração e diferenciação celular são a base para a remodelação e regeneração dos tecidos periodontais e é necessário que algum mecanismo de sinalização esteja envolvido para regular este processo. Entretanto, o funcionamento deste mecanismo ainda não é claro na literatura devido à diversidade de tipos de células e tecidos (Melsher, 1976. Gay et al., 2007).
O principal meio de obtenção destas PDLSCs é a cuidadosa remoção do ligamento periodontal no terço médio da raiz de dentes saudáveis extraídos por razões ortodônticas ou terceiros molares com indicações para exodontia. No entanto, as células obtidas do ligamento periodontal representam um pool heterogêneo de células, que envolvem diferentes subtipos celulares envolvidos na formação dos tecidos que compreendem o periodonto de inserção (cemento, ligamento periodontal e osso alveolar), podendo se apresentar em diferentes estágios de diferenciação celular (Murakami et al., 2003; Seo et al., 2004; Ivanovski et al., 2006; Nagatomo et al., 2006; Gay et al., 2007; Singhatanadgit et al., 2009; Wang et al., 2011).
Estudos envolvendo PDLSCs, tem confirmado seu perfil multipotente e comprovado a capacidade de se diferenciar in vitro em fenótipos osteogênico, cementogênico, condrogênico e adipogênico, apresentando ainda habilidade de formar nódulos mineralizados e expressar marcadores associados ao tecido ósseo (Seo et al., 2004; Nagamoto et al., 2006; Singhatanadgit et al., 2009; Silvério et al., 2010; Sununliganon & Singhatanadgit, 2012). Em trabalhos experimentais in vivo, o transplante destas células foi capaz de promover a formação de tecidos semelhantes ao cemento e ao ligamento periodontal mostrando seu potencial para aplicação em regeneração tecidual (Seo et al., 2004).
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Durante o processo de caracterização das PDLSCs, diferentes marcadores de superfície tem sido utilizados com esta finalidade, incluindo CD29, CD44, Stro-1, CD105, CD106, CD146 e CD166 (Nagamoto et al., 2006; Singhatanadgit et al., 2009; Silvério et al., 2010). Esta variedade de marcadores envolvidos na caracterização do pool de PDLSCs confirma a heterogeneidade celular encontradas nestas populações. Alguns estudos demonstram que há heterogeneidade celular, mesmo dentro deste grupo específico de PDLSCs isoladas (Seo et al., 2004; Gay et al., 2007; Singhatanadgit et al., 2009; Wang et al., 2011; Sununliganon & Singhatanadgit, 2012). Acredita-se que dentro deste pool de células, algumas estejam relacionadas a linhagem fibroblástica e outras a linhagem com potencial de formação de tecido mineralizado, podendo ser consideradas subpopulações comprometidas com fenótipos osteoblásticos e cementoblásticos (Liu et al., 1997; Seo et al., 2004; Nagatomo et al., 2006; Gay et al., 2007).
Deste modo, torna-se importante o estudo dos marcadores celulares e a elucidação dos mecanismos que levam estas células a se comprometer com algum fenótipo específico. Alguns estudos tem permitido a identificação de marcadores de MSCs que poderiam selecionar um subgrupo de células com maior potencial a se diferenciar em tecidos mineralizados (Bruder et al., 1998; Arufe et al., 2010; Rada et al., 2011). No entanto, ainda é necessário investigar os marcadores associados às PDLSCs com maior capacidade de diferenciação em células da linhagem osteoblástica/cementoblástica e se a expressão destes marcadores sofre modulação durante o processo de diferenciação.
A partir da necessidade de identificação de grupos menos heterogêneos de células, muito tem sido pesquisado na tentativa de obter-se culturas altamente enriquecidas para um marcador específico, utilizando técnicas de clonagem ou seleção positiva através de anticorpos específicos (Singhatanadgit et al., 2009). É possível inferir que através da identificação de marcadores celulares que caracterizam células com maior potencial de diferenciação em tecidos mineralizados, os procedimentos que envolvem engenharia tecidual poderiam ser aperfeiçoados.
Células positivas para os marcadores de superfície CD105 e CD166 mostraram-se capazes de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos e adipócitos sob condições de cultura apropriadas (Ozbey et al., 2010). Um estudo prévio identificou que em amostras do ligamento periodontal de dentes permanentes, 8,76% das células eram positivas para os
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marcadores CD105 e CD166. Em acréscimo, também foi identificado que estas células eram positivas para o marcador Oct-4, reconhecido por manter sua característica multipotente e seu estado indiferenciado (Silvério et al., 2010). Embora haja o crescente número de estudos neste campo, a caracterização e proporção destas populações celulares ainda não está completamente compreendida (Nagamoto et al., 2006).
Quando induzidas à diferenciação osteogênica, as PDLSCs apresentam aumento na expressão de alguns genes associados ao tecido ósseo, dentre eles o fator de transcrição relacionado a Runt-2 (Runx-2), que é um fator chave na diferenciação osteoblástica e formação óssea; a fosfatase alcalina (ALP) envolvida na precipitação de cristais de hidroxiapatita nas fases iniciais da mineralização; e a osteocalcina (OCN), uma proteína comumente encontrada na matrix óssea extracelular (Liu et al., 2008; Fuji et al., 2008; Sununliganon & Singhatanadgit, 2012). O padrão de expressão destes genes nas populações celulares varia com o tempo de indução à diferenciação (Silvério et al., 2010; Cheng et al. 2011). Recentemente foi identificado que clones provenientes de PDLSCs apresentaram aumento na expressão dos genes relacionados ao tecido ósseo Runx-2 e ALP ao longo de 14 dias de cultura em meio osteogênico (Saito et al. 2014).
Quanto ao marcador de superfície celular CD166, também conhecido como molécula de adesão de leucócito ativado (ALCAM), é um membro da superfamília das imunogloboluinas que atua na mediação de adesão homofílica (ALCAM- ALCAM) e heterofílica (ALCAM-CD6) (Bruder et al., 1998; Chitteti et al., 2013, 2014). Células positivas para CD166 são capazes de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos e adipócitos em condições apropriadas (Ozbey et al., 2010). CD166 é expresso em células hematopoiéticas, endoteliais, neurais, precursoras de osteoblastos e células mesenquimais indiferenciadas (Arai et al., 2002; Nakamura et al., 2010), além disso, a morfogênese do tecido ósseo resulta da diferenciação de MSCs positivas para este marcador (Bruder et al., 1998).
Quanto ao potencial regenerativo das células positivas para o marcador CD166, alguns resultados interessantes têm sido encontrados. Células na cartilagem articular positivas para CD105 e CD166 foram apontadas como importantes na vitalidade, interação célula-matriz, migração e crescimento da cartilagem da epífise (Ozbey et al., 2010). De
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maneira semelhante, dados indicam células CD166+ como capazes de promover reparação na cartilagem articular do joelho, além disso, o processo de reparo em casos de osteocondrite parece ser afetado pela a quantidade destas células nos fragmentos (Sakata et al., 2012). Também foi sugerido que a alta expressão de CD105 e CD166 em MSCs da medula óssea pode estar associada à habilidade de diferenciação em fenótipo osteoblástico (Arai et al., 2002; Liu et al., 2008). Em acréscimo, populações de células pericondriais de camundongos com maior expressão de CD166 foram capazes de se diferenciar em osteoblastos e adipócitos quando cultivadas em meio apropriados confirmando mais uma vez o fenótipo mesenquimal indiferenciado e multipotente das mesmas (Arai et al., 2002).
Dados recentes apontam o CD166 como um marcador importante da manutenção e função indiferenciada de células mesenquimais e do processo de diferenciação osteoblástica (Chitteti et al., 2013). A expressão do CD166 diminuiu marcadamente com o avanço do tempo de indução à diferenciação em meio osteogênico sugerindo que a expressão é aumentada em células osteoblásticas menos maduras e diminuída ao longo do tempo de cultura (Chitteti et al., 2013; Chitteti et al., 2014). Os autores observaram por citometria de fluxo que o tempo em cultura reduziu a expressão de CD166 e correlacionaram este achado à maturação dos osteoblastos. Além disso, a expressão deste marcador diminuiu à medida que a células perdem suas características hematopoiéticas (Chitteti et al., 2013). No mesmo contexto, os autores ainda apontam que a expressão de CD166 está correlacionada à expressão de Runx-2 (Chitteti et al., 2013; Chitteti et al., 2014).
A literatura também mostra que a perda na expressão de CD166 é crítica na função mesenquimal de células hematopoiéticas. O mesmo estudo ainda aponta que linhagens de osteoblastos negativos para o marcador CD166 apresentam algumas alterações no seu processo de maturação e diferenciação (Chitteti et al., 2014).
Neste mesmo contexto, variações são encontradas na expressão de alguns genes ao longo do processo de diferenciação osteogênica. Maior expressão de Runx-2 foi identificada em estágios iniciais e diminuiu ao longo do tempo de cultura, enquanto a expressão de OCN, marcador tardio da diferenciação osteogênica, aumentou nos estágios mais avançados, em que células caracterizadas como osteoblastos mais maduros são identificadas (Cheng et al., 2011; Chitteti et al., 2013). Por sua vez, um estudo aponta
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expressão de CD166 tende a diminuir à medida que as células mesenquimais entram no processo de diferenciação osteogênica e começam a expressar ALP (Chitteti et al., 2013).
Neste mesmo cenário, a literatura aponta que a osteogênese pode ser dependente de células CD166+. Estas células estão presentes na camada externa do periósteo e possuem um formato alongado. A medida que elas se diferenciam em células com fenótipo osteoblástico, elas assumem um formato cuboide, reduzem a expressam de CD166, aumentam a atividade de ALP e passam a secretar matriz osteóide como osteoblastos maduros (Bruder et al., 1998).
No que tange a modulação de CD166 e Runx-2 em PDLSCs, um estudo recente identificou que populações de células induzidas à diferenciação osteogênica apresentaram aumento na expressão destes marcadores ao longo processo de indução. Além disso, devido ao aumento gradual na expressão de CD166 sob condições de cultura em meio osteogênico, os autores sugerem que a expressão deste gene pode estar relacionada à capacidade das PDLSCs em adquirir fenótipo osteoblástico, entretanto destacam a necessidade de outros estudos que melhor elucidem o papel do CD166 (Saito et al., 2014). Este conjunto de informações indica que o CD166 parece ter um papel importante no progresso da diferenciação osteogênica, embora seu mecanismo exato ainda precise ser estudado (Arai et al., 2002; Nakamura et al., 2010; Saito et al., 2014).
11 3. Proposição
Partindo do contexto previamente exposto, o presente estudo tem como objetivos avaliar o potencial de diferenciação osteoblástica/cementoblástica de PDLSCs enriquecidas para o marcador de superfície CD166 (PDL/CD166+) e verificar se esse marcador é modulado ao longo do processo de diferenciação celular.
12 4. Material e métodos
Este estudo seguiu as recomendações do Conselho Nacional de Saúde e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – Universidade Estadual de Campinas (FOP-UNICAMP) sob o protocolo de número 053/2013 (Anexo).
4.1 Isolamento das PDLSCs de terceiros molares de humanos
Para a realização desse estudo foram utilizadas três populações de culturas primárias de células do ligamento periodontal oriundas de três pacientes que foram isoladas e caracterizadas no Laboratório de Biologia Celular e Molecular da Área de Periodontia da FOP – UNICAMP. Brevemente, terceiros molares inclusos indicados para exodontia de pacientes que procuraram a Clínica de Graduação da FOP-UNICAMP foram obtidos, sendo esses pacientes saudáveis, do sexo masculino ou feminino, entre 19 e 29 anos, não fumantes, que não estavam grávidas e sem história de medicação sistêmica nos últimos seis meses. O ligamento periodontal do terço médio destes dentes foi gentilmente removido, digerido em uma solução de colagenase/dispase (Gibco BRL, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), e uma suspensão celular foi obtida passando as células através de um cell strainer de 100 m de diâmetro (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, EUA). Esta suspensão celular foi centrifugada por 5 min a 2500 rpm, e o pellet celular obtido foi cultivado em meio de cultura padrão, composto por Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, EUA), 100 g/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, EUA) até alcançar confluência. Este cultivo celular e os demais citados neste trabalho foram cultivados em incubadora (Sanyo MCO -18IAC, Moriguchi City, Osaka, Japão) a 37°C em atmosfera saturada em 5% de CO2 e 98% de umidade. Frações destas células
foram armazenadas em nitrogênio líquido para futuros experimentos e neste trabalho receberam o nome de grupo PDL, por se tratar de um grupo de células heterogêneo e não enriquecido para nenhum marcador específico.
13
4.2 Separação magnética para o marcador de superfície CD166
Parte das células do grupo PDL foi expandida e depois de alcançado a subconfluência (70-80% de confluência), as populações heterogêneas de células do ligamento periodontal foram purificadas para o antígeno de superfície CD166, utilizando a técnica de separação magnética (MACS, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha), seguindo as recomendações do fabricante. Brevemente, as células foram resuspendidas em 200 µL de soro de Donkey 10% (Sigma-Aldrich, Milão, Itália), e incialmente incubadas com 2µL do anticorpo primário CD166 (Biolegend, San Diego, CA, EUA) por 15 minutos a uma temperatura de 6°C a 12°C. Em seguida as células foram ressuspendidas em 80 µL de uma solução tampão composta por tampão fosfato salino (PBS-Gibco BRL, LifeTechnologies, Rockville, MD, USA) suplementada com 0,5% de FBS. Foi então adicionado 20 µL do anticorpo secundário Anti-mouse IgG MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). Então, as células foram lavadas duas vezes, resuspendidas em 500 µL da solução tampão e aplicadas a uma coluna do tipo MS acoplada a um separador magnético (MACS separator, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). A fração de células que passaram diretamente pela coluna foram neste trabalho denominadas PDL/CD166-, enquanto que, as células que permaneceram retidas no interior da coluna,
correspondeu a população marcada positivamente para o antígeno CD166, deste modo considerada uma população enriquecida para este marcador e neste trabalho denominado grupo PDL/CD166+. A coluna magnética foi lavada três vezes com solução de tampão,
ambas frações de células PDL/CD166+ e PDL/CD166- foram coletadas e a sua proporção em relação ao número inicial de células foi determinada, utilizando um hemocitômetro. Em seguida, essas células foram expandidas em meio de cultura padrão e, após alcançarem subconfluência, foram mantidas congeladas em nitrogênio líquido, utilizando-se como meio de congelamento o Recovery™ Cell Culture Freezing Medium (Gibco BRL).
4.3 Caracterização das populações de células por citometria de fluxo
A técnica da citometria de fluxo foi utilizada para avaliação da expressão de marcadores de superfície de interesse para caracterização, como mesenquimal
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indiferenciado, do grupo PDL/CD166+ das três populações celulares utilizadas neste
estudo. Também para confirmação de que o grupo era enriquecido para o marcador chave CD166. Para a realização deste experimento, os grupos PDL/CD166+ foram semeadas em
placas para cultura celular (100x20mm) e incubadas até alcançarem cerca de 80% de confluência. Então, as células foram lavadas com PBS (Gibco BRL, LifeTechnologies, Rockville, MD, USA) e, em cada placa foi adicionada a solução de dissociação (TrypleSelect, Gibco). Em seguida, foi adicionado PBS gelado nas placas e todo o conteúdo foi transferido para tubos cônicos de 15mL e centrifugados a 2500 rpm por 5 min. Após a centrifugação, as células foram contadas e distribuídas nos tubos de ensaio para citometria de fluxo a uma concentração de 1 x 105 células/tubo. Então, foi adicionada a solução de bloqueio de Dunkey a 10% (Sigma-Aldrich, Milão, Itália) e as células incubadas por 40 minutos a 4°C. Após esse período, as células foram incubadas com os anticorpos monoclonais conjugados mouse anti-human para CD166-PE, CD105-APC e CD34-FITC a 4°C por 1 horas. Como controle negativo, APC, PE e FITC conjugados a anticorpo mouse IgG1 foram utilizados como substitutos dos anticorpos primários. A seguir, as células foram adquiridas em citômetro de fluxo (BD FACSCalibur™; BD BiosciencePharmigen, San Jose, CA, EUA) e os dados analisados utilizando um software específico (BD CellQuest™ Pro, BD Bioscience Pharmigen, San Jose, CA, EUA). Os resultados foram expressos como a proporção de células CD105+ e CD166+ (fenótipo mesenquimal) e CD34
-(ausência de fenótipo endotelial/hematopoiético).
4.4 Ensaio de mineralização para avaliação do potencial de formação de nódulos minerais in vitro
Os três grupos, PDL, PDL/CD166+ e PDL/CD166- das três populações celulares foram semeados em triplicata em placas de 24 poços (2 x 105 células/poço) e cultivadas em meio de cultura padrão por 24 horas. Após este período, o DMEM foi substituído pelo meio osteogênico (OM) composto por DMEM suplementado com 2% de FBS, 50 g/ml de ácido ascórbico, 10 mM de -glicerolfosfato (GP) e dexamethasona (10-5M). Em seguida, estas células foram cultivadas por 28 dias para permitir a formação dos nódulos minerais, sendo que o OM foi trocado a cada três dias.
15
Para análise quantitativa, a técnica de coloração por vermelho de alizarina (Sigma-Aldrich, Milão, Itália) foi utilizada. Então, após o período de 28 dias, as células foram lavadas com PBS e fixadas em etanol 70% gelado por 1 hora. O etanol foi aspirado e as células lavadas com água destilada para remover o etanol remanescente. A cada poço foi adicionada 600 µL de uma solução de vermelho de alizarina 40mM (pH 4,2) em temperatura ambiente por 10 minutos sob agitação. As células foram então lavadas cinco vezes com água, a fim de remover a solução de vermelho de alizarina, e em seguida 1 mL de PBS foi adicionado a cada poço por 15 minutos sob agitação, a fim de reduzir a coloração não específica. A placa foi fotografada, e o procedimento de descoloração dos nódulos foi realizado para realização a análise quantitativa. Para promover a descoloração dos nódulos, foi adicionado 1 mL de uma solução de cloreto de cetilperidina a 10% (pH 7,0) por 15 minutos e as alíquotas desta solução pipetadas em triplicata em uma placa de 96 poços e, em seguida, submetidas à análise de absorbância em um espectofotômetro utilizando-se um comprimento de onda de 562 nm.
4.5 Expressão dos marcadores biológicos Runx-2, ALP, OCN, CD166
Esta etapa teve como objetivo avaliar se o padrão de expressão dos marcadores biológicos relacionados ao fenótipo osteoblástico/cementoblástico é modulados durante o processo de diferenciação osteogênica. Para tanto, os três grupos, PDL, PDL/CD166+ e
PDL/CD166- das três populações celulares foram semeados em placas para cultivo celular
de 60 mm a uma densidade de 4 x 105 células/cm2, mantidos em meio de cultura padrão e incubados em estufa umidificada a 37ºC em atmosfera saturada com 5% de CO2 por 24
horas. Em seguida, o meio de cultura padrão foi substituído pelo meio de cultura osteogênico (OM) composto por DMEM suplementado com 10% de FBS, 50 g/ml de ácido ascórbico, 10 mM de -glicerolfosfato (GP) e dexamethasona (10-5 M) e trocado a cada 3 dias. Ao final dos períodos de 3, 7 e 14 dias de indução osteogênica o RNA total foi coletado por meio da utilização do reagente Trizol® conforme descrito abaixo em detalhes, e as reações de real time PCR foram realizadas para a quantificação relativa dos níveis de RNAm para os genes relacionados à diferenciação osteogênica (Runx2, ALP e OCN), e relacionados à condição mesenquimal indiferenciada (CD166).
16 4.6 Extração de RNA
Brevemente, o meio de cultura foi aspirado e as células lavadas com tampão fosfato salino (PBS-Gibco BRL, life technologies, Rockville, MD, USA) em temperatura ambiente. Um mililitro do reagente Trizol® foi adicionado a cada placa de cultura sendo seu o conteúdo (células + reagente Trizol®) transferido para um tubo cônico e incubado por 5 minutos em temperatura ambiente. A cada tubo cônico foi adicionado 0,2 mL de clorofórmio (Merck, Frankfurt, Alemanha) sendo estes agitados cuidadosamente em “vortex”, incubados por 10 minutos em temperatura ambiente e centrifugado a 11500 rpm por 15 minutos a 4oC (Bio-Spin-R, BioAgency, São Paulo, Brasil). A fase aquosa foi transferida para um novo tubo, ao qual foi adicionado 0,5ml de isopropanol (Merck, Frankfurt, Alemanha), passando por agitação em “vortex” e incubado por 15 minutos em temperatura ambiente. Novamente os tubos foram centrifugados a 11500rpm por 15 minutos a 4oC (Bio-Spin-R, BioAgency, São Paulo, Brasil). O precipitado foi lavado em etanol 75% gelado e seco a temperatura ambiente, com o tubo invertido sobre um papel de filtro. As amostras de RNA foram suspensas em água MiliQ livre de Rnase e então, armazenadas a -70oC. O RNA total foi tratado para a eliminação de qualquer resíduo de DNA na amostra com Turbo DNA-free® seguindo as recomendações do fabricante
(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).
4.7 Síntese de DNA complementar
A concentração de RNA das amostras tratadas foi medida utilizando-se um espectrofotômetro Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EUA) e 1 μg da amostra tratada foi utilizada para a síntese de 20 µL de DNA complementar (cDNA). As reações foram realizadas utilizando-se o kit First-strand cDNA synthesis com o primer Anchored-oligo (dT)18 (Roche Diagnostic Co., Indianapolis, IN, EUA), seguindo as
recomendações do fabricante.
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Os primers para GAPDH (gene de referência), RUNX2, ALP, CD166 e OCN foram desenhados com o auxílio de um programa desenvolvido especificamente para desenhar primers para o sistema o LightCycler 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), e a eficiência das reações para cada primer foi otimizada anteriormente ao início das reações de PCRq propriamente ditas (Tabela 1). As reações de real-time PCR foram realizadas com o sistema LightCycler 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), utilizando-se o kit “LightCycler 480 SYBR Green I Master” (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha)”. O perfil das reações foi determinado seguindo a fórmula sugerida pelo fabricante do equipamento.
Para cada uma das “corridas”, a água foi utilizada como controle negativo, e o produto das reações foi quantificado utililizando o programa do próprio fabricante (LightCyclerRelativeQuantification Software - Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). A quantificação relativa foi realizada utilizando o gene GAPDH como gene de referência para normalização dos valores.
Tabela 1. Primers para reações de PCRq
Gene Primers (5’ 3’) Amplic
on (pb) Temperatur a de Anelamento Nº de Ciclos GAPD H Forward: ACATCATCCCTGCCTCTAC Reverse: CCACCTTCTTGATGTCATCATATTTG 171 55ºC 40
OCN Forward: AGCTCAATCCGGACTGT
Reverse: GGAAGAGGAAAGAAGGGTGC 150 55 ºC 40
CD166 Forward: CATGAAGAAGTCAAAGACTGCATC
Reverse:TTTGTTTATGTCTTAAATACAATCCACGTT 190 55 ºC 40
RUNX2 Forward: CCGTCCATCCACTCTACCAC
Revese:ATGAAATGCTTGGGAACTGC 139 55 ºC 40
ALP Forward: CGGGCACCATGAAGGAAA
Reverse: GGCCAGACCAAAGATAGAGTT 184 55 ºC 40
GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; RUNX2: fator de transcrição relacionado a Runt-2; ALP:
fosfatase alcalina. OCN: osteocalcina.
4.9 Avaliação da expressão dos marcadores de superfície por citometria de fluxo
Os grupos PDL e PDL/CD166+ das três populações celulares foram semeadas em placas de 100 mm2 (2 x 105 células/placa) e cultivadas em DMEM por 24 horas. Após este
18
período, o meio padrão foi substituído pelo OM. Ao final dos períodos de 3, 7 e 14 dias de indução osteogênica as células foram novamente submetidas a citometria de fluxo para avaliar a expressão dos marcadores de superfície CD105 e CD166 e verificar se existe uma modulação na expressão dos mesmos ao longo do processo de indução osteogênica. As amostras foram transferidas em uma concentração de 1x105 por tubo, como previamente descrito e foram adquiridas utilizando citômetro de fluxo (BD FACSCalibur™) e os resultados analisados, usando um software específico (BD CellQuest™ Pro).
4.10Análise estatística
A análise estatística foi realizada através do software Bioestat 5.3 (Sociedade Civil Mamirauá, Belém, PA, Brasil), sendo os valores apresentados na forma de média e desvio-padrão. Os dados foram submetidos ao teste Lilliefors para avaliação de normalidade. Para comparação entre três ou mais grupos, os resultados foram submetidos ao teste ANOVA um critério, seguido pelo teste de Tukey ou Bonferroni quando diferenças entre os grupos foram detectadas. A comparação entre dois grupos foi realizada utlizando o Test t. Para todas as análises, o nível de significância utilizado foi de 5%. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
19 5. Resultados
5.1 Isolamento da população enriquecida em CD166 por separação magnética
Três populações de PDLSCs (A, B e C) foram isoladas de terceiros molares de três pacientes para que fossem submetidas à separação magnética. Cada população foi expandida até uma concentração de 107 como preconizado pelo fabricante do sistema utilizado. Após a remoção das células aderidas na coluna magnética, as mesmas foram contadas com o auxílio de um hemocitômetro e foi identificado que da concentração inicial de 1 x 107 células, uma proporção média de 9,3% (±2,08%) seriam aquelas consideradas o grupo PDL/CD166+.
5.2 Caracterização das populações de células por citometria de fluxo
As células PDL/CD166+ das três populações foram analisadas pela técnica da citometria de fluxo para confirmar o enriquecimento para o marcador CD166, avaliar a expressão de outro marcador de células mesenquimais indiferenciadas, o CD105, e também, para confirmar a ausência de expressão de marcador de células hematopoiéticas, CD34.
A análise por citometria de fluxo mostrou uma concentração média de 91,5% (±4,3%) de células positivas para o marcador CD166. A concentração média de células positivas para CD105 foi de 96,8% (±2,1) e apenas 0,9% (±0,8%) apresentavam marcação positiva para CD34. Os resultados da citometria de fluxo mostram que a separação magnética foi eficaz para obtenção de uma população purificada para o CD166. A figura 1 apresenta o percentual médio de expressão de CD166, CD105 e CD34 das três populações. As figuras 2, 3 e 4 apresentam o painel de histogramas dos grupos PDL/CD166+ cada população trabalhada neste estudo.
20 91,5 96,8 0,9 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 CD166 CD105 CD34 Po rcen tag em e c élu las pos itiva s População A
Figura 1. Concentração média de expressão dos marcadores de superfície entre os grupos
PDL/CD166+ das três populações avaliadas (Valores em %).
21
Figura 3. Painel de marcação para CD166, CD105 e CD34 no grupo PDL/CD166+ da população B.
População B
População C
Figura 4. Painel de marcação para CD166, CD105 e CD34 no grupo PDL/CD166+ da população C.
22
Figura 5. Ensaio vermelho de alizarina. Médias dos grupos PDL, PDL/CD166+ e PDL/CD166- das
três populações trabalhadas nas duas condições de cultura. Letras maiúsculas diferentes representam diferenças estatísticas intragrupo (DMEM x OM). Letras minúsculas diferentes representam diferenças estatísticas intergrupo (PDL OM x PDL/CD166+ OM x PDL/CD166- OM).
5.3 Ensaio de mineralização para avaliação do potencial de formação de nódulos minerais in vitro
O ensaio do vermelho de alizarina confirmou a habilidade das PDLSCs em formar nódulos minerais in vitro quando cultivadas em OM mostrando o potencial destas células em diferenciação osteoblástica/cementoblástica. Apenas o grupo PDL/CD166- da
população C não apresentou depósitos mineralizados na placa de cultura. Foi observado através dos resultados que os grupos PDL/CD166+ demonstram uma tendência a apresentar
maiores níveis de mineralização, seguido pelos grupos PDL e PDL/CD166-. Para PDL e PDL/CD166+ foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos DMEM e OM. Também houve diferença entre PDL e PDL/CD166+ comparado a PDL/CD166 -(p<0,05). A figura 5 apresenta os resultados deste ensaio através das médias das três populações.
23
Figura 6. Ensaio de vermelho de Alizarina dos grupos PDL, PDL/CD166+ e PDL/CD166- das três populações
deste estudo, cultivados em DMEM e OM. Apenas o grupo PDL/CD166- da população C não mostrou
habilidade de formação de nódulos minerais in vitro quando cultivado em OM.
A figura 6 apresenta os depósitos minerais visualizados in vitro nas três populações após 28 dias de cultivo.
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5.4 Expressão dos genes relacionados ao fenótipo osteoblástico (Runx-2, ALP e OCN)
A figura 7 apresenta o perfil de expressão de Runx-2 através das médias das três populações nos grupos PDL, PDL/CD166+ e PDL/CD166- nos três períodos de análise. Não foi identificado diferença estatisticamente significante entre os grupos, embora no PDL cultivado em OM, é possível observar numericamente um aumento da expressão deste gene aos 14 dias. A figura 8 representa a expressão do mesmo gene apenas entre os grupos cultivados em OM, neste caso, foi observado que o grupo PDL/CD166+ apresentou uma expressão significativamente maior quando comparado aos grupos PDL e PDL/CD166- no terceiro dia de indução (p<0,05).
A expressão do gene ALP apresentou uma tendência de aumento ao longo do período de cultura. O grupo PDL não apresentou diferença estatística significante entre os grupos DMEM e PDL, mas foi identificado que intragrupo, houve diferença significativa tanto no grupo DMEM como no grupo OM do dia 3 ao dia 14 (p<0,05). Quanto a expressão de ALP no grupo PDL/CD166+ foi observado que houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos DMEM e OM nos dias 7 e 14 e a análise intragrupo revelou que para o grupo OM houve acréscimo estatisticamente significante nos dias 7 e 14 (p<0,05). Já o grupo PDL/CD166- não apresentou diferenças na expressão deste gene entre
as duas condições de cultivo, mas numericamente há uma tendência em maior expressão de ALP após 7 e 14 dias de indução osteogênica. A avaliação intragrupo mostrou que sob indução osteogênica, a expressão de RNAm é aumentada no dia 14 com diferença estatisticamente significante em relação ao dia 7 e há uma queda significativa no dia 7 comparado ao dia 3 quando cultivado em DMEM (p<0,05) (Figura 9).
Quando foi comparado a expressão de RNAm para ALP entre os grupos cultivados em OM, identificou-se que o grupo PDL apresentou uma expressão significativamente menor deste gene em relação aos grupos PDL/CD166+ e PDL/CD166- após 14 dias de indução osteogênica (Figura 10).
A avaliação da expressão de RNAm para OCN demonstrou que há uma tendência a acréscimo na expressão de ao longo dos 14 dias de cultura. O grupo PDL mostrou que aos 14 dias de indução há diferença estatisticamente significante na expressão deste gene entre
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DMEM e OM. Além disso, a análise intragrupo indica que sob indução osteogênica há um aumento estatisticamente significante na expressão de OCN no dia 14 comparado ao dia 3 (p<0,05). As células PDL/CD166+ apenas apresentaram aumento de expressão de OCN aos
14 dias de indução quando comparado ao meio padrão (p<0,05). Não houve diferença no perfil de expressão deste gene entre os três períodos de análise nem para DMEM nem para OM. Para PDL/CD166- não foram encontradas diferenças entre os grupos DMEM e OM em nenhum período de observação, embora o grupo OM apresentasse maiores valores nos níveis de RNAm para OCN comparado ao grupo cultivado em meio padrão. A avaliação intragrupo mostrou que no dia 14 há maior nível de expressão de OCN comparado ao dia 7, tanto para DMEM quanto para OM (Figura 11). Além disso, ainda foi possível notar que nos grupos cultivados em OM, a expressão deste gene no PDL foi significativamente menor que nos demais grupos no dia 3 e menor, quando comparado ao PDL/CD166- , no dia 14 (Figura 12).
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Figura 7. Comparação da expressão de Runx-2 entre os grupos cultivados em DMEM e OM.
Figura 8. Comparação da expressão de Runx-2 entre os grupos cultivados em OM. Foi identificada
diferença estatisticamente significante entre o grupo PDL/CD166+ e os demais grupos no dia 3. Médias e desvio- padrão das três populações celulares. * Diferença intergrupo revelada pelo teste ANOVA um critério seguido pelo teste de Bonferroni. (α = 0,05).
