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“AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DIRETOS DA RADIOTERAPIA
SOBRE A MICROVASCULARIZAÇÃO, A INERVAÇÃO E A MATRIZ
EXTRACELULAR DA POLPA DENTAL DE PACIENTES
ONCOLÓGICOS”
PIRACICABA 2013
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KARINA MORAIS FARIA
“AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DIRETOS DA RADIOTERAPIA
SOBRE A MICROVASCULARIZAÇÃO, A INERVAÇÃO E A MATRIZ
EXTRACELULAR DA POLPA DENTAL DE PACIENTES
ONCOLÓGICOS”
Orientador: Prof. Dr. Alan Roger dos Santos Silva
PIRACICABA 2013
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA À FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRA EM ESTOMATOPATOLOGIA, ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM ESTOMATOLOGIA
Este exemplar corresponde à versão final da Dissertação defendida pela aluna Karina Morais Faria e orientada pelo Prof. Dr. Alan Roger dos Santos Silva
Assinatura do Orientador
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
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Dedicatória
A Deus por estar comigo em todos os dias, por todas as coisas boas que vivi, pela saúde e determinação para realizar este curso de mestrado.
Aos meus pais Adonizete e Marlene, conselheiros dos momentos decisivos, símbolos de paciência e esperança, agradeço por iluminarem meu caminho com tanto carinho e dedicação, por diminuírem a distância física por meio do imenso amor e apoio incondicional, por acreditarem e terem feito dos meus planos os seus sonhos.
Aos meus irmãos Lucas e Carolina pela amizade e carinho, por compartilhar em cada etapa da minha formação sempre com grande entusiasmo, por todos os momentos de alegria que garantem que sempre poderei contar com o amparo e a torcida de vocês.
Aos meus avós Claudiomiro José de Faria (in memorian), Júlia Caetano de Paiva (in memorian), Lucas Luís de Morais e Nalzira Maria de Morais pelo exemplo de humildade, dedicação ao trabalho e amor ao próximo. E aos meus padrinhos, tios, tias, primos, primas e amigos que me apoiam e vibram a cada passo da minha caminhada.
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Agradecimentos especiais
Ao Professor Doutor Alan Roger dos Santos Silva, pela orientação, pelo exemplo de educação e bondade, por ter conduzido os ensinamentos com tanta sabedoria, pela amizade, pelo estímulo a cada dia, pela confiança, por dispor de tanto zelo e energia tornando meu trabalho tão recompensador. Expresso também toda minha admiração pela postura como docente, por transmitir tranquilidade diante dos desafios, sempre com palavras amáveis e sorriso sereno. Agradeço por me fazer sentir importante, demonstrando sempre que posso fazer a diferença. Enfim, juntos vencemos esta etapa.
Ao Professor Doutor Oslei Paes de Almeida da Área de Patologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, pelos exemplos de competência, seriedade e pela colaboração inestimável neste trabalho.
A Coordenadora do Serviço de Odontologia Oncológica do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP) Dra. Thais Bianca Brandão, pela atenção e oportunidades concedidas tão importantes para o meu aprendizado.
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Agradecimentos
À Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), na pessoa do Magnífico Reitor, Professor Doutor José Tadeu Jorge.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na pessoa de seu Diretor, Professor Jacks Jorge Júnior e Diretor Associado, Professor Doutor Alexandre Augusto Zaia.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de Mestrado concedida e pelo apoio financeiro por meio do Projeto PROEX 758/2012, ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e à Extensão (FAEPEX) pelo auxílio concedido sob o processo 512.292, bem como ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC) pela bolsa concedida à aluna Vanessa Cristina Gross, sob o processo número 122167/2012-0.
À Professora Doutora Renata Cunha Matheus Rodrigues Garcia, Coordenadora Geral da Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, ao Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia Professor Doutor Alan Roger dos Santos Silva.
Aos Professores Doutores das Áreas de Semiologia e Patologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Márcio Ajudarte Lopes, Alan Roger dos Santos Silva, Oslei Paes de Almeida, Pablo Agustín Vargas, Edgard Graner, Jacks Jorge Júnior, e Ricardo Della Coletta, pela maneira competente e admirável com que conduzem nosso grupo de trabalho.
Aos profissionais do OROCENTRO e do Laboratório de Patologia Oral, da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, pela oportunidade, atenção e cuidados
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dedicados durante o desenvolvimento deste trabalho. Em especial ao Professor Márcio Ajudarte Lopes e aos funcionários Rogério de Andrade Elias, Aparecida Campion, Daniele Castelli, João Carlos da Silva Júnior, Fabiana Facco Casarotti, Geovania Almeida e Adriano Luis Martins. A todos os profissionais da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de Campinas.
À Faculdade de Odontologia de Araçatuba (UNESP) pelos primeiros passos e à todos os seus funcionários, em especial aos membros do Departamento de Patologia e Propedêutica Clínica, especialmente à Professora Doutora Renata Callestini Felipini, Professora Doutora Ana Maria Pires Soubhia, Professor Doutor Alvimar Lima de Castro e ao Professor Doutor Glauco Issamu Miyahara, que me despertaram para o universo da ciência e do diagnóstico bucal, por sempre incentivarem o meu crescimento pessoal e profissional.
Ao Serviço de Odontologia Oncológica do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP), em especial à querida Doutora Ana Carolina Prado Ribeiro e Silva e Doutora Adriele Ferreira Gouvêa Vasconcellos por compartilharem suas experiências e contribuírem para minha formação, a todos os profissionais da equipe que de diversas maneiras contribuíram para realização deste trabalho e a todos os pacientes, exemplos de luta e superação.
Ao Serviço de Radioterapia do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP) e a todos seus funcionários pela valiosa colaboração em especial à Gisela Menegucci, Coordenadora do Serviço de Física Médica do ICESP e ao Doutor Gilberto de Castro Junior do Serviço de Oncologia Clínica do ICESP.
Aos amigos conquistados ao longo da pós-graduação, Lara Maria Alencar, Wilfredo Arriagada, Nathália Lima, Katya Díaz, Camilla Borges, Roberta Galetti e Karen Graner. Agradecimento especial ao amigo Mestrando Rodrigo Neves da Silva, recordo que no início éramos apenas nomes na lista de aprovação,
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desconhecidos, assustados, durante o curso experimentamos os desafios e as boas sensações que a pós-graduação nos permite, ultrapassando os obstáculos que, muitas vezes pareciam intransponíveis, assim agradeço pela atenção e por esta amizade que espero levar por toda a vida. A todos os colegas pós-graduandos do Programa de Estomatopatologia, pelo convívio, oportunidade de poder desfrutar de uma Universidade referência em pesquisa, ensino e por compartilhar os aprendizados.
A Gustavo Morelli, Mário Morelli, Maria Paula dos Santos Morelli, Tatiana Morelli, Davison Venâncio Santana, Ana Júlia Morelli Santana e Helena Morelli Santana, pessoas muito queridas por mim, que com tanto amor e carinho me acolheram em suas vidas durante os últimos cinco anos, revigorando as minhas energias, deixando os meus dias confortáveis e os preenchendo de ternura e felicidade.
A querida “Vó Santina” e a todos os membros da família Santos pela atenção que sempre me estimaram e por me tornarem parte da família.
Ao amigo Dr. Henrique Luiz Savoi, sempre amável, exemplo de dedicação, experiência e excelência em odontologia. Agradeço pelo carinho e apoio.
À Giselle Ribeiro e Marcele Jardim Pimentel, minhas companheiras de república e irmãs de coração, pela confiança, apoio emocional, momentos de descontração, incentivo e contribuição para o meu aprendizado.
A todos os amigos conquistados ao longo dos anos em minha vida, em especial as inesquecíveis Milla Melo, Thereza Abdalla Veríssimo, Tarcilla Fleury e Rafaella Santiago. Aos saudosos amigos da 53° Turma de Odontologia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, em especial as amigas Carla Oliveira
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Favretto, Amanda Matheus, Ila Flávia, Ana Flávia Signoreli, Adriana Diniz e Talita Begalli que sempre torceram pelo meu sucesso.
A todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho ou estiveram presentes em minha vida contribuindo para o meu crescimento pessoal e profissional.
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"Desistir... eu já pensei seriamente nisso, mas nunca me levei realmente a
sério; é que tem mais chão nos meus olhos do que o cansaço nas minhas
pernas, mais esperança nos meus passos, do que tristeza nos meus ombros,
mais estrada no meu coração do que medo na minha cabeça.”
Cora Coralina
xiii RESUMO
O tratamento do câncer de cabeça e pescoço está associado a uma série de toxicidades bucais. Neste contexto, evidências clínicas recentes demonstraram que a radioterapia em cabeça e pescoço provoca alterações na microvascularização e na inervação pulpar. Entretanto, estas alterações não foram demonstradas por meio de estudos morfológicos do tecido pulpar oriundo de pacientes oncológicos. Portanto, esta dissertação se propôs a investigar os efeitos diretos da radioterapia sobre a microvascularização, a inervação e a matriz extracelular da polpa de pacientes com câncer de cabeça e pescoço que foram submetidos à radioterapia. Foram utilizadas 40 amostras de polpa dental humana que foram divididas em dois grupos. No grupo irradiado, foram utilizadas 23 amostras de polpa obtidas de pacientes que haviam concluído radioterapia na região de cabeça e pescoço. O grupo controle foi composto por 17 amostras de polpas obtidas de pacientes sem histórico de radioterapia. Os espécimes dos dois grupos foram processados histologicamente e submetidos à coloração por meio da técnica da hematoxilina e eosina para avaliação morfológica da microvascularização, da inervação e da matriz extracelular das polpas. Adicionalmente, foi realizada análise da expressão imunoistoquímica (IHQ) de proteínas relacionadas à vascularização (CD-34 e actina músculo liso), à inervação (S-100; NCAM/CD56 e neurofilamento) e à matriz extracelular (vimentina) da polpa. O estudo morfológico identificou a presença e a preservação da microvasculatura, dos feixes neurais e da matriz extracelular em todas as amostras. A análise IHQ confirmou os achados morfológicos e demonstrou expressão preservada dos marcadores analisados em todas as amostras. Em conclusão, os efeitos diretos da radioterapia não são capazes de gerar alterações morfológicas na microvasculatura, na inervação e na matriz extracelular da polpa dental de pacientes com câncer de cabeça e pescoço.
Palavras-chave: Dentes, Polpa dentária, Radioterapia, Cáries, Câncer Bucal, Efeitos Colaterais.
xiv ABSTRACT
The treatment of head and neck cancer is associated with a series of oral toxicities. In this context, recent clinical evidence demonstrated that head and neck radiotherapy causes changes in the microvasculature and innervation. However, such changes have not been demonstrated by morphological studies of the pulp tissue derived from cancer patients. Therefore, this essay aimed to investigate direct effects of radiation on the microvasculature, innervation and extracellular matrix of the pulp from patients with head and neck cancer who underwent radiotherapy. Forty samples of human dental pulp were used and were divided into two groups. In the irradiated group, 23 samples from patients who concluded head and neck radiotherapy were used. The control group was composed with 17 pulp samples obtained from patients without previous history of radiotherapy. Samples from both groups were histologically processed and stained with hematoxylin and eosin for a morphological evaluation of the microvasculature, innervation and extracellular matrix of the pulps. Subsequently, an immunohistochemical (IHC) analysis of proteins related to vascularization (CD-34 and smooth muscle actin), innervation (S-100, NCAM/CD56 and neurofilament) and extracellular matrix (vimentin) of the pulps was performed. The morphological study identified the presence and preservation of the microvasculature, nerve bundles and extracellular matrix of all studied samples. The IHC analysis confirmed the morphological findings and demonstrated a preserved expression for the studied markers in all samples. In conclusion, direct effects of radiotherapy are not able to generate morphological changes in the microvasculature, innervation or extracellular matrix of the dental pulp from patients with head and neck cancer. Keywords: Teeth, Dental Pulp, Radiotherapy, Caries, Oral cancer, Side Effects.
xv SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1 2. REVISÃO DA LITERATURA 3 3. PROPOSIÇÃO 19 4. MATERIAL E MÉTODOS 20 5. RESULTADOS 27 6. DISCUSSÃO 53 7. CONCLUSÃO 61 REFERÊNCIAS 62 ANEXO 1 72 ANEXO 2 73
1 1. INTRODUÇÃO
O câncer de cabeça e pescoço envolve uma série de tumores que podem ser classificados por sua localização; sistema nervoso central, cavidade nasal, seios paranasais, nasofaringe, cavidade oral, orofaringe, hipofaringe, laringe, e glândulas salivares, entre outros (Argiris et al., 2008). O tratamento das neoplasias malignas de cabeça e pescoço pode ser realizado por meio de cirurgia, radioterapia e quimioterapia e em muitas vezes com a combinação de mais de uma destas modalidades (Huber; Terezhalmy, 2003). O efeito terapêutico da radiação ionizante é eficiente para o controle e a eliminação dos tumores malignos destas regiões do corpo humano, entretanto, esta eficiência é obtida à custa de uma série de toxicidades agudas e crônicas aos tecidos adjacentes aos tumores (Iver; Balasubramanian, 2012).
A qualidade de vida durante e após o tratamento radioterápico em cabeça e pescoço pode ser drasticamente diminuída devido aos efeitos colaterais que afetam a boca, destacando-se a mucosite, a hipossalivação, o trismo, a cárie relacionada à radioterapia (CRR), a osterradionecrose, entre outras (Sciubba; Goldenberg, 2006, Walker et al., 2011). A CRR representa a complicação dentária de maior relevância no contexto da radioterapia em cabeça e pescoço e está associada à amputação generalizada de coroas dentárias e prejuízo na função mastigatória na maioria dos casos não diagnosticados e não tratados precocemente (Springer et al., 2005, Kielbassa et al., 2006).
Outra potencial complicação dentária da radioterapia de cabeça e pescoço é a condição pulpar dos pacientes que, para alguns pesquisadores, é afetada negativamente pelos efeitos diretos da radiação que seriam capazes de diminuir a vascularização da polpa, com a possibilidade de desencadear fibrose da matriz extracelular gerando, finalmente, alterações no padrão de resposta aos estímulos térmicos e elétricos (Kim, 1985; Katakoa et al., 2011; Katakoa et al., 2012). Esta possível toxicidade pulpar baseia-se no fato dos dentes, na grande maioria dos
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casos, estarem dentro do campo de radiação que é desenhado para o tratamento das neoplasias malignas de cabeça e pescoço.
Em 2011, Kataoka et al. avaliaram os níveis de saturação de oxigênio (%SpO2) na polpa dentária de pacientes com neoplasias malignas de cavidade oral e orofaringe que receberam radioterapia, demonstrando que a média de %SpO2 na polpa antes da radioterapia foi maior do que durante o tratamento, porém os valores obtidos 4 a 5 meses após o término da radioterapia foram próximos aos valores coletados antes do início tratamento, concluindo que a diminuição na saturação de oxigênio e possivelmente na microvascularização pulpar, associada à radioterapia em cabeça e pescoço é transitória. O mesmo grupo de pesquisadores, em um segundo trabalho de pesquisa, realizou teste de vitalidade pulpar em dentes de pacientes com câncer de cabeça e pescoço que foram submetidos à radioterapia e concluíram que a radiação ionizante diminuiu a resposta ao teste de sensibilidade térmica em pacientes que receberam doses superiores a 30-35 Gy de radiação (Kataoka et al., 2012).
Apesar de existir evidência clínica da diminuição da vascularização e da sensibilidade pulpar em pacientes tratados por radioterapia na região de cabeça e pescoço, até o momento, são raros os estudos morfológicos publicados que se concentraram em analisar o potencial da radioterapia em causar alterações na polpa de pacientes oncológicos. Diante do exposto, esta dissertação se propôs a investigar esta problemática recorrendo à análise morfológica baseada em histologia e ao estudo imunoistoquímico (IHQ) dos componentes estruturais fundamentais da polpa dental de pacientes que concluíram radioterapia em cabeça e pescoço. Este estudo testou a hipótese de que os efeitos diretos da radioterapia na região de cabeça e pescoço são capazes de gerar alterações morfologicamente detectáveis na microvasculatura, na inervação e na matriz extracelular da polpa de pacientes oncológicos.
3 2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Considerações gerais
O câncer de cabeça e pescoço corresponde ao sexto tipo de câncer mais comum na população mundial sendo que a grande maioria dos casos, cerca de 90%, é classificada como carcinoma espinocelular (Duvvuri; Myers, 2009). Os carcinomas espinocelulares podem se desenvolver em diversos locais da região de cabeça e pescoço, que – por sua vez – podem ser didaticamente agrupados em sete áreas fundamentais: 1. cavidade oral (lábios, mucosa jugal, língua, assoalho bucal, palato, gengiva e trígono retromolar); 2. faringe (orofaringe, nasofaringe e hipofaringe); 3. laringe (laringe supraglótica, cordas vocais e laringe subglótica); 4. cavidade nasal; 5. seios paranasais (seio maxilar, seio etmoidal, seio esfenoidal e seio frontal); 6. glândulas salivares e 7. neurocrânio (Matzinger et
al., 2009). Os fatores de risco mais importantes para os carcinomas
espinocelulares de cabeça e pescoço são o consumo de tabaco e álcool. Outros fatores de risco como infecção pelo papiloma vírus humano, dieta e susceptibilidade genética também estão relacionados com a patogênese dos carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço (Pelucchi et al., 2008, Hashible
et al., 2009).
As taxas de incidência e mortalidade para o câncer de boca variam de um país para outro e também dentro de um mesmo país. Em linhas gerais, essas variações acontecem pelas diferenças de hábitos, características socioeconômicas, expectativa de vida, fatores ambientais, educação preventiva e acessibilidade de assistência médica e odontológica nas diversas regiões (Brener
et al., 2007). Em 2013 no Brasil, foram estimados 9.900 novos casos de câncer
bucal em homens e 4.180 em mulheres (INCA, 2012).
O carcinoma espinocelular de boca tem um padrão predominantemente local e regional de crescimento e de expansão metastática, fato que direciona os
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métodos de tratamento principalmente para abordagens cirúrgicas que quase sempre são complementadas por radioterapia (Duvvuri; Myers, 2009).
A cirurgia ainda é considerada o tratamento primário para grande parte dos casos de carcinoma espinocelular de boca. Contudo, esta técnica muitas vezes é limitada nos casos de tumores avançados loco-regionalmente onde o envolvimento de estruturas anatômicas (como nervos, vasos e artérias de calibres expressivos) pode contraindicar sua utilização (Brener et al., 2007). Nestas situações, a radioterapia é etapa fundamental do tratamento e pode ser utilizada de modo neoadjuvante, adjuvante, curativa ou paliativa (Lefebvre, 2006).
O tratamento radioterápico está associado ao controle de tumores malignos e a altas taxas de cura para tumores em estágio inicial de desenvolvimento (Denham et al., 2003). Um evidente aprimoramento nas taxas de sucesso terapêutico de casos avançados de câncer bucal foi obtido recentemente com a introdução da radioquimioterapia, modalidade em que a quimioterapia é aplicada antes da radioterapia (quimioterapia de indução), concomitante à radioterapia (radioqumioterapia) ou após o tratamento radioterápico (quimioterapia adjuvante) (Bucheler et al., 2012).O objetivo desta modalidade é reduzir o tamanho do tumor, reduzir o risco de metástases e potencializar a atividade citotóxica da radiação contra o tumor (Sheets et al., 2013), entretanto, esta associação é notoriamente associada a maior prevalência e intensidade de toxicidades agudas e crônicas em boca.
2.2. Radioterapia
Como mencionado anteriormente nesta dissertação a radioterapia é uma importante modalidade terapêutica direcionada para o tratamento do câncer de cabeça e pescoço. Seu efeito terapêutico é atribuído à ação deletéria no DNA das células tumorais por meio da formação de pares de íons, espécies reativas de oxigênio e radicais hidroxilas que ocasionam morte celular. O tratamento radioterápico para esta doença consiste na aplicação de frações diárias de
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aproximadamente 2 Gy (Gray é a unidade de medida que representa a dose final de radiação absorvida pelo tecido). Em geral, o protoloco de 2 Gy diário se estende por 5 dias por semana até uma dose total de 70 Gy (aproximadamente 7 semanas de tratamento) (Huber; Terezhalmy, 2003). O maior desafio do tratamento radioterápico na região de cabeça e pescoço é alcançar o controle da doença gerando o mínimo de toxicidade para os tecidos normais que estão dentro do campo de radiação e morbidade mínima para o paciente (Thariat et al., 2011). Nos últimos 50 anos os protocolos de radioterapia utilizados foram baseados principalmente em fótons e elétrons, porém, recentes avanços tecnológicos mudaram drasticamente a gestão de radioterapia oncológica por meio do uso de aceleradores lineares e maior seletividade da entrega de dose para a região desejada (tumor) (Thariat et al., 2011). A título de exemplo, o advento da radioterapia conformacional e da radioterapia de intensidade modulada (RIM) permitiu que o planejamento do tratamento fosse realizado por meio de exames de imagens tridimensionais (tomografias computadorizadas, ressonâncias magnéticas e pet scans) proporcionando direcionamento dos feixes de radiação para o volume tumoral e reduzindo as doses de radiação para os tecidos não-alvo adjacentes ao tumor diminuindo os efeitos colaterais (Argiris et al., 2008).
Tecnologias modernas no campo da radioterapia como a RIM não são realidade na maioria dos serviços de oncologia por possuírem elevado custo de implementação e manutenção. Desta forma, as toxicidades bucais em função das altas doses de radiação ionizante absorvidas pelos tecidos sadios adjacentes ao tumor, como os dentes, persistem representando um importante desafio para a odontologia e gerando impacto negativo na qualidade de vida dos pacientes (Kielbassa et al., 2006, Sheets et al., 2013).
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2.3. Toxicidades bucais associadas à radioterapia em cabeça e pescoço
Aproximadamente dois terços dos pacientes diagnosticados com câncer de cabeça e pescoço no mundo apresentam doença avançada no momento do diagnóstico e, consequentemente, são tratados por meio de cirurgia associada a altas doses de radioterapia e quimioterapia (Sciubba; Goldenberg, 2006, Sheets et
al., 2013).
As toxicidades da radioterapia em boca podem ser divididas didaticamente em dois grupos: 1. toxicidades agudas (aquelas que acontecem durante o curso da radioterapia ou até aproximadamente 3 meses após sua conclusão) e 2. toxicidades crônicas que são identificadas aproximadamente 3 meses após o fim da radioterapia e podem persistir por anos após o fim do tratamento radioterápico (Rzeszowska-Wolny et al., 2009; Bucheler et al., 2012).
De um modo geral, as toxicidades da radioterapia estão relacionadas à extensão do segmento corporal que será atingida pela radiação ionizante direcionada para o tumor (conhecida como campo de radiação) e à dose de radiação que incidirá sobre o tumor e áreas adjacentes. Atualmente métodos sofisticados de imagem podem ser utilizados para que seja realizado o desenho tridimensional do tumor e estudada sua relação com as estruturas anatômicas vizinhas. Logo é realizada uma estimativa semelhante ao volume tumoral e é possível simular qual a dose total de radiação que será entregue ao tumor bem como aos tecidos adjacentes. Contudo, a despeito destes avanços tecnológicos no planejamento da radioterapia, o campo de radiação é diretamente relacionado ao tamanho do tumor portanto quanto maior a extensão tumoral, mais amplo será o campo de radiação (atingindo mais estruturas adjacentes ao tumor) e maior a dose de radiação prescrita – consequentemente, maior será o risco de desenvolvimento de toxicidades agudas e crônicas aos tecidos normais que estiverem dentro do campo de radiação (Basu et al., 2012).
Tomando como exemplo um tumor a ser irradiado que esteja localizado na base da língua, as glândulas salivares maiores parótida e submandibular estarão
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localizadas muito próximas do sítio do tumor primário e também dentro do campo de radiação, bem como a articulação têmporo-mandibular, alguns músculos da mastigação, um segmento da mandíbula, dentes, mucosa oral e orofaríngea, entre outros. No caso em questão, quanto maior for o tamanho do tumor de base de língua, maior será o campo de radiação desenhado para o tratamento e, possivelmente, mais estruturas normais da face e boca estarão incluídas no campo irradiado, recebendo uma dose de radiação muito próxima daquela prescrita para a base da língua. Portanto, maior será a chance do desenvolvimento de toxicidades da radioterapia em boca, orofaringe e adjacências. Em resumo, as toxicidades da radioterapia à mucosa bucal estão diretamente relacionadas com a dose de radiação, com o volume de tecido irradiado (campo de radiação), com o fracionamento da radioterapia e com o tipo de radiação ionizante aplicada (Maciejewski et al., 1991; Scully; Epstein, 1996; Denham et al., 1999; Handschel et al., 1999).
Os principais efeitos agudos da radioterapia em cabeça e pescoço incluem mucosite, hipossalivação, disfagia, disgeusia e infecções na mucosa oral (candidose). Os principais efeitos crônicos incluem hipossalivação, trismo, cárie relacionada à radioterapia e osteorradionecrose (Hancock et al., 2003).
A mucosite oral induzida pela radioterapia é caracterizada por eritemas e úlceras que são observadas nos pacientes cujo campo de radiação envolva a cavidade oral. Protocolos de tratamento baseados na quimiorradioterapia estão associados a quadros mais graves de mucosite. Os casos graves de mucosite são aqueles cujas úlceras estão difusas em mucosa oral e faríngea, causam dor intensa, dificuldade de deglutição, desidratação, perda de peso, bacteremia e febre persistente (Jang et al., 2013). Este fato pode culminar na interrupção da radioterapia para que o paciente tenha suas funções orgânicas restabelecidas. Interrupções na radioterapia, por sua vez, resultam no prolongamento do tempo de tratamento, na redução do efeito terapêutico da radioterapia e no impacto negativo no prognóstico da doença (Vissink et al., 2003). Além disso, a mucosite grave pode aumentar significativamente os custos hospitalares por que os pacientes
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geralmente necessitam de vários dias de internação para controle da bacteremia, da dor por meio da prescrição de analgésicos opióides e do déficit nutricional por meio de sondas nasogástricas (Jang et al., 2013).
A xerostomia é uma queixa comum para os pacientes submetidos ao tratamento radioterápico em cabeça e pescoço e está associada a um impacto negativo na qualidade de vida desta população por dificultar a deglutição (disfagia), limitar a fala, predispor o paciente a infecções recorrentes em mucosa bucal que geram dor. Alterações no paladar (disgeusia) limitam a escolha de alimentos (Jensdottir et al., 2012; Kakoei et al., 2012) além disso, a redução do fluxo salivar secundária à toxicidade da radiação às glândulas salivares gera mudanças na composição salivar que estão relacionadas ao aumento da atividade cariogênica e à erosão dentária. Dreizen et al., (1977) demonstraram que a taxa de fluxo salivar reduz de maneira considerável após aproximadamente 6 semanas do início da radioterapia em cabeça e pescoço e esta redução é acompanhada por um aumento à suscetibilidade de cárie (CRR) (Jensdottir et al., 2012).
Em 2011, Walker et al., correlacionaram a dose de radiação com a toxicidades às glândulas salivares e alterações dentárias (erosão e cárie) em 93 pacientes que realizaram radioterapia em cabeça e pescoço. Eles observaram poucas alterações dentárias nos dentes de pacientes que receberam doses abaixo de 30 Gy, entretanto, associaram um risco maior para pacientes submetidos a doses entre 30 Gy e 60 Gy - nestes casos, as alterações dentais estariam relacionadas com as modificações na quantidade e qualidade salivar decorrente do dano radiogênico ao parênquima das glândulas salivares. Estes autores concluíram ainda que doses iguais ou superiores a 60 Gy seriam capazes de gerar erosão e cárie nos dentes em decorrência dos efeitos diretos da radiação à estrutura dentária, incluindo esmalte, dentina e polpa.
A osteorradionecrose é caracterizada pela exposição de tecido ósseo necrótico que não cicatriza espontaneamente por pelo menos 3 meses, em pacientes que realizaram radioterapia em cabeça e pescoço (Marx, 1983). Clinicamente, pode estar associada a infecção, dor, fístulas orofaciais, exposição
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óssea intra ou extra-oral, fratura patológica e supuração. Esta complicação da radioterapia acomete com maior frequência a região posterior da mandíbula, talvez pela menor vascularização e maior compactação óssea desta região, sendo atribuída principalmente a extrações pré ou pós-radioterapia (Reuther et al., 2003). Entretanto, a osteorradionecrose pode se desenvolver espontaneamente pós radioterapia em qualquer local da mandíbula ou maxila (Chrcanovic et al., 2010).
A principal estratégia preventiva para a CRR e a osteorradionecrose é a avaliação e o tratamento odontológico prévio ao início do tratamento com eliminação de todo foco de infecção instalado (Jham et al., 2008) assim como a avaliação, tratamento odontológico trans e pós radioterapia e orientação periódica ao paciente. Estes protocolos de prevenção e cuidados odontológicos são aplicados de modo sistemático em poucos serviços hospitalares, justificando as precárias condições bucais de grande parte dos pacientes com malignidades de cabeça e pescoço que foram tratados por radioterapia. Fato que gera com frequência a necessidade de extrações dentais mesmo após o término da radioterapia (Sulaiman et al., 2003; Koga et al., 2008).
É relevante mencionar que os tecidos normais da boca que farão parte do campo de radiação como dentes, glândulas salivares, mucosa oral, músculos da mastigação e tecido ósseo devem ser avaliados sistematicamente antes, durante e depois da radioterapia para que as possíveis toxicidades do tratamento sejam prevenidas ou diagnosticadas precocemente, permitindo o suporte e cuidados imediatos (Hancock et al., 2003).
2.4. Cárie relacionada à radioterapia
A CRR é uma forma potencialmente destrutiva de cárie que afeta pacientes com histórico prévio de radioterapia em cabeça e pescoço, caracterizada por início e progressão rápidos e clinicamente as lesões de CRR tem início nas superfícies lisas de esmalte com predileção para a região cervical dos dentes. Afetam inicialmente regiões geralmente resistentes à cárie em indivíduos não expostos à
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radiação ionizante como face vestibular, lingual e incisal dos dentes anteriores (Specht, 2002, Kielbassa et al., 2006). O desenvolvimento das lesões tem início geralmente de 3 a 6 meses após o final do tratamento radioterápico em cabeça e pescoço e quando não diagnosticadas e tratadas precocemente costumam progredir para a destruição de todos os dentes e amputação das coroas dentárias em um curto período de tempo (poucos meses a 1 ano) (Jham et al., 2008). É oportuno mencionar que a CRR não tratada ocasiona focos de infecção que predispõem o desenvolvimento da osteorradionecrose.
As toxicidades bucais da radioterapia, sobretudo aquelas que afetam tecido mole, parecem desempenhar um importante papel para o desenvolvimento da CRR. A mucosite provoca dor e desconforto, que costumam levar à limitação da higiene oral e ao um aumento no consumo de alimentos pastosos e ricos em carboidratos (maior potencial cariogênico). A hipossalivação, a disfagia e a disgeusia também costumam induzir o paciente a escolher alimentos pastosos e ricos em açúcar (Kielbassa et al., 2006). Em conjunto com estas alterações em tecido mole, as mudanças na composição da saliva, a redução da capacidade de tamponamento e aumento da viscosidade resultam em alterações na flora bucal com aumento de microrganismos cariogênicos e acidogênicos (Streptococcus
mutans, Lactobacillus e Candida sp) (Keene et al., 1981, Tolentino et al., 2011).
Este agregado de sintomas bucais decorrente da toxicidade da radiação à boca gera um ambiente altamente cariogênico e foi recentemente sugerido por nossa equipe como um importante evento para explicar o início e a rápida progressão da CRR (Santos-Silva et al., 2011, Ribeiro et al., 2013).
Apesar da evolução rápida e destrutiva, a CRR não está clinicamente associada à sintomatologia dolorosa nos dentes dos pacientes afetados. Em adição a esta evidência, o perfil atípico de desenvolvimento da CRR fez com que diversos pesquisadores considerassem que a CRR fosse resultado de efeitos deletérios diretos da radiação ionizante sobre o esmalte, a dentina e polpa dos dentes que estariam dentro do campo de radiação (Grötzet et al., 1998; Al-Nawas
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estudos recentes desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa descreveram os padrões microscópicos de desenvolvimento e progressão da CRR e demonstraram que a dentina irradiada preserva a atividade reparadora em resposta à progressão da CRR por meio da deposição de dentina reacional e de dentina intra-tubular, eventos dependentes da viabilidade dos odontoblastos da polpa dental. Não foi encontrada evidência microscópica do impacto da radiação sobre o padrão morfológico da CRR que se desenvolve de modo semelhante à cárie convencional (Silva, 2008; Silva et al., 2009; Santos-Silva et al., 2011).
Apesar dos resultados supramencionados sugerirem que a CRR seria uma doença multifatorial e resultante principalmente dos efeitos indiretos da radiação sobre os dentes, evidências científicas oriundas de estudos in vitro sugerem que a radioterapia teria a habilidade de causar danos diretos ao complexo dentino-pulpar dos dentes irradiados, o que modificaria o tecido pulpar e comprometeria a capacidade de resposta contrária à progressão da CRR (Açil et al., 2005; Springer
et al., 2005). Contudo, esta hipótese de toxicidade direta na polpa pela
radioterapia ainda não foi suficientemente investigada pela perspectiva da morfologia da estrutura dos componentes da polpa de pacientes oncológicos irradiados em cabeça e pescoço.
2.5. A polpa dentária
A polpa dentária tem origem mesenquimal, sendo um tecido conjuntivo frouxo altamente especializado, vascularizado e inervado. As células mais abundantes no tecido pulpar são os fibroblastos, no entanto, as células endoteliais, as fibras neurais, as células do sistema imunológico (linfócitos T, macrófagos e células dendríticas) e as células mesenquimais indiferenciadas também são constituintes importantes da polpa (Okiji 2002; Goldberg; Smith, 2004). A morfologia microscópica da polpa basicamente se organiza em uma região central caracterizada pela presença de vasos sanguíneos, fibroblastos e feixes neurais. A região central é circundada por uma “zona rica em células”
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(constituída fundamentalmente por fibroblastos) e uma região mais externa (sub-odontoblástica) conhecida como “zona Weil” (região mais periférica da polpa que é pobre em células e contém fibras neurais e vasos sanguíneos de menor calibre).
No limite entre a polpa e a dentina existe uma população celular essencial para os mecanismos de manutenção dos dentes, denominada como camada odontoblástica. As células mesenquimais indiferenciadas responsáveis pela diferenciação dos odontoblastos e dos fibroblastos estão distribuídas por todo tecido pulpar, preferencialmente ao redor dos vasos sanguíneos, entretanto, não são distinguíveis morfologicamente dos fibroblastos pulpares (Mjor et al. 200, Okiji 2002). Anatomicamente, a polpa encontra-se envolta por uma rígida estrutura de dentina, isto a torna um ambiente muito particular no que diz respeito aos processos patofisiológicos. As quatro funções principais da polpa são: 1. Formadora (produção de dentina); 2. Nutritiva (vascularização para manutenção do tecido orgânico mineralizado); 3. Defensiva (formação de dentina reacional ou reparadora); 4. Sensorial (resposta aos estímulos nocivos por meio da dor) (Van Hassel, 1971; Syngcuk, 1985; Trowbridge, 1986; Tziafas et al., 2000; Goldberg; Smith, 2004; Nakashima et al., 2009, Demarco et al., 2011).
A microvascularização pulpar é composta por arteríolas, capilares e vênulas. Desempenha um papel importante na nutrição, no transporte de oxigênio e de resíduos metabólicos oriundos da polpa. Os vasos pulpares respondem aos agentes vasodilatadores de uma maneira singular, por que enquanto a vasodilatação nos tecidos em geral é uma ação defensiva que promove sobrevivência durante a reação inflamatória, na polpa a vasodilatação pode levar a necrose devido a uma intensa vasoconstrição secundária que é característica da polpa. O fluxo vascular é mais concentrado na polpa coronária do que na radicular e a presença de vasos linfáticos na polpa é controversa (Kim, Dorscher, 1989; Nakashima et al., 2009).
As fibras neurais adentram a polpa radicular por meio do ápice dental; as fibras desmielinizadas são responsáveis pela vasoconstrição (sistema nervoso autônomo) e as fibras mielinizadas controlam a sensação de dor. Geralmente, na
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região da camada sub-odontoblástica as fibras neurais perdem a camada de mielina e ficam cobertas apenas pelas células de Schwann, formando terminações nervosas conhecidas como plexo de Raschkow onde é possível observar algumas fibras neurais que penetraram nos túbulos dentinários. O estímulo de dor é associado ao rápido deslocamento de fluidos no interior dos túbulos dentinários decorrente de estímulos externos que provocam alterações mecânicas transitórias no tecido pulpar próximo à dentina (Gopikrishna et al., 2009, Nakashima et al., 2009). Dois tipos de fibras sensoriais estão presentes na polpa, as fibras mielinizadas (fibra A) que correspondem a aproximadamente 20% das fibras neurais da polpa e as fibras não mielinizadas (fibras C) que representam aproximadamente 80% das fibras neurais pulpares. As fibras A se localizam preferencialmente na periferia do tecido pulpar e respondem aos estímulos hidrodinâmicos que afetam a dentina e geram dor aguda, pulsátil e rápida. As fibras do tipo C tem localização preferencialmente central no tecido pulpar, inervando o corpo da polpa e possuindo um limiar de sensibilização maior por estímulos mecânicos ou térmicos mais intensos que atingem diretamente a polpa dentária gerando dor difusa e lenta (Olgart, 1974; Byers, 1974). Na polpa, as fibras neurais apresentam uma exímia relação de colaboração com a microvasculatura e contribuem para a angiogênese, para o extravasamento de células do sistema imunológico para regular a inflamação, para a manutenção da homeostase do tecido pulpar, e – consequentemente – para os mecanismos de defesa da polpa. Assim, a angiogênese e a neurogênese são fundamentais para a regeneração da população celular que constitui a polpa dental humana (Gopikrishna et al., 2009, Nakashima et al., 2009).
Os fibroblastos são as células predominantes da polpa dental e são responsáveis pela síntese e secreção de componentes da matriz extracelular da polpa. Eles se caracterizam por morfologia fusiforme ou estrelada com evidentes prolongamentos citoplasmáticos e grande quantidade de organelas. Evidências sugerem que polpas de pacientes jovens são caracterizadas por tecido conjuntivo mais frouxo, rico em fibroblastos, enquanto o envelhecimento pulpar seria
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caracterizado por maior deposição de colágeno (fibrose) por parte dos fibroblastos que estariam diminuídos em número nas polpas de pacientes senis (Arana-Chavez; Massa, 2004).
Os odontoblastos derivam das células ectomesenquimais, são células colunares dispostas em paliçada que se organizam de forma contínua ao longo da periferia da polpa dentária, em contato com os túbulos dentinários, emitindo prolongamentos (fibrilas de Tomes) que adentram a dentina. Estas células são altamente diferenciadas e especializadas na produção de dentina primária, secundária e terciária, desempenhando importante papel na manutenção da integridade do dente, devido à sua capacidade de deposição de novas camadas de dentina ao longo da vida. Embora os mecanismos exatos envolvendo a sensibilidade dentinária e dor dentária não estejam bem estabelecidos, acredita-se que os odontoblastos desempenham um papel fundamental considerando que eles possam colaborar na condução de impulsos nervosos (Arana-Chavez; Massa, 2004).
As células mesenquimais indiferenciadas (células-tronco) da polpa dentária são células morfologicamente semelhantes aos fibroblastos que se localizam preferencialmente ao redor dos vasos sanguíneos, entretanto, possuem uma propriedade de diferenciação dinâmica com capacidade de diferenciação osteogênica, miogênica, odontogênica, adipogênica e neurogênica. Devido à sua capacidade de pluripotência, essas células apresentam elevado potencial para aplicações clínicas em virtude de serem facilmente obtidas a partir de dentes descartados após extração ou esfoliação (Ranganathan; Lakshminarayanan, 2012).
Além das populações celulares supramencionadas, a polpa dental humana é constituída por uma complexa matriz extracelular que funciona como meio de transporte para os nutrientes provenientes da microvascularização pulpar, armazenando proteoglicanas e água para os feixes neurais, vasos sanguíneos e células componentes da polpa (Nakashima et al., 2009).
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O maior constituinte da matriz extracelular pulpar são as fibras colágenas que formam o arcabouço de sustentação do tecido pulpar. Estas fibras são predominantemente do tipo colágeno I (60%) e se dispõem paralelamente umas às outras com maior concentração no terço apical da polpa. As fibras reticulares (colágeno tipo III) se concentram em torno dos vasos sanguíneos e as fibras elásticas estão dispostas nas paredes dos vasos da polpa (Arana-Chavez; Massa, 2004).
As calcificações distróficas são comumente encontradas de modo disperso na matriz extracelular da polpa e podem apresentar forma e extensão variadas. Histologicamente, o padrão das calcificações pulpares é amorfo e o material calcificado geralmente se encontra disposto em finas camadas paralelas e concêntricas. Acredita-se que calcificações da matriz extracelular pulpar possuem relação com a ocorrência de fatores irritantes locais de baixa intensidade, como trauma, cárie, restaurações extensas e associação com alguns distúrbios sistêmicos (Kansu et al., 2009).
2.6. Efeitos da radioterapia na polpa dentária
Até o presente momento, poucos trabalhos de pesquisa publicados na literatura científica se dedicaram a compreender os efeitos diretos da radioterapia sobre a polpa dental. Provavelmente, o primeiro trabalho desenvolvido neste contexto foi publicado em 1954, por Kalnis et al., que avaliaram morfologicamente os efeitos diretos da radiação pela técnica de ortovoltagem em polpas coronárias e radiculares de 4 dentes provenientes de um modelo experimental desenvolvido em um cão. Os autores observaram algumas mudanças discretas na microvascularização pulpar, como um aumento nas células endoteliais e o aumento na deposição de colágeno ao redor dos vasos sanguíneos. Os odontoblastos observados estavam morfologicamente preservados, mesmo após as polpas receberem doses superiores a 6.900 rads (69 Gy). Contudo, os autores destacaram que os resultados obtidos não foram suficientes para concluir se as
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mudanças ocorridas nas polpas foram ocasionadas por efeitos diretos da radiação.
Ainda na década de 50, com a introdução do Cobalto-60 como fonte de radiação terapêutica, a radioterapia passou a ser administrada de forma menos destrutiva aos tecidos normais presentes no campo de radiação (Burstone, 1950). Imbuídos deste conhecimento, Meyer et al., (1964) realizaram uma análise morfológica dos efeitos da técnica de radioterapia baseada no uso do Cobalto-60 (200 Kv) sobre as estruturas dentárias de 70 ratos. Os resultados demonstraram que os animais expostos a 2.040 rads (20,40 Gy) apresentaram necrose e hemorragia pulpar, calcificações em diferentes zonas da polpa, presença de infiltração inflamatória e danos aos fibroblastos. Portanto, diferente do que seria esperado, o uso de Cobalto-60 como fonte geradora de radiação em substituição à ortovoltagem resultou em alterações morfológicas mais evidentes no tecido pulpar.
Anos depois, Hutton et al., (1974) desenvolveram um modelo experimental animal de radioterapia baseado em macacos. Estes autores utilizaram duas maxilas de macacos que foram irradiadas com Cobalto-60 simulando doses terapêuticas que variaram de 3.000 (30 Gy) a 7.013 rad. (70,13 Gy). Após eutanásia dos animais, os autores estudaram amostras das polpas irradiadas e concluíram que não houve mudanças significativas na estrutura pulpar após a radiação. Destaca-se o fato de que já naquela ocasião os pesquisadores em questão concluíram que a falta de condições experimentais que pudessem simular o meio ambiente bucal dos pacientes irradiados em cabeça e pescoço (incluindo hipossalivação, dieta cariogênica e falta de higiene) valorizavam a necessidade de futuras investigações a respeito do efeito da radioterapia na polpa dental humana.
Com o argumento da carência de estudos que averiguassem a problemática dos efeitos da radioterapia na polpa de humanos, Anneroth et al., (1985) realizaram uma avaliação morfológica por descalcificação e análise por microscopia de luz óptica em 54 polpas de dentes humanos extraídos após a conclusão da radioterapia em cabeça e pescoço. Todos os 20 pacientes foram tratados por meio da técnica do Cobalto-60 e receberam doses variáveis entre 15
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e 70 Gy. Os autores observaram transformação metaplásica de tecido fibroso e formação de dentina secundária, entretanto, estas alterações morfológicas semelhantes foram observadas também nas polpas obtidas de dentes utilizados do grupo controle que não receberam radiação. Na ocasião, os autores não puderam afirmar que as alterações pulpares encontradas foram decorrentes da radioterapia, resposta às lesões de cárie ou tratamentos restauradores anteriores. Vier-Pelisser et al. (2007) avaliaram os efeitos diretos da radioterapia por Cobalto-60 sobre a morfologia das polpas dentárias de ratos. Os animais receberam dose total de 60 Gy e a eutanásia foi realizada em 2 tempos; imediatamente após o término da última sessão de radioterapia e 30 dias após a última sessão de radioterapia. Os autores concluíram que o tratamento radioterápico nos animais não provocou reações inflamatórias ou modificação na matriz extracelular da polpa já que o conteúdo colagenoso não apresentou alterações significativas. Entretanto, o núcleo de alguns fibroblastos e odontoblastos apresentaram vacuolização.
Recentemente, surgiram os primeiros estudos clínicos acerca das alterações pulpares relacionadas à radioterapia em cabeça e pescoço. Estes trabalhos encontraram alterações transitórias na microvascularização pulpar bem como alterações nos níveis de saturação de oxigênio da polpa. Em 2011, Kataoka
et al., realizaram um estudo prospectivo baseado no teste de oximetria de pulso
em dentes de pacientes submetidos à RIM em cabeça e pescoço e observaram que durante a radioterapia os pacientes que receberam doses acima de 30 Gy apresentaram diminuição dos níveis de saturação de oxigênio (%SpO2) e sugeriram diminuição na microcirculação pulpar. Porém, durante o acompanhamento pós-radioterapia, foi observado que após 4 a 5 meses do término da radioterapia os valores de saturação de oxigênio retornaram ao valor basal encontrado antes do inicio do tratamento radioterápico, demonstrando que o impacto da radioterapia na saturação de oxigênio foi apenas transitório.
Em 2012, Kataoka et al., realizaram um estudo prospectivo utilizando pacientes tratados por 2 técnicas diferentes; a radioterapia conformacional (3D) e
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a RIM e concluíram que a radiação ionizante entregue em doses superiores a 30-35 Gy foi capaz de gerar diminuição na resposta após o teste de vitalidade pulpar térmico, sem diferença entre as técnicas.
A tecnologia contemporânea utiliza aceleradores lineares para a radioterapia médica, operando em níveis de energia próximos de 20 meV (Chvetsov et al., 2013). Até o presente momento, não foram realizados trabalhos de pesquisa que se concentraram na avaliação morfológica das estruturas da polpa dental humana de pacientes tratados por radioterapia na região de cabeça e pescoço baseada no uso dos aceleradores lineares.
Frente aos resultados escassos e contraditórios expostos por esta revisão de literatura, é imperioso destacar a necessidade da realização de estudos complementares acerca dos efeitos diretos da radioterapia na região de cabeça e pescoço sobre a morfologia e a fisiologia da polpa dental humana de pacientes oncológicos, sobretudo nos aspectos relacionados às eventuais alterações na microvascularização e na inervação da polpa. Este estudo testou a hipótese de que os efeitos diretos da radioterapia na região de cabeça são capazes de gerar alterações morfologicamente detectáveis na microvasculatura, na inervação e na matriz extracelular da polpa dentária de pacientes oncológicos.
19 3. PROPOSIÇÃO
As finalidades desta dissertação encontram-se fundamentadas nos seguintes objetivos:
Objetivo geral:
Verificar se a radioterapia possui a capacidade de gerar alterações nos padrões morfológicos estruturais, microvasculares e de inervação da polpa dental humana irradiada in vivo.
Objetivos específicos:
i. Analisar e descrever por meio da microscopia de luz óptica convencional a morfologia da microvascularização, da inervação e da matriz extracelular de cortes histológicos corados pela técnica da hematoxilina e eosina;
ii. Avaliar a expressão imunoistoquímica de proteínas relacionadas à microvascularização (CD-34 e actina músculo liso);
iii. Avaliar a expressão imunoistoquímica de proteínas relacionadas à inervação (S-100; NCAM/CD56 e neurofilamento);
iv. Avaliar a expressão imunoistoquímica de proteínas relacionadas à matriz extracelular (vimentina);
v. Comparar os resultados obtidos nos estudos morfológicos e
20 4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Caracterização da amostra
A proposta de investigação realizada nesta dissertação foi avaliada e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP (FOP-UNICAMP), sob o protocolo 116/2011 (Anexo A) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, sob o parecer 191.171 (Anexo B).
A seleção dos pacientes e a coleta dos dentes foram realizadas com base nos protocolos descritos por Silva et al., (2009). Foram utilizadas 23 polpas para o grupo irradiado oriundas de dentes de 14 pacientes com histórico de câncer de cabeça e pescoço. Os pacientes que doaram os dentes para esta pesquisa haviam concluído radioterapia na região de cabeça e pescoço (com tempo mínimo de 6 meses) e apresentaram necessidade de extração dentária por causa de doença periodontal avançada. Todos os dentes foram obtidos de pacientes que foram tratados ou que foram assimilados para acompanhamento pós-tratamento no Serviço de Odontologia Oncológica do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo Octavio Frias de Oliveira (ICESP), São Paulo - SP, Brasil. Logo após a extração, os dentes foram acondicionados em recipientes plásticos com solução tamponada de formol a 10%.
Para caracterização clínica dos pacientes cujos dentes e polpas foram utilizados nesta dissertação, foi consultado o sistema de prontuário eletrônico do ICESP (Tasy). O planejamento da radioterapia de todos os pacientes foi verificado para estudo do campo de radiação e a dose total direcionada para o tumor primário. Foram utilizados apenas aqueles dentes que estavam dentro do campo de radiação. Posteriormente, foram coletadas as seguintes informações: idade, gênero, local do tumor primário, tipo histológico do tumor, estadiamento clínico da doença (TNM), tipo de radioterapia, dose de radiação em Gy prescrita para o tumor, período de tempo entre a conclusão da radioterapia e a extração dentária,
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presença do dente extraído no campo de radiação, tratamento quimioterápico e realização de adequação odontológica pré-radioterapia.
O Serviço de Odontologia Oncológica do ICESP realiza o procedimento de adequação odontológica na maioria absoluta dos pacientes que receberão radioterapia em cabeça e pescoço, contudo, apenas 5 pacientes avaliados neste estudo foram irradiados no ICESP, os outros 9 pacientes foram admitidos após terem realizado a radioterapia em Serviços externos e, portanto, não receberam adequação bucal prévia ao início da radioterapia.
Para o grupo controle (não irradiados), foram utilizados amostras coletadas junto ao banco de dentes do Serviço de Patologia Oral da FOP-UNICAMP. Esses dentes foram oriundos de espécimes como cistos odontogênicos, capuz pericoronário e tumores odontogênicos que foram submetidos para análise diagnóstica. Durante o processamento dos espécimes patológicos os dentes foram armazenados em um banco comum (acondicionados em um recipiente plástico com solução tamponada de formol a 10%). Foram obtidas 17 amostras de polpa, entretanto, não foi possível resgatar as informações clínicas como idade e gênero dos pacientes que cederam os dentes para o grupo controle.
4.2. Análise macroscópica e radiográfica
Inicialmente todos os 40 espécimes foram descritos de acordo com as características macroscópicas e submetidos à documentação fotográfica. Cada amostra foi identificada, codificada e classificada de acordo com o grupo anatômico de origem. Posteriormente, todos os espécimes foram radiografados de maneira padronizada. Os dentes foram posicionados individualmente em uma película radiográfica periapical para adultos, Kodak Ultra-speed (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA), com a coroa voltada para o picote do filme. Foi utilizado um aparelho de raios-x (Toshiba XR 6010, 127 V, 60 KV, 10 mAs, 60 Hz), com o tempo de exposição de 0,3 segundos e distância foco-filme de 15 cm.
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Todos os filmes radiográficos foram revelados no mesmo processador automático (Flat CO. Ltda. Japan, Level 300).
4.3. Preparo das amostras
Os 40 espécimes foram limpos com curetas periodontais para remoção de resíduos de tecido mole. Cada dente foi parcialmente seccionado no eixo longitudinal (plano vertical) com auxílio de um disco diamantado de alta concentração (Extec, Enfield, CT, USA) em cortadeira de precisão (Isomet 1000- Buehler Ltda., Lake Bluff, IL, USA) (Figura 1). Finalmente, com auxílio de um cinzel odontológico cirúrgico e por meio da técnica de clivagem o dente foi dividido em duas metades de modo que a polpa pudesse ser removida com auxílio de uma cureta cirúrgica (Figura 2). As amostras de polpa foram imediatamente fixadas em solução tamponada de formol a 10%.
Figura 1. Secção de um espécime do estudo com auxílio de disco diamantado para remoção da polpa.
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Figura 2. Espécime após manobra de clivagem, seccionado em duas metades, permitindo remoção da polpa dentária com auxílio de uma cureta. Note a presença de cárie cervical neste espécime do grupo irradiado.
4.4. Análise morfológica das polpas
Para a análise morfológica, todas as 40 polpas coletadas para os grupos: irradiado (n = 23) e controle (n = 17) foram submetidas a processamento histológico de rotina para inclusão em parafina e foram realizados cortes histológicos de 5 μm de espessura sendo posteriormente montados em lâminas de vidro para coloração por meio do método de hematoxilina e eosina (H.E). Três cortes histológicos de cada amostra foram digitalizadas no Laboratório de Patologia Oral da Faculdade de Odontologia de Piracicaba com auxílio do sistema Aperio ScanScope® CS (Aperio Technologies Inc., Vista, CA, US). Foi realizada análise histológica descritiva de toda extensão do tecido pulpar (desde a região mais coronária da polpa até a extremidade mais apical) para avaliação da presença e preservação morfológica dos seguintes parâmetros: vasos sanguíneos; feixes neurais e componentes da matriz extracelular da polpa (fibroblastos, fibrose, calcificação, necrose e células inflamatórias). A análise histológica foi realizada de modo independente por 2 avaliadores que
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desconheciam a origem dos espécimes avaliados (os três cortes da amostra foram codificados de modo a não permitir associação com o grupo de origem).
4.5. Análise imunoistoquímica das polpas
De modo complementar ao estudo morfológico da polpa, foi realizado um estudo imunoistoquímico para verificar a viabilidade dos componentes morfológicos da polpa por meio da expressão de proteínas relacionadas à vascularização, à inervação e aos fibroblastos da matriz extracelular. Para isto, foram utilizados os seguintes anticorpos: CD-34 e actina músculo liso (direcionados para a microvascularização); S-100, NCAM/CD56 e neurofilamento (direcionados para inervação) e vimentina (direcionada para a matriz extracelular) (Tabela 1).
Para a realização das reações imunoistoquímicas, todos os blocos de parafina selecionados foram cortados na espessura de 3 μm e o material obtido foi colocado sobre lâmina de vidro previamente tratada com 3-aminopropil-trietoxi-silano (Sigma Chemical Company, EUA). Inicialmente, os cortes foram desparafinizados com 2 sequências de xilol por 10 minutos cada em temperatura ambiente, hidratados em solução de concentrações decrescentes de etanol (100%, 90%, 70% e 50%) e posteriormente foram lavados em água corrente por 30 segundos.
A recuperação antigênica foi realizada de acordo com protocolos previamente estabelecidos no Laboratório de Patologia Oral da FOP-UNICAMP para cada anticorpo (Tabela 1). Após a recuperação antigênica os cortes ficaram em repouso durante 20 minutos em temperatura ambiente, foram lavados em água corrente e a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando peróxido de hidrogênio (H2O2) 20 volumes em 5 incubações de 5 minutos cada. Após a inativação da peroxidase endógena, os cortes foram lavados em água corrente por 30 segundos e colocados em solução salina tamponada com fosfato (phosphate-buffered saline: PBS pH 7,4). Os cortes foram então incubados com os
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anticorpos primários, diluídos em albumina sérica bovina a 1% e azida sódica a 0,1% em PBS, em câmara úmida por 18 horas a 4°C.
Tabela 1. Anticorpos primários, clones, diluições, método de recuperação antigênica e fabricantes utilizados no estudo imunoistoquímico.
PP3’ Ac. citr. = Panela de pressão 3 minutos em ácido cítrico, PPE 15’ Ac. citr = Panela de pressão elétrica 15 minutos ácido cítrico, BM 40’ = Banho Maria 40 minutos, S2367 = Solução de recuperação S2367.
Após a incubação com os anticorpos primários, os cortes foram lavados em PBS (3 trocas), e o anticorpo secundário conjugado a peroxidase foi adicionado (Strept AB Complex/HRP Duet, Dako, EUA, 1/500), durante 30 minutos a 37°C. Terminada esta etapa, as lâminas foram lavadas em água destilada e contra-coradas com Hematoxilina de Carrazi durante 2 minutos, desidratadas por meio de 2 banhos em solução de etanol a 100%, diafanizadas em xilol com 2 trocas de 10 minutos cada e montadas em bálsamo do Canadá. Controles positivos específicos para cada anticorpo foram utilizados em todas as reações deste estudo.
Anticorpo primário Clone Diluição Recuperação Fabricante
Actina músculo liso 1 A 4 1:400 PP3’ Ac.citr. Dako
CD-34 QBEnd 10 1:50 PP3’ Ac.citr. Dako
Vimentina Vim 3B4 1:400 PPE15’ Ac. citr. Dako
S-100 Policlonal 1:10.000 PP3’ Ac.citr. Dako
NCAM/CD56 CD56-1B6 1:50 BM40’ S2367 Novocastra
26 4.6. Forma de análise dos resultados
Os resultados gerados pelas análises morfológica e imunoistoquímica foram comparados entre os grupos irradiado e controle por meio de análise estatística descritiva, utilizando valores absolutos e porcentagens.
27 5. RESULTADOS
5.1. Caracterização da amostra
A média de idade dos 14 pacientes estudados do grupo irradiado foi de 49,42 anos, variando entre 16 e 62 anos. Oito (57,14%) pacientes eram do gênero masculino e 6 (42,86%) pacientes do gênero feminino. A maioria dos pacientes relatou histórico de tabagismo e etilismo; sendo 6 (42,86%) tabagistas e ex-etilistas, 4 (28,58%) somente ex-tabagistas, 1 (7,14%) tabagista e etilista, 1 (7,14%) somente tabagista, 2 (14,28%) negaram tabagismo e etilismo prévio.
Todos os pacientes da amostra foram diagnosticados com carcinomas espinocelulares e tratados por meio de quimiorradioterapia. Os sítios anatômicos dos tumores de cabeça e pescoço que afetaram os pacientes da amostra estudada foram: base de língua com 2 (14,28%) casos, assoalho de boca com 1 (7,14%) caso, palato com 1 (7,14%) caso, orofaringe com 2 (14,28%) casos, nasofaringe com 5 (35,73%) casos, e laringe com 3 (21,43%) casos. Os dados completos do perfil clínico dos pacientes e informações do tratamento realizado estão apresentados na Tabela 2.
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Tabela 2. Resumo do perfil clinico-patológico dos pacientes do grupo irradiado.
Paciente Idade Gênero Tabaco Álcool Sítio Anatômico TNM Tumor QT RDT Dose Adeq Exo (mês)
1 50 M Ex Ex Base de língua T2N2M0 CEC Sim AL 2D 60 Gy Sim 30
2 59 M Sim Não Palato T3N3M0 CEC Sim AL 2D 70 Gy Sim 60
3 58 M Ex Ex Base de língua T2N1M0 CEC Sim AL 2D 60 Gy Não 30
4 16 F Não Não Nasofaringe Desc CEC Sim AL 3D 70 Gy Não 20
5 54 F Ex Ex Nasofaringe Desc CEC Sim AL 2D 70 Gy Sim 12
6 37 F Não Não Nasofaringe T4N3M0 CEC Sim AL 3D 70 Gy Não 24
7 49 M Ex Ex Nasofaringe TXN1M0 CEC Sim AL 3D 70 Gy Sim 6
8 55 F Ex Não Laringe Desc CEC Sim AL 2D 60 Gy Não 30
9 54 M Sim Sim Laringe T1N1MX CEC Sim AL 2D 50 Gy Não 19
10 62 M Ex Ex Orofaringe T1N0M0 CEC Sim AL 2D 50 Gy Não 8
11 47 M Ex Ex Laringe T4N2MX CEC Sim AL 3D 60 Gy Não 7
12 55 F Ex Não Orofaringe T4N2M0 CEC Sim AL 3D 60 Gy Sim 30
13 45 M Ex Não Assoalho de boca T2N2M0 CEC Sim AL 2D 70 Gy Não 23
14 51 F Ex Não Nasofaringe T4N2MX CEC Sim AL 2D 50 Gy Não 18
M = masculino, F = feminino, Ex = ex-tabagista ou ex-etilista, Des = Desconhecido, CEC = carcinoma espinocelular, QT = quimioterapia, RDT = tipo de radioterapia e planejamento, AL = acelerador linear, 2D = bidimensional, 3D = tridimensional, Dose = dose total prescrita para o volume tumoral, Adeq = realização de adequação odontológica pré-radioterapia, Exo = intervalo de tempo (em meses) entre o final da RDT e a extração do dente analisado.
