AVALIAÇÃO DO POSSÍVEL EFEITO ANSIOLÍTICO EM RATOS E
CAMUNDONGOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE LAVANDULA ANGUSTIFOLIA
MILL.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do grau de Mestre em Psicobiologia
São Paulo 2010
AVALIAÇÃO DO POSSÍVEL EFEITO ANSIOLÍTICO EM RATOS E
CAMUNDONGOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE LAVANDULA ANGUSTIFOLIA
MILL.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do grau de Mestre em Psicobiologia
São Paulo 2010
Junior, Jaime Fassin
Avaliação do possível efeito ansiolítico em ratos e camundongos do óleo essencial de Lavandula angustifolia Mill. / Jaime Fassin Júnior.—São Paulo, 2010.
xviii, 78
Tese (mestrado) – Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Psicobiologia.
Título em inglês: Avaliation of the possible ansiolitic effect of the
Lavandula angustifólia Mill. essential oil através intraperitoneal administration or inhalation in mice and rats.
JAIME FASSIN JUNIOR
AVALIAÇÃO DO POSSÍVEL EFEITO ANSIOLÍTICO EM RATOS E
CAMUNDONGOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE LAVANDULA ANGUSTIFOLIA
MILL.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do grau de Mestre em Psicobiologia
São Paulo 2010
Orientador: Prof. Dr. José Roberto Leite Co-orientadora: Profª Drª Rita Mattei Persoli
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE PSICOBIOLOGIA
Chefe de Departamento: Profa. Dra. Maria Lucia de Oliveria Souza Formigoni. Coordenador do Curso de Pós-graduação: Marcos Túlio de Melo.
Esta tese foi realizada no Departamento de Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP/EPM, com o apoio financeiro da Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
JAIME FASSIN JUNIOR
AVALIAÇÃO DO POSSÍVEL EFEITO ANSIOLÍTICO EM RATOS E
CAMUNDONGOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE LAVANDULA ANGUSTIFOLIA
MILL.
Presidente da banca: Prof. Dr. José Roberto Leite
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcelo Paes de Barros.
Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega Almeida.
________________________________________________________
Prof. Dr. Roberto Andreatini.
_______________________________________________________
Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação para processos de fotocopiadoras ou eletrônicos.
ix
Dedicatória
Aos meus pais e minha noiva, que sem sua ajuda e empenho, nunca teria chegado a esse trabalho
x
Agradecimentos
Ao professor José Roberto Leite, pela excelente orientação e principalmente pela confiança e apoio incondicionais em momentos cruciais do meu trabalho. Minha eterna gratidão.
À professora Rita Mattei pelas orientações e sugestões. À AFIP pelo apoio financeiro.
Eliane,grande amiga e companheira, presente em todos os momentos ajudando desse modo a realizar este trabalho.
Aos colegas do Instituto de Medicina Comportamental, Anna Alice, Giuliano, José Luis, Eliana, Rui cuja troca de experiências foi enriquecedora e a Sueli por toda a paciência com que nos trata.
Ao Gilbertinho da Bioquímica, pela ajuda sempre pronta e pelas horas de conversa extremamente instrutivas.
Júlio, Nereide e Mara, funcionários da secretaria de pós-graduação, pela presteza, atenção e ajuda na resolução de problemas em qualquer situação e sempre bem humorados!
A todos os técnicos e bioteristas, em especial ao Tomé, pela bondade, e presteza com a qual me auxiliou.
Ao grupo de pessoas responsáveis pela limpeza e cozinha. Sempre alegres e colaborativas.
E finalmente, aos animais, sem os quais, jamais teria realizado este trabalho.
xi
Agradecimentos especiais
Agradecemos a Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro e bolsa de mestrado
xii Lista de figuras
Figura 1: Comunicação neuro-anatômica entre sistema olfatório e SNC 7
Figura 2: Linalool 9
Figura 3: Acetato de linalil 9
Figura 4: Lavandula angustifólia Mill 10
Figura 5: Caixa de inalação 15
Figura 6: Jaula para observação 17
Figura 7: Caixa de atividade motora 18
Figura 8: Rota-rod 19
Figura 9: Tempo de sono 20
Figura 10: Campo aberto 21
Figura 11: Interação social 22
Figura 12: Labirinto em cruz elevado 23
Figura 13: Resultados atividade motora i.p 26
Figura 14a: Resultados latência para o sono i.p Figura 14b: Resultados tempo de sono i.p
28 28 Figura 15a: Resultado atividade motora inalatório 15’
Figura 15b: Resultado atividade motora inalatório 30’ Figura 15c: Resultado atividade motora inalatório 60’ Figura 15d: Resultado atividade motora inalatório 90’ Figura 16: Resultado tempo de sono inalatório
Figura 17: Resultado campo aberto Figura 18: Resultado interação social
Figura 19a: Resultado labirinto em cruz elevado exposição aguda
30 31 31 33 34 35 36 37
xiii Figura 19b: Resultado labirinto em cruz elevado exposição aguda 38
Figura 20a: Resultado labirinto em cruz elevado exposição sub-crônica 39 Figura 20b: Resultado labirinto em cruz elevado exposição sub-crônica 40
xiv Lista de tabelas
Tabela 1: Perfil dos componentes fito-químicos o OEL 9 Tabela 2: Resultado Screening farmacológico do OEL i.p 25
Tabela 3: Resultados Rota-rod i.p 27
Tabela 4: Resultados Screening farmacológico do OEL inalatório 29
xv Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
OEL Óleo essencial de lavanda
ISO International Standard Oraganization
IFF International Flavors and Fragrance
xvi Resumo
Os óleos essenciais podem ser utilizados terapeuticamente no controle das emoções, pelos seus efeitos sedativos e ansiolíticos. Por outro lado, a relação entre a percepção de odores e alteração da resposta emocional tem sido proposta, uma vez que é conhecido o fato da atuação dos mesmos sobre o sistema límbico. Considerando que na medicina popular são propostas certas propriedades depressoras para o óleo essencial de lavanda (OEL), no presente estudo foi avaliado o possível efeito ansiolítico desse óleo. Métodos: Ratos Wistar machos de 3-5 meses de idade, foram divididos nos grupos controle e OEL (2,5%; 100% p/v), sendo expostos à inalação durante 7 minutos, Os animais foram avaliados no campo aberto, interação social e labirinto em cruz elevado..
Resultados: Nossos resultados indicam um possível efeito depressor para o OEL, sugerindo um efeito ansiolítico. Tal efeito poderia ser correlacionado a comunicação entre o sistema olfatório e áreas límbicas, regiões que controlam as emoções e a motivação nos animais.
xvii SUMÁRIO
Dedicatória x
Agradecimentos xi
Lista de figuras xii
Lista de tabelas xiii
Lista de abreviaturas xv Resumo xvi 1. INTRODUÇÃO 1 1.1 Ansiedade 1 1.2 Plantas medicinais 2 1.3 Óleo essencial 2
1.4 Óleos essenciais e suas aplicações 4
1.5 Aromaterapia 6
1.6 Caracterização da planta e do óleo essencial de lavanda 7
1.7 Justificativa 10
2. OBJETIVOS 11
3. MATERIAIS 12
3.1 Animais 12
3.2 Óleo, drogas e reagentes 12
3.3 Análise do óleo essencial de Coentro 13
4. MÉTODOS 14
4.1 Tratamento 14
4.1.1 Administração por via i.p em camundongos 14
4.1.2 Exposição olfatória em camundongos 14
4.1.3 Exposição olfatória em ratos 15
4.2 Testes gerais 16
4.2.1 Triagem farmacológica inicial 16
4.2.2 Medida da atividade motora 17
4.2.3 Medida da coordenação motora (Rota-rod) 18 4.2.4 Tempo de sono induzido pelo tiopental 19
4.3 Modelos comportamentais específicos 20
4.3.1 Avaliação comportamental no campo aberto 20
4.3.2 Teste da interação social 21
xviii
4.4 Análise estatística 23
5. RESULTADOS 24
5.1 Teste gerais por via i.p 24
5.1.1 Triagem farmacológica inicial 24
5.1.2 Medida da atividade motora 25
5.1.3 Medida da coordenação motora 26
5.1.4 tempo de sono induzido por Tiopental 27
5.2 Exposição por via inalatória 29
5.2.1 Triagem farmacológica inicial 29
5.2.2 Medida da atividade motora 30
5.2.3 Medida da coordenação motora 33
5.2.4 tempo de sono induzido por Tiopental 34
5.3 Testes específicos 34
5.3.1 Avaliação da emocionalidade no campo aberto 34
5.3.2 Teste da interação social 35
5.3.3 Labirinto em cruz elevado depois de exposição aguda 36 5.3.4 Labirinto em cruz elevado depois de exposição repetida 38
6. DISCUSSÃO 41
7. CONCLUSÃO 45
8. ANEXOS 46
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52
1 1. INTRODUÇÃO
1.1 ANSIEDADE
Ansiedade é um sentimento característico do ser humano, caracterizado pela sensação de apreensão e desconforto, cuja causa pode ser ou não conhecida pelo individuo que sofre. Pode ser caracterizada também por um sentimento de antecipação de um perigo eminente. Geralmente é acompanhada de sintomas relacionados ao sistema nervoso autonômico, tais como taquicardia, sudorese. Estudo demonstra que cerca de 19 milhões de adultos nos Estados Unidos tem algum tipo de transtorno de ansiedade (Cline et al, 2008). Os transtornos de ansiedade como a ansiedade generalizada, transtorno de pânico, transtorno obsessivo-compulsivo, fobias ou estresse pós traumático são as principais causas de incapacitação, sua prevalência é cerca de 13% das causas de afastamento médico do trabalho (Narrow et al., 1998). A ansiedade também pode estar associada a outras condições médicas ou psiquiátricas, tais como algumas doenças envolvendo alterações de metabolismo ou transtornos do humor (Cline et al, 2008). O tratamento eficaz é realizado com drogas ansiolíticas ou antidepressivos, associado ou não a terapia cognitivo-comportamental. Entretanto, um numero considerável de pacientes não respondem ao tratamento convencional com drogas (Ernst, 2006). O custo com o tratamento medicamentoso para os transtornos de ansiedade no Reino Unido é na razão de 5 bilhões de libras esterlinas anuais (Bradley et al 2007) e nos Estados Unidos na ordem de 42 bilhões de dolares ao ano (Cline et al, 2008). Alem desses tratamentos convencionais, sabe-se que um número significativo de pacientes faz uso de formas alternativas de tratamentos e dentre estes destacam-se os produtos de origem vegetal. Em
2 estudo Ernst (2006) afirma que cerca de 43% dos pacientes com quadros de ansiedade se utilizam de práticas complementares para o controle dos sintomas, as mais popular é relacionada a utilização de substâncias derivadas de plantas.
1.2 PLANTAS MEDICINAIS
O uso de plantas medicinais no tratamento de doenças é relatado desde os tempos antigos (Muller et al., 2006). e seu poder precisa ser investigado para confirmar seus possíveis efeitos terapêuticos descritos pela medicina popular (Almeida, 1993). As plantas, são verdadeiros laboratórios vivos, onde se sintetizam substancias que podem ter efeitos tanto terapêuticos como tóxicos. As substâncias que encerram um preparo popular podem conter ações sinérgicas que, quando tomadas isoladamente não produzem efeitos. Mas essas ações sinérgicas podem produzir, ao longo do tempo, efeitos não conhecidos, que assumem natureza tóxica, a exemplo do barbatimão (Stryphnodendron O bovatum; Barbatiman; S. pollyphyfum) e do confrei (Symphytum officinale L.). Contudo, outras plantas apresentam, realmente, efeitos que o uso popular afirma ser positivo, tendo estudos preliminares comprovados, como por exemplo: quebra-pedra (Phyllanthus sellowianus), o alho (Allium sativum) e boldo (Peumus boldus, Jusieu) (Almeida, 1993)
1.3 ÓLEO ESSENCIAIS
A ISO (International Standard Organization) define óleos voláteis como os produtos obtidos de partes de plantas através de destilação por arraste com vapor d’água. De forma geral, são misturas complexas de substâncias voláteis,
3 lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. Também podem ser chamadas de óleos essenciais, óleos etéreos ou essências. Essas denominações derivam de algumas de suas características físico-químicas, como, por exemplo, a de serem geralmente líquidas à temperatura ambiente, advindo daí a designação de óleo. Entretanto sua principal característica é a volatilidade. Outra característica importante é o aroma intenso da maioria dos óleos voláteis, sendo, por isso, também chamados de essências (Simões et al. 1999)
Dentre os principais constituintes químicos das plantas, encontramos os terpenóides, como estruturas fundamentais dos óleos essenciais (Almeida, 1993). Os mais freqüentes compostos terpênicos presentes nos óleos essenciais são os monoterpenos (cerca de 90% dos óleos essenciais) e os sesquiterpenos. Os monoterpenos podem, ainda, ser divididos em três subgrupos: acíclicos (mirceno, linalool, geraniol), monocíclicos (alfa-terpineol e terpinoleno) e bicíclicos (alfa-pineno, tujona, cânfora, fenchona). Em cada um desses subgrupos, há ainda outras classificações: hidrocarbonetos insaturados (limoneno), alcoóis (mentol), aldeídos ou cetonas (mentona, carvona), lactonas (nepetalactona) e tropolonas (gama-tujaplicina) (Simões et al., 1999).
Os óleos essenciais estão presentes em muitos medicamentos vegetais, contribuindo para as suas características organolépticas e, muitas vezes, também para as propriedades terapêuticas, como no caso da Chamomilla
recrutia L. (camomila), Calendula officianalis L. (calêndula). Melissa officinalis
L. (erva-cidreira). São também componentes importantes e determinantes da qualidade da maioria das plantas utilizadas como condimentos, como o Carum
4 Algumas propriedades farmacológicas dos óleos essenciais estão relativamente bem estabelecidas como ação analgésica (Peanna et al., 2003), anticonsulsivante (Souza et al., 2006), ansiolítica (Umezu et al., 2002; Almeida et al., 2004) e sedativa (Vale et al, 2002; Leite et al, 2008).
Dependendo da família das plantas, os óleos essenciais podem ocorrer em estruturas secretoras especializadas, tais como em pelos glandulares (Lamiaceae), células parenquimáticas diferenciadas (Lauraceae, Piperaceae, Poaceae), canais olíferos (Apiaceae) ou em bolsas lisígenas (Pinaceae, Rutaceae). Porém, também podem estar estocados em certos órgãos, tais como flores (laranjeira, bergamoteira, lavanda), folhas (capim-limão, eucalipto, louro) ou ainda nas cascas dos caules (canelas), madeira (sândalo, pau-rosa), raízes (vetiver), rizomas (cúrcuma, gengibre), frutos (anis-estrelado, funcho, erva-doce) ou sementes (noz-moscada) (Simões et al, 1999)
Os óleos essenciais obtidos de diferentes órgãos de uma mesma planta podem apresentar composição química, caracteres físico-químicos e odores bem distintos devido, a fatores como à época de coleta, condições climáticas, de solo, hidratação do terreno e presença de micronutrientes nitrogenados, fosfatados ou com metais alcalinos (De Feo et al, 2002)
1.4 ÓLEOS ESSENCIAIS E SUAS AÇÕES
Nos últimos anos a busca por novos medicamentos visando menor custo e a redução dos efeitos colaterais, tem despertado o interesse pelos óleos essenciais (Gedney et al, 2004), sendo o seu uso conhecido desde épocas remotas (Umezu et al, 2002). A maior aceitação das terapias alternativas e
5 complementares tem contribuído para o crescente número de estudos clínicos e pré-clínicos, que mostram os seus benefícios, tanto físicos como psicológicos, reduzindo sintomas de ansiedade e depressão (Lehrner et al, 2000). Dados da literatura destacam as diferentes propriedades dos óleos essenciais como a ação analgésica (Peanna et al, 2003), anticonvulsivante (Souza et al, 2006), ansiolítica (Umezu et al 2002; Almeida et al, 2004) e sedativa (Vale et al, 2002; Leite et al, 2008).
Estudos com animais mostram que os óleos essenciais também atuam sobre o sistema nervoso central (SNC). O efeito antinociceptivo, do óleo essencial da Lavandula hybrida Reverchon, foi observado por Barocelli et al (2004), quando animais expostos á inalação do óleo de lavanda e avaliados em modelos de analgesia, mostraram diminuição do número de contorções abdominais e aumento do tempo de resposta ao estímulo térmico na placa quente. Abdon et al (2002) observou ainda, que os efeitos do óleo essencial de
Croton nepetaefolius, verificados em modelos animais de analgesia, foram
semelhantes e mais duradouros quando comparados á morfina.
Estudos em ratos tratados com o óleo essencial de laranja sugerem ação ansiolítica (Vale et al, 2002; Umezu et al, 2002; Leite et al, 2008). Estudo realizado por Bradley e colaboradores (2007) em gerbilos (espécie de roedor) machos e fêmeas expostos a inalação do óleo de lavanda e avaliados no Labirinto em cruz elevado, mostra um perfil ansiolítico decorrente de alteração dos parâmetros de emocionalidade.
Lehrner e colaboradores (2000), verificaram que pacientes expostos ao aroma de óleo essencial de laranja, mostraram-se mais relaxados, tranqüilos e
6 com redução no nível de ansiedade. A mudança da percepção da intensidade e desconforto da dor, após a inalação dos óleos essências de laranja e alecrim, foi observada por Gedney (et al, 2004) e Kim et al (2006). Esses autores verificaram que pacientes expostos ao óleo essencial de lavanda suportaram melhor o período de pós-operatório. Estudo feito por Lin e colaboradores (2007) sinalizou um possível efeito ansiolítico observado pela diminuição da agitação após inalação do OEL por pacientes idosos com quadro de demência.
1.5 AROMATERAPIA
Diversas desordens mentais têm sido, tradicionalmente, tratadas através de óleos essenciais derivados de plantas. O uso medicinal dos OE tem sua origem no antigo Egito e continua presente em diversas culturas. A aromaterapia tem tido uma ressurgimento nos últimos tempo, sendo utilizada como tratamento complementar às práticas convencionais (Perry e Perry, 2006). A ausência de embasamento científico que comprove sua eficácia tem constituído um obstáculo à credibilidade dessa prática (Umezu et al, 2006). A terapia com o uso dos OE sugere que possam ser eficazes no tratamento de diversas patologias. Estudos sugerem que os óleos essenciais quando inalados atuam no sistema límbico (Perry & Perry, 2006), através da ativação de receptores no sistema olfatório, que tem comunicação com áreas que modulam o comportamento e emoções (Doty, 1986, Umezu et al 2006; Niconov et al. 2005) conforme pode ser visto na figura 1.
7 Figura 1 Comunicação anatômica entre receptores olfatórios localizados no forame nasal com o córtex órbito-frontal, responsável pela identificação da informação olfatória. Comunicação entre o córtex orbito-frontal com a região lateral da amígdala (figura retirada da internet, não consta autor)
1.6 CARACTERIZAÇÃO DA LAVANDA E DO ÓLEO ESSENCIAL
O odor fresco da lavanda era o aditivo para o banho preferido pelos gregos e romanos, sendo o seu nome derivado da palavra latina lavare, que significa lavar. A fama de que os luveiros de Grasse utilizavam o óleo de alfazema para perfumarem as suas luvas (que estavam sempre livres de parasitas e doenças) encorajou outras pessoas a usarem alfazema contra as pestilências na Idade Média (Teske e Trentini, 1995)
O gênero Lavandula é composto por diversas espécies, dentre elas, as mais conhecidas são Lavandula officinalis Chaich syn e L. angustifólia Mill. Em alguns países, algumas espécies vêm sendo utilizadas para fins medicinais, desde tempos imemoriais. Devido ao seu odor agradável, a lavanda tem sido
8 amplamente utilizada em perfumes e cosméticos, no decorrer da história. Lavandula angustifólia é uma planta pertencente a família Lamiaceae, oriunda dos países banhados pelo Mediterrâneo (Büyükokuroglu et al 2002), sendo um subarbusto com base lenhosa, folhas estreito-lanceoladas e inflorescência terminal, composta de flores pequenas azuis (Aoyama et al, 1996), conforme mostra a figura 4. As Lamiaceas são, geralmente, conhecidas por seu espectro farmacológico, tais como ação anticonvulsivante, sedativa, ansiolítica, antidepressiva, antispasmódica, analgésica, antioxidante, entre outras (Hosseinzadeh et al, 2000; Lis-Balchim e Hart, 1999; Kovatcheva et al, 2001; Ghelardini et al, 1999). O óleo essencial de lavanda é extraído das partes áreas da planta, principalmente das flores, onde estão localizadas em grande quantidade as glândulas produtoras de óleo (Cavanagh e Wilkinson, 2002; Hajhashemi et al, 2003)
A análise fito-química do óleo essencial de Lavandula angustifólia demonstra a presença de diversos monoterpenos, especialmente linalool (figura 2) e acetato de linalil (figura 3), os possíveis responsáveis pela ação farmacológica, porém também foram encontrados outros compostos em menor quantidade, tais como Cis-β-Ocimeno, Trans-β-Ocimeno, β-cariofileno e acetato de lavandulil, como pode-se verificar na tabela 1. A Lavandula
angustifolia Mill. é endógena do Mediterrâneo e na região da Mármara na
Turquia, é cultivada para perfumes e como ornamento. Sua infusão em 4-4,5% de óleo essencial é utilizado como diurético e analgésico na medicina tradicional turca.
9
Figura 2 linalool Figura 3 acetado de linalil
Tabela 1: Tabela do perfil dos componentes fito-químicos do óleo essencial extraído da Lavandula angustifóliaMill. através do tempo de retenção na
cromatografia gasosa(dados fornecidos por IFF-Ltda).
Composto % Acetato de linalil 40,71 Linalool 28,17 Cis-β-ocimeno 4,73 β-cariofileno 4,72 Trans-β-ocimeno 2,93 Acetato de lavandulil 2,17
10 Figura 4: Lavandula angustifólia Mill.
subarbusto com base lenhosa, folhas estreito-lanceoladas e inflorescência terminal, composta de flores pequenas azuis
(http://www.examiner.com/gardening-scene- in-sacramento/english-lavender-the-little-black-dress-of-the-lavender-world)
1.7 JUSTIFICATIVA
Considerando que poucos estudos sobre a utilização dos óleos essenciais de plantas através de inalação como alternativa ao tratamento convencional dos sintomas da ansiedade, este estudo tem como objetivo principal avaliar o possível efeito ansiolítico do OEL em ratos e camundongos através de inalação ou administração por via i.p
11 2.OBJETIVOS
1. Traçar o perfil farmacológico do óleo essencial de Lavandula
angustifolia Mill, utilizando-se de testes farmacológicos básicos, visando avaliar
as suas possíveis ações através de administração por via intraperitoneal ou inalação em camundongos.
2. Verificar a possível ação ansiolítica do óleo essencial de Lavandula
12 3. MATERIAIS
3.1. ANIMAIS
Foram utilizados camundongos da linhagem Suíça machos pesando de 30-40 g de 3-4 meses de idade e ratos Wistar machos pesando de 300-400 g e de 3-4 meses de idade. Os animais foram obtidos do biotério do Departamento de Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).
Os animais foram mantidos em salas com controle de temperatura (21 + 2ºC) e ciclo claro/escuro de 12 horas em jaulas de polipropileno (32x40x18 cm), contendo 25 camundongos ou 4 ratos cada. Foram mantidos com água e comida ad libitum até 4 horas antes da administração via (i.p) e 30 minutos antes da exposição inalatória ao óleo essencial.
Os experimentos realizados com camundongos foram realizados entre 7 e 12h, enquanto ensaios com ratos foram conduzidos entre 13 e 17h. O protocolo experimental foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP, CEP/UNIFESP : No: 1276/07.
3.2 ÓLEO ESSENCIAL, DROGAS E REAGENTES
O óleo essencial obtido das flores da L. angustifolia foi fornecido e identificado pela International Flavors and Fragrances (IFF) Ltda. Barueri-SP. A composição do OEL foi determinada pela empresa fornecedora.
Tionembutal-Abott Ltda. Tween 80.
13 3.3 ANÁLISE DO ÓLEO ESSENCIAL
A análise e o laudo do OEL foram fornecidos e realizados pela International Flavors and Fragances (IFF), empresa que forneceu o óleo essencial para a pesquisa. O OEL foi analisado pelo método de cromatografia gasosa (CG). A quantificação dos constituintes do óleo foi calculada através de CG com detecção por ionização. A análise da CG foi realizado no aparelho de cromatografia Afilet-hp 6890 com detecção FID e coluna capilar COV-1 (30 m x 0.25 mm): espessura do filme 0,25µm. As condições de operação foram ás seguintes: transporte de gás, hidrogênio com fluxo de 30 mL/min; coluna de temperatura 80-220ºC a 4 ºC/min.; injetor e detector de temperatura 250ºC; volume de óleo injetado de 0.2µL; taxa de separação 1:150 (anexo 2).
14 4 METODOS
4.1 TRATAMENTO
4.1.1 ADMINSTRAÇÃO INTRAPERITONEAL (I.P) EM CAMUNDONGOS.
Os grupos tratados e controles continham 12 camundongos cada. Para a administração via i.p do OEL, consideramos a densidade do óleo como sendo 900 mg/mL, conforme laudo do IFF. Doses de 500 mg/kg; 250 mg/kg e 125 mg/kg foram utilizadas para o tratamento do animais dos grupos experimentais. Os animais controles receberam solução de NaCl 0.9%, sendo imediatamente após avaliados nos testes não específicos.
4.1.2 EXPOSIÇÃO OLFATÓRIA EM CAMUNDONGOS
Os grupos tratados e controles continham 12 camundongos cada Para a exposição inalatória, os animais foram colocados individualmente em caixas acrílicas (36 x 30 x 29 cm), com 4 furos na parte anterior e quatro furos na posterior, preenchidos com chumaços de algodão. Cada algodão recebeu 1 ml de água (grupo controle) ou de suspensão 2,5% e 100% (w/w) de óleo essencial em água (grupo tratado) . As caixas foram lacradas durante 5 minutos para a saturação do ambiente. Após esse intervalo, os animais foram colocados no interior e la permanecendo durante 20 minutos. Imediatamente após a exposição os animais foram avaliados nos testes não específicos. Os grupos experimentais foram expostos ao OEL 2.5% e OEL 100% w/w (Almeida et al. 2004).
15 4.1.3 EXPOSIÇÃO OLFATÓRIA EM RATOS
Os grupos tratados e controles continham 12 ratos cada. Para a exposição inalatória, os animais foram colocados individualmente em caixas acrílicas (36 x 30 x 29 cm), conforme descrito anteriormente para os camundongos. Cada algodão recebeu 1 ml de água (grupo controle) ou de suspensão 2,5% e 100% (w/w) de óleo essencial em água (grupo tratado). As caixas foram lacradas durante 5 minutos para a saturação do ambiente. Após esse intervalo os animais foram colocados no interior e inalaram (figura 5) durante 7 minutos (exposição aguda) ou 10 minutos durante 15 dias (exposição sub-crônica). Imediatamente após a exposição os animais foram avaliados nos modelos experimentais. Os grupos experimentais foram expostos ao OEL 2.5% e OEL 100% w/w (Almeida et al. 2004).
16 4.2 TESTES GERAIS
4.2.1TRIAGEM FARMACOLÓGICA INICIAL
Quatro grupos de camundongos com 6 animais cada receberam via ip OEL (500mg/kg;250mg/kg e 125mg/kg) ou salina (controles). Três grupos de 6 camundongos cada foram expostos por via inalatória OEL ( puro e suspensão a 2,5%) ou água (controles),colocados em gaiolas de arame (figura 6), cada uma com 3 animais e observados aos 5,15,30,60,120,180 e 240 minutos e 24h seguindo-se o protocolo (anexo 1) rotineiramente utilizado pelo Departamento de Psicobiologia (Carlini, 1972; Mattei et al, 1998). Foi observado a presença ou ausência dos seguintes sinais: freqüência urinária, defecação, pilo-ereção, alteração da atividade motora, tremores, convulsão, tônus muscular, alteração de postura, ataxia, ptose palpebral, perda de reflexos, lacrimejação e salivação (Carlini, 1972). Com o objetivo de se estimar a possível toxicidade e orientar a escolha de doses para os testes gerais, os animais foram mantidos e observados durante 7 dias após o tratamento.
17 Figura 6 gaiola de arame contendo 3 camundongos em observação após a
administração via i.p do OEL ou inalação do OEL
4.2.2 MEDIDA DA ATIVIDADE MOTORA
Três grupos de 12 camundongos cada receberam por via ip OEL (250mg/kg e 125mg/Kg) ou salina (controles).Três grupos de 12 camundongos cada foram expostos por via inalatória o OEL ( puro e suspensão a 2,5%) ou água (controles).Os animais foram colocados imediatamente após a administração ou inalação, individualmente em caixas equipadas com células foto-elétricas, sendo computada a movimentação nos tempo de 30,60 e 90 minutos. Devido a grande atividade exploratória inicial, os animas passam por um período de adaptação nas caixas durante os 5 minutos iniciais (Carlini, 1972; Mattei et al, 1995).
18 O aparelho (Opto-Varimex MINI) consiste de uma caixa acrílica transparente (48 x 24 x 20 cm), com piso e tampa de metal, dotada de células foto-elétricas e despositovo de contagem de movimentação (figura 7)
Figura 7 caixa utilizada para registrar a atividade motora
4.2.3 MEDIDA DA COORDENAÇÃO MOTORA (ROTA-ROD)
Três grupos de 12 camundongos cada previamente selecionados (pré-seleção dos animais 24h antes do teste, separando para o estudo somente aqueles que conseguiram permanecer na barra giratória por 60 segundos em uma de três tentativas) receberam por via i.p (250mg/kg e 125mg/kg) ou expostos por via inalatória o OEL ( 2,5% e suspensão a puro) e água (controles) .
19 Este teste consiste em avaliar a coordenação motora dos camundongos que são colocados sobre uma barra giratória (Figura 8) a 12 rpm e avaliados nos tempos 0 (basal), 30, 60 e 90 minutos após o tratamento (figura 8). O tempo máximo de observação foi de 60 segundos (Carlini & Burgos, 1979; Mattei et al, 1995).
Figura 8. Aparelho de rota-rod
4.2.4 TEMPO DE SONO INDUZIDO PELO TIOPENTAL
Três grupos com 12 camundongos cada, receberam por via ip OEL 125 mg/kg; OEL 250 mg/kg e salina (controles) ou expostos por via inalatória o OEL (suspensão 2,5% e puro) e água (controles). Após trinta minutos os animais receberam por via i.p uma dose de 85 mg/kg de tiopental. Foi registrado o tempo que o animal levou para perder o reflexo de endireitamento (tempo de latência) e o tempo para recuperá-lo (tempo de sono). A perda do reflexo de endireitamento é a incapacidade de o animal voltar á posição normal quando colocado em decúbito dorsal. O critério para a recuperação do reflexo de endireitamento foi fixado quando o animal por três vezes consecutivas saiu da
20 posição de decúbito dorsal (Figura 9), o tempo máximo de observação foi 90 minutos (Carlini et al, 1986; Mendes et al,2002).
Figura 9. Perda do reflexo de endireitamento
4.3 MODELOS COMPORTAMENTAIS ESPECÍFICOS
4.3.1AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL NO CAMPO ABERTO
Três grupos com 12 ratos cada foram expostos à inalação do OEL (suspensão a 2,5% ou puro) e água (controles), foram então submetidos ao teste do campo aberto. Esse teste se baseia no fato de que os animais em ambientes novos e muito iluminados alteram seu comportamento pelo estímulo estressor. O aparato é uma arena circular dividida em 3 círculos concêntricos, subdivididos por segmentos de linha reta de 19 partes iguais medindo 80 cm de diâmetro e 30 cm de altura (figura 10). A arena era iluminada com o uso de 6
21 lâmpadas de 100 watts colocadas 100 cm acima do chão do campo aberto. Os ratos foram individualmente colocados no centro do campo aberto e foram registrados parâmetros de comportamento referentes à locomoção, rearing (número de vezes em que o animal ficou nos membros traseiros) e tempo em
freezing (tempo total de imobilidade tônica) durante 5 minutos (Candland e
Campbell, 1962). Tais parâmetros são indícios do grau de emocionalidade dos animais.
Figura 10. Arena circular onde foram avaliados os animais
4.3.2 TESTE DA INTERAÇÃO SOCIAL
Quatro grupos com 12 ratos cada foram expostos por via inalatória ao OEL (suspenso a 2,5% ou puro), água (controles). Este procedimento é baseado na observação de que os animais tendem a reduzir ou até suprimir sua interação (lamber, cheirar, brigar ou ter comportamento sexual), figura 11
22 com outros animais quando submetidos a situações de estresse (novos ambientes ou luz excessiva). O aparelho utilizado foi o mesmo descrito acima para o teste de comportamento em campo aberto. Pares de ratos de até 10 g de diferença em seus pesos, foram colocados no centro da arena, quantificando-se suas atividades de interação social ativa durante o tempo de observação de 5 minutos (File e Hyde 1978).
Figura 11. Interação social ativa
4.3.3 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO
Três grupos com 12 ratos cada foram expostos por via inalatória ao OEL (suspenso a 2,5% ou puro), água (controles). Este teste baseia-se na avaliação do comportamento exploratório do rato quando exposto a áreas abertas e desprotegidas. Resumidamente, o labirinto consiste de dois braços abertos e dois braços fechados por paredes com 30 cm de altura (figura 12). Cada braço mede 50 cm de comprimento por 10 cm de largura e contém um quadrado central de 10 x 10 cm. O labirinto estava elevado a 60 cm do chão. Os ratos foram colocados individualmente na área central do labirinto e foi registrado o
23 número de vezes em que o mesmo entrou nos braços abertos e fechados, assim como o período de permanência nos mesmos durante um intervalo de medida de 5 minutos. Com intuito de avaliar as alterações na emocionalidade, foram considerados os números de entradas nos braços abertos bem como o tempo nos mesmos (Pellow et al., 1985).
Figura 12. Labirinto em cruz elevado
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados pelo programa Statistica® versão 6.0 levando-se em consideração o número de grupos experimentais e o tipo de medida (intervalar, nominal ou ordinal).
Para a análise dos dados não-paramétricos com mais de três grupos foram utilizados os testes de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Para analise dos resultados obtidos por dois grupos, foi utilizado o teste U de Mann-Whitney. Adotou-se um nível de significância de 5% (p<0,05).
24 Para análise dos dados paramétricos para comparação dos resultados de dois grupos, foi utilizado o teste t-Student. Para análise de três grupos ou mais foram feitos através do teste da analise de variância de uma via (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey ou de Duncan. O nível de significância foi
estabelecido em 5% (p<0,05).
5 RESULTADOS
5.1 TESTES GERAIS POR VIA I.P
5.1.1 TRIAGEM FARMACOLÓGICA INICIAL
O óleo essencial de lavanda nas doses de 125 mg/kg, 250mg/kg e 500mg/kg produziu uma aparente diminuição da atividade motora e ptose palpebral. Sinais de toxicidade puderam ser incluídas, pela presença de writhes e pelos arrepiados. Houve aumento da micção para as doses de 250 mg/kg e 125mg/kg, e diminuição da defecação para todas as doses quando comparadas ao grupo controle. Foi observada uma morte em resposta à dose de 250 mg/kg após 120horas e 500 mg/kg após 96 horas, conforme indica a tabela 2.
25 Tabela 2: Efeitos do óleo essencial de lavanda, na avaliação farmacológica inicial. Foi considerado o valor cumulativo das observações durante 4h. Cada grupo foi constituído por 6 camundongos.
EFEITOS OBSERVADOS DOSES (mg/kg)
Controle 125 250 500 Locomoção + ↓ ↓ ↓ N° bolos fecais + ↓ ↓ ↓ Pêlos arrepiados - + + + Micção + - ↑ ↑ Writhes - + + + Ptose palpebral - + + +
Morte 0 0 1 Após 5 dias 1 Após 4 dias
(↓) diminuído, (↑) aumentado, (+) presente e (-) ausente
Nº de bolos fecais menos de 40 (↓↓↓ ) entre 40-80 (↓↓) mais de 80(↓)
5.1.2 MEDIDA DA ATIVIDADE MOTORA
Conforme pode ser visto na figura 13, os animais tratados com OEL nas concentrações de 125mg/kg e 250 mg/kg não diferiram quanto a medida da ambulação, quando comparados aos controles. Este resultado pode sugerir assim que não há efeito sedativo ou estimulante pelo OEL nas doses empregadas e que possam ser perceptíveis nesse teste.
26 Figura 12: Efeito do óleo essencial de lavanda em camundongos submetidos ao teste da movimentação espontânea. Dados expressos em medias ± erro padrão. Diferença entre os grupos tratado e controle, foram analisados através de do teste de analise de variância de uma via (ANOVA) /Tukey, p < 0,05.
5.1.3 MEDIDA DA COORDENAÇÃO MOTORA
Conforme pode ser visto pela tabela 3, os animais previamente expostos ao OEL nas concentrações de 125mg/kg e 250 mg/kg não diferiram quanto ao tempo de permanência no rota-rod, quando comparados aos controles, sugerindo assim que não há efeito perceptíveis nesse teste, que permita inferir ação no SNC nessas concentrações.
27 Tabela 2: Efeito do óleo essencial de lavanda na coordenação motora de camundongos submetidos ao teste do rota-rod.
TEMPO DE PERMANÊNCIA NO
ROTA-ROD (segundos)
TRATAMENTO VIA DOSE
(mg/kg) INTERVALOS DE OBSERVAÇÃO (minutos) 0 30 60 90 Controle (n=12) ip - 43 (32 - 60) 60 (60 - 60) 60 (49 - 60) 60 (40 - 60) OEC (n=12) ip 125 60 (11 - 60) 60 (18 - 60) 60 (36 - 60) 60 (22 - 60) OEC (n=10) ip 250 53 (45 - 60) 46 (25 - 60) 60 (32 - 60) 60 (40 - 60)
Dados expressos em mediana e intervalo interquartílico (Q1-Q3). (NS) Teste Kruskal-Wallis.
5.1.1.4 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR TIOPENTAL
Conforme pode ser visto pelas figuras 14 a, b, os animais previamente expostos a administração via i.p de OEL na concentração de 125mg/kg apresentaram uma latência maior para o sono quando comparados aos controles (H ( 2, N= 36) =6,96 p=,0307), sugerindo assim que há efeito potencializador da ação do barbitúricos na indução ao sono.
28
Latencia para o sono
Median 25%-75% Min-Max controle lav 125 lav 250
-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 L a te n c ia p a ra o s o n o e m s e g u n d o s *
Figura 14a. Efeito do óleo essencial de lavanda sobre o tempo de latência para o sono induzido por Tiopental em camundongos. Dados expressos em mediana e intervalo interquartílico (Q1-Q3). * p < 0,05 vs Controle; … p < 0,05 vs OEL125 mg/kg. Teste Kruskal-Wallis e U de Mann-Whitney
tempo de sono
Median 25%-75% Min-Max controle lav 125 lav 250
-1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 te m p o d e s o n o e m s e g u n d o s *
Figura 14b. Efeito do óleo essencial de lavanda sobre o tempo de sono induzido por Tiopental em camundongos. Dados expressos em mediana e intervalo interquartílico (Q1-Q3). * p < 0,05 vs Controle; p < 0,05. Teste Kruskal-Wallis
29 5.2 EXPOSIÇÃO POR VIA INALATÓRIA
5.2.1 TRIAGEM FARMACOLÓGICA INICIAL
A suspensão do OEL na concentração de 2,5% ou OEL puro diminuiu a atividade motora, conforme pode ser visto pela tabela 4. Leve toxicidade pôde ser inferida pela manifestação de pelos arrepiados. Houve diminuição da micção e da defecação em ambas as concentrações, quando comparadas ao grupo controle. Não foi observado morte em resposta as concentrações inaladas após 7 dias, conforme indica a tabela 4.
Tabela 4: Efeitos do óleo essencial de lavanda, pela via inalatória em camundongos. Foi considerado o valor cumulativo das observações durante 4h. Cada grupo foi constituído por 6 camundongos.
EFEITOS OBSERVADOS CONCENTRAÇÕES Controle 2,5% 100% Locomoção + ↓ ↓ N° bolos fecais + ↓ ↓ Pêlos arrepiados - + + Micção + ↓ ↓ Writhes - - - Ptose palpebral - - - Morte 0 0 0
(↓) diminuído, (↑) aumentado, (+) presente e (-) ausente Nº de bolos fecais mais de 80(↓)
30 5.2.2 MEDIDA DA ATIVIDADE MOTORA
Os resultados obtidos da atividade motora medidas aos 15, 30, 60 e 90 minutos após a administração do OEL estão apresentados nas figuras 15 a,b,c e d. Conforme pode ser visto pelas figuras, os animais previamente expostos ao OEL por via inalatória diferiram quanto a medida da ambulação, quando comparados aos controles aos 15,30,60 e 90 minutos, pode se observar pela figura a uma redução significativa da ambulação nos animais do grupo tratado com OEL na concentração de 2,5%, pela via inalatória. Os resultados com o uso da concentração de 2,5% foram diferentes dos do 100% aos 15 minutos (F(12, 56)=2,184, p=,02508) e aos 60 minutos, sugerindo assim um possível efeito sedativo nessa concentração.
31
Atividade Motora aos 15 minutos
Median 25%-75% Min-Max controle lav 250 lav puro
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 N ú m e ro d e i n te rr u p çõ e s d e ce lu la s fo to -e le tr ica s * **
Figura 15a. Efeito do óleo essencial de lavanda em camundongos submetidos ao teste da movimentação espontânea. Resultados expressos em medianas e intervalo inter-quartílico (Q1-Q3). *Diferença entre os grupos tratado e controle,** diferenças entre ambos os grupos tratados. Resultados analisados com o uso do teste de Kruskal-Wallis / Mann-Whitney, p < 0,05.
Atividade Motora aos 30 minutos
Median 25%-75% Min-Max controle lav 250 lav puro
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 N ú m e ro d e i n te rr u p çõ e s d e ce lu la s fo to -e le tr ica s
Figura 15b. Efeito do óleo essencial de lavanda em camundongos submetidos ao teste da movimentação espontânea. Resultados expressos em medianas e intervalo inter-quartílico (Q1-Q3). *Diferença entre os grupos tratado e controle. Resultados
32 analisados com o uso do teste de Kruskal-Wallis / Mann-Whitney, p < 0,05.
Atividade Motora aos 60 minutos
Median 25%-75% Min-Max controle lav 250 lav puro
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 N ú m e ro d e i n te rr u p çõ e s d e ce lu la s fo to -e le tr ica s *
Figura 15c. Efeito do óleo essencial de lavanda em camundongos submetidos ao teste da movimentação espontânea. Resultados expressos em medianas e intervalo inter-quartílico (Q1-Q3). *Diferença entre os grupos tratado e controle. Resultados analisados com o uso do teste de Kruskal-Wallis / Mann-Whitney, p < 0,05.
Atividade Motora aos 90 minutos
Median 25%-75% Min-Max controle lav 250 lav puro
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 N ú m e ro d e i n te rr u p çõ e s d e ce lu la s fo to -e le tr ica s *
Figura 15d. Efeito do óleo essencial de lavanda em camundongos submetidos ao teste da movimentação espontânea.
33 Resultados expressos em medianas e intervalo inter-quartílico
(Q1-Q3). *Diferença entre os grupos tratado e controle. Resultados analisados com o uso do teste de Kruskal-Wallis / Mann-Whitney, p < 0,05.
5.2.3 MEDIDA DA COORDENAÇÃO MOTORA
Conforme pode ser visto na tabela 5, os animais previamente submetidos a inalação do OEL nas concentrações de 2,5% e puro não diferiram quanto ao tempo de permanência no rota-rod, quando comparados aos controles, sugerindo assim que nessa concentração não se observa efeito sobre o SNC com o uso deste teste.
Tabela 5: Efeito do óleo essencial de lavanda sobre a coordenação motora de camundongos submetidos ao teste do rota-rod.
TEMPO DE PERMANÊNCIA NO
ROTA-ROD (segundos)
TRATAMENTO CONC. INTERVALOS DE OBSERVAÇÃO
(minutos)
0 30 60 90
Controle (n=12) - 39 (22 - 60) 60 (60 - 60) 60 (60 - 60) 60 (40 - 60) OEL (n=12) 2,5% 46 (27 - 58) 60 (49 - 60) 60 (60 - 60) 60 (22 - 60) OEL (n=12) puro 52 (33 - 60) 60 (60 - 60) 60 (41 - 60) 60 (51 - 60)
Resultados expressos em mediana e intervalo interquartílico (Q1-Q3). Teste Kruskal-Wallis.
34 5.2.4 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR TIOPENTAL
Conforme pode ser visto na figura 16, os animais previamente submetidos a inalação do OEL nas concentrações de 2,5% e puro não diferiram quanto ao tempo e de latência de sono quando comparados aos controles.
Figura 16. Efeito do óleo essencial de lavanda sobre o tempo de latência para o sono e tempo de sono induzido pelo Tiopental em camundongos. Resultados expressos em medias ± ep. p < 0,05. Analise de variância de uma via (ANOVA).
5.3 TESTES ESPECÍFICOS COM EXPOSIÇÃO POR VIA INALATÓRIA 5.3.1 AVALIAÇÃO DA EMOCIONALIDADE NO CAMPO ABERTO
Conforme pode ser visto pela figura 17, os animais previamente expostos à inalação do OEL na concentração de 2,5%, apresentaram uma diminuição no tempo em freezing (t =3,797; p<0,001), quando comparados ao
35 grupo controle. Observa-se que não houve alterações quanto ao número de bolos fecais,do comportamento de elevar-se ou na ambulação.
Figure 17: Efeito do óleo essencial de lavanda sobre a frenquência de locomoção, número de levantares e tempo em ―freezing” dos ratos observados no campo aberto. Resultados expressos em média ± EP (*)p<0,05 (Student-t test).
5.3.2 TESTE DA INTERAÇÃO SOCIAL
Conforme pode ser visto pela figura 18, os animais expostos à inalação do OEL na concentração de 2,5% apresentaram um maior tempo de interação social (F(2, 26)=3,784, p<0,05), sendo esta alteração estatisticamente diferente quando comparado aos controles e aos tratados com OEL puro.
36 Figura 18: Efeito da inalação aguda do óleo essencial de lavanda no comportamento de interação social de ratos avaliados no campo aberto. Os resultados estão expressos em média ± EP. * Diferença observada entre os resultados dos grupos tratados em relação aos controle. ** Diferença observada entre os resultados dos grupos 2,5% e 100%. Foi empregado para analise dos resultados a análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Duncan.
5.3.3 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (EXPOSIÇÃO AGUDA)
Conforme pode ser visto pela figura 19 a, b, os animais previamente expostos à inalação do OEL nas concentrações de 2,5% e 100%, diferiram tanto para o tempo despendido, quanto no número de entradas nos braços abertos (F(8, 62)=2,556, p<0,02) quando comparados ao grupo controle, sugerindo um possível efeito ansiolítico.
37 Figure 19a: Efeitos da inalação aguda do óleo essencial de lavanda sobre o comportamento de ratos avaliados no labirinto em cruz elevado. Em ordenada, esta representado o número de entradas nos braços abertos (EBA) ou fechados (EBF). Os resultados foram expressos em média ± EP. * Diferença entre grupos tratados e controle analisados com o emprego de analise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Tukey); p<0,05.
38 Figure 19b: Efeitos da inalação do óleo essencial de lavanda sobre o comportamento de ratos avaliados no labirinto em cruz elevado. Em ordenada, está representado o tempo despendido nos braços abertos (TBA) e fechados (TBF). Os resultados foram expressos em média ± EP. * Diferença entre grupos tratados e controle, analisados com o emprego de analise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Tukey); p<0,05.
5.3.4 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (EXPOSIÇAO SUB-CRÔNICA)
Conforme pode ser visto pela figura 20 a, b, os animais previamente expostos por 15 dias ao OEL 2,5%, não diferiram quanto ao número de entradas e quanto ao tempo de permanência dos animais nos braços abertos
39 do LCE, quando comparados aos controles, sugerindo assim que não se observa efeito do OEL no comportamento dos ratos após a inalação repetida.
Figure 20a: Efeitos da inalação do óleo essencial de lavanda sobre o comportamento de ratos avaliados no labirinto em cruz elevado, quanto ao número de entradas nos braços abertos (EBA) e fechados (EBF). Os dados foram expressos em média ± EP. p<0,05 diferença entre os grupos tratado e controle, foram analisados com o uso do teste de t Student,
40 Figure 20b: Efeitos da inalação do óleo essencial de lavanda sobre o comportamento de ratos avaliados no labirinto em cruz elevado, quanto ao tempo despendido nos braços abertos (TBA) e fechados (TBF). Os dados foram expressos em média ± EP. p<0,05 diferença entre os grupos tratado e controle, foram analisados com o uso do teste de t Student,
41 6. DISCUSSÃO
Os óleos essenciais vêm sendo apontados como uma possível alternativa terapêutica para os sintomas de ansiedade, devido à presença de monoterpenos em sua constituição, ao qual se atribui efeitos depressores do SNC (Leite et al. 2008). O perfil farmacológico do OEL pode ser correlacionado à presença de linalool e acetato de linalil, compostos de comprovada ação sedativa e ansiolítica (Umezo et al, 2006). Estudo mostra que o linalool (um dos principais componentes o OEL) pode ter ação sobre o sistema glutamatérgico (principal neurotransmissor excitatório do SNC), reduzindo a ação do mesmo e conseqüentemente reduzindo a excitabilidade central (Buyukokuroglu et al. 2003).
Os resultados iniciais obtidos com o óleo OEL, administrado por via i.p e avaliado no screening farmacológico inicial, mostraram ação depressora observada, tanto pela diminuição da ambulação, como pela presença de ptose palpebral nos animais (tabela 2). Sinais de toxicidade (presença de pêlos arrepiados) também foram constatados, além de mortes para as concentrações mais elevadas no decorrer de sete dias.
Um possível efeito depressor foi sinalizado pela diminuição da atividade motora e pela facilitação na indução do sono nos camundongos. É importante ressaltar que o OEL não alterou a coordenação motora dos animais, indicando que as doses empregadas não induziram um relaxamento muscular intenso nem alteraram o senso de equilíbrio dos animais.
Os resultados no screening farmacológico por exposição por via inalatória do OEL mostraram uma ação depressora sobre o SNC pela diminuição da locomoção, defecação e micção, tanto para a concentração de
42 2,5%, como para o OEL puro. Ressalta-se a ausência de sinais de toxicidade, mesmo após 7 dias de observação, comprovando sua segurança quando inalado (Bradley, 2007; Perry and Perry, 2006).
Uma possível ação depressora sobre o SNC foi observada pela diminuição da atividade motora dos animais, aos 15, 60 e 90 minutos, sendo a concentração de 2,5% mais efetiva, pois aos 15 minutos foi já se observa a redução da ambulação no grupo, enquanto não se observa no grupo tratado com OEL puro. Dados da literatura mostram que o óleo essencial de lavanda apresenta ação depressora, observada tanto em experimentos pré-clínicos como clínicos (Lin et all, 2007; Hwang, 2006), sendo este efeito observado mesmo em baixas concentrações (Buchbauer et all, 1993). É importante ressaltar que o OEL não alterou a coordenação motora dos animais em relação aos controles, indicando que as doses empregadas não induziram um relaxamento muscular intenso nem alteraram o senso de equilíbrio dos animais.
O possível efeito ansiolítico pode ser sugerido pela diminuição do tempo em freezing dos animais submetidos à inalação do OEL, avaliados no campo aberto, com a concentração de 2,5%. Vale ressaltar que, quanto menor for o tempo em freezing, menor será o grau de emocionalidade dos animais. Esse comportamento está relacionado ao medo inerente que os roedores apresentam de ambientes abertos e iluminados. Nossos resultados estão de acordo com outro estudo realizado com ratos expostos pela via inalatória do óleo essencial de lavanda (Shaw et al. 2007)
No teste de interação social o OEL na concentração de 2,5%, produziu um efeito similar ao de drogas ansiolíticas como o diazepam, aumentando o tempo de interação social ativa. Vale ressaltar que, nossos resultados com o
43 OEL na concentração de 2,5% sugerem uma maior efetividade do que com a concentração de 100%. Tal fato vem de encontro com estudo feito por Atsumi e Tonosaki (2007), no qual voluntários saudáveis foram expostos a inalação do OEL, em elevadas ou baixas concentrações, em que foram avaliados marcadores relacionados aos níveis de estresse na saliva dos mesmo. Em altas concentrações OEL alterou esses parâmetros, mostrando um efeito estressor, em contra partida, em baixas concentrações diminuiu os parâmetros quando comparados os valores basais. Tal fato pode estar relacionado com a percepção olfativa desagradável, que alguns indivíduos demonstram quando submetidos a concentrações muito elevadas do OEL (Atsumi e Tonosaki, 2007)
No labirinto em cruz elevado, nossos resultados mostraram que o OEL modificou o grau de emocionalidade dos animais, sugerindo um efeito ansiolítico, verificado pelo aumento no tempo despendido e no número de entradas nos braços abertos, para ambas as concentrações de 2.5% e 100%. Estudo feito em gerbilos avaliados no LCE, após inalação do óleo essencial de lavanda, aponta para um efeito ansiolítico similar ao encontrado por nosso grupo (Bradley et al. 2007). Nossos resultados mostraram que não houve alteração no grau de emocionalidade nos animais expostos repetidamente ao OEL e, posteriormente, avaliados no labirinto em cruz elevado, sugerindo que um efeito de tolerância ao OEL, pela exposição repetida, ocasionado pela saturação dos receptores olfatórios.
Outros trabalhos sugerem que os óleos essenciais atuam modulando a neurotransmissão no SNC (Komiya et al, 2006). Estudo clínico sinaliza uma relação entre a percepção de odores e a resposta emocional, mostrando uma correlação neuro-anatômica entre o córtex órbito-frontal (região responsável pela interpretação dos estímulos olfativos) e a amígdala (região que controla o
44 humor e sentimentos) (Pollatos et al, 2007). Podemos concluir que, o OEL apresenta um perfil ansiolítico constatado nos modelos animais (campo aberto, interação social e labirinto em cruz elevado através de exposição aguda), e que a concentração de 2,5% foi a mais efetiva. Nossos dados sugerem que há uma modulação do SNC através do sistema olfatório. Novos estudos são necessários para se entender como o OEL, através de ativação de receptores olfatórios específicos modula o SNC, bem como seriam as alterações emocionais em seres humanos submetidos a inalação do OEL no controle dos
45 7. CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que: 1. O OEL mostrou perfil depressor sobre o SNC.
2. Ação sedativa leve através de administração por via i.p. 3. Ação sedativa através da exposição inalatória.
4. Concentrações menores são mais efetivas.
46 8. ANEXOS
47
ANEXO 2.
50 ANEXO 3.
52 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abdon APV, Leal-Cardoso JH, Coelho-de-Souza NA, Morais SM, Santos. Antinociceptive effects of the essentialoil of Croton nepetaefolius on mice. Brazilian Journal of Medical and Biologal Research. 2002; 35 (10): 1215-9.
Almeida ER. Coentro. In: Almeida ER. Plantas medicinais brasileiras. São Paulo: Hemus; 1993. p 145-146.
Almeida RN, Motta SC, Faturi CB, Catallani B, Leite JR. Anxiolytic-like effects of rose oil inhalation on the elevated plus-maze test in rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior 2004; 77:361-4.
Atsumi T, Tonosaki K. Smelling lavender and rosemary increases free radical scavenging activity and decreases cortisol level in saliva. Psychiatry Research 2007; 150:89-96.
Aoyama EM, Ono EO, Furlan MR. Estudo da germinação de sementes de lavanda (Lavandula angustifólia Mill. Science agriculture 1996; 53: 2-3.
Barocelli E, Calcina F, Chiavarini M, Impicciatore M, Bruni R, Bianchi A, Ballabeni V. Antinociceptive and gastroprotective effects of inhaled and orally administered Lavandula hybrida Reverchon. Grosso essential oil. Life Sciences 2004; 76: 213-223.
53 Bradley BF, Starkey NJ, Brown SL, Lea RW. Anxiolytic effects of Lavandula
angustifolia odour on the mongolian gerbil elevated plus maze. Journal of
Ethnopharmacology 2007; 111:517–25.
Buchbauer G, Jirovetz L, Jager W, Plank C, Dietrich H. Fragrance 660-campounds and essential oils with sedative effects upon inhalation. Journal of Pharmaceutical Sciences 1993; 82(6): 660-664m.
Buyukokuroglu ME, Gepdiremen A, Hacimuftuoglu A, Oktay M. The effects of aqueous extract of Lavandula angustifolia flowers in glutamate-induced
neurotoxicity of cerebellar granular cell culture of rat pups. Journal of Ethnopharmacology 2003; 84:91-4
Candland DK, Campbell BA. Development of fear in the rat as measured by bahaviour in the open-field. Journal of Comportamental Psychology 1962; 55: 593-96.
Carlini, E. A. -Sreening farmacológico de plantas brasileiras. Revista Brasileira de Biologia, 32(2): 265-274, 1972.
Carlini, E. A.; Burgos, V.- Screening farmacológico de ansiolíticos: metodologia laboratorial e comparação entre o diazepam e o clorobenzapam. Revista da Associação Brasileira de. Psiquiatria, São Paulo, 1(3): 25-31,1979.
54 Carlini, E. A.; Contar, J. D. P.; Silva-Filho, A. R.; Silveira-Filho, N. G.; Frochtengarten, M. L.; Bueno, O. F.A. -Pharmacology of lemongrass (Cymbopogon citratus Stapf). I. effects of teas prepared from the leaves on laboratory animals. Journal of Ethnopharmacology, 17: 37-64, 1986.
Cavanagh, H. M. A.; Wilkinson, J. M.-Biological activities of lavender essential oil. Phytotherapy Research 2002; 16: 301-308.
Cline M, Taylor JE, Flores J, Bracken S, McCall S, Ceremuga TE. Investigation of the anxiolytic effects of linalool, a lavender extract, in the male sprague-dawley rat. AANA Journal 2008; 76(1): 47-52.
De Feo V, De Simone F, Senatore F. Potential allelochemicals from the essential oil of Ruta graveolens. Phytochemistry. 2002; 61(5): 573-8.
Doty RL. Odor-guided bahavior in mammals. Experientia 1986; 42(3):257-71.
Ernst E. Herbal remedies for anxiety- a systematic review of controlled clinical trials. Phytomedicine 2006; 13: 205-208.
File SE, Hyde JR. Can social interaction be used to measure anxiety? British Journal of Pharmacology 1978; 62:19-4.
Gedney JJ, Glover TL, Fillingim RB. Sensory and affective pain discrimination after inhalation of essential oils. Psychosomatic Medicine. 2004; 66 (4): 599-6.
55 Ghelardini C, Galeotti N, Salvatore G, Mazzanti G. Local anaesthetic activity of the essential oil of Lavandula angustifolia .Planta Medica 1999; 65(8): 700-703.
Hwang JH. The effects of the inhalation method using essential oils on blood pressure and stress responses of clients with essential hypertension.Taeham Kanho Hakhoe Chi 2006; 36(7):1123-34.
Hajhashemi V, Ghannadi A, Sharif B. Anti-inflammatory and analgesic properties of the leaf extracts and essential oil of Lavandula angustifolia Mill. Journal of Ethnopharmacology 2003; 89:67-1.
Hosseinzadeh H, Ramezani M, Salmani G. Antinociceptive, anti-inflammatory and acute toxicity effects of Zataria multiflora Boiss extract in mice and rats. Journal of Ethnopharmacology 2000; 73: 379-385.
Komiya M, Takeuchi T, Harada E. Lemon oil vapor causes an anti-stress effect via modulating the 5-HT and DA activities in mice. Behavioural Brain Research 2006; 172:240-49.
Komori T, Fujiwara R, Tanida M, Nomura J. Potential antidepressant effects of lemon odor in rats. European Neuropsycopharmacology 1995; 5(4):477-80.
Kovatcheva AG, Koleva II, Ilieva M, Pavlov A, Mincheva M, Konushlieva M. Antioxidant activity of extract from Lavandula vera MM cell cultures. Food Chemistry 2001; 72: 295-300.
56 Lader M, Tylee A, Donoglue J. Withdrawing benzodiazepines in primary care. CNS Drugs 2009; 23(1): 19-34
Lehrner J, Eckersberger C, Walla P, Postsch G, Deecke L. Ambient odor of orange in a dental office reduces anxiety and improves mood in female patients. Physiology and Behavior 2000; 71:83-6.
Leite MP, Fassin JJr, Baziloni EMF, Almeida RN, Mattei R, Leite JR. Behavioral effects of essential oil of Citrus aurantium L. inhalation in rats. Revista Brasileira de Farmacognosia. 2008; 18:661-66.
Lin PW, Chan W, Fung-leung B, Lam LC. Efficacy of aromatherapy (Lavandula
angustifolia) as an intervention for agitated behaviours in chinese older persons
with dementia: a cross-over randomized trial. International Journal of Geriatric Psychiatry 2007; 22(5):405-10.
Lis-Balchin M, Hart S. Studies on the mode of action of the essential oil of lavender (Lavandula angustifolia P. Miller). Phytotherapy Research 1999; 13: 540-542.
Mattei, R.; Leite, J. R.; Tufik, S.- A study of the pharmacological actions of
Dioclea grandiflora Martius ex Bentham. São Paulo Medical Journal, 113
57 Mattei, R.; Dias, R. F.; Espínola, E. B.; Carlini, E. A.; Barros, S. B. M.- Guaraná (Paullinia cupana): toxic behavioral effects in laboratory animals and antioxidant activity in vitro. Journal of Ethnopharmacology, 60:111-116, 1998.
Mendes FR, Mattei R, Carlini EA. Activity of Hypericum brasiliense and Hypericum cordatum on the central nervous system in rodents. Fitoterapia. 2002; 73(6): 462-471.
Müller M, Pape HC, Speckmann EJ, Gorji A. Effect of eugenol on spreading depression and epileptiform discharges in rat neocortical and hippocampal tissues. Neuroscience. 2006; 140(2): 743-51.
Narrow WE, Rae DS, Regier DA, NIMH epidemiology note: prevalence of anxiety disorders. One-year prevalence best estimates calculate from ECA and NCS data. Population estimates bases on US census estimated residential population age 18 to 54 on july 1.
Nikonov AA, Finger TE, Caprio J. Beyond the olfactory bulb: an adotopic map in the forebrain. PNAS 2005; 102(51):18688-18693.
Peana AT, D’Aquila PS, Chessa ML, Moretti MDL, Serra G, Pippia P. (-)-Linalool produces antinociception in two experimental models of pain. Eur J Pharmacol. 2003; 460(1): 37- 41.
58 Pellow S, Chopin P, File SE, Briley, M. Validation of open:closed arms entries in evelated plus maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods 1985; 14:149-67.
Perry N, Perry E. Aromatherapy in the management of psychiatric disorders: clinical and neuropharmacological perspectives. Central Nervous System Drugs 2006; 20(4):257-80.
Pollatos O, Albrecht J, Kopietz R, Linn J, Schoepf V, Kleemann AM, Schreder T, Schandry R, Wiesmann M. Reduced olfactory sensitivity in subjects with depressive symptoms. Journal of Affectives Disorders 2007; 102(1-3):101-08.
Shaw D, Annett JM, Doherty B, Leslie JC. Anxiolytic effects of lavender oil inhalation on open-field behaviour in rats. Phytomedicine 2007; 14:613-20.
Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2ª Ed. Santa Catarina: Editora da UFSC; 1999.
Sousa DP, Gonçalves JCR, Quintans-Júnior L, Cruz JS, Araújo DA, Almeida RN. Study of anticonvulsant effect of citronellol, a monoterpene alcohol, in rodents. Neurosci Lett. 2006;401(3): 231-5.