Painel comparativo dos resultados imunoistoquímicos

A composição de imagens das Figuras 22 A, 22 B, 22 C, 22 D, 22 E e 22 F e 23 A, 23 B, 23 C, 23 D 23 E e 23 F apresenta uma comparação dos resultados imunoistoquímicos entre as amostras dos grupos, irradiado e controle para os parâmetros de microvascularização e inervação.

Figura 22. Análise comparativa da expressão imunoistoquímica para microvasculatura. Amostras do grupo irradiado na linha superior e do grupo controle na linha inferior. A. Marcação citoplasmática em células endoteliais de vaso sanguíneo em amostra do grupo irradiado (CD-34, 400X). B. Marcação citoplasmática em pericitos e células endoteliais de vaso sanguíneo em amostra do grupo irradiado (Actina-músculo liso, 400X). C. Marcação citoplasmática em células endoteliais do vaso sanguíneo e fibroblastos de matriz extracelular no grupo irradiado (Vimentina, 400X). D. Marcação citoplasmática em células endoteliais de vaso sanguíneo em amostra do grupo controle (CD-34, 400X). E. Marcação citoplasmática em pericitos e células endoteliais de vaso sanguíneo em amostra do grupo controle (Actina-músculo liso, 400X). F. Marcação citoplasmática em células endoteliais do vaso sanguíneo e fibroblastos de matriz extracelular no grupo controle (Vimentina, 400X).

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Figura 23. Análise comparativa da expressão imunoistoquímica para inervação. Amostras do grupo irradiado na linha superior e do grupo controle na linha inferior. A. Fibras neurais em disposição perivascular mostrando intensa positividade em amostra do grupo irradiado (S-100, 400X). B. Marcação positiva em feixes neurais de amostra do grupo irradiado (NCAM/CD56, 200X). C. Discreta marcação positiva em fibras neurais perivasculares de amostra do grupo irradiado (Neurofilamento, 200X). D. Feixe neural perivascular mostrando intensa marcação em amostra do grupo controle (S- 100, 400X). E. Feixe neural exibindo marcação em padrão granular em amostra do grupo controle (NCAM/CD56, 200X). F. Discreta marcação positiva em feixe neural de amostra do grupo controle (Neurofilamento, 200X).

53 6. DISCUSSÃO

O carcinoma espinocelular (CEC) de cabeça e pescoço acomete principalmente homens entre a sexta e sétima década de vida, sendo que aproximadamente 75% dos casos de CEC nesta região são diagnosticados em estágios clínicos avançados da doença (estadio III e IV) e demandam tratamento baseado na combinação de cirurgia com altas doses de radioterapia e quimioterapia (Scully; Felix, 2006; Warnakulasuriya et al, 2007). Na população em geral, o sítio anatômico de maior incidência do CEC de cabeça e pescoço é a boca, seguida por laringe e nasofaringe sendo que mais de 90% dos pacientes afetados por esta doença são tabagistas e etilistas de longa data (Scully; Felix, 2006).

A amostra de pacientes estudada no grupo irradiado desta dissertação apresentou perfil epidemiológico e clínico-patológico dentro dos parâmetros esperados para o CEC de cabeça e pescoço já que a média de idade foi de aproximadamente 50 anos, com discreta predileção para o gênero masculino e forte associação com tabagismo e etilismo. Além disso, a maioria absoluta dos pacientes em questão foi diagnosticada com tumores em estadio clínico avançado acometendo principalmente a boca e a nasofaringe. Consequentemente, todos os pacientes da amostra foram tratados por protocolos que envolveram radioterapia com doses de radiação que variaram entre 50 e 70 Gy e quimioterapia.

Sabe-se que a extração dental em pacientes que realizaram radioterapia na região de cabeça e pescoço é um fator de risco para o desenvolvimento de osteorradionecrose (Reuther et al.,2003, Chrcanovic et al., 2010) assim como os focos de infecção bucal instalados, como doença periodontal e cárie também funcionam como fatores de risco para a osteorradionecrose e precisam ser removidos, mesmo que após a radioterapia (Hancock et al., 2003). A adequação odontológica pré-radioterapia ainda não é realidade na maioria dos serviços oncológicos e isto faz com que a indicação de extrações dentais após a conclusão da radioterapia em cabeça e pescoço seja um procedimento de rotina, o que justifica a obtenção dos espécimes dentários que

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foram estudados nesta pesquisa. O Serviço de Odontologia Oncológica do ICESP realiza o procedimento de adequação odontológica na maioria absoluta dos pacientes que receberão radioterapia em cabeça e pescoço, contudo, apenas 5 (35,71%) pacientes avaliados neste estudo foram irradiados no ICESP, os outros 9 pacientes foram admitidos após terem realizado a radioterapia em Serviços externos e portanto não receberam adequação bucal prévia. Todas as amostras utilizadas no grupo irradiado foram extraídas pela equipe de odontologia do ICESP em tempo que variou entre 6 e 60 meses após a conclusão da radioterapia.

O protocolo de tratamento radioterápico utilizado e a determinação do campo que será irradiado dependem do estadiamento clínico, do tamanho do tumor primário, de sua localização e da presença de metástase regional (Kielbassa et al., 2006, Goto et al., 2013). Todos os pacientes estudados foram submetidos à radioterapia por meio de aceleradores lineares Sinergy (Elekta), 6 MeV, com doses de radiação que variaram entre 50 e 70 Gy. Dentre eles, 5 (35,72%) foram submetidos ao tratamento conformacional com base em planejamentos tridimensionais e 9 (64,28%) tiveram o tratamento pela técnica convencional baseada em planejamentos bidimensionais (2D). Todos os pacientes receberam irradiação cérvico-facial bilateral (2 campos opostos laterais).

Aparentemente, este é o primeiro trabalho de pesquisa a estudar a morfologia pulpar de pacientes irradiados em cabeça e pescoço por meio de equipamentos aceleradores lineares. Apenas um estudo anterior avaliou polpas dentais humanas irradiadas in vivo que, no caso, foram obtidas de pacientes tratados por equipamentos cuja técnica emissora de radiação era baseada no uso de Cobalto-60 (Anneroth et al., 1985). Todos os demais pesquisadores que avaliaram os efeitos da radioterapia sobre a morfologia pulpar lançaram mão de modelos experimentais animais irradiados por meio da ortovoltagem ou do Cobalto-60 (Kalnis et al., 1954; Meyer et al., 1964; Hutton et al., 1974; Vier- Pelisser et al., 2007). O presente trabalho de pesquisa estudou os planejamentos do tratamento radioterápico dos pacientes que doaram espécimes para o grupo irradiado, isto permitiu que fossem analisadas apenas

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amostras que estivessem dentro do campo de radiação e, consequentemente, que fosse possível avaliar os efeitos diretos da radioterapia sobre as polpas. Não foi possível obter a dose de radiação direcionada para cada dente utilizado visto que a maioria dos pacientes não foi irradiada no Serviço de Radioterapia do ICESP, o qual dispõe de estrutura para estimar esta dose em pacientes tratados por radioterapia conformacional.

A CRR apresenta manifestações clínicas muito particulares, com pigmentação acastanhada difusa dos dentes afetados (concentrada nas faces lisas de esmalte) e cavitações nas regiões cervicais e incisais com evidente tendência de amputação coronária (Kielbassa et al., 2006). As amostras de dentes irradiadas investigadas neste estudo apresentaram perfil macroscópico e radiográfico compatíveis com este perfil clínico da CRR, sendo que aproximadamente 90% dos espécimes apresentaram extensa cavitação cervical e pigmentação castanha difusa em esmalte não cavitado. Estes resultados macroscópicos e radiográficos também estão de acordo com resultados de estudos anteriores (Silva, 2008; Silva et al., 2009).

Pacientes submetidos à radioterapia podem apresentar resposta negativa aos testes de vitalidade pulpar (Kielbassa et al., 2011). Evidências clínicas desta natureza despertam conjecturas a respeito da possibilidade da radiação causar danos diretos à inervação da polpa, inibindo a resposta sensitiva frente à progressão da cárie (Açil et al., 2005; Springer et al., 2005). Hipóteses sugerem que os efeitos diretos da radioterapia sobre a polpa dental seriam capazes de afetar negativamente o metabolismo odontoblástico e comprometer a resposta do complexo dentino-pulpar frente à progressão da CRR, justificando a ausência de dor nos casos avançados de CRR, bem como sua rápida progressão. (Açil et al., 2005; Springer et al., 2005).

Resultados recentemente publicados investigaram estas últimas hipóteses e demonstraram que o padrão de desmineralização da CRR é semelhante ao da cárie convencional ocorrendo por meio da deposição de dentina reacional e dentina peritubular, sugerindo que a polpa irradiada preserva a viabilidade odontoblástica e a habilidade defensiva e reparadora em resposta à progressão da CRR (Silva, 2008; Silva et al., 2009; Santos-Silva et

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al., 2011). Como continuidade natural dos resultados supramencionados esta

pesquisa se propôs, a avaliar os efeitos diretos da radioterapia sobre a morfologia pulpar de pacientes oncológicos buscando uma compreensão mais apurada acerca de eventuais danos à microvascularização, à inervação e à matriz extracelular.

A polpa consiste em um tecido conjuntivo delicado de pequeno tamanho circundado por paredes de tecido duro. A técnica de remoção das polpas utilizada neste estudo foi a técnica de clivagem, que elimina a necessidade de descalcificação dos tecidos duros e permite maior conservação das estruturas do tecido pulpar (Bernardi et al., 2007). No entanto, esta técnica possui limitações como a dificuldade de preservação da camada de odontoblastos, que se rompe ao ser desgarrada da parede de dentina e a dificuldade de obtenção das polpas em dentes cujos condutos radiculares estiverem atrésicos.

No que diz respeito aos resultados da análise morfológica, todos as amostras de polpa pertencentes aos dois grupos avaliados mostraram morfologia preservada, inclusive com manutenção da hierarquia morfológica tecidual descrita por Mjor et al. (2001) e Okiji (2002) a qual é caracterizada pela região central (rica em vasos sanguíneos, fibroblastos e feixes neurais), pela zona rica em células (mais externa à central) e pela região sub-odontoblástica, ou zona Weil, localizada no terço mais periférico da polpa e com notável escassez celular. Não foi possível identificar e caracterizar a camada de odontoblastos na maioria dos espécimes da amostra por que a técnica utilizada para remoção das polpas não permitiu preservar esta região.

Todas as amostras de polpa pertencentes aos 2 grupos estudados mostraram vasos sanguíneos normais com comprimento e o calibre variáveis, bem como apresentando paredes vasculares de espessura variável. As células endoteliais dos vasos sanguíneos apresentaram morfologia preservada e não foi possível identificar vasos com morfologia sugestiva de vascularização linfática em nenhuma das amostras avaliadas. Durante o estudo da inervação das amostras dos dois grupos, fibras e feixes neurais de tamanho e espessura variáveis, porém, dotados de morfologia normal com manutenção de células de

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Schwann e dos axônios foram observadas a despeito do grupo de origem. É oportuno destacar a constatação de que todos os 40 espécimes analisados mostraram uma clara relação de proximidade entre feixes neurais e vasos sanguíneos, corroborando com observações anteriores a respeito da profícua interrelação entre a angiogênese e a neurogênese pulpar (Gopikrishna et al., 2009, Nakashima et al.,2009).

A matriz extracelular das polpas advindas dos dois grupos avaliados neste estudo apresentaram fibroblastos morfologicamente normais e distribuídos de modo heterogêneo pela matriz extracelular. Em nenhuma das 40 amostras foi possível detectar áreas de fibrose focal ou generalizada na matriz extracelular, a despeito de uma quantidade variável de fibroblastos e de fibras colágenas, provavelmente atribuídas às diferentes idades dos pacientes - a preservação da matriz extracelular com a manutenção dos fibroblastos contrariam Springer et al. (2005) que identificaram alterações evidentes na matriz extracelular da polpa irradiada in vitro observadas pela diminuição na quantidade de colágeno. Focos ocasionais de infiltração por células inflamatórias mononucleares foram encontrados em aproximadamente 35% das amostras irradiadas e em aproximadamente 40% das amostras do grupo controle. Não houve evidência de formação de áreas de microabcesso ou necrose nas amostras dos dois grupos. Calcificações distróficas focais de tamanho variável e dispersas de modo aleatório pela matriz extracelular foram identificadas em cerca de 25% das amostras irradiadas e das amostras do grupo controle.

Os aspectos morfológicos encontrados nos espécimes dos grupos irradiados e controle foram muito semelhantes. Apesar de outros estudos predominantemente baseados em experimentos com animais terem avaliado o efeito direto da radioterapia sobre a polpa dental (Kalnis et al., 1954; Meyer et

al., 1964; Hutton et al., 1974; Vier-Pelisser et al., 2007), este parece ser o

primeiro trabalho a investigar em detalhes o impacto direto da radiação direcionada para pacientes oncológicos sobre diferentes componentes morfológicos da polpa dentária, utilizando a combinação de morfologia convencional e IHQ.

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De modo contraditório aos resultados observados neste estudo, Kalnis et

al. (1954) encontraram um impacto negativo da radiação sobre a

microvascularização pulpar de cães, que foi descrita como um aumento nas células endoteliais e aumento na deposição de colágeno ao redor dos vasos sanguíneos. Meyer et al. (1964) também apresentou resultados que sugeriram um impacto negativo da radiação sobre a polpa e encontraram necrose, hemorragia e calcificações em diferentes zonas da polpa de um modelo experimental animal, além da presença de intensa infiltração inflamatória e danos aos fibroblastos. Hutton et al. (1974), de modo semelhante aos resultados aqui descritos, não encontraram alterações radiogênicas na estrutura pulpar de macacos e destacaram a necessidade de um novo modelo experimental que simulasse de modo mais fidedigno os efeitos diretos e indiretos da radioterapia sobre as polpas dentais.

Um estudo prévio avaliou amostras humanas irradiadas para investigar o efeito da radioterapia sobre a polpa encontrou transformação metaplásica de tecido fibroso pulpar e formação de dentina secundária. Entretanto, estas alterações morfológicas foram observadas também nas polpas obtidas de dentes do grupo controle, levando à conclusão de que as alterações pulpares encontradas não foram decorrentes da radioterapia (Anneroth et al., 1985). Vier-Pelisser et al. (2007) mostraram que o tratamento radioterápico não provocou reações inflamatórias ou modificação na matriz extracelular da polpa de ratos, eles concluíram que o núcleo de alguns fibroblastos e que os odontoblastos apresentaram vacuolização induzida pela radiação.

Apesar dos resultados da análise morfológica baseada no estudo de amostras de polpas preparadas histologicamente e coradas por H.E. terem sido suficientes para demonstrar ausência de alteração na microvascularização, na inervação e na matriz extracelular após a radioterapia, optou-se por complementar a investigação por meio do estudo IHQ dos mesmos componentes estruturais com o objetivo de demonstrar atividade funcional destes elementos morfológicos.

A análise da expressão IHQ de proteínas relacionadas à vascularização (CD-34 e actina músculo liso), à inervação (S-100; NCAM/CD56 e

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neurofilamento) e à matriz extracelular (vimentina) de todas as amostras de polpa avaliadas no grupo irradiado e controle demonstrou positividade e padrão de marcação normal.

Em relação à vascularização, o anticorpo CD-34 caracteriza-se como uma glicoproteína transmembrana que possui alta especificidade, principalmente, para células endoteliais de vasos sanguíneos e elementos precursores do componente vascular e hematopoiético (Yoshida et al., 2009). Trubiani et al. (2003) demonstraram que a expressão IHQ para o anticorpo CD- 34 na polpa dentária normal sugere processo de vasculogênese preservado, fato também observado nas amostras irradiadas desta dissertação. O anticorpo actina músculo liso demonstra expressão para fração alfa dos microfilamentos de actina, exibindo especificidade para células musculares lisas, células com diferenciação mioepitelial e células endoteliais em nível microvascular (em virtude da expressão nos pericitos próximos ao endotélio). Pericitos viáveis marcados por actina músculo liso exibem atividade na contração dos capilares sanguíneos (Herman; D`Amore, 1985).

Considerando a inervação, o anticorpo S-100 é um marcador neural expresso no núcleo e no citoplasma das células de Schwann (Dourou et al., 2006) e também expresso em uma variedade de outras células normais como melanócitos, condrócitos, células miocárdicas e células musculares esqueléticas (Barra, 2006). O CD-56 é um antígeno com especificidade para neurônios, células de Schwann e astrócitos. É também expresso em um linfócitos com função natural killer e em um subgrupo de linfócitos T ativados (Bryson et al., 2002). O anticorpo neurofilamento é um marcador para tecido neural com expressividade em axônios (Dourou et al., 2006), o grau da imunoexpressão está relacionado com o grau de maturação neuronal, assim, a expressão do neurofilamento pode ser bastante variável e delicada em alguns tecidos, sendo indicada a utilização de mais de um marcador neuronal (Barra, 2006). O anticorpo vimentina é expresso nos filamentos intermediários que compõem o citoesqueleto presente em diversas linhagens de células de origem mesenquimal e é expresso no citoplasma dos fibroblastos e em células endoteliais (Murakami et al., 2012).

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Não foram encontradas diferenças entre os espécimes dos grupos irradiado e controle para a expressão IHQ de nenhum dos anticorpos utilizados, sugerindo preservação da atividade da microvasculatura, dos feixes neurais e dos componentes da matriz extracelular da polpa mesmo após os efeitos diretos da radioterapia.

Este parece ser um estudo pioneiro ao lançar mão de uma análise IHQ para avaliar os efeitos diretos da radiação sobre a polpa dental humana. Embora seja difícil extrapolar os resultados morfológicos obtidos neste estudo para observações clínicas, é oportuno discutir que as alterações no fluxo sanguíneo da polpa durante a radioterapia descritas por Kataoka et al. (2011) foram transitórias e se restabeleceram após 4 a 5 meses da conclusão da radioterapia. As amostras do grupo irradiado avaliadas nesta dissertação foram extraídas com período mínimo de 6 meses após o término da radioterapia e o estudo morfológico não encontrou alteração significativa na microvascularização.

Assim, torna-se relevante a realização de estudos morfológicos futuros que avaliem a microvascularização da polpa durante a radioterapia ou em um período de tempo mais próximo ao fim do tratamento radioterápico. A diminuição da sensibilidade ao estímulo em polpas dentárias de pacientes submetidos a doses entre 60 a 70 Gy de radiação descrita por Kataoka et al. (2012) não pode ser explicada pelos achados desta dissertação, pois a morfologia das fibras neurais e a preservação da atividade de expressão IHQ de proteínas relacionadas à fisiologia neural foi encontrada em todas as amostras do grupo irradiado.

Tendo em vista os resultados apresentados nesta dissertação, é pouco provável que alterações radiogênicas sejam capazes de contribuir para o início e progressão da CRR, como sugerido por outros pesquisadores (Açil et al., 2005, Springer et al., 2005, Walker et al., 2011).

Portanto, este estudo rejeitou a hipótese de que efeitos diretos da radioterapia na região de cabeça seriam capazes de gerar alterações morfologicamente detectáveis na microvasculatura, na inervação e na matriz extracelular da polpa de pacientes oncológicos.

61 7. CONCLUSÃO

- As características morfológicas da microvascularização, da inervação e da matriz extracelular de polpas dentais de pacientes que foram submetidos à radioterapia na região de cabeça e pescoço não mostraram diferenças quando comparada às polpas de pacientes não submetidos à radioterapia;

- A avaliação da expressão imunoistoquímica de proteínas relacionadas à microvascularização (CD-34 e actina músculo liso), à inervação (S-100; NCAM/CD56 e neurofilamento) e à matriz extracelular (vimentina) da polpa dental de pacientes que foram submetidos à radioterapia na região de cabeça e pescoço não mostrou diferenças quando comparada às polpas de pacientes não submetidos à radioterapia;

- Os efeitos diretos da radioterapia na região de cabeça não são capazes de gerar alterações morfologicamente detectáveis na microvasculatura, na inervação e na matriz extracelular da polpa de pacientes com câncer de cabeça e pescoço.

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