NAYARA DOS SANTOS VIEIRA
EFEITO DO ESTRESSE ASSOCIADO À AVALIAÇÃO ACADÊMICA SOBRE A
PRODUÇÃO DE COMPOSTOS SULFURADOS VOLÁTEIS
PIRACICABA 2018
Nayara dos Santos Vieira
EFEITO DO ESTRESSE ASSOCIADO À AVALIAÇÃO ACADÊMICA SOBRE A
PRODUÇÃO DE COMPOSTOS SULFURADOS VOLÁTEIS
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Odontologia, na área de Fisiologia Oral.
Orientadora: Profª Drª Fernanda Klein Marcondes
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA NAYARA DOS SANTOS VIEIRA E ORIENTADA PELA PROFª FERNANDA KLEIN MARCONDES.
PIRACICABA 2018
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, aos meus amados pais, Márcio e Zilnete, e ao meu namorado, Phelipe, por estarem sempre ao meu lado, me apoiando e incentivando em minhas decisões. Agradeço à minha prima Miviani, pela amizade e parceria; aos meus amigos de longa data e parceiros de profissão, Letícia, Lucas e Tabatha.
À FOP/UNICAMP, que estará sempre em meu coração, por me proporcionar todo o meu conhecimento, a realização de mais uma etapa em minha carreira e pelas amizades conquistadas.
Às colegas de mestrado Lais, Kelly, Mari, Hortência e Maeline. À professora Fernanda Klein por todos os ensinamentos dados. Aos técnicos de laboratório Feliciano e Fábio.
À professora Maria Beatriz Duarte Gavião, por ceder seu laboratório para que eu pudesse usá-lo para minhas coletas.
Aos colegas da microbiologia, pelos conselhos e dicas.
A todos os professores e funcionários que, direta ou indiretamente, fizeram com que houvesse a realização de mais uma etapa.
Ao CNPq pela bolsa de estudo concedida.
À Bruna Manesco, por me ajudar com as questões financeiras e burocráticas dos orçamentos. Sempre muito solícita. O meu muito obrigada!
Aos voluntários que me ajudaram a tornar essa pesquisa possível, pela paciência e dedicação. Meus sinceros e imensos agradecimentos.
E um agradecimento especial à Paty, pela paciência e dedicação que teve comigo, por todos os ensinamentos e conselhos dados a mim. Foi uma pessoa essencial para a realização desse trabalho, e a qual sou eternamente grata.
RESUMO
A halitose é uma desordem funcional do hálito que pode comprometer a sociabilização de seu portador. Na maioria dos casos sua origem está concentrada na cavidade oral, sendo os principais gases responsáveis por esta condição chamados de compostos sulfurados voláteis (CSV): sulfeto de hidrogênio, metilmercaptana e dimetilsulfeto. Entretanto, muitos pacientes queixam-se de mau hálito sem a presença de causas clínicas evidentes. Diante disso, alterações emocionais, como o estresse e a ansiedade, têm sido relacionadas à sua produção, embora haja poucos estudos sobre esta relação. O estresse entre estudantes da área de saúde tem sido estudado nas últimas décadas, e representa uma abordagem útil no estudo da relação entre alterações emocionais e produção de CSV. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar a relação entre o estresse associado à avaliação acadêmica, a produção oral de compostos sulfurados voláteis e a concentração de biomarcadores do estresse, em estudantes de graduação. Participaram do estudo 11 alunos do gênero masculino, do curso de graduação em Odontologia da FOP/UNICAMP. Foram determinados: a concentração oral de CSV através do OralChroma®; a ansiedade traço e a ansiedade estado, através do Inventário de Ansiedade Traço-Estado (IDATE); as concentrações salivares de cortisol e alfa-amilase, por ensaio imunoenzimático ELISA; e o fluxo salivar. As coletas ocorreram em dois momentos: no dia de uma avaliação da matéria de Biociências II e, aproximadamente, 5 meses após esta avaliação. Nestes dois momentos, os voluntários também responderam ao IDATE para caracterização de seu nível de ansiedade. Os dados foram analisados através do teste t de Student. Foram indicativos de significância estatística valores de p<0,05. Houve aumento da ansiedade estado dos alunos, observado através do IDATE-estado, acompanhado de aumento da concentração de sulfeto de hidrogênio (H2S), no dia da realização da avaliação, quando comparados aos dados obtidos após a avaliação. Não houve diferença estatística nas concentrações de metilmercaptana, dimetilsulfeto, cortisol e alfa-amilase em relação aos dois momentos nos quais foram realizadas as coletas. Também não houve diferença estatística nos resultados encontrados para o fluxo salivar e para o traço de ansiedade. Os resultados encontrados reforçam que o estresse exerce influência sobre a produção de CSV. Palavras-chave: Halitose. Cortisol. Alfa-amilase. Estresse acadêmico.
ABSTRACT
Halitosis is a functional disorder of breath that can compromise the socialization of its owner. In most cases, its origin is concentrated in the oral cavity, being the main gases responsible for this condition called volatile sulfur compounds (CSV): hydrogen sulfide, methyl mercaptan and dimethyl sulphide. However, many patients complain of bad breath without the presence of obvious clinical causes. Therefore, emotional changes such as stress and anxiety have been related to their production although there are few studies about this relationship. Stress among health students has been studied in recent decades and represents a useful approach in the study of the relationship between emotional changes and CSV production. Thus, the objective of this study was to investigate the relationship between stress associated with academic exam, oral production of volatile sulfur compounds and the concentration of stress biomarkers in undergraduate students. Eleven male students of the graduation course in Dentistry from FOP/UNICAMP participated in this study. Oral concentration of CSV was determined using OralChroma®; trait and state anxiety were assessed through the “State-Trait Anxiety Inventory” (STAI); salivary cortisol and salivary alpha-amylase concentrations were determined by enzyme-linked immunosorbent assay ELISA. Salivary flow rate was also determined. The collections occurred in two moments: on the day of an exam of the matter of Biosciences II and 5 months after this exam. In these two moments, volunteers also responded to the STAI to characterize their level of anxiety. Data were analysed using Student’s t-test. Significance for these analyses was set at p<0,05. There was an increase in the level of anxiety of the students, observed through the STAI-state, followed by an increase in the concentration of hydrogen sulphide (H2S) on the day of the exam when compared to the data obtained after the exam. There was no statistical difference in the concentrations of methylmercaptan, dimethyl sulphide, cortisol and alpha-amylase in relation to the two moments in which the samples were collected. There were also no statistical difference in the results found for salivary flow rate and trait anxiety. The results found reinforce that stress exerts influence on the production of CSV.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ---9
2 REVISÃO DA LITERATURA ---11
2.1 Definição e origem da Halitose---11
2.2 Métodos de avaliação e tratamento da Halitose---14
2.3 Estresse e Halitose---17
2.4 Avaliação do Estresse e Ansiedade---20
3 PROPOSIÇÃO ---24 3.1 Objetivo Geral---24 3.2 Objetivos Específicos---24 4 MATERIAL E MÉTODOS ---25 5 RESULTADOS ---31 6 DISCUSSÃO ---34 7 CONCLUSÃO ---40 REFERÊNCIAS --- ---41 ANEXOS Anexo 1 –Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa---58
1 INTRODUÇÃO
A halitose, também conhecida como mau odor ou mau hálito, é uma desordem funcional do hálito, relativamente comum, que atinge grande parte da população. Pode ser indicativa de alguma doença sistêmica (Tárzia, 2003) porém, a grande maioria dos casos é proveniente de alterações na cavidade oral (Tárzia, 2003), como, por exemplo, doenças periodontais e língua saburrosa (Attia & Marshall, 1982). Neste sentido, o dorso da língua tem sido considerado o local mais importante para o desenvolvimento da halitose, onde são retidas quantidades numerosas de células descamadas e leucócitos, além de haver o crescimento de bactérias anaeróbicas em sua superfície irregular (Yaegaki & Sanada, 1992; van den Broek, 2007; Haraszthy et al., 2007; Hughes & McNab, 2008; Cortelli et al., 2008). Essas bactérias promovem a degradação de aminoácidos sulfurados, transformando-os em sulfeto de hidrogênio (H2S), metilmercaptana (CH3SH) e dimetilsulfeto ((CH3)2S) (Tonzetich, 1977; Springfield et al., 2001; Tárzia, 2003), sendo estes gases denominados compostos sulfurados voláteis (CSV). Entretanto, cerca de 3% dos pacientes queixam-se de halitose sem que haja qualquer evidência de sua causa, tanto na anamnese quanto clinicamente, quando de sua visita ao consultório (Calil & Marcondes, 2006). Desta maneira, alguns estudos têm avaliado a influência das alterações emocionais, como o estresse, no aumento de CSV (Queiroz et al., 2002; Calil & Marcondes, 2006).
O estresse provoca alterações hormonais e imunes que, quando persistentes, prejudicam o bem-estar e a saúde dos indivíduos e podem levar ao desenvolvimento de doenças, tais como gastrite, hipertensão, diabetes e doenças cardíacas (Tortora & Grabowski, 2002; Chrousos, 2009). Nesse sentido, a vida acadêmica é apontada como uma fonte estressora, onde os estudantes universitários, durante o treinamento profissional, podem ser propensos ao desenvolvimento de sintomas de ansiedade, insônia, falta de atenção e Síndrome de Burnout (Monteiro et al., 2007; Campos et al., 2012). Deste modo, como exemplo de agente estressor, o exame acadêmico tem sido frequentemente usado no estudo das respostas psicológicas e fisiológicas durante a reação de estresse (Lacey et al., 2000; Cohen et al., 2008; Cohen & Khalaila, 2014).
A reação de estresse promove a liberação de cortisol e alfa-amilase, biomarcadores do estresse, podendo ser quantificados em amostras de saliva (Macaluso &
Preskorn, 2012). A secreção de cortisol aumenta quando somos expostos a agentes estressores, por meio da ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA). Inicialmente, haverá a liberação de hormônio liberador de corticotrofina (CRH), pelo hipotálamo. O CRH irá estimular a adenohipófise a produzir o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) que, por sua vez, irá promover a secreção de cortisol pelo córtex da glândula suprarrenal (Kirschbaum & Hellhammer, 1994; Soares & Alves, 2006). O cortisol é lipossolúvel e sua passagem da corrente sanguínea para as glândulas salivares ocorre por difusão passiva. Portanto, a dosagem de cortisol na saliva representa um método de avaliação hormonal do estresse (Kirschbaum & Hellhammer, 1989; Kirschbaum & Hellhammer, 1994).
Semelhantemente, tem sido relatado que níveis de alfa-amilase salivar aumentam sob condições de estresse físico e psicológico (Chatterton et al. 1997), durante os quais há a ativação do sistema nervoso simpático, o qual irá influenciar a secreção das glândulas salivares através da liberação de catecolaminas (Nater & Rohleder, 2009). Estes dois processos ocorrem ao mesmo tempo, com a diferença de que a resposta do eixo HHA é mais lenta do que a resposta simpática (Mc Ewen & Sapolsky, 1995).
Desta maneira, considerando a importância clínica e social da halitose, o objetivo do presente estudo foi avaliar o impacto de uma avaliação acadêmica, como agente estressor, sobre a produção de CSV; a concentração dos biomarcadores salivares do estresse, cortisol e alfa-amilase; o fluxo salivar e o nível de ansiedade em graduandos em Odontologia.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Definição e origem da Halitose
Halitose, fetor oris ou mau hálito são os termos gerais utilizados para descrever um hálito desagradável emitido através da cavidade oral de um indivíduo. Infelizmente, não é possível obter a estimativa precisa da prevalência de halitose na população mundial (Rösing & Loesche, 2011), porém, diversos estudos têm mostrado a prevalência da halitose em determinados grupos, comunidades e cidades ao redor do mundo. Em estudo realizado por Aimetti et al. (2015), com habitantes da cidade de Turim, na Itália, com idade entre 20 e 75 anos, foi observada prevalência estimada de halitose de 53,51%. Aproximadamente um terço dos 419 participantes de uma pesquisa realizada na cidade de Berna, capital da Suíça, relataram ter sofrido, alguma vez, de halitose (Bornstein et al., 2009). No Brasil, Togashi et al. (1998) realizaram um levantamento epidemiológico na cidade de Bauru, estado de São Paulo, e observaram que 30% das 1.600 pessoas participantes do estudo, de diferentes faixas etárias, apresentavam problemas com o hálito. Em estudo mais recente (Milanesi et al., 2016), realizado com 257 estudantes do curso de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 21,4% relataram que percebiam às vezes a presença de mau hálito, enquanto 0,4% relataram sempre perceber a presença de mau hálito. Segundo pesquisa realizada pela Associação Brasileira de Pesquisas de Odores da Boca (ABPO), em 2008, foi possível verificar que 88% dos 127 entrevistados consideram que a halitose tenha provocado mudanças nas suas vidas, seja no âmbito social, afetivo e/ou profissional. Sendo assim, a halitose gera constrangimento ao seu portador, comprometendo o seu convívio social (Bogdasarian, 1986; Calil & Marcondes, 2006; Carvalho et al., 2008).
A fonte de odor pode ter origem intra ou extra-orais, podendo ser fisiológicas, patológicas ou psicológica (Tárzia, 2003; Cortelli et al., 2008).
A halitose proveniente da cavidade oral, devido a fatores como doença periodontal, cárie, má higienização e língua saburrosa, representa, aproximadamente, 85% dos casos de halitose (Attia & Marshall, 1982; Bollen & Beikler, 2012; Wilhelm et al., 2012). A maioria dos casos de halitose tem sido atribuída à língua saburrosa (Ren et al., 2016), pelo fato do dorso lingual possuir estruturas papilares que representam um nicho ecológico único na cavidade oral, o qual oferece uma superfície ampla que favorece o acúmulo de restos alimentares e microorganismos (Sara et al., 2016). Calil et al. (2009) observaram que altos
índices de saburra lingual estavam relacionados a altos níveis de CSV. Da mesma forma, Zhang et al. (2015) encontraram uma correlação positiva entre a presença de saburra lingual e a concentração total de compostos sulfurados voláteis em crianças. Chen et al. (2016), em pesquisa realizada com trabalhadores Chineses, também constataram que a língua saburrosa pode contribuir para a produção do mau hálito.
Outras fontes causadoras do mau hálito, consideradas fisiológicas (Attia & Marshall, 1982; Porter & Scully, 2006; Aylikci & Çolak, 2013), são a ingestão de determinados alimentos, tais como alho, cebola, pimenta e álcool, bem como a utilização do tabaco. Um mau hálito transitório também é causado pela manhã, ao acordar, devido à diminuição do fluxo salivar durante o sono e à consequente diminuição da limpeza da cavidade oral pela saliva, deixando substratos e bactérias disponíveis para a formação dos gases (Madhushankari et al., 2015).
As fontes patológicas extra-orais do mau hálito, que representam uma minoria (aproximadamente 10%) (Tangerman, 2002) dos casos, podem ter origem do trato respiratório, do sistema gastrointestinal e de desordens sistêmicas e metabólicas, como diabetes, cirrose hepática e trimetilaminúria (Tárzia, 2003; Kapoor et al., 2016). Em revisão publicada por Kinberg et al., em 2010, foram examinados 94 pacientes portadores de halitose, dos quais 54 possuíam problemas gastrointestinais, sugerindo que esta seria uma causa comum de halitose não proveniente da cavidade oral. Por sua vez, Bollen & Beikler (2012) observaram que a cetoacidose diabética leva a um típico odor do hálito, caracterizado por ser doce e frutado. Em doenças onde há a diminuição da função hepática, também há a presença de odores desagradáveis, uma vez que os produtos da metabolização que ocorre neste órgão são eliminados através dos pulmões, podendo então, serem exalados através da cavidade nasal. Além disso, algumas drogas, como antibióticos, anti-histamínicos e tranquilizantes, por exemplo, são conhecidas por causarem um odor desagradável do hálito, devido ao fato de levarem à diminuição do fluxo salivar, reduzindo, assim, a limpeza da cavidade oral, favorecendo, então, a ação das bactérias sobre os substratos sulfurados (Bollen & Beikler, 2012; Aylikci & Çolak, 2013).
A halitose pode ser classificada também de acordo com a origem psicológica: pseudo-halitose e halitofobia. Na pseudo-halitose, o paciente queixa-se da presença do mau odor, sem que haja a percepção do mesmo por outras pessoas. Por sua vez, a halitofobia ocorre quando o paciente insiste em acreditar na presença do mau hálito, mesmo após
tratamento de uma halitose verdadeira ou pseudo-halitose, ou mesmo que nenhuma evidência seja encontrada (Yaegaki & Coil, 2000).
O mau hálito originado na cavidade oral é caracterizado pela presença de CSV, diaminas (cadaverina, putrescina) e compostos fenis (van den Broek et al., 2007, Hughes & McNab, 2008), sendo que os mais importantes, em ordem decrescente de sensibilização do olfato humano (Falcão & Vieira, 2003), o sulfeto de hidrogênio (H2S), a metilmercaptana (CH3SH) e o dimetilsulfeto (CH3)2S), são pertencentes aos CSV (Springfield et al., 2001; Tárzia, 2003). Desses três gases, (CH3)2S é o principal gás envolvido na halitose extra-oral (Tangerman & Winkel, 2007), enquanto que CH3SH é mais patogênico do que o H2S, devido à sua citotoxicidade e está associado à doença periodontal (Yaegaki & Sanada, 1992; Amou et al., 2014).
Alguns estudos apontam a toxicidade dos CSV aos tecidos orais. Ng & Tonzetich, em 1984, demonstraram o aumento da permeabilidade da mucosa oral, quando houve exposição ao sulfeto de hidrogênio e à metilmercaptana, podendo, assim, danificar os tecidos periodontais, causando maior perda de sustentação (De Geest et al., 2016). Esses gases possuem papel importante no desenvolvimento e progressão da doença periodontal, como demonstrado por Chi et al. (2014), que observaram que o H2S aumentou a expressão de interleucinas 6 e 8 em fibroblastos periodontais e células do ligamento periodontal, as quais poderiam promover o desenvolvimento da doença periodontal. Além disso, foi observado que o H2S induz a diferenciação de osteoclastos, influenciando a perda óssea, e que induz a apoptose de células gengivais, contribuindo com o avanço da doença periodontal (Fujimura et al., 2010; Ii et al., 2010; Aoyama et al., 2012). Por sua vez, a metilmercaptana pode inibir a síntese de DNA e de proteínas, favorecendo, assim, a progressão da doença periodontal (Johnson et al., 1996).
Os CSV são formados após a degradação de proteínas e glicoproteínas em cistina, cisteína e metionina (Hughes & McNab, 2008). Os substratos utilizados para a produção dos CSV, principalmente por bactérias anaeróbicas gram-negativas (Messadi, 1997), estão presentes em restos alimentares, na saliva, nas células epiteliais descamadas e no sangue (Massler et al., 1951, Tonzetich, 1977). Algumas das bactérias associadas a esse processo são
Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola, que estão associadas
à doença periodontal (Persson et al., 1990). Além dessas bactérias, em estudo realizado por Haraszthy et al. (2007), foi observado que a bactéria Solobacterium moorei estava presente
em todos os sujeitos com halitose, o que não ocorreu com nenhum indivíduo do grupo sem halitose; enquanto que Washio et al. (2005) reportaram que as bactérias predominantes na produção de sulfeto de hidrogênio são, principalmente, espécies comensais da cavidade oral, como Veillonella e Actinomyces. Por sua vez, Nani et al. (2017) observaram o aumento da quantidade de bactérias da espécie S. moorei e sua coexistência com F. nucleatum e T.
forsythia, que elevaram a concentração de H2S em indivíduos sob estresse crônico.
2.2 Métodos de avaliação e tratamento da Halitose
A respeito dos métodos existentes para a mensuração da halitose, podemos citar o método organoléptico (Tonzetich, 1977; Erovic Ademovski et al., 2012), no qual a mensuração é realizada através da inalação do odor emitido pela cavidade oral, nariz e saliva (Rosenberg & McCulloch, 1992, apud Kapoor et al., 2016; Greenman et al., 2004, apud Kapoor et al., 2016) por um avaliador treinado e calibrado. Ele irá identificar os odores emitidos pelo sujeito, que se encontra a uma distância de aproximadamente 20 cm do avaliador (Dal Rio et al., 2007). Os scores obtidos desta avaliação são de acordo com a severidade da condição avaliada, variando de 0 (indetectável) a 5 (forte mau cheiro) (Rosenberg et al., 1991). Apesar da avaliação organoléptica ser considerada padrão ouro, por simular situações do dia-a-dia e ser um método de baixo custo, ela expõe os juízes a riscos de contaminação e infecção cruzada. Além disso, apresenta outras desvantagens como dificuldade de quantificação, saturação nasal - devido ao fato dos receptores olfativos humanos apresentarem rápida adaptação -, reprodutibilidade e subjetividade do teste (Tonzetich, 1977; Calil et al., 2006; Nakhleh et al., 2017).
Outros métodos objetivos estão disponíveis para a mensuração dos gases da cavidade oral, sendo eles, os mais utilizados (Scully & Greenman, 2012): o monitor portátil de CSV (Halímetro ™) e a cromatografia gasosa (convencional e portátil – OralChroma™) (Porter & Scully, 2006).
O Halímetro™ analisa concentrações de CSV, que se correlacionam aos níveis obtidos com o método organoléptico (Rosenberg et al., 1991). Neste método, é solicitado ao paciente manter-se em silêncio por 1 minuto antes do procedimento. O aparelho é colocado em níveis basais em ar ambiente e um tubo descartável – conectado ao monitor - é inserido
4 cm dentro da boca do paciente. Neste momento, o paciente deve respirar apenas pelo nariz ou segurar a respiração, para evitar contaminação (Rosenberg et al., 1991; van den Broek et al., 2007; Calil et al., 2009). Reações eletroquímicas com CSV presentes no ar geram uma corrente elétrica, que é diretamente proporcional a concentração de CSV, expressa em partes por bilhão (ppb) (Dal Rio et al., 2007).
Por sua vez, o cromatógrafo gasoso convencional (CG) é altamente preciso e detecta concentrações muito baixas de CSV. É equipado com uma chama detectora fotométrica e necessita de um gás carreador (como gás hélio ou nitrogênio) (Murata et al., 2006). O CG é um dos métodos mais confiáveis para o diagnóstico da halitose, porém, possui um custo elevado, necessita de mais tempo para a sua execução e de operadores altamente treinados (Hakim et al., 2012; Nakhleh et al., 2014; Mokeem, 2014). Desta maneira, foi elaborado um cromatógrafo gasoso portátil, com menor custo e de mais fácil manuseio (Mokeem, 2014), o OralChroma™. Este possui um sensor de gás semicondutor (Óxido de Índio), altamente sensível a todos os CSV, e tem o ar ambiente como gás carreador (Murata et al, 2006; Tangerman & Winkel, 2008). O procedimento de diagnóstico da halitose através deste equipamento consiste em inserir uma seringa de 1 ml na cavidade oral do paciente, o qual segura a mesma com os lábios, sem tocar a língua em sua extremidade, pelo período de 1 minuto. Após este período, o êmbolo da seringa é puxado e, o ar, inserido no aparelho. Após 8 minutos, os CSV são mensurados em sulfeto de hidrogênio (H2S), metilmercaptana (CH3SH) e dimetilsulfeto (CH3)2S) (Winkel & Tangerman, 2008).
Dos aparelhos de diagnóstico portáteis, enquanto o Halímetro™ não faz a diferenciação adequada entre os três CVS, já que possui maior sensibilidade para identificar o sulfeto de hidrogênio aos outros dois gases, o OralChroma™ faz a diferenciação quantitativa entre os gases, tornando possível a identificação da origem da halitose (Rosenberg et al., 1991; Furne et al., 2002, Tangerman & Winkel, 2008). Ao contrário do método organoléptico, a cromatografia gasosa portátil é um método com um custo maior e relativamente mais demorado, mas, por outro lado, é um método reprodutível e confiável, assim como o Halímetro™ (Porter & Scully, 2006; van den Broek et al., 2007; Kini et al., 2012).
Após avaliada a existência da halitose através de um método ou da associação de métodos existentes, e a realização de um exame clínico detalhado para determinar a sua
causa, é importante a definição de um protocolo de tratamento para o paciente, uma vez que a halitose pode e deve ser tratada (Aylıkcı & Çolak, 2013). Caso a origem do mau hálito seja intra-oral, os tratamentos realizados podem ser através da redução mecânica e química de microorganismos e neutralização química de CSV (Armstrong et al., 2010).
Nos tratamentos da halitose intra-oral a adequação do meio bucal, como adequação de próteses e restaurações mal adaptadas, restauração de dentes cariados e tratamento periodontal, deve ser realizada como parte fundamental deste tratamento; bem como a instrução de higiene oral, com a utilização de escovas apropriadas, utilização de fio-dental e a higienização do dorso da língua, para a redução mecânica de microorganismos. (Rosenberg, 1996; Aylıkcı & Çolak, 2013; Iatropoulos et al., 2016). Esse protocolo foi utilizado por Oyetola et al. (2016), os quais observaram uma taxa de sucesso de mais de 90% no tratamento da halitose, junto à instrução de dieta.
Assim sendo, é importante ressaltar que devido ao fato da saburra lingual ser um dos principais fatores que contribuem para o mau hálito, é de extrema importância a limpeza da superfície dorsal da língua, para que haja a diminuição de substratos e microorganismos, promovendo uma melhora do hálito (Menon & Coykendall, 1994; Mokeem, 2014; Ren et al., 2016).
Por sua vez, a utilização de enxaguantes bucais e antibióticos são meios químicos para a redução de microorganismos, dos quais podemos citar o metronidazol, a clorexidina, o triclosan e enxaguantes a base de óleos essenciais (Rosenberg et al., 1992; Thaweboon & Thaweboon, 2011; Scully & Greeman, 2012; Kapoor et al., 2016). Já a neutralização química dos CSV pode ser realizada através da utilização, por exemplo, de pastas de dentes e enxaguantes bucais que contenham em sua formulação íons metais e agentes oxidantes (Singh et al., 2015).
Em adição aos tratamentos existentes, pesquisas recentes têm mostrado a eficácia de probióticos e da terapia fotodinâmica na redução de microorganismos responsáveis pela halitose (Janczarek et al., 2016; Rai et al. 2016). Os probióticos, tais como
Streptococcus salivarius (K12), Lactobacillus salivarius or Weissella cibaria, atuam como
auxiliares no tratamento da halitose e têm como objetivo prevenir o restabelecimento de bactérias não desejáveis, limitando a recorrência do mau hálito por um longo período (Singh
et al., 2015). Por sua vez, a terapia fotodinâmica envolve interações entre uma fonte de luz (630 a 880 nm de comprimento de onda) e um fotossensibilizador, como o azul de metileno ou a toluidina azul. A reação resultante produz espécies reativas ao oxigênio, que têm um efeito bactericida (Lopes et al., 2014; Kellesarian et al., 2017).
Pacientes diagnosticados com halitofobia devem ter um acompanhamento psicológico para tratamento, assim como pacientes diagnosticados com halitose extra-oral devem ser encaminhados a médicos especializados, como otorrinolaringologista e gastroenterologista, por exemplo, para a realização de tratamento apropriado (Kapoor et al., 2016).
2.3 Estresse e Halitose
A reação ao estresse ocorre após a exposição a situações estressoras, como pressão no trabalho, provas e estresse físico, social e psicológico (Kyrou & Tsigos, 2009; Ranabir & Reetu, 2011). Estas situações estressoras representam ameaças à homeostase, promovendo alterações nas respostas fisiológicas e comportamentais (Sapolsky, 2000; Cozma et al., 2017). Dessa maneira, haverá a ativação dos dois principais componentes da resposta ao estresse, que são o Sistema Nervoso Simpático e o eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (Chrousos & Gold, 1992), para que haja a liberação de catecolaminas e glicocorticoides, respectivamente, para a mobilização de substratos energéticos para o Sistema Nervoso Central (SNC), tecido muscular e coração. Possuem como objetivo aumentar rapidamente a circulação, promover o catabolismo para a produção energética e diminuir as atividades não essenciais. Além disso, com a ativação do SNS, há o aumento da frequência e força da contração cardíaca e da pressão sanguínea, aumento da frequência respiratória e aumento do catabolismo do glicogênio para elevar a glicemia e diminuir a funcionalidade do sistema digestório (McEwen & Sapolsky, 1995; Sapolsky, 2000; Tanno & Marcondes, 2002; Tortora, 2004; Ranabir & Reetu, 2011; Ali and Pruessner, 2012; Sousa et al., 2015).
Segundo Selye (1936), essa reação é dividida em três diferentes fases: (1) Alarme ou alerta, (2) Resistência e (3) Exaustão, caracterizando a Síndrome Geral da Adaptação (SAG) (Sousa et al., 2015). A fase de alarme consiste em quando o organismo reconhece a
situação estressora e há uma mobilização para o enfrentamento da mesma. Se o estímulo continua, os recursos para o enfrentamento são mantidos e as respostas são, normalmente, adaptativas, aumentando as chances de sobrevivência do indivíduo, sendo esta a fase de resistência (Chrousos, 1998). Quando esta adaptação não ocorre, o organismo falha em neutralizar o agente estressor e continua respondendo de forma crônica, diversas funções fisiológicas essenciais do organismo podem ser prejudicadas, tais como o metabolismo, o crescimento, a reprodução e a imunocompetência, caracterizando a fase de exaustão (Araldi-Favassa et al., 2005; Kyrou & Tsigos, 2009; Sousa et al., 2015).
Sendo assim, sabendo que o estresse causa alterações fisiológicas no organismo como um todo, ele tem sido apontado como um fator que pode influenciar a produção dos CSV, em casos onde não é possível a determinação da causa da halitose (Queiroz et al., 2002; Kurihara & Marcondes, 2002; Calil & Marcondes, 2006; Lima, 2014).
Esse fato pôde ser observado em estudo realizado por Kurihara & Marcondes (2002), com ratos de laboratório submetidos a estresse por imobilização ou natação, nos quais foi observado o aumento nas concentrações de CSV. Em estudo posterior, realizado com humanos, Calil & Marcondes (2006) observaram que o Video Recorded Stroop Color Word Test (VRSCWT) induziu o aumento destes compostos na cavidade oral de homens e mulheres saudáveis, que não possuíam halitose. Já em um estudo in vitro, realizado por Calil et al. (2014), foi observado que hormônios do estresse (noradrenalina, adrenalina e cortisol) foram capazes de aumentar a produção de sulfeto de hidrogênio por bactérias periodontopatogênicas.
Por sua vez, Lima (2014) realizou um estudo com estudantes de graduação em Odontologia, no qual observou se haveria influência do estresse da vida acadêmica na produção de CSV. Foi observado aumento da concentração oral de CSV em estudantes do terceiro ano em comparação aos estudantes dos outros anos do mesmo curso. Desta maneira, a vida acadêmica também pode ser uma fonte de estresse, tais como o ambiente de ensino, medo de falhar, alta carga horária, dificuldade em lidar com as transições curriculares e avaliações acadêmicas (Simić & Manenica, 2012; Wilson et al., 2015), sendo que os estudantes estão expostos a diversas pressões durante a sua formação (Monteiro et al., 2007; Ratanasiripong et al., 2015; Tartas et al., 2016). Dentre as fontes estressoras presentes na vida acadêmica, as avaliações são frequentemente utilizadas como estressores
da vida real (Stowell 2003), uma vez que níveis elevados de estresse podem afetar negativamente as funções cognitivas e as habilidades de aprendizagem dos estudantes (de Kloet et al. 2005; Lupien et al. 2007; Pani et al., 2011). Diante disso, diversos estudos têm mostrado como períodos e situações de avaliações são estressantes para os mesmos (Johannsen et al., 2010; Simic & Manenica, 2012; Singh et al., 2012; Soliman et al, 2016), já que geralmente implicam em consequências futuras em sua carreira (Singh et al., 2012). Neste sentido, com relação à influência do estresse provocado por uma avaliação, sobre a produção de CSV, Queiroz et al. (2002) observaram, em alunos de graduação, o aumento nas concentrações de CSV no dia de um exame acadêmico de bioquímica, quando comparado às concentrações desses compostos na semana anterior e posterior ao exame.
Entretanto, alguns fatores podem influenciar a relação entre o estresse e a produção de CSV, tais como o gênero e o fluxo salivar.
Com relação ao gênero, em estudo realizado por Lima (2014), com estudantes de graduação em Odontologia, foi observado que as mulheres apresentavam maior valor de CSV totais e de mertilmercaptana, quando comparadas aos homens. Queiroz et al. (2002) também observaram que as concentrações de CSV estavam maiores em mulheres na fase pré-menstrual, que sofriam de tensão pré-menstrual, quando comparadas com mulheres que não sofriam desta desordem, a qual tem a ansiedade como um sintoma comum (Halbreich, 2003). Resultados semelhantes também foram observados por Lima et al. (2013), nos quais mulheres mostraram maior aumento de CSV, quando comparadas aos homens. Alguns autores acreditam que esses resultados sejam devidos às variações hormonais que ocorrem durante o ciclo (Tonzetich et al., 1978). Além disso, durante o ciclo menstrual, sugere-se que há um aumento na quantidade de bactérias da cavidade oral e no número de células descamadas, favorecendo o aumento dos CSV (Prout & Hopps, 1978; Quaranta et al., 1980).
Já com relação ao fluxo salivar, os dados encontrados na literatura mostram-se controversos. Queiroz et al. (2002) observaram que o aumento da produção oral de compostos sulfurados voláteis em estudantes universitários, no dia de uma avaliação, foi acompanhado de redução do fluxo salivar. Por outro lado, em estudo realizado por Calil & Marcondes (2006), não foi observada alteração no fluxo salivar após a exposição a uma situação ansiogênica, na qual foi acompanhada de aumento da concentração de CSV. Lima et
al. (2013) mostraram o aumento na concentração de CSV, após a exposição ao Video Recorded Stroop Color Word Test (VRSCWT), sem alteração na taxa de fluxo salivar. Lima (2014) também demonstrou que o estresse crônico relacionado às atividades acadêmicas não promoveu a alteração do fluxo salivar, apesar de ter havido aumento da concentração oral de CSV.
2.4 Avaliação do Estresse e Ansiedade
A ansiedade é um sentimento desagradável de medo e apreensão, caracterizado por tensão ou desconforto, devido à antecipação do perigo de algo desconhecido. A ansiedade passa a ser patológica quando é exagerada, desproporcional em relação ao estímulo e interfere na qualidade de vida, no conforto emocional ou no desempenho diário do indivíduo (Allen et al., 1995; Castillo et al., 2000; Margis et al., 2003).
O estresse emocional é um dos maiores problemas da sociedade moderna, tendo como um dos sintomas a ansiedade (Loures et al., 2002; Margis et al., 2003). Eventos estressores promovem uma resposta ao estresse, sendo este um processo bem coordenado que envolve mecanismos de ajustes fisiológicos, para lidar com as exigências da quebra da homeostase (Bali & Jaggi, 2013). Ocorrem mudanças a níveis psicológico (emocional e cognitivo), comportamental (luta e fuga) e biológico (funções neuroendócrinas e autonômicas alteradas) (Lazarus & Folkman, 1984).
Diversas pesquisas e modelos foram desenvolvidos até o presente, para a compreensão de mecanismos básicos do estresse, suas formas de enfrentamento e instrumentos para sua avaliação (Chamon, 2006). A avaliação do estresse em humanos é usualmente realizada através de biomarcadores como o cortisol, a alfa-amilase salivar, a norepinefrina (plasmática/urinária) e as interleucinas. Outras formas utilizadas para avaliar o estresse são através da mensuração da variação da frequência cardíaca, do tamanho da pupila, da pressão arterial e o auto relato de ansiedade (Bali & Jaggi, 2015).
Biomarcadores do estresse, como o cortisol e a alfa-amilase, são utilizados como forma de acessar o nível de estresse em ambientes estressores, incluindo fatores presentes na vida acadêmica, como, por exemplo, as avaliações acadêmicas. A secreção do cortisol apresenta um ritmo circadiano, tendo o seu pico pela manhã e as concentrações mais baixas
sendo observadas no período noturno, a qual é estimulada em situações de estresse. Na saliva, o cortisol não é afetado pela taxa de fluxo salivar (Vining & McGinley, 1987; Garde & Hansen, 2005) e aparece principalmente na forma livre, ao contrário do cortisol encontrado no sangue (Aardal & Holm, 1995), sendo considerado um marcador bioquímico de estresse (Vining et al., 1983). McCartan et al. (1996) encontraram correlação positiva entre ansiedade e a concentração de cortisol salivar. Fukui et al. (2010) observaram que houve aumento da concentração salivar de cortisol em pacientes ansiosos diagnosticados com halitose. Em estudo posterior, Lima et al. (2012) observaram que indivíduos saudáveis expostos a um teste ansiogênico apresentavam aumento significativo na concentração salivar de cortisol e na concentração bucal de CSV.
Com relação à alfa-amilase, é a enzima mais dominante na saliva, sendo responsável pela degradação do amido. Age também como um antimicrobiano salivar, contribuindo para a imunidade inata, neutralizando e prevenindo a entrada de patógenos no corpo através de superfícies mucosas (Papacosta & Nassis, 2011), sendo considerada um indicador da imunidade mucosa da cavidade oral, por inibir a aderência e crescimento de bactérias (Nater & Rohleder, 2009). Sua secreção é devida à ativação do sistema nervoso autônomo, que controla as glândulas salivares, e um aumento em sua atividade é esperado durante as reações ao estresse, nas quais há alta ativação do sistema nervoso simpático (Nater & Rohleder, 2009). Sendo assim, a alfa-amilase é sugerida como sendo um biomarcador do Sistema Nervoso Simpático (Bishop & Gleeson, 2009). Tendo em vista esta característica, aumento na concentração salivar de alfa-amilase foi observado em resposta a situações ansiogênicas, tais como exames acadêmicos (Bosch et al., 1996), apresentação de vídeos com cenas desagradáveis (Bosch et al., 2003), e estressores laboratoriais (Granger et al., 2006). Em estudantes universitários, também foi observado o aumento da concentração de alfa-amilase salivar associada à maior concentração bucal de CSV (Lima, 2014). Portanto, associada à avaliação da concentração de cortisol na saliva, a avaliação da concentração salivar de alfa-amilase pode auxiliar na compreensão de mecanismos envolvidos na fisiologia do estresse, funções comportamentais e cognitivas (Granger et al., 2007).
Dentre as desordens emocionais, a ansiedade é a mais prevalente na população (Kessler et al., 2005; Copeland et al., 2009). Sendo assim, é de grande importância a existência de ferramentas de avaliação psicométricas bem validadas e sólidas, para a
identificação e intervenção em transtornos de ansiedade e seus sintomas (Ortuño-Sierra et al., 2016).
Assim como os biomarcadores salivares do estresse (cortisol e alfa-amilase), os testes de avaliação psicológica são úteis e, em humanos, as mudanças emocionais induzidas pelo mesmo são avaliadas através do uso de uma grande variedade de escalas e questionários, que incluem as Escalas Analógicas Visuais, o Inventário de Ansiedade Traço-Estado (Biaggio & Natalício, 1979), o Questionário de Perfil de Traço-Estados de Humor (Cruz & Viana, 1993), a Escala de Afeto Positivo e Negativo (Giacomoni & Hutz, 1997), a Escala de Estresse Percebido (Reis et al., 2010), dentre outros, permitindo observar a manifestação de características psicológicas de um indivíduo (Noronha et al., 2004).
Dentre os questionários citados, o Inventário de Ansiedade Traço-Estado - IDATE (State-Trait Anxiety Inventory – STAI, em inglês) é um instrumento avaliador de auto relato, muito utilizado para avaliar traços e estados de ansiedade, tanto na população geral quanto na clínica (Beutel et al.,2011). A versão brasileira do STAI, o “Inventário de Ansiedade Traço-Estado”, foi validada através do trabalho realizado por Biaggio & Natalício em 1979 (“State-Trait Anxiety Inventory” [STAI]; Spielberger, Gorsuch e Lushene, 1970).
O IDATE é composto por duas subescalas: uma para traço e outra para estado. Cada uma das subescalas possui 20 itens, sendo que alguns destes itens são positivos e, outros, negativos (Biaggio & Natalício, 1979). As qualidades essenciais avaliadas pelo IDATE-estado envolvem sentimentos de tensão, nervosismo, preocupação e apreensão (Biaggio & Natalício, 1979). O IDATE-traço avalia características estáveis e particulares de cada pessoa reveladas sob o estímulo adequado (Baldassin et al., 2006).
O traço de ansiedade é descrito como uma tendência relativamente estável em relação ao tipo de ansiedade que qualquer um pode sofrer quando se depara com situações percebidas como ameaçadoras (Miller, 1970). Enquanto isso, o estado de ansiedade se refere a um estado emocional transitório cuja intensidade pode variar de acordo com o contexto e ao longo do tempo. É caracterizado por sentimentos desagradáveis de tensão ou apreensão e aumento da atividade do sistema nervosa simpático, causando alterações como taquicardia, sudorese e aumento da pressão arterial (Miller, 1970; Brenneisen Mayer et al., 2016). Assim, o IDATE-traço foi desenvolvido para identificar como o indivíduo se sente no geral e, o IDATE-estado, para mostrar como o indivíduo se sente em determinadas situações e condições (Terzioglu et al., 2016), em certo período de tempo (Ulker & Krivak, 2016).
O IDATE é um dos inventários mais utilizados para a avaliação de ansiedade (Fioravanti et al., 2006). Ortuño-Sierra et al. (2016) observaram que o IDATE possui propriedades psicométricas adequadas, sendo, portanto, um instrumento que pode ser utilizado para avaliar os sintomas de ansiedade traço-estado.
Desta forma, a avaliação do nível de estresse através do questionário IDATE e dos biomarcadores salivares, em estudantes universitários, é útil no estudo da influência do estresse sobre a produção e concentração de compostos sulfurados voláteis. Como não houve a avaliação do estresse, bem como dos biomarcadores do estresse em estudo realizado por Queiroz et al. (2002), com o objetivo de complementar as informações acerca deste assunto, este estudo busca avaliar a influência do estresse agudo, provocado por uma avaliação acadêmica, sobre o nível de ansiedade, a concentração de cortisol e alfa-amilase, em estudantes universitários, bem como sua influência sobre a produção de CSV, além de avaliar o fluxo salivar.
3 PROPOSIÇÃO
3.1 OBJETIVO GERALAvaliar a relação entre o estresse provocado por uma avaliação acadêmica, sobre a produção de compostos sulfurados voláteis, e a concentração de biomarcadores do estresse.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.2.1 Determinar a concentração oral de CSV, em alunos de graduação, no dia de uma avaliação acadêmica;
3.2.2 Determinar a concentração salivar de cortisol e alfa-amilase, biomarcadores do estresse;
3.2.3 Identificar a tendência à ansiedade e o estado emocional dos voluntários, através do IDATE-t e IDATE-e, respectivamente;
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICASEste projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da FOP/UNICAMP, sob o protocolo número 090/2015 (ANEXO 1). Os voluntários foram selecionados entre os alunos do gênero masculino, ingressantes do curso de Graduação em Odontologia da FOP – UNICAMP, no ano de 2016.
Após a seleção, os voluntários receberam uma informação verbal contendo a explicação dos procedimentos que seriam realizados, as recomendações para os dias das coletas, bem como o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Neste termo, foram explicados os objetivos e justificativas para a realização do estudo, os riscos e benefícios aos quais estariam expostos, e demais itens descritos nas Diretrizes do Conselho Nacional de Saúde (Resolução 466/12). Após a leitura do documento, foram esclarecidas todas as dúvidas dos voluntários que, posteriormente, assinaram duas vias do termo. Uma das vias permaneceu com o voluntário e a outra foi entregue à pesquisadora. Foi também garantido aos voluntários o direito de se recusarem a participar do estudo em qualquer momento, sem nenhum prejuízo, bem como foram informados o telefone das pesquisadoras para a solução de quaisquer dúvidas que poderiam surgir posteriormente.
4.2 CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA
Dos 15 alunos convidados a participarem, três não puderam participar por não atenderem aos critérios de inclusão e um aluno desistiu antes da segunda coleta.
Portanto, participaram do estudo 11 voluntários, que pertenciam ao gênero masculino, com idade entre 18 e 21 anos e eram estudantes de Odontologia, cursando o 2º e 3º semestres do curso, nos anos de 2016 e 2017, respectivamente, pertencentes à mesma turma ingressante do ano de 2016. Foram selecionados apenas homens devido ao fato de que alterações hormonais relacionadas ao ciclo menstrual podem influenciar a produção de CSV (Queiroz et al., 2002; Calil et al, 2008). Além disso, foi optado por voluntários do curso de odontologia por terem uma boa condição de saúde oral.
avaliação dos índices de placa e de sangramento gengival (Ainamo & Bay, 1975), saburra lingual (Miyazaki et al., 1995), presença de cáries, cálculos e outros fatores que favorecem a produção de CSV. Os critérios de inclusão foram: ser saudável, não fazer uso de medicamentos, não-fumar e não apresentar doenças periodontais, cáries, língua saburrosa, próteses, aftas e/ou ulcerações, alterações sistêmicas e/ou naso-faríngeas e respiração bucal já que todos esses fatores podem favorecer a produção dos CSV (Lee et al., 2016). Os voluntários que apresentaram índices de sangramento gengival e de placa maiores que 10%, foram excluídos da pesquisa (Lima, 2014). Para avaliação da presença e do índice de saburra lingual (Miyazaki et al., 1995), foram seguidos os seguintes critérios:
• 0 – ausência de saburra
• 1 – saburra cobrindo menos que 1/3 do dorso da língua • 2 - saburra cobrindo menos que 2/3 do dorso da língua • 3 - saburra cobrindo mais que 2/3 do dorso da língua
Todos os voluntários receberam instruções de higiene oral e limpadores linguais participando da pesquisa apenas voluntários com índice de saburra lingual menor ou igual que grau 1 (Lima, 2014).
4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Os experimentos foram realizados no segundo semestre de 2016, no dia da avaliação de Biociências II, no mês de outubro (Avaliação) e em março de 2017 (Após avaliação), devido este ser o início do ano letivo, estando os voluntários menos estressados, devido às férias recentes.
Nestes dois momentos, também foi solicitado aos alunos voluntários que respondessem ao IDATE-estado (“Inventário de Ansiedade Traço-Estado”), para caracterização do nível de ansiedade (Biaggio & Natalício, 1979) no dia da coleta. O IDATE-traço (“Inventário de Ansiedade Traço-Estado”) foi respondido antes do início da pesquisa, em 2016, e ao final da pesquisa, em 2017, antes dos dias agendados para a realização das coletas, para verificar se sofriam de ansiedade (Biaggio & Natalício, 1979). A análise dos
questionários foi supervisionada por um psicólogo pertencente ao Projeto Temático, do qual este estudo faz parte.
As recomendações para a coleta foram informadas antes da realização dos procedimentos, de modo que no dia da coleta foi explicado aos voluntários como seriam realizadas as coletas das amostras do ar da cavidade oral e de saliva.
Foi solicitado aos voluntários que, na manhã do dia agendado para coleta de amostras, logo após acordarem, fosse realizada a coleta da saliva utilizando um frasco Salivette®, seguindo as recomendações do fabricante, para a determinação das concentrações de cortisol. Ao chegarem na faculdade pela manhã, o Salivette® foi entregue à pesquisadora e, a saliva, foi centrifugada e armazenada em freezer (-80°C).
Entre os horários de 10 horas e 13 horas, foi solicitado aos voluntários que comparecessem ao laboratório, em jejum de 4 horas, em horários previamente agendados. Inicialmente, foi realizada a coleta do ar da cavidade oral, para mensuração dos CSV, através do Oral Chroma®, seguida da coleta de saliva não-estimulada, para a determinação das concentrações de alfa-amilase. As amostras de saliva foram mantidas em gelo até o momento da centrifugação. As amostras centrifugadas foram divididas em alíquotas, em tubos tipo eppendorf, e foram armazenadas a -80°C.
Cuidado foi tomado para que as coletas antes da prova não ocorressem em dias de outras provas, seminários e outras atividades que pudessem induzir ansiedade. Para isso, foi avaliado o cronograma de todas as matérias que os voluntários cursavam, bem como verificado com os mesmos se haveria algum compromisso acadêmico que inviabilizasse a realização das coletas.
4.4 APLICAÇÃO DE QUESTIONÁRIO PARA CARACTERIZAÇÃO DO NÍVEL DE ANSIEDADE
Para esta pesquisa, foi utilizado o “Inventário de Ansiedade Traço-Estado”, validado no Brasil por Biaggio & Natalício em 1979 (ANEXO 2) (“State-Trait Anxiety Inventory” [STAI]; Spielberger, Gorsuch e Lushene, 1970), para caracterização do estado e do traço de ansiedade dos voluntários.
negativos: a primeira parte refere-se ao estado e, a segunda parte, ao traço de ansiedade, no qual o voluntário, através de autorrelato, respondeu às perguntas, de acordo com os scores que poderiam ser: “quase nunca” (1), “às vezes” (2), “frequentemente” (3) e “quase sempre” (4). O score total varia de 20 a 80 para cada escala, com pontos de corte classificados como (Baldassin et al., 2006; Kaipper, 2008):
● menos de 33 pontos: indicação de ansiedade leve; ● de 33 a 49 pontos: ansiedade média;
● mais de 49 pontos: indicação de ansiedade alta.
Para a quantificação e interpretação das respostas, atribui-se a pontuação correspondente à resposta dada para cada uma das perguntas. Os scores para as perguntas de caráter positivo possuem pesos invertidos, atribuindo valores de 1, 2, 3 e 4 para as respostas 4, 3, 2 e 1, respectivamente. No IDATE-estado, as questões com pesos invertidos, de caráter positivas, são: 1 – 2 – 5 – 8 – 10 – 11 – 15 – 16 – 19 - 20. Já no IDATE-traço, as questões são: 1 – 6 – 7 – 10 – 13 – 16 – 19 (Biaggio & Natalício, 1979; Kaipper, 2008).
Foi solicitado aos voluntários que respondessem ao IDATE-estado para caracterização do nível de ansiedade (Biaggio & Natalício, 1979) no dia da coleta. O IDATE-traço foi respondido antes do início da pesquisa, em 2016, e ao final da pesquisa, em 2017, antes dos dias agendados para a realização das coletas, para verificar se sofriam de ansiedade (Biaggio & Natalício, 1979).
4.5 MEDIDA DOS COMPOSTOS SULFURADOS VOLÁTEIS (CSV)
Todos os voluntários selecionados apresentaram-se no laboratório, nos dias determinados, entre o período das 10 horas às 13 horas. Os voluntários foram instruídos a não utilizarem enxaguantes bucais, a não beberem café e bebidas alcoólicas e a não ingerirem alimentos que pudessem causar mau hálito (tais como alho, cebola e alimentos apimentados) no dia anterior aos dias das coletas. Foi permitido a ingestão de alimentos e a higienização da cavidade oral nas manhãs das coletas e, após essas atividades, foi solicitado jejum absoluto de 4 horas até o horário marcado para as mesmas (Lee et al., 2016). Também foi solicitado aos voluntários que, nos dias das coletas, não estivessem utilizando perfumes, colônias, loção pós barba e outros compostos com derivados alcoólicos.
A mensuração dos CSV foi realizada utilizando-se um cromatógrafo gasoso, o Oral Chroma™ (Oral Chroma™, Abilit Corporation, Osaka, Japão) (Lima et al., 2012; Lima et al., 2013) de acordo com protocolo modificado, segundo Tangerman & Winkel, 2008: uma seringa de 1 ml foi inserida na cavidade oral dos voluntários e solicitado aos mesmos que a segurassem com os lábios sem que encostassem a língua em sua extremidade, durante o tempo de 1 minuto. Após este período, o êmbolo da seringa foi puxado e 1 mL de ar coletado da cavidade oral dos voluntários foi inserido no aparelho, com a ajuda de uma agulha, própria do mesmo. Após 8 minutos, os CSV mensurados foram: sulfeto de hidrogênio (H2S), metilmercaptana (CH3SH) e dimetilsulfeto (CH3)2S), em partes por bilhão (ppb).
4.6 COLETA DE SALIVA
Foi realizada a coleta de saliva pelos voluntários em um frasco Salivette®, de acordo com as recomendações do fabricante. Foi solicitado aos voluntários que esta primeira coleta fosse realizada logo pela manhã, assim que eles acordassem, antes de realizarem qualquer atividade. Posteriormente, o Salivette® foi entregue à pesquisadora pela manhã, no momento em que os voluntários chegaram à faculdade. A saliva foi, então, centrifugada a 1.000 g, por 2 minutos, seguindo as recomendações do fabricante e, posteriormente, dividida em alíquotas para, então, ser armazenada em freezer a -80°C, para posterior dosagem de cortisol.
Foi realizada também a coleta de saliva não-estimulada, de acordo com Tárzia (2003), no dia marcado para a coleta, após a coleta do ar da cavidade oral. O voluntário foi orientado a deglutir a saliva que estivesse na boca e, em seguida, depositar no frasco toda a saliva que foi secretada durante os cinco minutos seguintes. O volume obtido foi dividido por cinco e, o resultado, apresentado em mL/min, nos fornecendo o fluxo salivar. A saliva coletada foi centrifugada a 4.000 g, por 10 minutos, a 4°C e, o sobrenadante, colocado em eppendorfs esterilizados para então, serem armazenanados no freezer (-80°C), para posterior dosagem de alfa-amilase (Lima, 2014).
A análise do cortisol foi realizada através da coleta de saliva com o Salivette®, diferentemente da coleta de saliva para análise de alfa-amilase (saliva não-estimulada), para que houvesse um nivelamento do horário, ou seja, para que as coletas ocorressem no
mesmo horário entre todos os voluntários, uma vez que o cortisol apresenta um ritmo circadiano de secreção. Esse ritmo possui picos de secreção durante o início da manhã, diminuindo no decorrer do dia, atingindo um mínimo durante a noite (Soares & Alves, 2006; Silva et al., 2007).
4.7DOSAGENSBIOQUÍMICAS
As dosagens bioquímicas de cortisol e alfa-amilase na saliva foram realizadas por ensaio imunoenzimático ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), utilizando-se kits comerciais Salimetrics®, de acordo com as recomendações do fabricante.
Para o cortisol, a densidade óptica é lida através da intensidade de coloração, em comprimentos de ondas de 450 nm. Os coeficientes de intra e inter-ensaio foram de 3,65% e 6,41%, respectivamente.
Para a alfa-amilase, a leitura ocorre em comprimentos de ondas de 405 nm. Os coeficientes de intra e inter-ensaio foram de 6,7% e 5,8%, respectivamente.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise dos dados foi realizado o teste t de Student para amostras pareadas.
5 RESULTADOS
Não houve diferença nos scores de ansiedade traço quando comparados o dia da avaliação (p>0,05; Figura 1A) com o período após a avaliação. Por outro lado, houve aumento da ansiedade estado no dia da avaliação em comparação com o momento após a avaliação (p<0,05; Figura 1B).
Figura 1. “Scores” do IDATE-traço (Figura 1A) e do IDATE-estado (Figura 1B), de alunos do primeiro ano de graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP). Ambos os questionários foram respondidos pelos voluntários tanto no dia da avaliação quanto no período após a avaliação; n=11. Os resultados estão apresentados em média ± erro padrão.
Com relação à concentração oral de compostos sulfurados voláteis, houve aumento significativo de sulfeto de hidrogênio (H2S) no dia da avaliação em relação aos dados obtidos após a realização da avaliação (p<0,05; Figura 2. Dia da avaliação: 160 ppb/ Após a avaliação: 42,64 ppb), sem diferença significativa para os gases metilmercaptana (CH3SH; p>0,05; Dia da avaliação: 66,45 ppb/ Após a avaliação: 17,91 ppb) e dimetilsulfeto ((CH3)2S; p>0,05; Dia da avaliação: 78,91 ppb/ Após a avaliação: 23,64 ppb).
C o n c e n tr a ç ã o d e S u lf e t o d e H id r o g ê n io ( p p b ) Av a lia ç ã o Ap ó s a v a lia ç ã o 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 *
Figura 2. Concentrações de sulfeto de hidrogênio expressos em ppb, obtidas de alunos do primeiro ano de graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP); n=11. Os resultados estão apresentados em média ± erro padrão.
Com relação ao fluxo salivar, não houve diferença significativa entre os resultados obtidos no dia da avaliação e após a avaliação (p>0,05; Figura 3).
F lu x o s a li v a r ( m l/ m in ) Av a lia ç ã o Ap ó s a a v a lia ç ã o 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0
Figura 3. Fluxo salivar obtido por coleta de saliva não-estimulada, durante 5 minutos, de alunos do primeiro ano de graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP). Valores expressos em ml/min. n=11. Os resultados estão apresentados em média ± erro padrão.
Para os biomarcadores salivares, tanto para o cortisol (p>0,05; Figura 4A) quanto para a alfa-amilase (p>0,05; Figura 4B), não foram observadas diferenças significativas entre os dados obtidos no dia da avaliação e no período após a avaliação.
Figura 4. Concentração de Cortisol (Figura 4A) e Alfa-amilase (Figura 4B) de alunos do primeiro ano da graduação de Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP); n=11. Os resultados estão apresentados em média ± erro padrão.
6 DISCUSSÃO
Este estudo teve como objetivo avaliar a relação entre o estresse provocado por uma avaliação acadêmica, sobre a produção de compostos sulfurados voláteis e a concentração de cortisol e alfa-amilase. Os resultados mostram que a avaliação acadêmica aumentou o nível de ansiedade estado e a concentração oral de H2S, sem alteração no fluxo salivar, ansiedade traço e concentrações salivares de cortisol e alfa-amilase.
O corpo humano regula o seu meio interno através de processos fisiológicos, mantendo a homeostase. Fatores conhecidos como estressores, que incluem influências físicas (doenças, alergias ou pouco sono), psicológicas (conflitos, trauma, estado financeiro, exigências no trabalho ou educacionais) e ambientais (barulhos, multidão, poluição) (Selvaraj, 2015) levam o corpo ao desequilíbrio. Desta forma, exames acadêmicos são reconhecidos como situações estressoras para os estudantes (Simić & Manenica, 2012). A ansiedade proveniente de uma avaliação acadêmica causa algumas respostas, como preocupação excessiva e nervosismo (Hashmat et al., 2008), acompanhadas frequentemente por uma diminuição no desempenho (Neuderth et al., 2009; Sohail, 2013). Para avaliar como o indivíduo geralmente responde às situações estressoras, foi utilizado o IDATE-traço, tanto no dia da avaliação, quanto após a avaliação, os quais não mostraram diferença significativa entre estes dois momentos, mostrando que a ansiedade traço não alterou no intervalo de tempo entre as coletas. Ferreira et al. (2009) observaram que estudantes do ciclo básico da área biomédica possuem traço de ansiedade mais elevado em comparação às áreas tecnológicas e humanísticas, devido a demandas acadêmicas mais intensas. Baldassin et al. (2006) também observou que a maioria dos estudantes do curso de medicina possuíam traço de ansiedade classificado como “ansiedade média”. O presente estudo mostra que o traço de ansiedade dos voluntários é semelhante aos apresentados por esses autores, estando classificados como “ansiedade média” (Pesqueira et al., 2010).
Biaggio & Natalício (1979) afirmam que pessoas que possuem alto traço de ansiedade tendem a perceber um maior número de situações como perigosas ou ameaçadoras e, consequentemente, a responder com frequente aumento do estado de ansiedade. Levando em consideração essa afirmação, pode-se dizer que a maioria dos alunos tem tendência moderada de apresentar elevações dos níveis de ansiedade estado em situações ameaçadoras (Santos & Galdeano, 2009). Sendo assim, para verificar o nível do estado de ansiedade, tanto no dia da avaliação quanto após a avaliação, foi utilizado o
IDATE-estado, que avalia como o indivíduo se sente em determinada situação (Terzioglu et al., 2016). Tendo em vista essa avaliação, o presente estudo observou o aumento nos scores do questionário de ansiedade estado aplicado aos voluntários no dia da avaliação, quando comparado ao dia após a avaliação. Resultado semelhante foi encontrado em estudo realizado por Murphy et al. (2010), no qual estudantes mostraram aumento no nível de estresse percebido, durante o período de avaliação. Queiroz et al. (2002) e Ng et al. (2003) também observaram o aumento do estresse no dia da realização de uma avaliação. Da mesma maneira, Kang (2010) observou que o exame acadêmico foi capaz de provocar o aumento do estresse psicológico, em estudantes do segundo ano de um curso de Enfermagem.
Sendo assim, instrumentos psicométricos nos auxiliam na avaliação da situação psicológica de um indivíduo (Kaipper, 2008), na qual fatores estressores exercem influência. Da mesma forma que esses questionários, fatores fisiológicos também podem ser avaliados, para verificar tal influência. O agente estressor faz com que ocorra a reação ao estresse, na qual alterações metabólicas e endócrinas ocorrem, sendo que o aumento nos níveis de cortisol representa um dos efeitos fisiológicos mais importantes (Amenábar et al., 2008). Além disso, tem sido observado que a atividade de alfa-amilase na saliva aumenta em resposta ao estresse fisiológico e psicossocial (Nater et al., 2005), representando a atividade do Sistema Nervoso Simpático (Nater & Rohleder, 2009).
No presente estudo não foi observado alteração na concentração de cortisol, sendo este resultado inconsistente com diversos estudos que mostram que durante períodos de estresse o cortisol é produzido em níveis elevados (Al-Ayadhi, 2005; Schoofs, 2008; Johannsen et al. 2010; Murphy et al., 2010; Merz & Wolf, 2015). Entretanto, há resultados semelhantes ao obtido no presente estudo, como em estudo realizado por Valentin et al. (2015), no qual atividades de treinamento, através da simulação de situações médicas (hipoglicemia, queimadura e intoxicação) com manequins e pacientes humanos treinados e padronizados (graduandos e pós-graduandos em medicina), produziram estresse entre profissionais da saúde. Foi observado o aumento da concentração da alfa-amilase, que não foi acompanhado por aumento nas concentrações de cortisol. Sendo que o mesmo resultado foi observado por Hettiarachchi et al. (2014), no qual não houve alterações nas concentrações de cortisol sérico, no período de exames, entre estudantes de medicina do Sri Lanka.
Com relação à alfa-amilase, há estudos nos quais houve aumento de sua concentração em situações de estresse acadêmico, como observado por Schoofs (2008) e por Kang (2010), em resposta ao estresse ocasionado por uma avaliação oral em estudantes de Psicologia e uma avaliação acadêmica, em estudantes de enfermagem; além de Rashkova et al. (2012), no qual o aumento da concentração de alfa-amilase também foi observado antes da realização de um exame acadêmico, por estudantes de Odontologia. Porém, em outros tipos de situações estressoras, resultados diferentes podem ser observados. Em estudo realizado por Schäffer et al. (2008) não houve alteração na atividade de alfa-amilase salivar, quando analisados antes e após a aplicação do fator estressor (coleta de sangue pós-parto de rotina – “teste do pezinho”) em bebês recém-nascidos. Já em estudo realizado por Selvaraj (2015), o “Trier Social Stress Test – TSST” provocou o aumento da ansiedade em indivíduos de Palo Alto, na Califórnia, Estados Unidos, sem alteração na atividade salivar de alfa-amilase.
Em estudo realizado por Nagy et al. (2015) indicaram que o momento de coleta da saliva e o tipo de estressor podem influenciar na resposta do biomarcador alfa-amilase. Foi observado que um estressor cognitivo (teste de memória) foi capaz de promover o aumento da concentração de alfa-amilase salivar ao final do agente estressor, enquanto que um estressor físico (“cold pressor task”) não promoveu alteração na concentração da mesma. Da mesma forma, Kirschbaum et al. (1993) observaram que os níveis de cortisol salivar aumentaram gradualmente, até atingirem um pico máximo após 10 minutos do término do agente estressor (TSST), retornando aos valores basais dentro de 1 hora pós-estresse. Outra hipótese que pode ter influenciado a não alteração nas concentrações de cortisol salivar, no presente estudo, é o fato de que para essa alteração ser notada é necessário que haja uma alteração muito maior a níveis sanguíneos: para que haja um aumento do cortisol salivar de apenas 5nmol/L, é necessário que haja um aumento do cortisol total plasmático de 200 nmol/L para 400 nmol/L (Hellhammer et al., 2009). Além disso, uma parte do cortisol é convertido em cortisona na saliva, diminuindo, assim, a concentração de cortisol livre na saliva em comparação ao cortisol livre plasmático (Meulenberg & Hofman, 1990). Portanto, tendo em vista essas observações, repetidas amostras de saliva podem ser coletadas, no decorrer do tempo (por exemplo: antes, durante, logo após e a cada 15 minutos após o término do agente estressor – durante 1
